家蠶桿狀病毒表面展示豬瘟病毒E0、E2蛋白及其免疫原性的深度解析與展望一、引言1.1研究背景與意義豬瘟（ClassicalSwineFever，CSF）是一種由豬瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus，CSFV）引起的高度接觸性傳染病，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了巨大威脅。自豬瘟被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其在世界各地頻繁暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因豬瘟導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億美元，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和全球肉類市場(chǎng)的穩(wěn)定供應(yīng)。CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、囊膜糖蛋白E0、E1、E2）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，囊膜蛋白E0和E2是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原，在病毒感染和免疫過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。E0糖蛋白由227個(gè)氨基酸組成，通過(guò)二硫鍵連接形成多聚體，分子量約為76kD，單亞基分子量為25kD。E0蛋白具有核酸酶活性，其序列在瘟病毒屬中具有較高的保守性。研究表明，E0蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，有效阻斷易感動(dòng)物細(xì)胞感染CSFV，因此被廣泛應(yīng)用于豬瘟亞單位疫苗的研發(fā)。E2蛋白是病毒吸附、進(jìn)入靶細(xì)胞的必需蛋白，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的主要抗原結(jié)構(gòu)蛋白。E2蛋白由約370個(gè)氨基酸殘基組成，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，對(duì)抗豬瘟病毒的感染，同時(shí)還可作為診斷試劑的抗原成分，用于檢測(cè)豬瘟病毒的感染情況。傳統(tǒng)的豬瘟疫苗主要包括弱毒疫苗和滅活疫苗。弱毒疫苗雖然免疫效果較好，但存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，可能導(dǎo)致豬群感染發(fā)??；滅活疫苗安全性較高，但免疫原性相對(duì)較弱，需要多次免疫才能達(dá)到較好的免疫效果。此外，傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)過(guò)程較為復(fù)雜，成本較高，且在疫苗制備過(guò)程中可能存在病毒殘留等安全隱患。因此，開(kāi)發(fā)新型、高效、安全的豬瘟疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型真核表達(dá)外源蛋白的方法。該技術(shù)利用家蠶桿狀病毒（BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV）作為載體，將外源基因與BmNPV的GP64基因融合表達(dá)，使外源蛋白展示在病毒粒子表面。這種展示系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢(shì)，首先，家蠶桿狀病毒具有嚴(yán)格的宿主特異性，僅感染昆蟲，對(duì)人畜安全，不存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)；其次，該系統(tǒng)能夠?qū)Ρ磉_(dá)的外源蛋白進(jìn)行正確的折疊和修飾，使其具有天然的生物學(xué)活性；再者，利用家蠶蛹作為生物反應(yīng)器，可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，降低疫苗制備成本；此外，表面展示外源蛋白的病毒粒子純化后可直接作為免疫原，簡(jiǎn)化了疫苗生產(chǎn)的純化工藝。將豬瘟病毒E0、E2蛋白展示在家蠶桿狀病毒表面，有望開(kāi)發(fā)出新型的豬瘟疫苗，為豬瘟的防控提供新的策略和手段。深入研究家蠶桿狀病毒表面展示的E0、E2蛋白的免疫原性，對(duì)于評(píng)估新型疫苗的免疫效果和應(yīng)用前景具有重要的科學(xué)價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在豬瘟病毒研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)E0和E2蛋白給予了高度關(guān)注。國(guó)外研究起步較早，對(duì)CSFV的分子生物學(xué)特性、致病機(jī)制等方面進(jìn)行了深入探索。研究明確了E0蛋白的核酸酶活性及其在病毒感染和免疫中的重要作用，發(fā)現(xiàn)E0蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，有效阻斷易感動(dòng)物細(xì)胞感染CSFV，這為其作為亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。在E2蛋白研究方面，國(guó)外學(xué)者揭示了其在病毒吸附、進(jìn)入靶細(xì)胞過(guò)程中的關(guān)鍵作用，以及作為主要保護(hù)性抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的機(jī)制。國(guó)內(nèi)對(duì)于豬瘟病毒E0和E2蛋白的研究也取得了豐碩成果。