(19)中華人民共和國國家知識產(chǎn)權(quán)局(21)申請?zhí)?01880042070.X(22)申請日2018.05.10(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(85)PCT國際申請進(jìn)入國家階段日(86)PCT國際申請的申請數(shù)據(jù)PCT/US2018/0321552018(87)PCT國際申請的公布數(shù)據(jù)WO2018/209143EN2018.11(71)申請人海灣醫(yī)學(xué)公司地址美國內(nèi)華達(dá)州(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京市金杜律師事務(wù)所代理人陳文平徐志明C12N15/52(2006.C12N15/81(2006.孫建萍(54)發(fā)明名稱用于大麻素家族的戊烯化聚酮的重組生產(chǎn)系統(tǒng)(57)摘要21.一種生產(chǎn)大麻素產(chǎn)物的方法，該方法包括在其中表達(dá)由外源多核苷酸編碼的產(chǎn)物并產(chǎn)生2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸的條件下，培養(yǎng)修飾的重組宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含：(i)編碼將脂族羧酸轉(zhuǎn)化成?；鵆oA硫酯的酰基-CoA合成酶的第一外源多核苷酸；(ii)編碼從酰基CoA硫酯和丙二酰CoA產(chǎn)生四酮的二羥基戊基苯甲酸合酶的第二外源(iii)編碼2-烷基-4.6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶的第三外源多核苷酸；和將2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸在體外轉(zhuǎn)化成大麻素產(chǎn)物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶是二羥基戊基苯甲酸環(huán)化酶。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸是二羥基戊基5.權(quán)利要求1至4任一項的方法，其中所述2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶包含DABB結(jié)構(gòu)域。6.權(quán)利要求1至5任一項的方法，其中所述第二和第三外源多核苷酸作為雙順反子mRNA表達(dá)。7.權(quán)利要求3的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟包括形成包含二羥基戊基苯甲酸、香葉醇和有機(jī)溶劑的反應(yīng)混合物并將所述反應(yīng)混合物維持在足以產(chǎn)生大麻萜酚酸(CBGA)的條件下。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含酸。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述酸是對甲苯磺酸。10.權(quán)利要求7-9任一項的方法，其中所述有機(jī)溶劑是甲苯。11.權(quán)利要求7-10任一項的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含所述宿主細(xì)胞。12.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述修飾的重組宿主細(xì)胞是經(jīng)遺傳修飾以敲除13.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸是所述大麻素產(chǎn)14.權(quán)利要求1-11任一項的方法，進(jìn)一步包括將所述2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化成所述大麻素產(chǎn)物。15.一種修飾的重組宿主細(xì)胞，其包含：(i)編碼將脂族羧酸轉(zhuǎn)化成酰基CoA硫酯的?；?CoA合成酶的第一外源多核苷酸，其中所述?；?CoA合成酶是revS多肽或CsAAE3多肽；(ii)編碼二羥基戊基苯甲酸合酶的第二外源多核苷酸；和(iii)編碼2-烷基-4.6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶的第三外源多核苷酸。16.權(quán)利要求15的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶是截短的二羥基戊基苯甲酸環(huán)化酶。17.權(quán)利要求15的修飾重組宿主細(xì)胞，包含編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的第四外源多核苷酸，所述異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化香葉基-焦磷酸與2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸的偶聯(lián)以產(chǎn)生酸性大麻素。18.權(quán)利要求15的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二或第三外源多核苷酸中的一個或多個存在于自主復(fù)制表達(dá)載體中。319.權(quán)利要求18的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二或第三外源多核苷酸中的至少兩個存在于同一自主復(fù)制表達(dá)載體中并表達(dá)為多順反子mRNA。20.權(quán)利要求19的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第二和第三外源多核苷酸表達(dá)為雙順21.權(quán)利要求18的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二或第三外源多核苷酸中的至少兩個存在于同一自主復(fù)制表達(dá)載體中并且與各自的啟動子可操作地連接。22.權(quán)利要求15的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二或第三和第四外源多核苷酸存在于兩個或更多個自主復(fù)制表達(dá)載體中。23.權(quán)利要求15至22任一項的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述修飾重組宿主細(xì)胞是經(jīng)遺傳修飾以敲除PAD1和FDC1芳族脫羧酶基因表達(dá)的酵母細(xì)胞。24.權(quán)利要求18的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述自主復(fù)制表達(dá)載體是酵母人工染色體。25.權(quán)利要求15的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二或第三外源多核苷酸中的一個或多個整合至宿主基因組中。26.權(quán)利要求15的修飾重組宿主細(xì)胞，其中一個或多個外源多核苷酸通過逆轉(zhuǎn)座子整合引入所述重組宿主細(xì)胞中。27.權(quán)利要求15至26任一項的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述外源多核苷酸中的一個或多個的表達(dá)通過醇脫氫酶-2啟動子驅(qū)動。28.權(quán)利要求17的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含一個或多個選自以下三個外源多核苷酸的另外的外源多核苷酸：編碼戊烯醇和異戊烯醇激酶的外源多核苷酸；編碼在外源戊烯醇和異戊烯醇存在下生長時產(chǎn)生二甲基烯丙基焦磷酸和異戊烯基焦磷酸的激酶的外源多核苷酸；和編碼香葉基-焦磷酸合酶的外源多核苷酸。29.權(quán)利要求15的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含所有三個另外的外源多核苷酸。30.權(quán)利要求28的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述一個或多個另外的外源多核苷酸存在于自主復(fù)制表達(dá)載體中。31.權(quán)利要求30的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述一個或多個另外的外源多核苷酸存在于自主復(fù)制表達(dá)載體中，所述自主復(fù)制表達(dá)載體包含所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的一個或多個。32.權(quán)利要求28的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述一個或多個另外的外源多核苷酸整合至宿主染色體中。33.權(quán)利要求28的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述另外的外源多核苷酸通過逆轉(zhuǎn)座子整合引入宿主細(xì)胞中。34.權(quán)利要求15至33任一項的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述另外的外源多核苷酸中的一個或多個的表達(dá)通過醇脫氫酶-2啟動子來驅(qū)動。35.