發(fā)酵工程和細(xì)胞工程

課前學(xué)習(xí)任務(wù)

熱點(diǎn)拓展點(diǎn)

熱點(diǎn)拓展一影印平板培養(yǎng)法

影印平板培養(yǎng)法是一種微生物培養(yǎng)技術(shù)，其通過特定的操作方式，實(shí)現(xiàn)在一系列培養(yǎng)皿的相

同位置上接種并培養(yǎng)出相同遺傳型的菌落。這種方法在微生物學(xué)、基因工程等領(lǐng)域有著廣泛

的應(yīng)用。

把長有許多菌落的母種培養(yǎng)皿倒置于包有一層滅菌絲絨布的木質(zhì)圓柱卬章上，使其均勻地沾

滿來自母培養(yǎng)皿平板上的菌落。然后可把這一“印章”上的菌落一一接種到不同的選擇培養(yǎng)基

平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，對各平板相同位置上的菌落進(jìn)行對比，就可選出適當(dāng)?shù)耐蛔冃途?。?/p>

此通過影印平板培養(yǎng)法，就可以從非選擇性條件下生長的細(xì)菌群體中，分離到過去只有在選

擇性條件下才能分離到的相應(yīng)突變株。

以培養(yǎng)某種大腸桿菌（如轉(zhuǎn)胰島素基因大腸桿菌）為例，選擇具有標(biāo)記基因青霉素抗性基因和

四環(huán)素抗性基因，同時(shí)限制酹切點(diǎn)在青霉素抗性基因內(nèi)部的質(zhì)粒作載體，與目的基因構(gòu)建表

達(dá)載體。不考慮多個(gè)DNA片段的連接、目的基因的自我連接和目的基因的反向連接，將得

到兩種質(zhì)粒：原有質(zhì)粒重新連接而成的空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒與沒有青霉素、四環(huán)

素抗性的大腸桿菌混合、轉(zhuǎn)化，將得到三種大腸桿菌，即未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌、導(dǎo)入空質(zhì)粒的

大腸桿菌和導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌。將所得大腸桿菌培養(yǎng)，增加數(shù)量。然后接種到完全培

養(yǎng)基上，得如圖所示的6個(gè)菌落。然后，用影印接種法將菌落分別接種到含有四環(huán)素和青霉

素的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)結(jié)果如圖。

含有布家的培界羯

其中2號、5號菌落無法在兩種培養(yǎng)基上生存，說明所含大腸桿菌沒有抗性基因，即所含大

腸桿菌為未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌；1號、4號、6號菌落在兩種培養(yǎng)基中均能生存，說明其大腸

桿菌兩種抗性都有，即所含大腸桿菌為轉(zhuǎn)化了空質(zhì)粒的大腸桿菌；3號菌落能在含四環(huán)素的

培養(yǎng)基上生存，說明其含有四環(huán)素的抗性，不能在含青霉素的培養(yǎng)基上生存，說明不含有青

霉素的抗性（抗性基因酶切插入目的基因后喪失其作用），綜合分析其大腸桿菌含有重組質(zhì)粒。

3號菌落所含大腸桿菌即是要選擇培養(yǎng)的大腸桿菌。

熱點(diǎn)拓展二抗原檢測——雙抗體夾心法

1.原理

雙抗體夾心法是?種將兩種特異性抗體結(jié)合在?起來檢測目標(biāo)抗原或抗體的方法。其基本原

理是先將一種特異性抗體〔捕獲抗體）固定在固相載體（如微量滴定板、磁珠等）上，形成固相

抗體;然后加入待測樣本，使樣本中的目標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物；

再加入另一種特異性抗休［檢測抗體或酶標(biāo)抗體），該抗體與目標(biāo)抗原的另一個(gè)表位結(jié)合，形

成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)；最后通過加入底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)或觸發(fā)信號反應(yīng)（如光信號、電信號），

