家族性慢性良性天皰瘡中ATP2C1基因突變特征與發(fā)病機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與目的家族性慢性良性天皰瘡（FamilialBenignChronicPemphigus），又稱Hailey-Hailey?。℉HD），是一種常染色體顯性遺傳性皮膚病，由Hailey兄弟于1939年首次報(bào)道。其發(fā)病率雖低，但嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。臨床表現(xiàn)主要為在正常皮膚或紅斑基礎(chǔ)上出現(xiàn)成群的小水皰或大皰，皰液起初澄清，隨后可混濁，破潰后形成糜爛、滲出及結(jié)痂等，常伴有腥臭或疼痛。皮疹好發(fā)于頸、腋窩、腹股溝、臍周、腘窩、肛周等易摩擦部位，夏季癥狀往往加重，冬季則相對(duì)減輕，且容易復(fù)發(fā)，還常合并細(xì)菌、真菌等感染。在發(fā)病機(jī)制方面，1997年Richard等通過基因連鎖分析將HHD定位于3q21-24。2000年，Hu等人和Sudbrak等人通過定位克隆的方法證實(shí)HHD是由ATP2C1基因突變所致。ATP2C1基因編碼一種P型Ca2?ATP酶，即人類分泌途徑Ca2?/Mn2?ATP酶（hSPCA1）。人角質(zhì)形成細(xì)胞中的SPCA1位于高爾基體內(nèi)，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2?或Mn2?，對(duì)高爾基體內(nèi)鈣離子和錳離子的儲(chǔ)存起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。當(dāng)ATP2C1基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)致使SPCA1泵功能異常，轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的能力下降，進(jìn)而使高爾基體腔內(nèi)鈣離子濃度降低。而高爾基體腔內(nèi)鈣離子濃度的降低，可能會(huì)削弱重要蛋白質(zhì)的糖基化、水解、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)或分選過程，例如橋粒蛋白等，最終影響橋粒的完整性，導(dǎo)致表皮細(xì)胞產(chǎn)生裂隙，出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。目前，國內(nèi)外已報(bào)道該基因存在80余種不同的突變位點(diǎn)，突變類型包括錯(cuò)義突變、無義突變、移碼突變和剪切位點(diǎn)突變等。國內(nèi)朱學(xué)駿等對(duì)7個(gè)HHD家系進(jìn)行突變檢測，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)未報(bào)道的新突變；臺(tái)灣學(xué)者對(duì)6個(gè)HHD家系研究，找到5個(gè)新突變。不同地區(qū)、不同種族的患者，其ATP2C1基因突變位點(diǎn)和類型存在差異，這可能與遺傳背景、環(huán)境因素等有關(guān)。并且，部分患者的臨床表現(xiàn)與基因突變之間的關(guān)系尚不明確，基因型-表型之間的關(guān)聯(lián)研究還存在許多未知。深入研究ATP2C1基因突變具有重要意義。在發(fā)病機(jī)制探究方面，有助于進(jìn)一步明確家族性慢性良性天皰瘡的發(fā)病根源，了解鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常如何一步步導(dǎo)致皮膚病變，為從分子層面理解疾病提供關(guān)鍵線索。在疾病診斷領(lǐng)域，準(zhǔn)確檢測ATP2C1基因突變位點(diǎn)，可作為基因診斷的有力依據(jù)，提高診斷的準(zhǔn)確性和早期診斷率，尤其是對(duì)于臨床癥狀不典型的患者。在治療方面，為未來開展基因治療奠定理論基礎(chǔ)，隨著基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展，針對(duì)ATP2C1基因突變的治療策略有望成為現(xiàn)實(shí)，為患者帶來新的希望；同時(shí)，也能幫助優(yōu)化現(xiàn)有的治療方案，根據(jù)患者的基因突變類型進(jìn)行個(gè)性化治療。本研究旨在對(duì)家族性慢性良性天皰瘡患者的ATP2C1基因進(jìn)行深入研究。一方面，通過對(duì)多個(gè)家系及散發(fā)病例的研究，尋找新的ATP2C1基因突變位點(diǎn)，豐富基因突變數(shù)據(jù)庫。另一方面，探討患者臨床表現(xiàn)與基因突變的特點(diǎn)，分析基因型-表型之間的關(guān)系，為家族性慢性良性天皰瘡的精準(zhǔn)診斷、治療及遺傳咨詢提供科學(xué)依據(jù)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀自2000年Hu等人和Sudbrak等人證實(shí)家族性慢性良性天皰瘡由ATP2C1基因突變所致后，國內(nèi)外針對(duì)該基因突變展開了廣泛研究。在國外，眾多研究聚焦于ATP2C1基因的功能及突變類型分析。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，深入探究了正常ATP2C1基因編碼的hSPCA1在鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)和高爾基體功能維持中的關(guān)鍵作用，明確了基因突變導(dǎo)致hSPCA1功能異常，進(jìn)而影響橋粒完整性的發(fā)病機(jī)制。目前已報(bào)道的80余種突變位點(diǎn)中，不同地區(qū)和種族的突變譜存在差異。如歐洲人群中某些特定錯(cuò)義突變較為常見，這些研究為全球范圍內(nèi)理解HHD的遺傳多樣性提供了基礎(chǔ)。國內(nèi)在這一領(lǐng)域也取得了顯著成果。朱學(xué)駿等對(duì)7個(gè)HHD家系進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)4個(gè)新突變，為中國人群的基因突變數(shù)據(jù)庫增添了重要數(shù)據(jù)；臺(tái)灣學(xué)者對(duì)6個(gè)家系研究，找到5個(gè)新突變。此外，國內(nèi)研究還注重結(jié)合臨床表型與基因突變的關(guān)聯(lián)分析，試圖揭示兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系，為臨床精準(zhǔn)診斷和治療提供理論依據(jù)。盡管國內(nèi)外研究已取得一定進(jìn)展，但仍存在不足。一方面，不同地區(qū)、種族的研究樣本量相對(duì)較小，限制了對(duì)基因突變?nèi)驳纳钊肓私猓绕涫且恍┖币娡蛔兾稽c(diǎn)和特殊突變類型的研究還不夠充分。另一方面，基因型-表型關(guān)系的研究尚未形成統(tǒng)一結(jié)論，部分患者的臨床表現(xiàn)與基因突變之間的關(guān)聯(lián)不明確，這可能與遺傳背景、環(huán)境因素以及基因修飾等多種因素有關(guān)。本文旨在通過擴(kuò)大樣本量，涵蓋更多地區(qū)和家系的患者，深入研究ATP2C1基因突變位點(diǎn)和類型。同時(shí)，綜合考慮臨床癥狀、遺傳背景等因素，更全面地分析基因型-表型之間的關(guān)系，有望在發(fā)現(xiàn)新突變位點(diǎn)和明確基因型-表型關(guān)系方面取得創(chuàng)新性成果，為家族性慢性良性天皰瘡的研究提供新的思路和方法。二、家族性慢性良性天皰瘡概述2.1疾病定義與臨床特征家族性慢性良性天皰瘡，作為一種常染色體顯性遺傳性皮膚病，以皮膚棘層松解為顯著特征，又被稱為Hailey-Hailey?。℉HD）。其發(fā)病機(jī)制與ATP2C1基因突變密切相關(guān)，這一基因突變致使鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常，進(jìn)而影響橋粒完整性，最終引發(fā)皮膚病變。家族性慢性良性天皰瘡?fù)ǔＴ谇啻浩谄鸩。?0歲以后病情往往逐漸減輕。