棘阿米巴HSP20原核表達載體的構(gòu)建及純化工藝的研究 目錄TOC\o"1-3"\h\u摘要 ⑥顯色：在平板中放入1mL顯色液，顯色液配置比例為A液：B液=1:1。把膜放置于顯色液中，膜正反面都要和顯影液接觸，之后用ECL發(fā)光顯色儀進行拍照并保存。3.4.5HSP20蛋白的純化25℃條件下，以優(yōu)化的最佳IPTG濃度和最佳誘導溫度與時間為表達條件，對重組菌進行大量（100mL）誘導表達。誘導結(jié)束后，4℃離心收集菌體并重懸于結(jié)合液中，冰浴30min，冰浴超聲碎菌。超聲：①使用75％乙醇清洗探頭。設置條件為：超聲3s，停5s，超聲時間8min，超聲一次。②使用蒸餾水清洗探頭。設置條件為：超聲3s，停5s，超聲時間8min，超聲一次。③冰浴下超聲樣品。設置條件為：超聲5s，停5s，超聲時間8min，超聲兩次。④超聲完畢后，用蒸餾水清洗探頭。設置條件為：超聲3s，停5s，超聲時間8min，超聲一次。4℃12000r·min-1離心10min，利用Ni柱進行蛋白的分離純化，其步驟如下：①凝膠預處理：將葡萄糖凝膠干粉G-100在100℃水浴加熱，溶脹30min，期間不斷用玻璃棒攪拌。②鏈接裝置：將層析柱固定于鐵架臺上，保持與地面垂直，檢驗是否漏液，鏈接紫外檢測儀。③填裝層析柱：用玻璃棒攪勻凝膠，沿玻璃棒緩緩連續(xù)注入，待凝膠沉降徹底后，平衡凝膠柱（3-5個柱體積），調(diào)節(jié)流速1cm/min。④上樣。⑤洗脫：用上樣緩沖液洗脫樣品，用紫外檢測儀檢測蛋白是否流出，并收集。最后使用透析袋將蛋白在低溫環(huán)境下濃縮，獲得大量的HSP20可溶性重組蛋白。參考文獻[1].NeelamS,NiederkornJY.PathobiologyandImmunobiologyofAcanthamoebaKeratitis:InsightsfromAnimalModesl[J].YaleJBiolMed.2017;90(2):261-268.[2].JuYT,

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