根據(jù)反應(yīng)的程度進(jìn)行目標(biāo)抗原或抗體的定性或定量檢測。

2.應(yīng)用實(shí)例——早早孕試紙

人絨毛膜促性腺激素（HCG）是婦女妊娠期由胎盤產(chǎn)生的一種糖蛋白激素，HCG可在受孕后

的孕婦尿液中檢驗(yàn)到，而非妊娠孕婦尿液中幾乎不含該激素。用抗人絨毛膜促性腺激素單克

隆抗體做成的“早孕診斷試劑盒“靈敏度很高，在月經(jīng)推遲7?10天就可以做出診斷，比乳膠

法提前了10?20天，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成的不利

影響。

顯色劑標(biāo)記的抗體I

■IIII|HCG

III

MAX標(biāo)志線檢測線對照線

將驗(yàn)孕試紙標(biāo)有MAX標(biāo)志線的一端插入待測尿液中（尿液不能沒過該線），片刻后取出平放，

若尿液中含有HCG,會(huì)隨尿液向右擴(kuò)散,與包埋在標(biāo)志線右側(cè)區(qū)域的被顯色劑標(biāo)記的抗HCG

抗體I發(fā)生特異性結(jié)合，形成的復(fù)合體繼續(xù)隨尿液向右擴(kuò)散至檢測線處，又可以與固定在該

區(qū)域的抗體2結(jié)合形成新的復(fù)合體，并不斷積累，從而在此處顯示出顏色。對照線區(qū)域固定

著另外一種抗體3,可以捕獲被顯色劑標(biāo)記的抗體1。因而當(dāng)尿液繼續(xù)擴(kuò)散到對照線時(shí)，也

會(huì)顯示出顏色。

檢測結(jié)果分析：

⑴陽性（十）

兩條紫紅色條帶出現(xiàn)。一條位于測試區(qū)（T）內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)（C）。表明己懷孕。

T(n)(

陽性(懷拳)

⑵陰性(一)

僅質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)(T)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)。表明未懷孕。

T(De

陰性(未懷孕)

(3)無效

質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，表明不正確的操作過程或試劑條已變質(zhì)損壞。

TC3C

無效

熱點(diǎn)拓展三線粒體置換技術(shù)

線粒體置換技術(shù)，是指通過顯微操作將細(xì)胞核DNA(nDNA)從含有缺陷線粒體DNA(mtDNA)

的卵母細(xì)胞或受精卵中轉(zhuǎn)移到具有正常線粒體的去核卵母細(xì)胞或受精卵中的一系列技術(shù)。該

技術(shù)旨在幫助因攜帶缺陷mlDNA患嚴(yán)重線粒體疾病的母親生育帶有自身遺傳物質(zhì)和血緣關(guān)

系的健康子代。

“三親嬰兒”用線粒體替代療法來實(shí)現(xiàn)，可用三種方法：原核移植，紡錘體移植和極體移植。

1.原核轉(zhuǎn)移(PNT)

原核轉(zhuǎn)移是指將患者受精卵中的兩個(gè)原核同時(shí)取出，并轉(zhuǎn)移到去核的供體細(xì)胞質(zhì)中，以減少

線粒體從患者受精卵傳遞給子代的風(fēng)險(xiǎn)(見圖1)。值得注意的是，為避免損傷原核，PNT取

核過程會(huì)吸取原核周圍少量細(xì)胞質(zhì)，因而異常mlDNA也可能會(huì)被轉(zhuǎn)移到新的受精卵中，從

而導(dǎo)致子代mtDNA污染，患遺傳學(xué)線粒體疾病風(fēng)險(xiǎn)增加。

受精

供體次級卵母細(xì)胞合子細(xì)胞質(zhì)

(健康mtDMA)(去核雌雄原核)

減數(shù)第二次分裂中期

圖1原核移植過程模式圖

2.母體紡錘體移植

母體紡錘體移植是指將患者次級卵母細(xì)胞減數(shù)分裂II中期（Mil期）形成的無核膜紡錘體移

植到供體去核健康卵母細(xì)抱中的技術(shù)（見圖2）o理論上，重組的卵母細(xì)胞僅攜帶極低比例的

患者異常mtDNA,且MII期卵母細(xì)胞紡錘體遠(yuǎn)小于原核，因此易操作。

供體次級卵母細(xì)胞卵母細(xì)胞質(zhì)

（健康mlDNA）（移除細(xì)胞核）

減數(shù)第二次分裂中期

圖2母體紡錘體移植過程模式圖

3.極體移植

卵母細(xì)胞在成熟過程中經(jīng)歷兩次減數(shù)分裂，減數(shù)分裂I產(chǎn)生第一極體（FirstPolarBody,PB1）；

減數(shù)分裂H產(chǎn)生第二極體［SecondPolarBody,PB2）。在患者未受精的卵母細(xì)胞處于減數(shù)分

裂H中期時(shí)，將同處這一時(shí)期的PBI紡錘體移植到處于同時(shí)期、預(yù)先被移除紡錘體的健康

供體卵母細(xì)胞中（見圖3）o從患者受精卵中取出PB2的原核，將其移植到預(yù)先移除雌原核

的健康供體的受精卵中（見圖4）。

吸出第一極體

供體次級卵母細(xì)胞卵母細(xì)胞質(zhì)