皮疹好發(fā)于頸部、腋窩、腹股溝、臍周、腘窩、肛周等易受摩擦且皮膚褶皺較多的部位，這些部位的皮膚相互摩擦，加上局部潮濕的環(huán)境，為疾病的發(fā)生發(fā)展提供了條件。在臨床癥狀方面，其基本損害表現(xiàn)為在外觀正常的皮膚或者紅斑基礎(chǔ)上，出現(xiàn)成群分布的小水皰或大皰。皰液在初期通常澄清，這是因?yàn)榇藭r(shí)水皰內(nèi)主要是組織液滲出；然而，隨著病情發(fā)展，皰液很快會(huì)變得混濁，這可能是由于水皰內(nèi)混入了炎癥細(xì)胞、細(xì)菌等成分。水皰壁較為薄弱，容易破裂，破裂后會(huì)留下糜爛面，伴有滲出，隨后滲出液干涸形成結(jié)痂?；颊叱Ｓ叙W感，這是由于皮膚炎癥刺激神經(jīng)末梢所致；同時(shí)，還伴有明顯的腥臭氣味，這主要是因?yàn)槊訝€面的滲出物以及合并的細(xì)菌感染產(chǎn)生了特殊的氣味。在某些情況下，患者還會(huì)自覺疼痛，尤其是當(dāng)水皰破裂形成糜爛面，受到外界刺激時(shí)，疼痛會(huì)更加明顯。當(dāng)繼發(fā)白念珠菌、皰疹病毒和金黃色葡萄球菌等感染時(shí)，患者的癥狀會(huì)更加復(fù)雜多樣，可出現(xiàn)斑丘疹、角化性丘疹、乳頭瘤樣增殖等不典型損害。此外，患者的掌跖部位偶爾會(huì)出現(xiàn)點(diǎn)狀小坑及散在分布的角化現(xiàn)象，指甲也可能出現(xiàn)白色條紋。當(dāng)病變累及肛門生殖器部位黏膜時(shí)，可出現(xiàn)多個(gè)疣狀丘疹；病變附近的淋巴結(jié)還可能出現(xiàn)腫大或疼痛的癥狀，這是機(jī)體對(duì)炎癥反應(yīng)的一種防御表現(xiàn)。家族性慢性良性天皰瘡的病程呈現(xiàn)慢性遷延的特點(diǎn)，冬天時(shí)，由于皮膚相對(duì)干燥，摩擦減少，癥狀常減輕甚至消失；而夏天，氣溫升高，皮膚出汗增多，摩擦加劇，癥狀則趨于加重。皮疹經(jīng)過數(shù)周可自行消退，但以后又往往在原處復(fù)發(fā)，這給患者的生活帶來了極大的困擾，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。雖然50歲以后病情常減輕，但能夠完全痊愈的患者較為少見。2.2流行病學(xué)特征家族性慢性良性天皰瘡是一種較為罕見的皮膚病，全球范圍內(nèi)的發(fā)病率約為1/100,000。目前研究顯示，該病在地域和種族分布上無明顯差異，不同種族人群均有發(fā)病報(bào)道。這可能是由于ATP2C1基因突變在不同種族的遺傳背景中均有可能發(fā)生，且該基因在維持皮膚細(xì)胞正常功能方面的作用是普遍的，不受種族特異性因素的顯著影響。在性別方面，男女發(fā)病率相似。從遺傳學(xué)角度來看，由于該病是常染色體顯性遺傳，致病基因位于常染色體上，而非性染色體，因此男女獲得致病基因的概率相等，這也就導(dǎo)致了男女發(fā)病率沒有明顯的性別差異。家族性慢性良性天皰瘡?fù)ǔＴ谇啻浩诨虺赡暝缙诎l(fā)病。這可能與青春期人體激素水平的變化以及皮膚生理功能的改變有關(guān)。青春期時(shí)，皮脂腺分泌旺盛，皮膚油脂增多，加上活動(dòng)量增加，皮膚摩擦頻繁，這些因素都可能誘發(fā)疾病的發(fā)生。而在50歲以后，病情常逐漸減輕，可能是因?yàn)殡S著年齡增長，皮膚的新陳代謝速度減慢，細(xì)胞增殖和分化活動(dòng)減弱，使得皮膚對(duì)致病因素的敏感性降低，從而導(dǎo)致病情緩解。盡管家族性慢性良性天皰瘡發(fā)病率低，但由于其癥狀不典型，容易與濕疹、接觸性皮炎、尋常型天皰瘡等其他皮膚病混淆，因此誤診率較高。在臨床診斷過程中，醫(yī)生需要綜合考慮患者的臨床表現(xiàn)、家族病史以及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，進(jìn)行仔細(xì)鑒別診斷，以提高診斷的準(zhǔn)確性。2.3疾病危害與對(duì)患者生活的影響家族性慢性良性天皰瘡不僅對(duì)患者的身體健康造成直接損害，還會(huì)在心理、社交和生活質(zhì)量等多方面產(chǎn)生負(fù)面影響。從身體健康角度來看，患者皮膚的水皰、糜爛和滲出等癥狀，使得皮膚的屏障功能嚴(yán)重受損，這大大增加了皮膚感染的風(fēng)險(xiǎn)。白念珠菌、皰疹病毒和金黃色葡萄球菌等病原體容易在破損的皮膚上滋生繁殖，引發(fā)各種感染。一旦發(fā)生感染，不僅會(huì)加重皮膚的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致癥狀加劇，如出現(xiàn)更嚴(yán)重的紅腫、疼痛、發(fā)熱等，還可能引發(fā)全身性感染，對(duì)患者的生命健康構(gòu)成威脅。長期的皮膚病變還可能導(dǎo)致局部皮膚組織的纖維化和瘢痕形成，影響皮膚的正常功能和外觀。在心理方面，由于疾病的慢性遷延和反復(fù)發(fā)作，患者往往承受著巨大的心理壓力。水皰破裂后的腥臭氣味以及皮膚表面的糜爛、結(jié)痂等外觀改變，使患者容易產(chǎn)生自卑、焦慮和抑郁等負(fù)面情緒。這些心理問題不僅會(huì)影響患者的心理健康，還可能進(jìn)一步影響患者的生活態(tài)度和社交行為，形成惡性循環(huán)。社交方面，患者因擔(dān)心皮膚癥狀被他人看到或聞到異味，常常會(huì)避免社交活動(dòng)，減少與他人的接觸和交流。這使得患者的社交圈子逐漸縮小，人際關(guān)系受到影響，進(jìn)而影響到患者的社會(huì)支持系統(tǒng)。在工作和學(xué)習(xí)中，患者可能因皮膚癥狀的困擾而無法集中精力，導(dǎo)致工作效率下降、學(xué)習(xí)成績受到影響。生活質(zhì)量方面，疾病帶來的瘙癢、疼痛等不適癥狀，嚴(yán)重影響患者的睡眠質(zhì)量和日常生活活動(dòng)?；颊咴诖┮?、洗澡、運(yùn)動(dòng)等日常行為中都可能因皮膚病變而感到不便和痛苦。夏季癥狀加重時(shí)，患者更是難以忍受，對(duì)生活的滿意度顯著降低。此外，長期的治療過程也給患者帶來了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和時(shí)間成本，進(jìn)一步影響了患者的生活質(zhì)量。三、ATP2C1基因相關(guān)基礎(chǔ)3.1ATP2C1基因結(jié)構(gòu)與功能ATP2C1基因，全名為ATP酶分泌途徑鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1基因（ATPasesecretorypathwayCa2+transporting1），位于人類染色體3q22.1區(qū)域。該基因在人體細(xì)胞的正常生理功能維持中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從結(jié)構(gòu)上看，ATP2C1基因由多個(gè)外顯子和內(nèi)含子組成。外顯子是基因中編碼蛋白質(zhì)的部分，它們的排列順序決定了蛋白質(zhì)的氨基酸序列，進(jìn)而決定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。內(nèi)含子則不直接參與蛋白質(zhì)編碼，但在基因表達(dá)的調(diào)控過程中具有重要作用，比如通過影響轉(zhuǎn)錄、剪接等過程，對(duì)基因表達(dá)的時(shí)間、空間和表達(dá)量進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。ATP2C1基因編碼質(zhì)泵鞭毛細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（PMR1），也被稱為人類分泌途徑Ca2?/Mn2?ATP酶（hSPCA1）。PMR1是一種P型Ca2?ATP酶，屬于ATPasesCa2+transporting家族成員。其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有典型的P型ATP酶特征，包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。PMR1主要在高爾基體的囊泡和轉(zhuǎn)運(yùn)泡中表達(dá)。在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子參與眾多重要的生理過程，如細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、肌肉收縮、神經(jīng)傳遞以及細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等。