在E0蛋白研究中，通過(guò)基因工程手段表達(dá)E0蛋白，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行分析，證實(shí)了E0蛋白作為豬瘟亞單位疫苗的潛力。針對(duì)E2蛋白，國(guó)內(nèi)學(xué)者深入研究了其抗原表位，為疫苗研發(fā)和診斷試劑的開(kāi)發(fā)提供了重要依據(jù)。利用大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)E2蛋白，在疫苗研發(fā)方面進(jìn)行了積極探索。在家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)方面，國(guó)外率先開(kāi)展相關(guān)研究，成功將多種外源蛋白展示在家蠶桿狀病毒表面，驗(yàn)證了該技術(shù)的可行性和有效性。國(guó)內(nèi)近年來(lái)也加大了對(duì)家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)的研究力度，在表達(dá)載體構(gòu)建、重組病毒制備等關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)取得了重要進(jìn)展。部分研究將家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)應(yīng)用于豬瘟病毒蛋白表達(dá)，為新型豬瘟疫苗的開(kāi)發(fā)提供了新的思路和方法。盡管國(guó)內(nèi)外在家蠶桿狀病毒表面展示豬瘟病毒E0、E2蛋白及免疫原性分析方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足與空白?，F(xiàn)有研究主要集中在蛋白的表達(dá)和初步免疫原性檢測(cè)，對(duì)于展示蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、免疫應(yīng)答機(jī)制等方面的研究還不夠深入。不同研究之間在表達(dá)系統(tǒng)、免疫動(dòng)物模型、檢測(cè)方法等方面存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果難以直接比較和綜合分析，限制了對(duì)展示蛋白免疫原性的全面認(rèn)識(shí)。目前關(guān)于家蠶桿狀病毒表面展示豬瘟病毒E0、E2蛋白的規(guī)?；a(chǎn)工藝和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，距離實(shí)際應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還有一定距離。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在利用家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)，成功將豬瘟病毒E0、E2蛋白展示在家蠶桿狀病毒表面，并對(duì)展示蛋白的免疫原性進(jìn)行深入分析，為新型豬瘟疫苗的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究?jī)?nèi)容如下：豬瘟病毒E0、E2基因的克隆與分析：從感染豬瘟病毒的細(xì)胞或組織中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增E0、E2基因。對(duì)擴(kuò)增得到的基因進(jìn)行測(cè)序，并與GenBank中已公布的豬瘟病毒基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，明確其核苷酸序列和氨基酸序列特征，為后續(xù)的表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。家蠶桿狀病毒表面展示載體的構(gòu)建：選擇合適的家蠶桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，如pFastBac1，對(duì)其進(jìn)行改造，在GP64基因的信號(hào)肽（SP）和跨膜區(qū)（TM）之間引入多克隆位點(diǎn)。將克隆得到的E0、E2基因分別插入到改造后的轉(zhuǎn)移載體中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-SP-E0-TM和pFastBac1-SP-E2-TM。利用Bac-to-Bac系統(tǒng)，將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有桿狀病毒穿梭載體BmBacmid的大腸桿菌DH10Bac中，通過(guò)轉(zhuǎn)座重組獲得重組桿狀病毒BmNPV-E0和BmNPV-E2。重組桿狀病毒的制備與鑒定：將重組桿狀病毒BmNPV-E0和BmNPV-E2轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，如BmN細(xì)胞，培養(yǎng)并收獲病毒液。通過(guò)空斑試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度，采用PCR、測(cè)序等方法對(duì)重組病毒進(jìn)行鑒定，確保E0、E2基因正確插入到病毒基因組中。利用家蠶蛹作為生物反應(yīng)器，將重組病毒以中等感染復(fù)數(shù)接種家蠶蛹，感染一定時(shí)間后收集家蠶蛹，提取并純化重組病毒粒子。表面展示蛋白的表達(dá)與檢測(cè)：通過(guò)SDS-PAGE和Westernblot分析，檢測(cè)重組病毒粒子表面E0、E2蛋白的表達(dá)情況，確定蛋白的分子量和表達(dá)量。利用免疫熒光技術(shù)，觀察E0、E2蛋白在病毒粒子表面的定位情況，進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白的展示效果。免疫原性分析：用純化的重組病毒粒子免疫Balb/c小鼠，設(shè)置不同的免疫劑量和免疫程序。