基因工程基因工程原理：基因重組基因工程過程：目的基因獲取、基因表達(dá)載體構(gòu)建（核心步驟）、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、檢測與鑒定基因工程工具：限制酶、DNA連接酶、載體基因工程工具酶：限制酶、DNA連接酶限制酶 6.DNA連接酶縫合黏性末端和平末端縫合黏性末端和平末端 7.載體 8.DNA連接酶與DNA聚合酶比較①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。9.限制酶的選擇原則選兩種不同的限制酶，且形成不同的末端不能破壞目的基因、啟動子、復(fù)制原點、終止子、標(biāo)記基因（留一種即可）等酶切位點位于啟動子與終止子之間。若有T-DNA片段則酶切位點需位于T-DNA中。不選同一種限制酶的原因：防止目的基因或者質(zhì)粒自身環(huán)化以及目的基因反向連接。10.獲取目的基因的方法（1）基因文庫法①基因組文庫：提取某種生物的全部DNA限制酶切取一定大小的DNA片段導(dǎo)入受體菌中儲存②CDNA文庫：提取某種生物的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA雙鏈DNA導(dǎo)入受體菌中儲存（2）人工合成目的基因：需要一段已知目的基因的核苷酸序列（3）常用PCR特異性地快速擴增目的基因①原理：DNA半保留復(fù)制②酶：耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）：催化子鏈的合成③模板：DNA兩條鏈④原料：脫氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP：提供能量，作為合成DNA的原料）⑤緩沖溶液中Mg2+作用：激活DNA聚合酶⑥引物：2種，2n+1-2個;與模板鏈的3，端結(jié)合⑦PCR擴增3輪可得到完整的目的基因⑧過程：變性（90℃以上）→復(fù)性（55℃左右）→延伸（72℃左右）預(yù)變性作用：使變性更充分。低溫復(fù)性：便于引物與模板鏈結(jié)合⑨PCR產(chǎn)物的鑒定：瓊脂糖凝膠電泳注意：1.凝膠濃度會影響DNA遷移速度，所以根據(jù)DNA分子大小選擇合適濃度的凝膠。2.DNA分子（負(fù)電）的分離不僅取決于電荷性質(zhì)和數(shù)量，也取決于分子大小3.瓊脂糖凝膠中的DNA分子通常在紫外光下才能被檢測出來。4.凝膠載樣緩沖液中指示劑（溴化乙錠）的作用是使DNA在紫外燈下發(fā)出熒光11.基因表達(dá)載體構(gòu)建（核心步驟）（1）構(gòu)建完載體包含五部分：啟動子、終止子、復(fù)制原點、目的基因、標(biāo)記基因（2）啟動子作用：位于基因上游，具有RNA聚合酶識別和結(jié)合位點，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄（3）標(biāo)記基因：篩選含有目的基因的受體細(xì)胞例子：抗四環(huán)素基因（四環(huán)素抗性基因）、抗氨芐青霉素基因(ampr)篩選時向培養(yǎng)基中加入：四環(huán)素、氨芐青霉素12.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）導(dǎo)入動物細(xì)胞：顯微注射技術(shù)（2）導(dǎo)入植物細(xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法（基因槍法）①農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的T-DNA可整合到受體細(xì)胞染色體DNA中，將目的基因插入T-DNA中，導(dǎo)入植物細(xì)胞②酚類物質(zhì)可吸引農(nóng)桿菌，在培養(yǎng)基中加入酚類物質(zhì)可吸引農(nóng)桿菌，受傷的葉片可分泌酚類物質(zhì)。（3）導(dǎo)入微生物細(xì)胞：Ca2+處理法（例：CaCl2）Ca2+處理后微生物細(xì)胞處于可從周圍環(huán)境自動吸收DNA的生理狀態(tài)（感受態(tài)細(xì)胞）13.檢測與鑒定（1）分子水平①目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞：DNA分子雜交技術(shù)②目的基因是否轉(zhuǎn)錄成mRNA：分子雜交技術(shù)③是否翻譯形成蛋白質(zhì)：抗原—抗體雜交技術(shù)（2）個體水平：抗蟲實驗、抗寒實驗14.蛋白質(zhì)工程（第二代基因工程）（1）實質(zhì)：通過改造或合成基因，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)（2）