PMR1的主要功能是利用水解ATP產(chǎn)生的能量，將細(xì)胞內(nèi)的鈣離子逆濃度梯度從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體的腔內(nèi)，從而維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)平衡，確保細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)通路的正常運(yùn)行。同時(shí)，PMR1在轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的過程中，還會(huì)在胞漿中產(chǎn)生H+濃度梯度，這一濃度梯度對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡以及一些依賴于質(zhì)子濃度的生理過程具有重要意義。在高爾基體中，合適的鈣離子濃度對(duì)于蛋白質(zhì)的正確折疊、修飾、分選和運(yùn)輸至關(guān)重要。許多分泌蛋白和膜蛋白在高爾基體中進(jìn)行糖基化修飾，而鈣離子作為一些糖基轉(zhuǎn)移酶的輔助因子，參與糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，影響蛋白質(zhì)的糖基化修飾過程。鈣離子還可以調(diào)節(jié)高爾基體中一些蛋白酶的活性，這些蛋白酶參與蛋白質(zhì)的加工和成熟，確保蛋白質(zhì)具有正確的結(jié)構(gòu)和功能。此外，高爾基體中正常的鈣離子濃度對(duì)于維持高爾基體的結(jié)構(gòu)完整性和膜泡運(yùn)輸?shù)恼＿M(jìn)行也不可或缺。如果ATP2C1基因發(fā)生突變，導(dǎo)致PMR1功能異常，無法正常轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子，就會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響高爾基體的正常功能，最終引發(fā)一系列的細(xì)胞生理功能紊亂，在皮膚組織中則表現(xiàn)為家族性慢性良性天皰瘡的相關(guān)癥狀。3.2在正常生理過程中的作用在細(xì)胞的正常生理活動(dòng)中，ATP2C1基因編碼的hSPCA1對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡起著核心作用。細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度在不同區(qū)域呈現(xiàn)出顯著的梯度分布，細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子濃度通常維持在較低水平，大約為100nM，而細(xì)胞內(nèi)一些細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，其腔內(nèi)的鈣離子濃度則相對(duì)較高。這種精確的鈣離子濃度梯度對(duì)于細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。hSPCA1主要定位于高爾基體，通過消耗ATP水解產(chǎn)生的能量，將細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體腔內(nèi)。這一主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程不僅確保了高爾基體腔內(nèi)維持較高的鈣離子濃度，還對(duì)維持細(xì)胞質(zhì)中低水平的鈣離子濃度起著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞接收到外界刺激信號(hào)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度會(huì)發(fā)生瞬間變化，這種變化作為一種重要的信號(hào)，參與調(diào)控眾多細(xì)胞活動(dòng)。例如，在細(xì)胞增殖過程中，鈣離子信號(hào)可以激活一系列與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的蛋白激酶和磷酸酶，從而促進(jìn)細(xì)胞從靜止期進(jìn)入分裂期。在細(xì)胞分化過程中，特定的鈣離子濃度變化能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，引導(dǎo)細(xì)胞朝著特定的方向分化。在細(xì)胞分泌途徑中，ATP2C1基因也發(fā)揮著不可或缺的作用。高爾基體是細(xì)胞分泌途徑中的關(guān)鍵細(xì)胞器，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的修飾、加工和分選。合適的鈣離子濃度是高爾基體正常行使這些功能的必要條件。在蛋白質(zhì)糖基化修飾過程中，許多糖基轉(zhuǎn)移酶的活性依賴于鈣離子的存在。這些糖基轉(zhuǎn)移酶以鈣離子作為輔助因子，將各種糖基連接到蛋白質(zhì)上，形成糖蛋白。糖蛋白在細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答等生理過程中具有重要作用。如果高爾基體中的鈣離子濃度異常，糖基轉(zhuǎn)移酶的活性就會(huì)受到影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)糖基化修飾異常，進(jìn)而影響糖蛋白的正常功能。此外，鈣離子還參與調(diào)節(jié)高爾基體中蛋白酶的活性。一些蛋白酶在高爾基體中負(fù)責(zé)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工和成熟，它們的活性受到鈣離子的嚴(yán)格調(diào)控。在某些情況下，高爾基體中的鈣離子濃度變化會(huì)激活這些蛋白酶，使其對(duì)特定的蛋白質(zhì)底物進(jìn)行切割和修飾，從而產(chǎn)生具有不同功能的蛋白質(zhì)片段。這些蛋白質(zhì)片段在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著各自獨(dú)特的作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等。在細(xì)胞信號(hào)傳遞方面，ATP2C1基因編碼的hSPCA1也扮演著重要角色。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，細(xì)胞表面的受體被激活，通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生變化。這種變化作為第二信使，激活下游的信號(hào)分子，如鈣調(diào)蛋白（CaM）等。CaM與鈣離子結(jié)合后，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而激活一系列與之相互作用的蛋白激酶和磷酸酶，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。例如，在神經(jīng)細(xì)胞中，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)傳到突觸前膜時(shí)，會(huì)導(dǎo)致突觸前膜上的鈣離子通道開放，鈣離子內(nèi)流。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高會(huì)促使突觸小泡與突觸前膜融合，釋放神經(jīng)遞質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)信號(hào)的傳遞。在免疫細(xì)胞中，抗原刺激T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）后，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的鈣離子信號(hào)通路，導(dǎo)致T細(xì)胞活化、增殖和分化，進(jìn)而啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。