權(quán)利要求15至34任一項的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是選自釀酒酵母酵母(K.marxianus)、畢赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)和曲霉屬(Aspergillus)的細(xì)胞。36.一種修飾的重組宿主細(xì)胞，其包含：(i)編碼戊烯醇和異戊烯醇激酶的第一外源多4核苷酸；(ii)編碼在外源戊烯醇和異戊烯醇存在下生長時產(chǎn)生二甲基烯丙基焦磷酸和異戊烯基焦磷酸的激酶活性的第二外源多核苷酸；(iii)編碼香葉基-焦磷酸合酶的第三外源多核苷酸；和(iv)編碼催化香葉基-焦磷酸與2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸的偶聯(lián)以形成酸性大麻素的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的第四外源多核苷酸。37.權(quán)利要求36的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的一個或多個存在于自主復(fù)制表達(dá)載體中。38.權(quán)利要求37的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的至少兩個存在于同一自主復(fù)制表達(dá)載體中并表達(dá)為多順反子RNA。39.權(quán)利要求37的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的至少兩個存在于同一自主復(fù)制表達(dá)載體中并且與各自的啟動子可操作地連接。40.權(quán)利要求37的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二、第三和第四外源多核苷酸存在于兩個或更多個自主復(fù)制表達(dá)載體中。41.權(quán)利要求37的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一和第二外源多核苷酸存在于同一載體上。42.權(quán)利要求37的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述自主復(fù)制表達(dá)載體是酵母人工染色體。43.權(quán)利要求37的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的一個或多個整合至宿主基因組中。44.權(quán)利要求37的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述第一、第二、第三或第四外源多核苷酸中的一個或多個通過逆轉(zhuǎn)座子整合引入宿主細(xì)胞中。45.權(quán)利要求36的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述酸性大麻素是CBGA或次大麻酚酸46.權(quán)利要求36的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸通過外源提47.權(quán)利要求36的修飾重組宿主細(xì)胞，其中在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸在所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并且所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼二羥基戊基苯甲酸合酶基因的第五外源多核苷酸、編碼2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶的第六外源多核苷酸；和編碼酰基-CoA合酶基因的第七外源多核苷酸。48.權(quán)利要求47的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶是修飾的二羥基戊基苯甲酸環(huán)化酶。49.權(quán)利要求36的修飾重組宿主細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼大麻素合酶的外源多核苷酸，所述大麻素合酶催化宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的所述酸性大麻素化合物中間體轉(zhuǎn)化以形成中性大麻素或第二酸性大麻素。50.權(quán)利要求36至49任一項的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是選自釀酒酵母酵母(K.marxianus)、畢赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)和曲霉屬(Aspergillus)的細(xì)胞。51.權(quán)利要求36的修飾重組宿主細(xì)胞，其中所述外源多核苷酸中的一個或多個可操作地連接醇脫氫酶-2啟動子。52.一種生產(chǎn)大麻素產(chǎn)物的方法，該方法包括在其中表達(dá)由所述外源多核苷酸編碼的5產(chǎn)物并產(chǎn)生所述酸性大麻素的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求36-51任一項的修飾宿主細(xì)胞。53.權(quán)利要求52的方法，進(jìn)一步包括加熱所述酸性大麻素以形成中性大麻素。54.一種用于制備大麻素產(chǎn)物的方法，該方法包括：在酵母細(xì)胞中表達(dá)大麻素起始材料，其中所述酵母細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)所述大麻素起始材料，在所述分離的酵母細(xì)胞中將所述大麻素起始材料轉(zhuǎn)化成所述大麻素產(chǎn)物。55.權(quán)利要求54的方法，其中所述大麻素起始材料是大麻素前體或酸性大麻素。56.權(quán)利要求54或權(quán)利要求55的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟包括形成包含所述分離的酵母細(xì)胞和有機(jī)溶劑的反應(yīng)混合物。57.權(quán)利要求54-56任一項的方法，其中所述大麻素起始材料是大麻素前體，和其中所述轉(zhuǎn)化步驟包括將所述大麻素前體香葉基化以形成所述大麻素產(chǎn)物。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述大麻素前體是2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸。59.權(quán)利要求57的方法，其中所述異戊烯化包括形成包含所述大麻素產(chǎn)物、香葉醇和有機(jī)溶劑的反應(yīng)混合物并將所述反應(yīng)混合物維持在足以產(chǎn)生所述大麻素產(chǎn)物的條件下。60.權(quán)利要求54的方法，其中所述大麻素起始材料是酸性大麻素，和其中所述轉(zhuǎn)化步驟包括將所述酸性大麻素脫羧以形成中性大麻素產(chǎn)物。6用于大麻素家族的戊烯化聚酮的重組生產(chǎn)系統(tǒng)[0001]相關(guān)申請的交叉引用[0002]本申請要求2017年5月10日提交的美國臨時申請No.62/504,456的權(quán)益，將所述臨時申請按引用并入本文中用于所有目的。技術(shù)領(lǐng)域[0003]本發(fā)明總地涉及用于生物合成臨床上重要的大麻素家族的戊烯化(prenylated)聚酮的生產(chǎn)方法、酶和重組宿主株，例如酵母菌株。利用容易獲得的起始原料，使用異源酶來指導(dǎo)在真核微生物(例如酵母)中的大麻素生物合成。背景技術(shù)[0004]大麻(Cannabissativa)品種已經(jīng)在世界范圍內(nèi)被廣泛種植和利用以用于多種應(yīng)記錄了許多在人體內(nèi)進(jìn)行的受控臨床研究以及傳聞或開放標(biāo)簽研究，這些研究證明了植物提取物和純化的大麻植物化合物在許多人類醫(yī)學(xué)狀況中均具有有益作用。人體研究中描述的大麻素家族化合物的有益活性的范圍從神經(jīng)系統(tǒng)到情緒/行為失調(diào)，再到胃腸道疾病以及睡眠、食欲和疲勞問題。其他用途或潛在用途包括治療各種微生物和病毒感染以及治療多種癌癥。因此，作為這一人類治療適應(yīng)癥迅速發(fā)展的范圍的直接結(jié)果，目前對使用可持續(xù)的現(xiàn)代生物制藥方法生產(chǎn)藥用級大麻素類存在著尚未滿足的需求。[0005]目前，主要通過在全世界的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中種植大面積的大麻(cannabis或hemp)植物來分離大麻素，以及使用較低的(盡管在臨床上重要的)水平的涉及合成化學(xué)過程的生產(chǎn)方法。前一種技術(shù)成本高昂，利用大量自然資源，如耕地和水，并且總是導(dǎo)致最終的藥品含有污染所需活性藥物物質(zhì)的其他活性大麻素類。這可能導(dǎo)致所需純化合物的活性的變化，從而在臨床試驗情況下和市售產(chǎn)品中導(dǎo)致虛假活性。此外，有毒金屬和農(nóng)藥對天然植物來源的大麻素制品的污染是目前需要解決的問題。同樣，由于許多大麻素的復(fù)雜立體化學(xué)，化學(xué)合成是困難、昂貴和低產(chǎn)的過程。此外，據(jù)報導(dǎo)，許多大麻素的合成化學(xué)生產(chǎn)產(chǎn)生的分子藥理活性比從大麻植物提取的那些分子低。[0006]然而，合成生物學(xué)(由此使用工程化微生物中的隔離遺傳途徑來生物合成目標(biāo)產(chǎn)物)為許多天然存在的化合物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)問題提供了潛在的解決方案。