（健康mtDNA）（移除原核）

減數(shù)第二次分裂中期

圖3極體移植：第一極體移植過程模式圖

受精

吸出第二極體

第二極體核

患者次級卵/；￡細(xì)胞合子

（異常mtDNA）

減數(shù)第二次分裂中期

吸出雌原核

取組合子胚胎植入子宮

（攜帶健康mtD、A）

供體次級卵母細(xì)胞皿*B移除雌原核

（健康mtDNA）器膂的細(xì)胞質(zhì)

誠數(shù)第二次分裂中期

圖4極體移植：第二極體移植過程模式圖

課堂學(xué)習(xí)任務(wù)

熱點(diǎn)拓展一影印平板培養(yǎng)法

1.（2024?湖北武漢模擬）野生型大腸桿菌菌株能在基本培養(yǎng)基上生長，氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌

株由于發(fā)生基因突變而無法合成某種氨基酸只能在完全培養(yǎng)基上生長，下圖為純化某氨基酸

營養(yǎng)缺陷型突變株的部分流程圖，數(shù)字代表培養(yǎng)基，A、B、C表示操作步驟。卜列有關(guān)說

法正確的是（）

紫外線無菌絨布

A.①②為完全培養(yǎng)基，③④為基本培養(yǎng)基

B.A操作的目的是提高突變菌株的濃度

C.B操作可用涂布器蘸取菌液均勻的涂布在②表面

D.經(jīng)C過程影印及培養(yǎng)后，可從④培養(yǎng)基中挑取E菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)

2.（2024?安徽卷節(jié)選）丁二醇廣泛應(yīng)用于化妝品和食品等領(lǐng)域。興趣小組在己改造的大腸桿

菌中引入合成丁二醇的關(guān)鍵基因X,以提高丁二醇的產(chǎn)量。何答下列問題：

⑴擴(kuò)增X基因時(shí)，PCR反應(yīng)中需要使用TaqDNA聚合酶，原因是

（2）使用及〃〃HI和SRI限制酶處理質(zhì)粒和X基因，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并涂布在無抗生

素平板上（如圖）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選含目的基因菌株的實(shí)驗(yàn)思路是

HamWI

1^,‘Sal

乙Y啟動(dòng)子

Y四環(huán)索▼

入霉素抗嶗唳

抗性基因終止子

BamW1SalI

復(fù)制原點(diǎn)X基因

梅切，連接.

轉(zhuǎn)化大腸桿前

無抗生素平板

熱點(diǎn)拓展二抗原檢測——雙抗體夾心法

I.（2024.黑龍江哈爾濱模擬）視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病（NMOSD）是一種自身免疫性疾病，病因

是機(jī)體產(chǎn)生了水通道蛋白4（AQP4）的抗體。NMOSD的診斷依賴對外周血的檢測，檢測過程

如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

O1部4加入患者

mn<4%嘩血漿樣本.

粘貼/g/保溫處理

293T細(xì)胞

_______洗脫后加入.

熒光“二抗”顯微鏡

/JL/保溫處/理□T/V一檢測

A.圖示操作的目的是檢測患者體內(nèi)是否存在AQP4抗體

B.熒光標(biāo)記的“二抗”會(huì)與結(jié)合在AQP4上的抗體結(jié)合

C.患者的檢測結(jié)果應(yīng)為在細(xì)胞質(zhì)中觀察到免疫熒光

D.這種檢測方法保持了抗原結(jié)構(gòu)，因此具有較高的特異性

2.（2024?山東臨沂二模）科研人員將諾如病毒（NV）作為抗原注射給小鼠，通過制備NV單克

隆抗體1和2,應(yīng)用于膠體金檢測試紙進(jìn)行抗原鑒定（如圖）。檢測原理采用雙抗體夾心法：

將待測樣液加到樣品孔處，結(jié)合墊處含有過量膠體金（可與蛋白質(zhì)結(jié)合，大量聚集時(shí)出現(xiàn)肉

眼可見的紅色）標(biāo)記的游離金標(biāo)抗體1,可以結(jié)合樣液中的抗原，T上固定有抗體2,抗體1

和抗體2與NV表面同一抗原的不同部位發(fā)生特異性結(jié)合而呈紅色，多余的抗體I繼續(xù)向左

流，C上固定有抗體1的抗體，二者結(jié)合使膠體金大量聚集也呈紅色。下列敘述錯(cuò)誤的是

（）

吸水墊質(zhì)控線檢測線結(jié)合墊樣品孔

A.將NV作為抗原注射給小鼠，可獲得多種產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞

B.利用單克隆抗體技術(shù)制備的抗體1和抗體2不能直接對患者進(jìn)行注射治療

C.若僅C處呈紅色，說明檢測結(jié)果為陰性，則可初步判斷待測液中不含NV

D.若C、T處均呈紅色，說明檢測結(jié)果為陽性，該過程發(fā)生2次特異性結(jié)合

熱點(diǎn)拓展三線粒體置換技術(shù)