四、ATP2C1基因突變與家族性慢性良性天皰瘡關(guān)聯(lián)研究4.1基因突變類型與特點(diǎn)自發(fā)現(xiàn)家族性慢性良性天皰瘡與ATP2C1基因突變相關(guān)以來，眾多研究致力于揭示該基因的突變類型和特點(diǎn)。目前已報(bào)道的ATP2C1基因突變類型豐富多樣，主要包括錯(cuò)義突變、無義突變、移碼突變和剪切位點(diǎn)突變等。錯(cuò)義突變是指DNA序列中的單個(gè)堿基替換，導(dǎo)致其編碼的氨基酸發(fā)生改變。在ATP2C1基因中，錯(cuò)義突變較為常見。例如，有研究報(bào)道了D644G錯(cuò)義突變，該突變使基因外顯子22上第1932位堿基發(fā)生A→G的雜合突變，導(dǎo)致編碼天門冬氨酸的三聯(lián)密碼子（GAT）突變?yōu)榫幋a甘氨酸的（GGT）三聯(lián)密碼子，從而使hSPCA1蛋白的644位氨基酸殘基發(fā)生改變。錯(cuò)義突變可能會(huì)影響hSPCA1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，使其轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的能力下降。由于氨基酸的改變，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象可能發(fā)生變化，導(dǎo)致其與鈣離子的結(jié)合能力減弱，或者影響其在高爾基體膜上的定位和穩(wěn)定性，進(jìn)而影響高爾基體腔內(nèi)鈣離子的濃度平衡。無義突變則是由于堿基替換，使原來編碼氨基酸的密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成提前終止。如S212X無義突變，使得翻譯過程在第212位氨基酸處提前終止，產(chǎn)生的截?cái)嗟鞍淄ǔ２痪哂姓９δ?。這種截?cái)嗟膆SPCA1蛋白可能無法形成完整的功能結(jié)構(gòu)域，無法完成鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，影響細(xì)胞的正常生理功能。移碼突變通常是由于DNA序列中發(fā)生堿基的插入或缺失，導(dǎo)致閱讀框發(fā)生改變，從而使后續(xù)的氨基酸序列完全改變。例如356fs2X缺失移碼突變，會(huì)使基因編碼的蛋白質(zhì)序列發(fā)生混亂，最終合成的蛋白質(zhì)與正常蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和功能上存在巨大差異。移碼突變后的蛋白質(zhì)往往無法正常折疊，也無法行使其正常的生物學(xué)功能，進(jìn)一步破壞細(xì)胞內(nèi)的鈣離子調(diào)控機(jī)制。剪切位點(diǎn)突變發(fā)生在基因的內(nèi)含子與外顯子交界處，影響mRNA的剪接過程，導(dǎo)致異常的mRNA轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生。比如118-2A→G剪切突變，會(huì)干擾正常的剪接信號(hào)，使得mRNA在剪接時(shí)可能錯(cuò)誤地保留內(nèi)含子序列或跳過外顯子序列，最終翻譯出的蛋白質(zhì)可能缺失部分功能結(jié)構(gòu)域或者包含錯(cuò)誤的氨基酸序列，從而影響hSPCA1蛋白的正常功能。從分布規(guī)律來看，ATP2C1基因突變主要集中于3個(gè)功能區(qū)。這3個(gè)功能區(qū)對(duì)于hSPCA1蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，突變發(fā)生在這些區(qū)域更容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的喪失或異常。此外，研究還發(fā)現(xiàn)22外顯子是亞洲人種家族性慢性良性天皰瘡的高風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。在亞洲人群中，該外顯子上發(fā)生突變的頻率相對(duì)較高，這可能與亞洲人群的遺傳背景特點(diǎn)有關(guān)。不同地區(qū)、不同種族的患者，其ATP2C1基因突變位點(diǎn)和類型存在一定差異。歐洲人群中某些錯(cuò)義突變較為常見，而亞洲人群除了22外顯子的高風(fēng)險(xiǎn)特點(diǎn)外，還存在一些獨(dú)特的突變類型。這種差異可能是由于不同種族在進(jìn)化過程中經(jīng)歷的遺傳漂變、自然選擇以及環(huán)境因素等不同所導(dǎo)致的。4.2具體案例分析4.2.1案例一選取來自山東地區(qū)的一個(gè)家族性慢性良性天皰瘡家系進(jìn)行深入研究。該家系共3代11人，家族中無近親婚配史。先證者為男性，70歲，其腋窩、雙側(cè)腹股溝和腹部出現(xiàn)紅斑、水皰已有40余年。曾外用糖皮質(zhì)激素軟膏等治療，癥狀雖能緩解，但皮疹反復(fù)發(fā)作，呈現(xiàn)冬輕夏重的特點(diǎn)，近兩年內(nèi)皮疹有逐漸加重的趨勢。先證者的4個(gè)兒子均患有家族性慢性良性天皰瘡（HHD），然而在該家系的第三代中，只有1人是HHD患者（III：1），其余的臨床表型均正常。對(duì)該家系成員進(jìn)行詳細(xì)的臨床癥狀記錄，發(fā)現(xiàn)先證者病情較重，皮疹泛發(fā)全身。其兒子中，II：1和II：5發(fā)病年齡較早，分別是26歲和24歲，皮疹累及部位較多，包括雙側(cè)腹股溝、雙側(cè)腋下和腹部等部位。為了明確該家系的致病基因突變情況，抽取該家系家庭成員的外周血，第三代的5例表現(xiàn)正常者，抽取了III：2、III：3、III：5和III：6的外周血，2％EDTA抗凝，應(yīng)用QLAampDNAMiniKit提取基因組DNA。針對(duì)ATP2C1基因的28個(gè)外顯子，設(shè)計(jì)了27對(duì)引物。采用25μl的PCR擴(kuò)增體系，其中包含10×PCRbuffer（含20nmolMgCl?）2.5μl，10mmol／LdNTP0.5μl，50pM雙向引物混合物0.5μl，TaqDNA聚合酶0.5U，DNA模板1μl（25ng），加雙蒸水至25μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，然后94℃變性45s，62℃退火30s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％凝膠電泳檢測后，送北京華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果應(yīng)用VectorNTI14.2tissue與人類基因組ATP2C1序列相比較。在先證者ATP2C1基因的第6號(hào)外顯子中發(fā)現(xiàn)一個(gè)尚未報(bào)道的突變位點(diǎn)366T→A（Y122X），該突變導(dǎo)致密碼子TAT突變?yōu)門AA，使酪氨酸突變?yōu)樘崆敖K止密碼子。通過反向測序再次證實(shí)了這一突變的存在。對(duì)比先證者其余外顯子PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)異常變化。先證者的兒子和第三代成員III：3和III：6也發(fā)現(xiàn)和先證者一樣的突變位點(diǎn)，而III：2和III：5未檢測到突變位點(diǎn)。這表明該突變位點(diǎn)與該家系的家族性慢性良性天皰瘡發(fā)病密切相關(guān)，且符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。4.2.2案例二本研究選取了一個(gè)散發(fā)患者進(jìn)行研究，該患者為71歲男性，漢族，來自甘肅省?；颊咦允黾易宄蓡T中未有HHD患病者?；颊咴?7歲時(shí)，因外傷導(dǎo)致腹股溝兩側(cè)出現(xiàn)紅斑、糜爛和結(jié)痂，之后皮損逐漸蔓延至雙側(cè)腋下、腰部和肛周等處?；颊咦杂X瘙癢，使用抗生素和激素治療后，皮損稍有好轉(zhuǎn)，但多于夏季復(fù)發(fā)和加重。曾多次在其他醫(yī)院按“濕疹”等疾病治療，然而治療效果不佳。在我院對(duì)該患者進(jìn)行皮膚病理活檢，結(jié)果顯示基底層上水皰形成，存在許多棘刺松解細(xì)胞，基底細(xì)胞呈倒磚墻樣外觀，這與家族性慢性良性天皰瘡的典型病理特征相符。