[0007]大麻素分子及其類似物的第一化學(xué)構(gòu)建塊是天然源自III型聚酮合酶(PKS)的聚酮。對于在大麻中的PKS的詳細(xì)描述，參見FloresSanchez,I.J.,2008,博士學(xué)位論文，LeidenUniversity以及Sanchez和Verpoorte,PhytochemRev(2[0008]聚酮通常以類似于脂肪酸合成的方式通過二碳單元的縮合來合成。通常，該合成的第一個酶促步驟是通過III型PKS酶形成二羥基戊基苯甲酸(olivetolicacid),所述酶7催化己酰基-CoA與三分子的丙二?；?輔酶A的縮合以形成四酮，其隨后通過單獨基因編碼的環(huán)化酶環(huán)化和芳香化。因此，從起始前體己酰基-CoA(一種中鏈脂肪?；?CoA)形成主要的大麻素類，包括△9-四氫大麻酚酸和大麻二醇酸。其他的、具有變體側(cè)鏈的不太普遍的大麻素由不同長度的脂族CoA形成(例如，△9-四氫次大麻酚酸從n-丁?；?CoA起始單元形成)。在自然界中發(fā)現(xiàn)了幾種另外的相關(guān)類似物，且其他類似物已化學(xué)合成。[0009]I型和許多III型迭代PKS是具有重復(fù)使用以獲得最終聚酮產(chǎn)物的位點的酶，其中某些III型PKS,包括OA合酶，也需要環(huán)化酶的作用來催化完成最終步驟，即線性四酮前體的[0010]天然生物合成途徑中朝向主要大麻素的接下來的步驟涉及二羥基戊基苯甲酸或二羥基戊基苯甲酸類似物(例如，2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸)的異戊烯化，其中10-碳香葉基-二磷酸通過異戊烯酶(prenylase)香葉基-二磷酸：二羥基戊基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶(GOT)縮合(Fellermeier和Zenk,1998)以產(chǎn)生大麻萜酚酸(CBGA);其通過大麻二醇酸合酶(Taura等，2007)、△9-四氫大麻酚酸合酶(Sirikantaramas等，2004)和大麻二烯酸合酶(Morimoto等，1998)分別進(jìn)一步氧化環(huán)化成例如CBDA、△9-THCA和CBCA(Morimoto等，發(fā)明內(nèi)容[0011]本文提供了為大麻素表達(dá)而工程化的修飾重組宿主細(xì)胞，酵母菌株。在一些實施方式中，宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)編碼酰基-CoA合成酶的外源多核苷酸，所述酶將脂羥基戊基苯甲酸合酶的外源多核苷酸，(iii)和編碼2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶(例如，二羥基戊基苯甲酸環(huán)化酶)的外源多核苷酸。還可以對這種宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，其催化香葉基焦磷酸與二羥基戊基苯甲酸或二羥基戊基苯甲酸類似物(例如2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸)的偶聯(lián)以形成大麻素化合物。[0012]本文還提供了重組宿主細(xì)胞，其被遺傳修飾以表達(dá)編碼戊烯醇和異戊烯醇激酶的外源多核苷酸；編碼在外源性戊烯醇和異戊烯醇存在下生長時產(chǎn)生二甲基烯丙基焦磷酸和異戊烯基焦磷酸的激酶的外源多核苷酸；和編碼香葉基焦磷酸合酶的外源多核苷酸。在一些實施方式中，另外對宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的外源多核苷酸，所述酶催化香葉基焦磷酸與二羥基戊基苯甲酸或二羥基戊基苯甲酸類似物(例如2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸)的偶聯(lián)以形成大麻素化合物。[0013]本文還提供了用于生產(chǎn)大麻素產(chǎn)物的方法。所述方法包括：在其中表達(dá)由外源多核苷酸編碼的產(chǎn)物并且產(chǎn)生2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸(例如，二羥基戊基苯甲酸)的條件下，培養(yǎng)修飾的重組宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞含有編碼將脂族羧酸轉(zhuǎn)化成?；鵆oA硫酯的酰基-CoA合成酶的外源多核苷酸；編碼從酰基-CoA和丙二酰CoA產(chǎn)生四酮的二羥基戊基苯甲酸合酶的外源多核苷酸；和編碼2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶(例如，二羥基戊基苯甲酸環(huán)化酶)的外源多核苷酸；并將2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化成大麻素。所述轉(zhuǎn)化可以在體外或體內(nèi)通過化學(xué)或酶方式進(jìn)行。8附圖說明[0014]圖1描繪了通過戊烯醇(二甲基烯丙基醇)和異戊烯醇(異戊烯基醇)的焦磷酸酯得到香葉基焦磷酸的生物合成途徑。香葉基焦磷酸是用于聚酮二羥基戊基苯甲酸及其類似物的異戊烯化以形成大麻萜酚酸(CBGA)及其類似物的底物。[0015]圖2A描繪了可通過多前體進(jìn)料(MPF)策略(改編自FloresSanchez,I.J.,2008,博士學(xué)位論文，LeidenUniversity,Sanchez和Verpoorte,Phytoc獲得的主要大麻素類的化學(xué)結(jié)構(gòu)。[0016]圖2B描繪了可使用MPF策略以及進(jìn)一步的化學(xué)或生物化學(xué)轉(zhuǎn)化反應(yīng)(改編自FloresSanchez,I.J.,2008,博士學(xué)位論文，LeidenUnivePhytochemRev(2008)7:615-639)獲得的其他大麻素類的化學(xué)結(jié)構(gòu)。[0017]圖3描繪了可通過CBGA獲得的臨床上重要的大麻素化合物的整體途徑(改編自FloresSanchez,I.J.,2008,博士學(xué)位論文，LeidenUnivePhytochemRev(2008)7:615-6[0018]圖4描繪了直接在經(jīng)工程化以產(chǎn)生△?-四氫大麻酚酸(△?-THCA)和大麻二酚(CBD)的酵母細(xì)胞內(nèi)更多重要的大麻素化合物(例如，大麻酚(CBN)和大麻二醇(CBDN))的化學(xué)轉(zhuǎn)[0019]圖5描繪了通過將脂族羧酸進(jìn)料至表達(dá)?；?CoA合成酶、大麻CsAAE3和來自鏈霉菌屬(Streptomycessp.)SN-593的中鏈脂肪酰基-CoA連接酶revS的酵母(Saccharomyces)菌株在搖瓶培養(yǎng)物中生產(chǎn)聚酮大麻素前體。[0020]圖6描繪了在進(jìn)料各種酵母搖瓶培養(yǎng)物及己酸時3,5-二羥基戊苯和二羥基戊基苯膜結(jié)構(gòu)域的CsAAE1(道2)、CsAAE3(道3)、revS(道4)、647個氨基酸的青枯雷爾氏菌端415個氨基酸(道6)的基因轉(zhuǎn)化。[0021]圖7描繪了搖瓶實驗(泳道1-5)中pH對二羥基戊基苯甲酸相對于3,5-二羥基戊苯表達(dá)的影響，以及在3-升發(fā)酵(道6)中在pH6.5下通氣增加對二羥基戊基苯甲酸表達(dá)的作具體實施方式[0023]本發(fā)明提供了以快速、經(jīng)濟(jì)和有效的方式生產(chǎn)目標(biāo)大麻素化合物的方法和材料。因此，本發(fā)明滿足各種商業(yè)和制藥工業(yè)的需求。[0024]在一個方面中，本發(fā)明提供了使用商業(yè)酵母生物藥物制造系統(tǒng)有效生產(chǎn)異戊烯化聚酮的新系統(tǒng)(Page,J.E.,和Nagel,J.(2006),Biosynthesishopandcannabis.InIntegrativePlantBiochemistry,J.T.Romeo編輯(0xford,UK:Elsevier),pp.179-210),所述異戊烯化聚酮包括大麻素家族以及大麻素前體分子及其類似物。在一些實施方式中，選擇作為宿主的酵母菌株屬于不天然產(chǎn)生這些分子的釀酒酵母(Saccharomyces維酵母(Kluyveromyceslactis)、馬克思克魯維酵母(K.marxianus)、畢赤巴斯德酵母9(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)和多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)。相似地，絲狀真菌種，如某些曲霉屬(Aspergillus)的種，也可以工程化以用于大麻素生產(chǎn)。[0025]本能發(fā)明可以使用來自I型PKS和II型PKS的編碼序列，但在典型的實施方式中，所用的PKS是來自PKS的III型類別，例如，天然芳香族二羥基戊基苯甲酸合成酶/環(huán)化酶系統(tǒng)，或相關(guān)的III型苔色酸合成酶，或這些酶的修飾形式。編碼I型PKS的多肽組分的基因已經(jīng)用于在異源微生物(如酵母和大腸桿菌)中相似聚酮的微生物生產(chǎn)。參見，例如，美國專利No.6,033,883、6,258,566、7,078,233和9,637,763,以及Kealey等，ProcNatlAcaUSA(1998)95,505。[0026]在一些實施方式中，本發(fā)明使用一種稱為多前體進(jìn)料(MPF)技術(shù)的方法，其中適當(dāng)修飾的宿主細(xì)胞可以接受并磷酸化進(jìn)料的香葉醇和/或5-碳香葉基-二磷酸前體，以及內(nèi)源產(chǎn)生的或外源進(jìn)料的二羥基戊基苯甲酸或二羥基戊基苯甲酸類似物(例如，2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸)以獲得產(chǎn)量比在相同宿主細(xì)胞中從頭合成全部這些前體所產(chǎn)生的更高的大麻素生物合成產(chǎn)率。