1.（2024?江蘇徐州階段練習(xí)）為避免夫妻把生理缺陷遺傳給孩子，醫(yī)生去除女性捐贈(zèng)者的卵

子中的細(xì)胞核，接著用母親卵細(xì)胞中的細(xì)胞核取而代之，最后再按照標(biāo)準(zhǔn)的試管嬰兒技術(shù)進(jìn)

行培育。這樣誕生的孩子將會(huì)繼承一位父親和兩位母親的遺傳基因，這就是“三親嬰兒二下

列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是（）

A.該女性線粒體上的致病基因會(huì)遺傳給女兒，不會(huì)遺傳給兒子

B.培育三親嬰兒過程中用到了核移植技術(shù)，但不屬于無性繁殖

C.捐獻(xiàn)者卵母細(xì)胞去掉的細(xì)胞核實(shí)際是紡錘體一染色體復(fù)合物

D.三親嬰兒的培育用到了核移植、體外受精和胚胎移植等技術(shù)

2.（2024?吉林長春三模）三親嬰兒的培育過程可選用如下技術(shù)路線。據(jù)圖分析，下列敘述錯(cuò)

誤的是（）

公去冢C核Mil期

?。\移植件曾卵母細(xì)胞

捐獻(xiàn)者卵母細(xì)胞產(chǎn)落除＞一看

◎應(yīng)生［?/

不，受精卵

母親卵母細(xì)胞O精子

A.該技術(shù)可避免母親的線粒體遺傳病基因傳遞給后代

B.體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)，不僅需要多種營養(yǎng)物質(zhì)，還需提供02和CO2

C.捐獻(xiàn)者攜帶的紅綠色盲基因不能遺傳給三親嬰兒

D.三親嬰兒的基因全部來自父親和母親

答案解析

熱點(diǎn)拓展一拓展應(yīng)用

1.B［分析題圖可知，①②④為完全培養(yǎng)基，③為基本培養(yǎng)基，A錯(cuò)誤；紫外線可用于誘

導(dǎo)突變，提高突變的頻率，A操作的目的是提高突變菌株的濃度，B正確；B操作是先將菌

液滴加到培養(yǎng)基的表面，再用涂布器均勻的涂布在②表面，C錯(cuò)誤；由題圖可知，D菌落在

基木培養(yǎng)基中無法生長，而在完全培養(yǎng)基上能夠生長，這說明D菌落是氨基酸營養(yǎng)缺陷型

菌株，故經(jīng)C過程影印及培養(yǎng)后，可從④培養(yǎng)基中挑取D菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，D錯(cuò)誤。］

2.(1)在PCR反應(yīng)中，需要利用高溫使DNA雙鏈解旋，普通的DNA聚合酶在高溫下會(huì)變

性失活，而ThqDNA聚合酶能夠耐高溫，在高溫條件下依然具有活性(2)在平板中添加氯

霉素，再將在含有氯霉素的培養(yǎng)基中生長的菌落利用影印法影印到添加四環(huán)素的培養(yǎng)基中，

在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能正常生長的菌落就是由導(dǎo)入目的基因的菌株形成的

熱點(diǎn)拓展二拓展應(yīng)用

1.C［圖示操作加入患者血漿樣本，血漿中含有抗體，因此圖示操作的目的是檢測患者體

內(nèi)是否存在AQP4抗體，A正確；血漿中的抗體先與膜上的AQP4抗原結(jié)合形成復(fù)合物，再

加入熒光“二抗”，此時(shí)加入的熒光“二抗”能與AQP4上的抗體結(jié)合，B正確；抗體分布在細(xì)

胞外液中，則患者的檢測結(jié)果應(yīng)為在細(xì)胞外液中觀察到免疫熒光，C錯(cuò)誤；這種方法能與抗

原結(jié)合的抗體不會(huì)被洗脫，不能結(jié)合的就會(huì)被洗脫，力0人的“二抗”能與結(jié)合的抗體結(jié)合并通

過熒光觀察，這種檢測方法保持了抗原結(jié)構(gòu)，且具有較高的特異性，D正確。］

2.D［NV作為抗原，具有多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，可以誘導(dǎo)機(jī)體獲得多種產(chǎn)生特定抗體的B

淋巴細(xì)胞，A正確；利用單克隆抗體技術(shù)制備的抗體1和抗體2是利用小鼠的骨髓瘤細(xì)胞和

B淋巴細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，對人來說屬亍異物，為了降低免疫排斥，需要對

單克隆抗體進(jìn)行改造，除抗原結(jié)合區(qū)域外，其他部分都替換為人抗體區(qū)段，B