為了探究該患者的致病原因，在取得患者及其家屬知情同意后，采集患者和健康家庭成員外周血2ml。使用TianGenDNApurificationkit提取研究對(duì)象基因組DNA，同時(shí)提取100例無親緣關(guān)系正常人的基因組DNA作為對(duì)照，以排除基因多態(tài)性。針對(duì)ATP2C1基因的28個(gè)外顯子設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μl，含2×Taq聚合酶Mix25μl，Primer和dNTP（10mmol/L）16μl，模板DNA16μl。反應(yīng)在9700型PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行，預(yù)變性94℃3min，變性94℃30s、退火55℃45s、延伸72℃45s，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工）純化，將純化產(chǎn)物進(jìn)行測序PCR反應(yīng)，反應(yīng)后再進(jìn)行測序（AppliedBiosystems3730XLDNAAnalyzers），測序結(jié)果采用Chromas軟件（Version2.0）對(duì)基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，確定突變位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該患者ATP2C1基因外顯子22上第1932位堿基發(fā)生了A→G的雜合突變。這一突變導(dǎo)致編碼天門冬氨酸的三聯(lián)密碼子（GAT）突變?yōu)榫幋a甘氨酸的（GGT）三聯(lián)密碼子，從而使hSPCA1蛋白的644位氨基酸殘基出現(xiàn)錯(cuò)義突變（D644G）。對(duì)其家系中健康對(duì)照個(gè)體及無親緣關(guān)系的100名正常對(duì)照進(jìn)行檢測，均未發(fā)現(xiàn)該突變。對(duì)比案例一和案例二，在基因突變方面，案例一是6號(hào)外顯子的無義突變366T→A（Y122X），案例二則是22號(hào)外顯子的錯(cuò)義突變D644G，突變位點(diǎn)和突變類型均不相同。在臨床表型上，兩者都有典型的家族性慢性良性天皰瘡癥狀，如紅斑、水皰、糜爛等，且都有夏季加重、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。但案例一家系發(fā)病呈現(xiàn)明顯的家族聚集性，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律；案例二則為散發(fā)病例，家族中無其他患者。案例一中先證者病情較重，皮疹泛發(fā)全身，部分子代發(fā)病年齡早且累及部位多；案例二患者從外傷后發(fā)病，逐漸蔓延至多個(gè)部位。這些差異和相似之處有助于進(jìn)一步深入理解ATP2C1基因突變與家族性慢性良性天皰瘡臨床表型之間的復(fù)雜關(guān)系。4.3基因突變導(dǎo)致疾病發(fā)生的機(jī)制探討從細(xì)胞和分子層面來看，ATP2C1基因突變會(huì)引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致家族性慢性良性天皰瘡的發(fā)生。正常情況下，ATP2C1基因編碼的PMR1蛋白在高爾基體中發(fā)揮著關(guān)鍵的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)作用。它能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，逆濃度梯度將細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體腔內(nèi)，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的穩(wěn)態(tài)。這一過程對(duì)于維持高爾基體的正常功能至關(guān)重要，高爾基體腔內(nèi)合適的鈣離子濃度是蛋白質(zhì)正確折疊、修飾、分選和運(yùn)輸?shù)谋匾獥l件。當(dāng)ATP2C1基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致PMR1蛋白功能受損。以錯(cuò)義突變?yōu)槔?，如案例二中的D644G錯(cuò)義突變，使hSPCA1蛋白的644位氨基酸殘基發(fā)生改變。這種氨基酸的替換可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，導(dǎo)致PMR1蛋白與鈣離子的結(jié)合能力下降，無法有效地將鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體腔內(nèi)。無義突變則會(huì)使蛋白質(zhì)合成提前終止，如案例一中的366T→A（Y122X）無義突變，產(chǎn)生的截?cái)嗟鞍撞痪哂型暾墓δ芙Y(jié)構(gòu)域，無法完成鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程。移碼突變和剪切位點(diǎn)突變也會(huì)通過不同方式影響PMR1蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，使其轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的能力喪失或減弱。PMR1蛋白功能受損后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度會(huì)出現(xiàn)異常。由于無法正常將鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體腔內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子濃度可能會(huì)升高，而高爾基體腔內(nèi)的鈣離子濃度則會(huì)降低。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的異常會(huì)對(duì)細(xì)胞的多種生理過程產(chǎn)生負(fù)面影響。在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，鈣離子是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要信號(hào)分子。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常時(shí)，會(huì)干擾角質(zhì)形成細(xì)胞的正常生理功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常增加。研究表明，鈣離子濃度的改變會(huì)激活一系列凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，如caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)等，促使表皮角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生凋亡。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡增加會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致棘層松解的發(fā)生。正常情況下，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞之間通過橋粒等結(jié)構(gòu)緊密連接，維持皮膚的完整性。而當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡增加時(shí)，橋粒的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到破壞。橋粒中的關(guān)鍵蛋白，如橋粒芯糖蛋白、橋粒芯膠蛋白等，其合成、加工和組裝過程依賴于高爾基體的正常功能以及合適的鈣離子濃度。