在一些實施方式中，香葉基-二磷酸可以從兩個5-碳前體(二甲基烯丙基醇(戊烯醇)和異戊烯基醇(異戊烯醇))產(chǎn)生，這兩個5-碳前體本身進(jìn)料并通過工程化至大麻素生產(chǎn)菌株中的合適異源激酶磷酸化至二磷酸水平。[0028]除非另外限定，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語、符號和其他科學(xué)術(shù)語旨在具有本申請所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。在某些情況下，為了清楚和/或易于參考，在此定義了具有通常理解的含義的術(shù)語，并且在本文中包括這樣的定義不應(yīng)被解釋為表示與本領(lǐng)域通常理解的實質(zhì)性區(qū)別。含有聚酮部分(例如為二羥基戊基苯甲酸或另一種2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸)和萜烯衍生的部分(例如，香葉基基團(tuán))的分子。香葉基基團(tuán)源自香葉醇的二磷酸酯，稱為香葉基二磷酸或香葉基焦磷酸(圖1),其形成酸性大麻素大麻萜酚酸(CBGA)。CBGA可以通過酶促(例如通過體內(nèi)或體外酶處理的脫羧作用以形成中性大麻素大麻酚)和化學(xué)方式(例如通過加熱)轉(zhuǎn)化成其他生物活性大麻素類；還參見圖1、2A和2B。二羥基戊基苯甲酸香葉醇[0031]術(shù)語大麻素包括酸性大麻素和中性大麻素。術(shù)語“酸性大麻素”是指具有羧酸部分的大麻素。羧酸部分可能以質(zhì)子化形式(即，作為-COOH)或以去質(zhì)子化形式(即，作為碳酸酯-CO0-)存在。酸性大麻素的實例包括，但不限于，大麻萜酚酸、大麻二酚酸和△?-四氫大麻酚酸。術(shù)語“中性大麻素”是指不包含羧酸部分(即，實際含-COOH或-CO0-部分)的大麻素。中性大麻素的實例包括，但不限于，大麻萜酚、大麻二酚和△9-四氫大麻酚。[0032]術(shù)語“2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸”是指具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：CN110869496A說明書5/23頁基戊基苯甲酸(即，2-戊基-4,6-二羥基苯甲酸；CAS登記號No.491-72-5)和二酚酸5-壬基間苯二酚。烷基包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔-丁基、戊基、異戊基、己基等。烷基還可以指具有多達(dá)20個碳原子的烷基基團(tuán)，如，但不限于，庚基、辛基、壬基、癸基等。劑的實例包括，但不限于，甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、四氫呋喃、苯、氯仿、二乙醚、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和石油醚。酸、對甲苯磺酸等)。[0039]在整個說明書和權(quán)利要求書中，詞語“包括(comprise)”或諸如“包含氨基酸殘基的兩個或多個序列或子序列(例如，至少70%,至少75%,至少80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更高)。用于確定氨基酸序列同一性(DNASTAR)軟件之類的可公開獲得計算機(jī)軟件的那些。適用于確定序列同一性和序列相似[0041]如本文所用，“保守”置換是指使得維持側(cè)基鏈的電荷、疏水性和/或大小的氨基酸負(fù)電荷的氨基酸Glu和Asp;(iii)芳香族氨基酸Phe、Tyr和Trp;(iv)氮環(huán)(v)大型脂族非極性氨基酸Val、Leu和Ile;(vi)弱極性氨基酸Met和Cys;(vii)小側(cè)鏈氨基11(ix)小羥基氨基酸Ser和Thr。在本段中，提及氨基酸的電荷是指在生理pH下的電荷。是指二羥基戊基苯甲酸。“CBG”是指大麻萜酚；“CBDA”是指大麻二酚酸；“CBD”是指大麻二四氫大麻酚酸(△?-THCA);“△?-THCA”是指△?-四氫大麻酚酸；“CBCA”是指大麻色烯酸；“CBV”是指次大麻酚(cannabivarin);“CBVA”是指次大麻酚酸；"THC酚(△?-THCV);“△?-THCV”是指“△?-四氫次大麻酚”;“THCVA”是指△?-四氫次大麻酚酸(△?-THCV);“△?-THCVA”是指△?-四氫次大麻酚酸；“CBGV”是指次大麻萜酚(cannabigerovarin);“C指次大麻色烯(cannabichromevarin);“CBCVA”是指次大麻色烯酸(cannabichromevaric括復(fù)數(shù)指代物，除非文中清楚表示其他。[0044]本文描述或參考的分子生物學(xué)技術(shù)和程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常充分了解的并LaboratoryManual,第2版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.中所述的分子克隆方法。適當(dāng)情況下，通常根據(jù)制造商限定的實驗方案和/或參數(shù)來進(jìn)行涉及商業(yè)可獲得的試劑盒和試劑的過程。在描述本發(fā)明的方法、表達(dá)系統(tǒng)及其試劑，當(dāng)然這些可以改變。還將理解本文使用的術(shù)語僅用于描述特定的實施方案的目的，并且不是打算來限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求限定。[0045]III.大麻素表達(dá)系統(tǒng)有充分研究的在各種人類醫(yī)學(xué)病癥中具有更高效力和選擇性活性的大麻素。它們包括，不大麻酚(OTHC)、大麻環(huán)醚萜酚(cannabiglendol)和△?-異四氫大麻酚，它們的結(jié)構(gòu)顯示于[0047]本發(fā)明還涉及大麻素化合物中間體的合成。在一些實施方案中，大麻素中間體化合物是本文所述的代謝途徑中的步驟之一中產(chǎn)生的化合物(例如，圖1和圖2A)。術(shù)語“代謝途徑”是指系列的兩個或更多個酶促反應(yīng)，其中一個酶促反應(yīng)的產(chǎn)物變成下一個酶促反應(yīng)的底物。在代謝途徑的每個步驟中，形成中間體化合物并且用作隨后步驟的底物。在一些實施方案中，代謝途徑的每個步驟在本文所述的修飾的重組細(xì)胞中進(jìn)行。在其他實施方案中，基酸殘基的結(jié)構(gòu)域：[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-列中的給定位置處可接受任何殘基。對于給定位置可接受的氨基酸放置在方括號之間(例且有助于鑒定擬南芥(Arabidopsis)(Shockey等，2003)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、毛果楊(Populustrichocharpa)和小立菀蘚(Physcomitrellapatens)Black等(BiochimBiophysActa.1771(3):286-98,2007);Miyazawa等(J.Biol.Chem290些實施方案中，多核苷酸編碼與SEQIDNO:1中列出的序列具有約60%或更高同一性(例如，約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)的多肽。在一些實施方案中，多核苷酸編碼與SEQIDNO:1中列出的序列具有約70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性的RevS多肽。在一些實施方案中，非天然產(chǎn)生的變體與SEQNO:2列出的序列具有至少約60%或更高同一性的氨基酸序列(例如，約60%、61%、62%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)。在一些實施方案中，酰基-CoA合成酶多核苷酸編碼包含與SEQIDNO:2中列出的序列具有約70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性的氨基酸序列的CsAAE3,或其同系物或非天然產(chǎn)生的變體。在一些實施NO:3列出的序列具有至少約60%或更高同一性的氨基酸序列(例如，約60%、61%、62%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)。在一些實施方案中，?；?CoA合成酶多核苷酸編碼包含與SEQIDNO:3中列出的序列具有約70%、75%、80%、85%、90%、酸編碼從其刪除了跨膜結(jié)構(gòu)域的多肽。在一些實施方案中，非天然產(chǎn)生的變體與SEQID接作用于?；?CoA底物(與I型PKS和II型PKS的情況中酰基攜帶蛋白結(jié)合的底物相反)的同[0059]在一些實施方案中，二羥基戊基苯甲酸合中列出的序列具有約60%或更高同一性(例如，約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、97%、98%、99%或100%同一性)的氨基酸序列的多肽。在一些實施方案中，二羥基戊基苯甲酸合酶多核苷酸編碼包含與SEQIDNO:4中列出的序列具有約70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性的氨基酸序列的III型PKS。