第十七章重組DNA技術(shù)PaulBergHerbertBoyerStanleyCohen1.1972年P(guān)aulBerg和他的同事將λ噬菌體基因和大腸桿菌乳糖操縱子插入猴病毒SV40DNA中，首次構(gòu)建出DNA的重組體（recombinant）。2.第二年（1973），StanleyCohen和HerbertBoyer將細(xì)菌質(zhì)粒通過體外重組后導(dǎo)入宿主大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)繁殖得到基因的分子克隆(molecularcloning)，由此產(chǎn)生了基因工程。3.1983年K.M.Ulmer最早提出蛋白質(zhì)工程這個(gè)名詞，隨即被學(xué)術(shù)界廣泛采用。蛋白質(zhì)工程又稱為第二代基因工程第一節(jié)DNA克隆基礎(chǔ)DNA克?。喊◤拇蠖稳旧w上分離出特定基因或DNA片段，將其連接到一個(gè)小分子的DNA載體上，然后通過細(xì)胞的增殖及每個(gè)細(xì)胞中克隆DNA的增殖，使修飾過的DNA成百上千倍地復(fù)制，從而使特定的基因或DNA片段得到選擇性的擴(kuò)增。任何生物的DNA擴(kuò)增都需要5個(gè)基本步驟，如右圖所示。一、限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶構(gòu)建重組DNA在DNA重組技術(shù)方面起重要作用的酶二、克隆載體使插入的DNA片段擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室中常用的3類克隆載體：質(zhì)粒、病毒和細(xì)菌人工染色體（一段能自主復(fù)制的染色體DNA）。（一）質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是獨(dú)立于宿主染色體外能夠復(fù)制的環(huán)狀DNA分子。轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)化（transformation）過程導(dǎo)入?？梢詫⒓?xì)胞與質(zhì)粒DNA共同置于0?C的氯化鈣溶液中，然后迅速轉(zhuǎn)到37~43?C予以刺激，使宿主細(xì)胞接納DNA。或者，與質(zhì)粒DNA一起孵育的細(xì)胞用高壓脈沖加以刺激，這種方法稱為電穿孔法（electroporation），能在短時(shí)間讓大分子進(jìn)入細(xì)胞。篩選：無論用何種方法，實(shí)際上只有少量細(xì)胞可接納質(zhì)粒DNA，所以需要對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行篩選。常用的方法是：保證質(zhì)粒含有一個(gè)宿主細(xì)胞在特定情況下生長所需的基因，例如，一個(gè)能使細(xì)菌對(duì)抗生素抵抗的基因。最常用的抗生素抗性基因，如氨芐青霉素抗性基因（ampr）、四環(huán)素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（cmr）及卡那霉素抗性基因（kanr）。只有被轉(zhuǎn)化過的、含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞才可以在這種抗生素存在的環(huán)境下生長，這樣利用抗生素就可以篩選出含這些質(zhì)粒的細(xì)胞。這種基因有時(shí)被稱為選擇性標(biāo)記基因。（二）噬菌體(bacteriophage)λ噬菌體可以十分有效地將其48502bp的DNA導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)，因此可用來克隆相對(duì)較大的DNA片段。它的兩個(gè)重要特征有利于這方面的應(yīng)用：1.在整個(gè)λ噬菌體基因組中，大約1/3的染色體DNA序列對(duì)于噬菌體的復(fù)制和裝配來說是非必需的，因此可用外源DNA來取代它們。此時(shí)，λ噬菌體攜帶外源DNA一起增殖，起到載體的作用。2.只有介于40000-53000bp之間的DNA才能被包裝成為有感染性的噬菌體顆粒，這一限制可使得僅僅那些重組DNA被包裝。以λ噬菌體載體克隆DNA圖解（三）細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome）細(xì)菌人工染色體（BAC）是專門為了克隆大片段DNA而設(shè)計(jì)的簡單質(zhì)粒。這個(gè)質(zhì)粒只包含選擇性標(biāo)記如氯霉素抗性（CmR）)和一個(gè)非常穩(wěn)定的復(fù)制原點(diǎn)（ori），用于保證每個(gè)細(xì)胞中有1~2個(gè)拷貝?？蓪㈤L達(dá)數(shù)百萬堿基對(duì)的DNA片段克隆到BAC載體中，然后用電穿孔的方法將大的環(huán)狀DNA導(dǎo)入到宿主菌中。用于重組BAC的宿主菌細(xì)胞壁成分產(chǎn)生了突變，從而使得攝取大分子DNA變得容易。利用細(xì)菌人工染色體（BAC）克隆三、基因的分離從事一項(xiàng)基因工程，通?？傄全@得目的基因。利用限制酶切割生物基因組DNA，然后用適當(dāng)方法?？煞蛛x到所需要的基因片段。倘若基因的序列是已知的，可以用化學(xué)方法合成，或者用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由模板擴(kuò)增出該基因。此外，最常用并且無需已知序列的方法是建立一個(gè)基因文庫（genomiclibrary)或cDNA文庫（cDNAlibrary），從中篩選出目的基因的克隆。（一）基因文庫的構(gòu)建大致可分為五個(gè)步驟：1.染色體DNA的片段化2.載體DNA的制備3.體外連接與包裝4.重組噬菌體感染大腸桿菌5.基因文庫的鑒定和擴(kuò)增（二）cDNA文庫的構(gòu)建構(gòu)建cDNA文庫的基本步驟與上述基因文庫的構(gòu)建十分相似1.首先從特定個(gè)體或細(xì)胞中提取mRNA2.以mRNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA（complementaryDNA,cDNA）3.制備載體DNA4.雙鏈cDNA的分子克隆5.對(duì)構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行鑒定，測定文庫包含的克隆數(shù)，抽查克隆的質(zhì)量和異質(zhì)性，如果需要可適當(dāng)擴(kuò)增。（三）克隆基因的分離與鑒定1.基于載體特征的直接選擇2.細(xì)菌菌落或噬菌斑的原位雜交3.PCR法4.免疫化學(xué)法5.受體／配體的結(jié)合性質(zhì)6.Southwestern/Northwestern印跡法7.DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析法8.DNA序列分析法從一個(gè)龐大的克隆文庫中分離出感興趣的基因，這是一項(xiàng)難度很大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作?；谳d體的特征或目的基因的序列或基因的產(chǎn)物，已經(jīng)發(fā)展出一系列行之有效的方法：（四）特定DNA序列的擴(kuò)增如果知道特定基因的部分序列，則可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction;PCR)大量擴(kuò)增該基因的拷貝。PCR是體外酶促擴(kuò)增，故又稱