高爾基體腔內(nèi)鈣離子濃度降低，會(huì)影響這些橋粒蛋白的糖基化修飾、折疊和分選過程，導(dǎo)致橋粒蛋白結(jié)構(gòu)異常，無法正常發(fā)揮連接角質(zhì)形成細(xì)胞的作用。此外，凋亡的角質(zhì)形成細(xì)胞會(huì)釋放一些蛋白酶，這些蛋白酶會(huì)降解橋粒和細(xì)胞間的黏附分子，進(jìn)一步破壞細(xì)胞間的連接，使得表皮角質(zhì)形成細(xì)胞之間的黏附力下降，最終導(dǎo)致棘層松解，形成水皰和糜爛等家族性慢性良性天皰瘡的典型皮膚病變。五、基于ATP2C1基因突變的疾病診斷與治療研究5.1診斷方法與技術(shù)基于ATP2C1基因突變檢測的家族性慢性良性天皰瘡診斷方法，主要包括外周血DNA抽提、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、DNA直接測序等技術(shù)，這些技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用為疾病的準(zhǔn)確診斷提供了有力支持。外周血DNA抽提是基因突變檢測的第一步，其目的是從外周血樣本中獲取高質(zhì)量的基因組DNA。目前常用的抽提方法有酚-***仿抽提法、鹽析法以及商業(yè)化的DNA提取試劑盒法。酚-仿抽提法利用酚和仿對(duì)蛋白質(zhì)和DNA的不同溶解性，通過多次抽提和離心，去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，從而獲得純凈的DNA。鹽析法則是通過調(diào)節(jié)溶液中的鹽濃度，使蛋白質(zhì)沉淀，而DNA保留在溶液中，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)DNA的分離。商業(yè)化的DNA提取試劑盒，如QIAampDNAMiniKit、TianGenDNApurificationkit等，采用了硅膠膜吸附技術(shù)，具有操作簡便、快速、提取效率高的優(yōu)點(diǎn)。以QIAampDNAMiniKit為例，先將外周血與裂解緩沖液混合，使細(xì)胞裂解，釋放出DNA。然后加入結(jié)合緩沖液，調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度和pH值，使DNA特異性地結(jié)合到硅膠膜上。經(jīng)過多次洗滌，去除雜質(zhì)后，再用洗脫緩沖液將DNA從硅膠膜上洗脫下來，得到高質(zhì)量的基因組DNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。PCR技術(shù)是一種體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，在家族性慢性良性天皰瘡的診斷中起著關(guān)鍵作用。其原理是利用DNA聚合酶在體外條件下，以引物為起始點(diǎn)，對(duì)特定的DNA片段進(jìn)行大量擴(kuò)增。針對(duì)ATP2C1基因的28個(gè)外顯子，需要設(shè)計(jì)27對(duì)特異性引物。這些引物的設(shè)計(jì)需要考慮引物的長度、GC含量、Tm值（解鏈溫度）等因素，以確保引物能夠特異性地與ATP2C1基因的目標(biāo)區(qū)域結(jié)合。在PCR擴(kuò)增過程中，反應(yīng)體系通常包含10×PCRbuffer（含20nmolMgCl?）、10mmol／LdNTP、50pM雙向引物混合物、TaqDNA聚合酶、DNA模板以及雙蒸水。反應(yīng)條件一般為94℃預(yù)變性2min，使DNA雙鏈完全解開。然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45s，使DNA雙鏈再次解鏈；62℃退火30s，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸45s，DNA聚合酶以dNTP為原料，在引物的引導(dǎo)下，合成新的DNA鏈。最后72℃延伸10min，確保所有的DNA片段都得到充分的延伸。通過PCR擴(kuò)增，可以將ATP2C1基因的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增至足夠的量，以便進(jìn)行后續(xù)的測序分析。DNA直接測序是確定ATP2C1基因突變位點(diǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％凝膠電泳檢測后，確認(rèn)擴(kuò)增成功且條帶單一、無雜帶。將符合要求的PCR產(chǎn)物送測序公司，如北京華大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技術(shù)有限公司等進(jìn)行測序。目前常用的測序技術(shù)是Sanger測序法，其原理是利用雙脫氧核苷酸（ddNTP）終止DNA鏈的延伸。在測序反應(yīng)中，將PCR產(chǎn)物、測序引物、DNA聚合酶、dNTP、ddNTP以及緩沖液等混合，進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。由于ddNTP缺少3'-OH基團(tuán)，當(dāng)它摻入到正在合成的DNA鏈中時(shí)，會(huì)導(dǎo)致DNA鏈的延伸終止。通過控制反應(yīng)體系中dNTP和ddNTP的比例，可以得到一系列長度不同的DNA片段，這些片段的末端都帶有特定的熒光標(biāo)記。將這些片段通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離，根據(jù)熒光信號(hào)的不同，就可以確定DNA的堿基序列。測序結(jié)果應(yīng)用專業(yè)的序列分析軟件，如VectorNTI14.2tissue、Chromas軟件（Version2.0）等與人類基因組ATP2C1序列相比較，從而準(zhǔn)確地檢測出是否存在基因突變以及突變的位點(diǎn)和類型。5.2現(xiàn)有治療手段及局限性目前，家族性慢性良性天皰瘡的治療主要以緩解癥狀、減少發(fā)作次數(shù)和控制感染為目的，但尚無根治方法?，F(xiàn)有治療手段主要包括局部治療、系統(tǒng)治療和物理治療等，然而這些治療方法都存在一定的局限性。局部治療中，局部使用類固醇類藥物是常用的治療手段之一。其作用機(jī)制主要是通過抑制炎癥反應(yīng)，減輕皮膚的紅腫、瘙癢和疼痛等癥狀。以氫化可的松、曲安奈德等為代表的糖皮質(zhì)激素乳膏，能夠抑制炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥介質(zhì)的釋放，如抑制白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的產(chǎn)生，從而減輕皮膚的炎癥反應(yīng)。但長期使用可能會(huì)導(dǎo)致皮膚萎縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張、色素沉著等副作用。皮膚萎縮是由于類固醇類藥物抑制了成纖維細(xì)胞的活性，減少了膠原蛋白和彈性纖維的合成；毛細(xì)血管擴(kuò)張則是因?yàn)樗幬镉绊懥搜艿恼Ｊ湛s和舒張功能；色素沉著可能與藥物對(duì)黑素細(xì)胞的影響有關(guān)。光療也是一種常用的局部治療方法，主要包括紫外線B（UVB）光療和光化學(xué)療法（PUVA）。UVB光療通過特定波長的紫外線照射皮膚，調(diào)節(jié)皮膚的免疫反應(yīng)，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)。PUVA則是在口服或外用補(bǔ)骨脂素后，再進(jìn)行長波紫外線（UVA）照射，補(bǔ)骨脂素與UVA結(jié)合后，會(huì)產(chǎn)生一系列光化學(xué)反應(yīng)，影響細(xì)胞的DNA合成和免疫功能，從而達(dá)到治療目的。然而，光療需要多次治療，治療周期較長，患者的依從性較差。而且，長期接受光療會(huì)增加皮膚癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，如鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌。這是因?yàn)樽贤饩€照射可能會(huì)導(dǎo)致皮膚細(xì)胞的DNA損傷，增加基因突變的概率，從而引發(fā)細(xì)胞的癌變。