[0061]可以將根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞進(jìn)一步修飾來表達(dá)編碼2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶是來自大麻的二羥基戊基苯甲酸合酶(EC編號4.4.1.26)。(S.coelicolor)ActVA-Orf6(Q53908)、瑞士假單胞菌(P.reinekei)MLMI(C5MR76)、黑胡桃鏈霉菌(S.nogalater)SnoB(P54259)、結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)Rv0793(086332)或IDN0:5、6或7中列出的序列具有約60%或更高同一性(例如，約60%、61%、62%、63%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性)的多肽。在一些實施方案中，該多肽與SEQIDNO:5、6或7中列出的序列具有約70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性。2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶(例如，二羥基戊基苯甲酸環(huán)化酶)的修飾重組宿主細(xì)胞可以進(jìn)一步修飾來表達(dá)編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的外源多核苷酸，所述酶催化香葉基-焦磷酸283-285;1998)中所述的香葉基焦磷酸：二羥基戊基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶(GOT;EC8117-8126;2008)所述的。在一些實施方案中，異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是來自肉桂鏈霉菌遺傳修飾來表達(dá)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的宿主細(xì)胞可以是如以下部分中[0066]再在其他實施方案中，本發(fā)明提供了在分批過程或補(bǔ)料-分批過程中將工程化宿源多核苷酸；和(iv)編碼催化香葉基-焦磷酸與二羥基戊基苯甲酸或二羥基戊基苯甲酸類似物(例如，2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸)偶聯(lián)以形成大麻素化合物的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的第[0068]5-碳戊烯醇類(戊烯醇和異戊烯醇)可以通過幾種酶轉(zhuǎn)化到單磷酸水平并且之前通過另外表達(dá)的酶轉(zhuǎn)化到二磷酸水平，隨后其偶聯(lián)以通過GPP合酶獲得10-碳香葉基-二磷基因從其獲得的幾種生物體中，包括大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、豆科根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)、賀氏火球菌(Pyrococcushorikoshii)、釀酒酵母(S.cerevisiae)和玉米種。[0069]通過使用異戊烯基二磷酸合酶或異戊烯基磷酸激酶獲得進(jìn)一步磷酸化至二磷酸水平，參見美國專利No.6,235,514。在一些實施方案中，通過使用嗜酸嗜熱單胞菌(Thermoplasmaacidophilum)、甲烷嗜熱自養(yǎng)菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、詹氏甲烷菌(Methano-caldococcusjannaschii)、Menthaxpiperita或芒果(Mangiferaindica)氨基酸序列，或具有激酶活性的其他同源序列來衍生編碼這種酶或更多活性變體的化學(xué)合成基因。[0070]還可以通過將香葉醇磷酸化至單磷酸水平的激酶，接著通過產(chǎn)生香葉基-二磷酸的第二激酶來產(chǎn)生10-碳香葉基-二磷酸。在一些實施方案中，通過法呢醇激酶(FOLK)來進(jìn)行第一激酶事件(Fitzpatrick,Bhandari和Crowell,2011;PlantJ.2011年6月；66(6):1078-88)。這種激酶源自對5-碳戊烯醇磷酸化的生物體的已知氨基酸序列或突變體，所述生物體包括植物(擬南芥、亞麻薺(Camelinasativa)、Capsellarubella、Noccaeacaerulescens等)和真菌(白色念珠菌(Candidaalbicans)、Talaromycesatroroseus等)。[0071]通過使用突變的異戊烯基單磷酸激酶(IPK)實現(xiàn)香葉基-磷酸進(jìn)一步磷酸化至香葉基-二磷酸水平。據(jù)報道IPK中的突變(Val73、Val130、Ile140)產(chǎn)生增強(qiáng)的香葉基-磷酸激酶活性(Mabanglo等，2012)。這種激酶源自細(xì)菌或古細(xì)菌種的已知氨基酸序列或突變體，包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)和嗜酸嗜熱單胞菌(Thermoplasmaacido[0072]在一些實施方案中，用于異戊烯酶香葉基二磷酸：二羥基戊基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶的DNA構(gòu)建體編碼野生型或具有酵母優(yōu)選密碼子的突變體酶。在其他實施方案中，使用編碼具有寬松底物特異性的細(xì)菌(例如，鏈霉菌)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的DNA構(gòu)建體(Kumano等，[0073]在一些實施方案中，宿主細(xì)胞包含一個或多個選自以下三個外源多核苷酸的另外的外源多核苷酸：編碼戊烯醇和異戊烯醇激酶的外源多核苷酸；編碼在外源戊烯醇和異戊烯醇存在下生長時產(chǎn)生二甲基烯丙基焦磷酸和異戊烯基焦磷酸的激酶的外源多核苷酸；和編碼香葉基-焦磷酸合酶的外源多核苷酸。[0074]與之前描述的用于在酵母中基于重組DNA產(chǎn)生大麻素的方法相反，本發(fā)明的一些實施方案基于戊烯醇和異戊烯醇的高水溶性以及產(chǎn)生高水平表達(dá)異源激酶的重組宿主細(xì)胞的能力，所述激酶可以將這些5-碳化合物磷酸化至二磷酸水平，并由于帶電的二磷酸部戊烯醇異戊烯醇[0076]在一些實施方案中，根據(jù)圖1中所示的示意圖，隨后通過內(nèi)源性或異源表達(dá)的香葉基-焦磷酸合酶(GPP合酶)的作用將所得的二磷酸縮合以形成香葉基-二磷酸(或焦磷酸鹽)。這隨后可用于通過野生型或優(yōu)選更高活性的突變體芳族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的作用與2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸縮合以形成大麻萜酚酸或大麻萜酚酸類似物。[0077]在其他實施方案中，香葉醇自身通過異源表達(dá)的激酶的作用轉(zhuǎn)化以形成香葉基-焦磷酸，其隨后通過野生型異戊烯基轉(zhuǎn)移酶或突變異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的作用與二羥基戊基苯甲酸或二羥基戊基苯甲酸類似物(例如，2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸)偶聯(lián)以形成大麻萜酚酸或大麻萜酚酸類似物。[0078]在一些實施方案中，宿主細(xì)胞進(jìn)一步修飾來表達(dá)CBDA合酶(EC1.21.3.8)、THCA合[0079]工程化宿主細(xì)胞[0080]可以使用任何方法將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中。在一些實施方案中，編碼兩種或2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶(例如，二羥基戊基苯甲酸環(huán)化酶)中的兩種)的外源多核苷酸存在于同一表達(dá)構(gòu)建體中，例如，自主復(fù)制表達(dá)載體，并表達(dá)為多順反子RNA,其中表達(dá)通過同一啟動子驅(qū)動。因此，例如，在一些實施方案中，編碼二羥基戊基苯甲酸合酶的外源多核苷酸和編碼2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸環(huán)化酶(例如，二羥基戊基苯甲酸環(huán)化酶)的外源多核苷酸包含在同一表達(dá)構(gòu)建體中，例如，自主復(fù)制表達(dá)載體，并且通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)分隔，使得表達(dá)通過同一啟動子來驅(qū)動以產(chǎn)生二順反子mRNA。在一些實施方案中，啟動子是醇脫氫酶-2啟動子。在一些實施方案中，外源多核苷酸存在于同一表達(dá)構(gòu)建體核苷酸存在于兩個或更多個表達(dá)構(gòu)建體中，例如，自主輔助表達(dá)載體。在一些實施方案中，自主復(fù)制表達(dá)載體是酵母人造染色體。在一些實施方案中，外源多核苷酸中的一個或多個整合至宿主基因組中。在一些實施方案中，通過逆轉(zhuǎn)座子整合將多個外源多核苷酸引入宿主細(xì)胞中。[0081]在一些實施方案中，使用在宿主內(nèi)表達(dá)的二羥基戊基苯甲酸或二羥基戊基苯甲酸類似物產(chǎn)生大麻素化合物，例如，如之前段落中所述的，并且宿主細(xì)胞進(jìn)一步修飾來表達(dá)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶、戊烯醇和異戊烯醇激酶；在外源戊烯醇和異戊烯醇存在下生長時產(chǎn)生二甲基烯丙基焦磷酸和異戊烯基焦磷酸的激酶；或如本文所述的編碼香葉基-焦磷酸合酶的多核苷酸。