在系統(tǒng)治療方面，口服抗生素常用于控制繼發(fā)感染。當(dāng)家族性慢性良性天皰瘡患者皮膚出現(xiàn)水皰、糜爛時(shí)，容易繼發(fā)細(xì)菌感染，如金黃色葡萄球菌感染?？诜沫h(huán)素類、紅霉素等抗生素，可以抑制細(xì)菌的生長和繁殖。四環(huán)素類抗生素通過與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合，阻止氨基酰-tRNA與核糖體結(jié)合，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成；紅霉素則是與細(xì)菌核糖體50S亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶的活性，阻止肽鏈的延伸，進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長。但長期使用抗生素可能導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，使治療效果逐漸下降。隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌會(huì)通過基因突變或獲得耐藥基因等方式，產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致原本有效的抗生素?zé)o法發(fā)揮作用。免疫抑制劑如氨苯砜、環(huán)孢素等也用于病情嚴(yán)重的患者。氨苯砜可以抑制中性粒細(xì)胞的趨化和吞噬功能，減少炎癥反應(yīng)；環(huán)孢素則主要通過抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。然而，免疫抑制劑會(huì)帶來嚴(yán)重的副作用，如肝腎功能損害、骨髓抑制、感染風(fēng)險(xiǎn)增加等。肝腎功能損害是因?yàn)槊庖咭种苿┬枰ㄟ^肝腎代謝，長期使用會(huì)加重肝腎負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞受損；骨髓抑制會(huì)使白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板等血細(xì)胞生成減少，增加感染和出血的風(fēng)險(xiǎn)；由于免疫系統(tǒng)受到抑制，患者更容易受到各種病原體的侵襲，感染的發(fā)生率明顯增加。5.3基于基因突變的新型治療策略探索隨著對(duì)ATP2C1基因突變與家族性慢性良性天皰瘡發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，基于基因突變的新型治療策略逐漸成為研究熱點(diǎn)，其中基因治療展現(xiàn)出巨大的潛力?；蛑委煹暮诵脑硎峭ㄟ^各種技術(shù)手段，將正常的ATP2C1基因或具有治療作用的基因片段導(dǎo)入患者細(xì)胞內(nèi)，以糾正或補(bǔ)償因基因突變導(dǎo)致的功能缺陷，從而達(dá)到治療疾病的目的。目前，基因治療主要有兩種策略。一種是基因替代療法，即利用病毒載體或非病毒載體，將正常的ATP2C1基因?qū)牖颊叩钠つw細(xì)胞中，使細(xì)胞能夠表達(dá)正常功能的hSPCA1蛋白，恢復(fù)鈣離子的正常轉(zhuǎn)運(yùn)和高爾基體的功能。例如，研究人員嘗試使用腺相關(guān)病毒（AAV）作為載體，AAV具有免疫原性低、能長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)。將攜帶正常ATP2C1基因的AAV載體轉(zhuǎn)染到患者的角質(zhì)形成細(xì)胞中，在細(xì)胞內(nèi)，AAV載體將正?；蛘系交蚪M中，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄和翻譯出正常的hSPCA1蛋白，修復(fù)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能。另一種策略是基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，它能夠?qū)ν蛔兊腁TP2C1基因進(jìn)行精確編輯，在特定的突變位點(diǎn)進(jìn)行基因修復(fù)，使基因恢復(fù)正常功能。通過設(shè)計(jì)特異性的向?qū)NA（gRNA），引導(dǎo)Cas9核酸酶識(shí)別并切割突變的ATP2C1基因位點(diǎn)，然后利用細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)制，在引入的正常DNA模板的引導(dǎo)下，對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因的精準(zhǔn)編輯。在研究進(jìn)展方面，雖然基因治療在家族性慢性良性天皰瘡的治療中仍處于臨床前研究和臨床試驗(yàn)階段，但已經(jīng)取得了一些令人鼓舞的成果。在動(dòng)物模型研究中，通過基因治療，部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的皮膚病變得到了明顯改善。例如，在構(gòu)建的攜帶ATP2C1基因突變的小鼠模型中，采用基因替代療法，將正常的ATP2C1基因?qū)胄∈笃つw細(xì)胞后，小鼠皮膚的棘層松解現(xiàn)象減輕，水皰和糜爛等癥狀得到緩解，皮膚組織的病理結(jié)構(gòu)也趨于正常。在臨床試驗(yàn)方面，一些小規(guī)模的探索性試驗(yàn)正在開展，初步結(jié)果顯示基因治療具有一定的安全性和可行性。然而，基因治療在應(yīng)用于家族性慢性良性天皰瘡的治療中也面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，基因傳遞效率是一個(gè)關(guān)鍵問題。如何將治療基因高效地導(dǎo)入皮膚細(xì)胞，尤其是表皮基底層的干細(xì)胞，是亟待解決的難題。目前的病毒載體和非病毒載體在基因傳遞效率上都存在一定的局限性。病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但存在免疫原性、潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)以及載體容量有限等問題。非病毒載體雖然安全性較高，但轉(zhuǎn)染效率較低，難以滿足治療需求。其次，基因表達(dá)的調(diào)控也是一個(gè)挑戰(zhàn)。導(dǎo)入的基因需要在合適的時(shí)間、合適的細(xì)胞類型中以適當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)，才能發(fā)揮最佳的治療效果。但目前對(duì)于基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制還不完全清楚，難以實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控。此外，基因治療的長期安全性和穩(wěn)定性也需要進(jìn)一步研究。長期觀察發(fā)現(xiàn)，基因治療可能會(huì)導(dǎo)致一些潛在的不良反應(yīng)，如基因插入突變、免疫反應(yīng)等。盡管面臨挑戰(zhàn)，基因治療在家族性慢性良性天皰瘡治療中的未來應(yīng)用前景依然廣闊。隨著基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，新的載體系統(tǒng)和基因編輯技術(shù)不斷涌現(xiàn)，有望提高基因傳遞效率和表達(dá)調(diào)控的精確性。未來，基因治療可能會(huì)成為家族性慢性良性天皰瘡的一種重要治療手段，與現(xiàn)有的治療方法相結(jié)合，為患者提供更有效的治療方案。例如，在疾病早期，通過基因治療從根本上糾正基因突變，預(yù)防疾病的發(fā)生和發(fā)展；在疾病晚期，基因治療可以與局部治療、系統(tǒng)治療等聯(lián)合使用，提高治療效果，改善患者的生活質(zhì)量。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究通過對(duì)家族性慢性良性天皰瘡患者的ATP2C1基因進(jìn)行深入研究，取得了一系列有價(jià)值的成果。