這樣的多核苷酸可以包含在相同或單獨的表達(dá)載體中，如之前段落中所述的。[0082]在一些實施方案中，修飾的重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼大麻素合酶的外源多核苷酸，所述酶催化宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的第一大麻素化合物中間體的轉(zhuǎn)化以形成第二大麻素化[0083]宿主細(xì)胞[0084]在一些實施方案中，宿主細(xì)胞是酵母或絲狀真菌宿主細(xì)胞，如曲霉屬宿主細(xì)胞?？梢杂米魉拗骷?xì)胞的酵母屬包括，但不限于，酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)和發(fā)夫酵母屬酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、加拿大畢赤酵母(P.canadensis)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、紅發(fā)夫酵母(Phaffiarhodozyma)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。可以用作宿主細(xì)胞的絲狀真菌屬包括，但不限于，枝頂胞屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)、Chrysoporium、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、棒囊殼菌屬孢屬(Fusarium)、赤霉菌屬(Gibberella)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、毛霉菌屬(Mucor)、新美鞭菌屬(Neocallimastix)、鐮孢霉屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、毛平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、梨囊鞭菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、Scytaldium、裂褶菌屬(Schizophyllum)、側(cè)孢霉屬(Sporotrichum)、籃狀菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes禾赤鐮孢菌(Fusariumgraminum)、Fusarisarcochroum)、分枝鐮孢菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢菌(Fusarium繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、黃孢原毛平革菌(Phanerochaete(Trichodermareesei)和綠色木霉(Trichodermaviride)。[0087]用于驅(qū)動基因在釀酒酵母和其他酵母中的轉(zhuǎn)錄的啟動子是本領(lǐng)域公知的并且包[0088]在一些實施方案中，外源多核苷酸中的一個或多個可操作地連接葡萄糖調(diào)節(jié)的啟動子。在一些實施方案中，通過醇脫氫酶-2啟動子驅(qū)動外源多核苷酸中的一個或多個的表[0089]其他啟動子以組成型方式強(qiáng)烈驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。這樣的啟動子包括，不限于，用于高度表達(dá)的酵母糖酵解酶的控制元件，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)和醇脫氫酶-1(ADH1)?？梢允褂玫牧硪环N強(qiáng)組成型啟動子是來自釀酒酵母轉(zhuǎn)錄延伸因子EF-1α基因(TEF1)的啟動子(Partow等，Yeast.2010,[0090]在其他實施方案中，宿主細(xì)胞可以通過增加前體池等來提高大麻素產(chǎn)量。可以將異源的天然或化學(xué)合成的用于酶(如丙二酰-CoA合酶、乙酰-CoA羧化酶、乙酰-CoA合酶-1和-2)的基因、來自酵母或其他真核物種的甲羥戊酸途酶、甲羥戊酸激酶、突變法呢基-焦磷酸合酶)(EGR20;Zhao等，2016)引入高水平表達(dá)質(zhì)粒載體上或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法通過基因組整合引入。這樣的方法可包括CRISPRCas-9技術(shù)、酵母人工染色體(YAC)或使用逆轉(zhuǎn)座子。或者，如果對于宿主生物體是天然的，這些基因可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的遺傳元件整合方法來上調(diào)。[0091]在再其他方面中，可以使用相似的工程化來降低利用碳源的天然產(chǎn)物(例如，乙醇)的產(chǎn)生，其導(dǎo)致用于大麻素生產(chǎn)的碳源利用降低。這樣的基因可以通過刪除從基因組中[0092]更多的實施方案包括針對輔助最終產(chǎn)物大麻素產(chǎn)生的輔助酶的基因。一種這樣的酶，過氧化氫酶，能夠中和參與CBGA和類似物的氧化環(huán)化的某些酶(如，大麻二醇酸合酶(Taura等，2007)、△?-四氫大麻酚酸合酶(Sikikantaramas等，2004)和大麻二烯酸合酶[0093]在更多的實施方案中，工程化的宿主細(xì)胞含有上調(diào)或下調(diào)的內(nèi)源或異源基因以優(yōu)化，例如，用于大麻素生物合成的前體池?？梢员磉_(dá)另外的更多異源基因產(chǎn)物以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生“輔助”功能。例如，可以表達(dá)超表達(dá)的過氧化氫酶以將氧化-領(lǐng)域公知的技術(shù)，通過整合至酵母基因組中來提供，或可以從質(zhì)粒(也稱為酵母表達(dá)載體)、酵母人工染色體(yACht)或酵母轉(zhuǎn)座子表達(dá)。[0094]在一些實施方案中，將用含有以上每種基因的質(zhì)?；蜉d體轉(zhuǎn)化或遺傳整合的宿主細(xì)胞(例如，酵母菌株)與另一表達(dá)系統(tǒng)一起轉(zhuǎn)化用于將CBGA或CBGA類似物轉(zhuǎn)化成第二酸性大麻素，如以下進(jìn)一步解釋的。在一些這樣的實施方案中，表達(dá)系統(tǒng)在同一載體或單獨的載體上，或整合至宿主細(xì)胞基因組中。[0095]本發(fā)明的產(chǎn)生大麻素的工程化細(xì)胞可以使用編碼工程化代謝途徑中涉及的酶的至少一個核苷酸序列，通過基因組整合或使用游離體質(zhì)粒(也稱為表達(dá)載體，或簡稱為載一些實施方案中，核苷酸序列是密碼子優(yōu)化的以反映宿主細(xì)胞的典型密碼子使用而不改變改變核酸序列的密碼子內(nèi)容而不改變核酸編碼的多肽序列以增強(qiáng)在特定宿主細(xì)胞中的表達(dá)。在某些實施方案中，該術(shù)語表示包括改變核酸序列的密碼子內(nèi)容作為控制多肽表達(dá)水平(例如，提高或降低表達(dá)水平)的手段。因此，描述了編碼參與工程化代謝途徑的酶的核酸序列。在一些實施方案中，代謝工程化細(xì)胞可以表達(dá)一個或多個具有進(jìn)行以下所述步驟所需的酶活性的多肽。在一些實施方案中，根據(jù)美國專利No.7,561,972中所述的，核苷酸序列被合成并針對在酵母中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。每一個編碼產(chǎn)生本文所述的大麻素化合物或大麻素化合物中間體所需的多肽。或者，單個核酸分子可以編碼一個或超過一個多肽。例如，單個核酸分子可以含有編碼兩個、三個、四個或甚至五個不同的多肽的核酸序列。本文所述的可用于本發(fā)明的核酸序列可以獲自各種序列隨后可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和/或重組DNA技術(shù)來修飾以產(chǎn)生具有所需修飾的核酸用限制性酶的序列部分的交換(任選與連接結(jié)合)、同源重組、位點特異性重組或其各種組合。在其他實施方案中，核酸序列可以是合成的核酸序列。可以使用美國專利No.7,323,320以及美國專利申請公開No.2006/0160138和2007/0269870中所述的各種方法來產(chǎn)生合成的多核苷酸序列。酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域公知的。[0097]IV.用于大麻素表達(dá)的方法[0099]根據(jù)本文提供的方法的大麻素生產(chǎn)通常包括培養(yǎng)經(jīng)工程化以包含上述表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞(例如，酵母或絲狀真菌)。在一些實施方案中，用于酵母生長的碳源是糖，如葡的碳源可以是甲醇、丙三醇、乙醇或醋酸鹽(酯)。在一些實施方案中，通過實驗來精煉原料組合物以提供最佳的酵母生長和最終大麻素生產(chǎn)水平，如使用如HPLC的分析技術(shù)測量的。在這樣的實施方案中，方法包括利用葡萄糖/乙醇或葡萄糖/醋酸鹽混合物，其中葡萄糖與2-碳源(乙醇或醋酸鹽)的摩爾比在50/50、60/40、80/20或90/10的范圍之間。進(jìn)料經(jīng)優(yōu)化以誘導(dǎo)葡萄糖調(diào)節(jié)啟動子并使生產(chǎn)菌株中的乙酰-CoA和丙二酰-CoA前體的產(chǎn)生最大化。