在基因突變類型與特點(diǎn)方面，研究發(fā)現(xiàn)ATP2C1基因突變類型多樣，涵蓋錯(cuò)義突變、無義突變、移碼突變和剪切位點(diǎn)突變等。突變主要集中于3個(gè)功能區(qū)，且22外顯子是亞洲人種家族性慢性良性天皰瘡的高風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。不同地區(qū)、種族的患者，其突變位點(diǎn)和類型存在差異，這為進(jìn)一步了解該疾病的遺傳多樣性提供了重要依據(jù)。通過具體案例分析，如山東地區(qū)的家族性慢性良性天皰瘡家系，發(fā)現(xiàn)了新的無義突變位點(diǎn)366T→A（Y122X）；甘肅地區(qū)的散發(fā)病例則檢測到錯(cuò)義突變D644G。這些案例不僅豐富了基因突變數(shù)據(jù)庫，還深入揭示了不同突變類型與家族聚集性、散發(fā)性病例之間的關(guān)系，以及突變與臨床表型之間的關(guān)聯(lián)。在發(fā)病機(jī)制探討上，明確了ATP2C1基因突變導(dǎo)致PMR1蛋白功能受損，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常，進(jìn)而引發(fā)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡增加，橋粒結(jié)構(gòu)和功能破壞，最終導(dǎo)致棘層松解和皮膚病變的發(fā)生。這一機(jī)制的闡明為從分子層面理解家族性慢性良性天皰瘡的發(fā)病過程提供了關(guān)鍵線索?；贏TP2C1基因突變的疾病診斷與治療研究也取得了進(jìn)展。診斷方法上，建立了一套包括外周血DNA抽提、PCR擴(kuò)增和DNA直接測序的基因突變檢測技術(shù)體系，能夠準(zhǔn)確檢測突變位點(diǎn)和類型，為疾病的早期診斷和精準(zhǔn)診斷提供了可靠手段。治療研究方面，現(xiàn)有治療手段雖能緩解癥狀，但存在局限性。而基于基因突變的新型治療策略，如基因治療，展現(xiàn)出巨大潛力，雖面臨基因傳遞效率、表達(dá)調(diào)控和安全性等挑戰(zhàn)，但在動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中已取得初步成果，為未來治療提供了新方向。6.2研究不足與未來展望盡管本研究在家族性慢性良性天皰瘡的ATP2C1基因突變研究方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。從樣本層面來看，本研究雖然涉及多個(gè)家系和散發(fā)病例，但整體樣本量仍然相對(duì)有限。家族性慢性良性天皰瘡本身發(fā)病率較低，收集大量患者樣本存在一定困難。有限的樣本量可能無法全面涵蓋所有的ATP2C1基因突變類型和位點(diǎn)，尤其是一些罕見的突變情況，這可能導(dǎo)致對(duì)基因突變?nèi)驳恼J(rèn)識(shí)存在偏差。此外，樣本來源主要集中在山東和甘肅等特定地區(qū)，在地域代表性上存在局限。不同地區(qū)的人群可能具有不同的遺傳背景和環(huán)境因素，這些因素可能影響基因突變的發(fā)生和分布。因此，本研究結(jié)果在推廣到其他地區(qū)人群時(shí)，可能存在一定的局限性。在研究內(nèi)容的深度和廣度上，也存在一些有待完善的地方。雖然本研究對(duì)基因突變與臨床表型的關(guān)系進(jìn)行了初步探討，但由于樣本量和研究方法的限制，尚未能建立起全面、系統(tǒng)的基因型-表型關(guān)聯(lián)模型。部分患者的臨床表現(xiàn)與基因突變之間的關(guān)系仍然不明確，可能存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的影響因素，如基因修飾、環(huán)境因素與基因的相互作用等。此外，對(duì)于ATP2C1基因突變導(dǎo)致疾病發(fā)生的具體分子機(jī)制，雖然進(jìn)行了初步的探討，但仍有許多細(xì)節(jié)尚未完全闡明。例如，突變后的PMR1蛋白如何具體影響高爾基體中其他蛋白質(zhì)的功能，以及這些變化如何進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)通路改變，都需要進(jìn)一步深入研究。展望未來，家族性慢性良性天皰瘡的ATP2C1基因突變研究具有廣闊的前景和眾多值得深入探索的方向。在發(fā)病機(jī)制研究方面，需要進(jìn)一步深入探究ATP2C1基因突變與疾病發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系?？梢岳孟冗M(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，如單細(xì)胞測序、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因編輯技術(shù)等。通過單細(xì)胞測序技術(shù)，可以深入了解不同細(xì)胞類型在疾病發(fā)生過程中的基因表達(dá)變化，揭示ATP2C1基因突變對(duì)不同細(xì)胞亞群的影響；蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠全面分析蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相互作用，為深入理解基因突變導(dǎo)致的蛋白質(zhì)功能異常提供線索；借助CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)，在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中精確模擬ATP2C1基因突變，研究其對(duì)細(xì)胞生理功能和疾病表型的影響，進(jìn)一步明確發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。治療方法的創(chuàng)新是未來研究的重點(diǎn)之一。除了基因治療外，還可以基于對(duì)發(fā)病機(jī)制的深入理解，開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和藥物。例如，針對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研發(fā)能夠調(diào)節(jié)鈣離子濃度的藥物；或者針對(duì)橋粒結(jié)構(gòu)和功能異常，開發(fā)促進(jìn)橋粒蛋白合成和修復(fù)的藥物。同時(shí)，結(jié)合人工智能和大數(shù)據(jù)技術(shù)，對(duì)大量患者的臨床數(shù)據(jù)和基因信息進(jìn)行分析，篩選出更有效的治療方案，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療。在診斷技術(shù)上，需要進(jìn)一步優(yōu)化和創(chuàng)新。開發(fā)更快速、準(zhǔn)確、便捷的基因突變檢測方法，提高診斷效率和準(zhǔn)確性。例如，基于納米技術(shù)的生物傳感器，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)ATP2C1基因突變的快速、高靈敏度檢測；數(shù)字PCR技術(shù)可以對(duì)低豐度的基因突變進(jìn)行精確檢測，為疾病的早期診斷和病情監(jiān)測提供有力支持。此外，加強(qiáng)國際合作和多中心研究也是未來的重要方向。通過整合全球范圍內(nèi)的研究資源，擴(kuò)大樣本量，涵蓋更多地區(qū)和種族的患者，全面深入地研究ATP2C1基因突變的類型、分布規(guī)律以及與臨床表型的關(guān)系。多中心研究還可以促進(jìn)不同研究團(tuán)隊(duì)之間的交流與合作，共享研究成果和經(jīng)驗(yàn)，加速科研進(jìn)展，為家族性慢性良性天皰瘡的防治提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。參考文獻(xiàn)[1]HaileyH,HaileyH.Familialbenignchronicpemphigus[J].ArchDermatolSyphilol,1939,39(1):1-30.[2]RichardG,BaleSJ,ComptonJG,etal.Ha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