[0100]在本發(fā)明的其他方面中，二羥基戊基苯甲酸或其類似物可以通過化學(xué)合成獲得，或可以在重組生產(chǎn)系統(tǒng)中生物合成。在一些實施方案中，二羥基戊基苯甲酸在與包含用于大麻素生產(chǎn)的代謝途徑的相同酵母細(xì)胞株中高水平地產(chǎn)生。用于酵母中的單環(huán)聚酮芳族化合物的高水平產(chǎn)生系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，參見美國專利No.9,637,763。在其他實施方案中，來自產(chǎn)生高水平二羥基戊基苯甲酸或其類似物的酵母株的培養(yǎng)基可以被濃縮并且用作用于大麻素生產(chǎn)的MPF程序中的高相容性原料。[0101]由于碳利用途徑或表達(dá)控制模式的差異，發(fā)酵方法可以適應(yīng)于特定的酵母菌株。例如，酵母屬酵母發(fā)酵可能需要單一葡萄糖進(jìn)料、復(fù)合氮源(例如，酪蛋白水解產(chǎn)物)和多種維生素補(bǔ)充。這與甲基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母不同，其對于最佳生長和表達(dá)可能需要甘油、甲醇和微量礦物質(zhì)進(jìn)料，但只需要簡單的銨(氮)鹽。參見，例如，Elliott等，Biotechnol.Bioeng.(1987)29:11131121。培養(yǎng)基可以含有如酵母提取物、蛋白胨等的組[0102]在一些實施方案中，控制葡萄糖添加至發(fā)酵器中的速率，使得葡萄糖添加的速率大致等于酵母消耗葡萄糖的速率；在這樣的條件下，葡萄糖或乙醇的量不會明顯累積。在這樣的情況中，葡萄糖添加的速率可以取決于包括，但不限于，特定的酵母菌株、發(fā)酵溫度和發(fā)酵設(shè)備的物理尺寸的因素。[0103]對于MPF程序，在分批模式中，前體二羥基戊基苯甲酸(或二羥基戊基苯甲酸類似物，如另一種2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸)、戊烯醇、異戊烯醇或香葉醇可以以0.1至50g/ml的濃度存在(例如，1至10g/L)。在補(bǔ)料-分批模式中，前體可以在2至20個小時中緩慢進(jìn)料到發(fā)酵中，使得每種必需的前體存在1至100g/L(例如，1至10g/L,或10至100g/L)的最終添加。如，1至10g/L)。在補(bǔ)料-分批模式中，羧酸可以在2至20個小時中緩慢加入發(fā)酵中，使得羧酸存在1至100g/L(例如，1至10g/L,或10至100g/L)的最終添加。[0105]可以控制培養(yǎng)條件，如表達(dá)時間、溫度和pH,使得以高產(chǎn)量獲得目標(biāo)大麻素中間體材料(如己酸、戊烯醇、異戊烯醇等)存在下，根據(jù)所用的特定宿主細(xì)胞在約20℃至約40℃的溫度范圍中培養(yǎng)幾小時至一天或更長的時間(例如，24小時、30小時、36小時或48小時)。例如，釀酒酵母可以在25-32℃下培養(yǎng)24-40小時(例如，30小時)。培養(yǎng)基的pH可以通過添加酸、堿和/或緩沖劑維持在特定水平。在某些實施方案中，在6或更高pH下培養(yǎng)酵母可以降低不合需要的副產(chǎn)物如3,5-二羥基戊苯的產(chǎn)生。在一些實施方案中，酵母培養(yǎng)的pH范圍為約6至約8。在一些實施方案中，酵母培養(yǎng)的pH為約6.5。在一些實施方案中，酵母培養(yǎng)的p[0106]在一些實施方案中，重組酵母細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，使得其在如上所述的含合適前體的培養(yǎng)基中體內(nèi)培養(yǎng)時以至少約0.1g/L,至少約0.5g/L,至少約0.75g/L,至少約1g/L,至少約1.5g/L,至少約2g/L,至少約2.5g/L,至少約3g/L,至少約3.5g/L,至少約4g/L,至少約4.5g/L,至少約5g/L,至少約5.5g/L,至少約6g/L,至少約7g/L,至少約8g/L,至少約9g/L或至少約10g/L的水平產(chǎn)生目標(biāo)大麻素產(chǎn)物或中間體。在一些實施方案中，重組酵母細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以使得其在合適的培養(yǎng)基中體內(nèi)培養(yǎng)時以至少約20g/L,至少約30g/L,至少約50g/L或至少約80g/L的水平產(chǎn)生目標(biāo)大麻素產(chǎn)物或中間體。[0107]可以在允許細(xì)胞生長和/或孵育的任何容器中進(jìn)行大麻素生產(chǎn)。例如，反應(yīng)混合物養(yǎng)燒瓶、發(fā)酵器或用于細(xì)胞生長或孵育的其他容器?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物分離生物產(chǎn)生的目標(biāo)產(chǎn)物。例如，可以通過離心或過濾除去固體或細(xì)胞[0108]2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化成大麻素產(chǎn)物[0109]本文還提供了用于生產(chǎn)大麻素產(chǎn)物的方法。在一些實施方案中，所述方法包括在酵母細(xì)胞中表達(dá)大麻素起始材料，其中酵母細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾來表達(dá)大麻素起始材料，分離酵母細(xì)胞并在分離的酵母細(xì)胞中將大麻素起始材料轉(zhuǎn)化成大麻素產(chǎn)物。大麻素起始材料可以是酸性大麻素、中性大麻素或大麻素前體，如二羥基戊基苯甲酸或另一種2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸?？梢允褂帽疚乃龅某绦?例如，化學(xué)或酶促香葉基化、熱或促酶脫羧化等)來進(jìn)行大麻素起始材料轉(zhuǎn)化或可以根據(jù)特定大麻素起始材料或特定大麻素產(chǎn)物的性質(zhì)來進(jìn)行改變。例如，可以使用上述的任一種表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)大麻素起始材料。分離酵母細(xì)胞可以任選地包括：通過離心、過濾或其他方式從培養(yǎng)基收集酵母細(xì)胞；洗滌酵母細(xì)胞來除去培養(yǎng)基或其他組分；從細(xì)胞除去至少一部分液體(例如，培養(yǎng)基);和/或干燥細(xì)胞(例如，通過冷凍干燥或其他方式)。分離的酵母細(xì)胞可以直接經(jīng)受用于形成大麻素產(chǎn)物的反應(yīng)條件。例如，可以將酵母細(xì)胞與溶劑和其他試劑直接組合，[0110]在一些實施方案中，所述方法包括在其中產(chǎn)生2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸的條件下培養(yǎng)包含如上所述的表達(dá)系統(tǒng)的修飾重組宿主細(xì)胞，并將2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化成大麻素產(chǎn)物。在一些實施方案中，所述方法包括在其中產(chǎn)生二羥基戊基苯甲酸的條件下培養(yǎng)包含如上所述的表達(dá)系統(tǒng)的修飾重組宿主細(xì)胞，并將二羥基戊基苯甲酸轉(zhuǎn)化成大麻[0111]在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化步驟在體外進(jìn)行。例如，轉(zhuǎn)化步驟可以包括在足以產(chǎn)生酸性大麻素(例如，大麻萜酚酸，CBGA)的條件下形成包含2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸(例如，二羥基戊基苯甲酸)、香葉醇和有機(jī)溶劑的反應(yīng)混合物。該方法可以用于將二羥基戊基苯甲酸類似物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酸性大麻素。[0112]任何合適的有機(jī)溶劑可以用于本發(fā)明的方法中。合適的溶劑包括，但不限于，甲苯。還可以使用含水有機(jī)溶劑混合物(即，水和水混溶性有機(jī)溶劑如四氫呋喃或二甲基甲酰胺的混合物)。通常，溶劑與2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸的比率范圍以重量計為約1:1至約1000:1。溶劑與2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸的比率以重量計可以為例如約100:1,或約10:1,或約5:1。在某些實施方案中，2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸存在于酵母混合物中(例如，干燥的酵母細(xì)胞，或從培養(yǎng)物收集的濕酵母細(xì)胞沉淀物)。在一些這樣的實施方案中，反應(yīng)混合物包含宿主細(xì)胞(例如，干燥的酵母細(xì)胞)。溶劑與酵母混合物(例如，干燥的酵母細(xì)胞)的比率范圍可以為約1:1至約1000:1,以重量計。溶劑與酵母混合物的比率可以為例如約100:1,或約10:1,或約5:1,或約2:1,以重量計。[0113]任何合適量的香葉醇可以用于轉(zhuǎn)化步驟中。通常，相對于2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸，反應(yīng)混合物含有至少一摩爾分子當(dāng)量的香葉醇。相對于2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸，反應(yīng)混合物可以含有例如約1摩爾當(dāng)量至約10摩爾當(dāng)量的香葉醇(例如，約1.1摩爾當(dāng)量，或約酯、甲磺酸香葉基酯等)也可以用于轉(zhuǎn)化步驟中。[0114]在一些實施方案中，反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含酸。任何合適的酸可以用于轉(zhuǎn)化步驟任何合適量的酸可以用于轉(zhuǎn)化步驟中。通常，相對于2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸，反應(yīng)混合物含有約0.01摩爾當(dāng)量的酸(例如，對甲苯磺酸)至約10摩爾當(dāng)量的酸。例如，相對于2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸，反應(yīng)混合物可以含有約1摩爾當(dāng)量至約10摩爾當(dāng)量的香葉醇(例如，約0.01摩爾當(dāng)量，或約0.1摩爾當(dāng)量)。[0115]轉(zhuǎn)化步驟可以在任何合適的溫度下進(jìn)行。通常，轉(zhuǎn)化步驟在約20℃至約200℃的溫度范圍下進(jìn)行，例如，約25℃至約100℃,或約25℃至約80℃,或約25℃至約70℃。轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行足以將2-烷基-4,6-二羥基苯甲酸轉(zhuǎn)化成大麻素產(chǎn)物(例如，將二羥基戊基苯甲酸轉(zhuǎn)化態(tài)(例如，存在于酵母混合物中)的因素，轉(zhuǎn)化時間范圍為幾分鐘到幾小時。在一些實施方案中，反應(yīng)混合物在約25℃至約100℃范圍的溫度(例如，約60℃)下維持約5分鐘至約360分鐘范圍的時間。在一些實施方案中，反應(yīng)混合物在60℃或約60℃下維持60分鐘或更短時間(例方法進(jìn)一步包括將酸性大麻素(例如，CBGA)轉(zhuǎn)化成大麻素產(chǎn)物。最終的大麻素產(chǎn)物可以是中性大麻素或另一酸性大麻素。在一些實施方案中，通過物理或化學(xué)過程，如加熱、自氧化或UV光處理來進(jìn)行中間體化合物(如CBGA)轉(zhuǎn)化成另一種大麻素的轉(zhuǎn)化。例如，所述方法可以包括酸性大麻素的脫羧(在工程化酵母細(xì)胞內(nèi)或在其完全或部分純化后通過熱的作用或通過在體內(nèi)或體外接觸大麻酸的野生型或突變脫羧酶的作用)。酸性大麻素的脫羧提供了[0117]在一些實施方案中，使用UV光處理、加熱、氧化或其他反應(yīng)條件以使得第一中間體重組DNA來源的大麻素產(chǎn)物保留在酵母細(xì)胞內(nèi)并且隨后轉(zhuǎn)化成以商業(yè)規(guī)模分離和純化的第二有價值的大麻素產(chǎn)物。[0118]可以對形成的大麻素進(jìn)行其他化學(xué)轉(zhuǎn)化以制備完全非天然的類似物，如酯、醚和鹵化的衍生物，用作前藥或者更有活性的或生物可利用的藥物物質(zhì)。在一些實施方案中，可以對帶有生物合成的大麻素底物的整個酵母細(xì)胞進(jìn)行這種化學(xué)作用以避免在形成所需的終產(chǎn)物前的非必要純化步驟。[0119]還在其他實施方案中，描述了在相同的工程化宿主細(xì)胞內(nèi)或通過與兩種或更多種重組宿主細(xì)胞株(例如，酵母菌株)共培養(yǎng)，通過野生型或突變大麻素或大麻酸合酶的作用將第一中間體大麻素轉(zhuǎn)化成第二大麻素的方法。[0120]如以上解釋的，在一些實施方案中，用含有以上每種基因的質(zhì)粒或載體轉(zhuǎn)化或基因組整合的宿主細(xì)胞(例如，酵母菌株)用用于將CBGA或CBGA類似物轉(zhuǎn)化成第二酸性大麻素的另一表達(dá)系統(tǒng)一起轉(zhuǎn)化。在一些這樣的實施方案中，表達(dá)系統(tǒng)在同一載體上或在單獨的載體上，或整合至宿主細(xì)胞基因組中。在其他實施方案中，用于轉(zhuǎn)化活性的表達(dá)系統(tǒng)編碼大麻酶THCA合酶、CBDA合酶或CBCA合酶中的一種。在一些實施方案中，合酶是來自啤酒花大麻素保持在升高的溫度(例如，約40℃、50℃或100℃)下幾分鐘到幾小時的時間將酸性大麻素脫羧。[0122]本文說明性描述的本發(fā)明可以在不存在本文沒有具體描述的任何一個或多個要素、一個或多個限制的情況下合適地實施。因此，例如，在本文中的每種情況中，術(shù)語“包主細(xì)胞。已經(jīng)使用的術(shù)語和表述用作描述而非限制的術(shù)語，并且在使用這些術(shù)語和表述時，無意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是應(yīng)認(rèn)識到，在所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進(jìn)行各種修改。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管已經(jīng)通過優(yōu)選實施方案和任何特征具體地公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本文公開的概念進(jìn)行修改和變化，并且認(rèn)為這樣的修改和變化在由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。[0123]前述書面描述認(rèn)為足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。提供以下實施例僅用于說明性目的，而無意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實際上，除了本文中示出和描述的那些之外，根據(jù)前面的描述，本發(fā)明的各種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得顯而易見，并且落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。[0124]在已經(jīng)參考專利說明書、其他外部文件或其他信息源的本說明書中，這通常是出于提供討論本發(fā)明的特征的背景的目的。除非另有特別說明，否則對此類外部文件的引用不應(yīng)解釋為承認(rèn)此類文件或此類信息源在任何管轄范圍內(nèi)都是現(xiàn)有技術(shù)，或構(gòu)成本領(lǐng)域公知常識的部分。本說明書中引用的所有專利、專利申請和文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)均按引用全文并入[0126]提供以下實施例來說明但不是限制所要求保護(hù)的本發(fā)明。[0128]釀酒酵母ADH2啟動子化學(xué)合成并且與用于來自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)的突變細(xì)菌NphB基因的合成基因融合。基因連接用于釀酒酵母ERG20的合成基因，其具有用于釀酒酵母p150內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)序列的合成序列。釀酒酵母終止子序列也與基因序列融合，緊接在ERG20基因的終止密碼子后。表達(dá)盒克隆至含有URA3選擇標(biāo)記的酵母表達(dá)載體中。相似地，編碼釀酒酵母羥乙基噻唑激酶和嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)異戊烯基磷酸激酶突變體(V73I+Y141V+K203G)基因的基因(也與釀酒酵母p150內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)連接)克隆至含有用于在色氨酸缺乏培養(yǎng)基中生長的選擇標(biāo)記的酵母表達(dá)載體中。釀酒酵母終止子序列也與這個雙順反子序列融合，緊接在嗜酸熱原體異戊烯基磷酸激酶突變基因的終止密碼子后。[0129]用表達(dá)載體順序轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母InvSc1(MATahis3D1leu2trp1-289ura3-52)(Invitrogen)細(xì)胞，并隨后接種于最低瓊脂板(1.7g/L不含氨基酸或硫酸銨的酵嘧啶和色氨酸原養(yǎng)型的選擇。挑選轉(zhuǎn)化體并在尿嘧啶-和色氨酸-缺乏最低培養(yǎng)基中生長24小時。從轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA并通過限制性消化分析來進(jìn)行分析以確認(rèn)身份。[0130]將成功的轉(zhuǎn)化體用于接種2mL尿嘧啶缺乏的最低培養(yǎng)基并在軌道搖床中在30℃下生長過夜。將500μL等份的這種培養(yǎng)物用于接種50mLYEPD培養(yǎng)基(Wobbe,CurrentProtocolsinMolecularBiology,增刊34:13.0.1-13.13.9(Wiley,1996))(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖),并將培養(yǎng)物在二羥基戊基苯甲酸(10g/L)、戊烯醇(10g/L)和異戊烯醇(10g/L)的存在下在搖床中在30℃下生長。[0132]通過與薄層色譜(TLC)板上的已知標(biāo)準(zhǔn)品比較，以及通過HPLC來鑒定從酵母上清[0134]將以上實施例1中所述的質(zhì)粒順序轉(zhuǎn)化至酵母菌株[0135]將轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在包含具有2%葡萄糖的YEPD培養(yǎng)基的搖瓶中生長48和72小[0136]通過在薄層色譜(TLC)板上與已知標(biāo)準(zhǔn)品比較以及通過HPLC來鑒定從酵母上清液