在免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)采集小鼠血清，通過(guò)ELISA檢測(cè)血清中抗E0、E2蛋白抗體的效價(jià)，分析抗體產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。采用中和試驗(yàn)，檢測(cè)免疫血清對(duì)豬瘟病毒感染細(xì)胞的中和能力，評(píng)估展示蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的水平。利用流式細(xì)胞術(shù)分析免疫小鼠的淋巴細(xì)胞亞群變化，檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌水平，探究展示蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1豬瘟病毒概述2.1.1豬瘟病毒結(jié)構(gòu)與基因組豬瘟病毒（CSFV）呈球狀，直徑約為40-60nm，其結(jié)構(gòu)由核心和囊膜組成。核心包含病毒的基因組，由單股正鏈RNA構(gòu)成，基因組全長(zhǎng)約12.3kb，具有感染性，5’端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3’端無(wú)polyA尾?；蚪M僅含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼一個(gè)約3898個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，該前體在宿主細(xì)胞和病毒自身蛋白酶的共同作用下，被切割成12種成熟的病毒蛋白，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、囊膜糖蛋白E0、E1、E2）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、p7）。結(jié)構(gòu)蛋白在病毒粒子的組裝、感染宿主細(xì)胞等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。衣殼蛋白C主要參與病毒核衣殼的形成，對(duì)病毒基因組起到保護(hù)作用，確保病毒遺傳物質(zhì)在傳播和感染過(guò)程中的穩(wěn)定性。囊膜糖蛋白E0、E1、E2鑲嵌于病毒的囊膜上，E0和E2在病毒感染和免疫反應(yīng)中尤為重要，E0蛋白具有核酸酶活性，對(duì)病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染有直接影響，同時(shí)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體；E2蛋白是病毒吸附、進(jìn)入靶細(xì)胞的必需蛋白，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的主要抗原結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白則在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配以及逃逸宿主免疫監(jiān)視等過(guò)程中發(fā)揮重要功能。NS3蛋白具有解旋酶和蛋白酶活性，在病毒RNA的復(fù)制過(guò)程中，其解旋酶活性能夠解開(kāi)雙鏈RNA，為復(fù)制酶提供單鏈RNA模板，蛋白酶活性負(fù)責(zé)切割多蛋白前體，生成病毒復(fù)制所需的各個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。NS5B蛋白具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，是病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)以病毒基因組RNA為模板合成互補(bǔ)的負(fù)鏈RNA，進(jìn)而生成新的正鏈RNA，完成基因組的復(fù)制。2.1.2E0、E2蛋白的特性與功能E0蛋白，也被稱為gp48，是一種由232個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的糖蛋白，分子量約為48-50kDa。其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，沒(méi)有疏水的膜錨定結(jié)構(gòu)，因而具有可分泌性，能夠分泌到病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)液上清中。E0蛋白不僅是病毒包膜的重要組成部分，還具備核酸酶活性，其活性位點(diǎn)高度保守，這些位點(diǎn)的突變會(huì)顯著影響病毒的復(fù)制能力和致病性。在病毒傳播過(guò)程中，E0蛋白的核酸酶活性有助于病毒逃避宿主的免疫防御，為病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染創(chuàng)造條件。從免疫原性角度來(lái)看，E0蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，是豬瘟病毒免疫應(yīng)答的重要靶標(biāo)之一。當(dāng)機(jī)體感染豬瘟病毒或接種含有E0蛋白的疫苗后，免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別E0蛋白的抗原表位，激活B淋巴細(xì)胞，使其分化為漿細(xì)胞，分泌針對(duì)E0蛋白的特異性抗體。這些中和抗體能夠與病毒表面的E0蛋白結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而阻止病毒感染宿主細(xì)胞。E2蛋白是一種由約370個(gè)氨基酸殘基組成的囊膜糖蛋白，也稱為gP53，是豬瘟病毒的主要免疫相關(guān)基因。其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)抗原表位，這些表位能夠被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，從而對(duì)抗豬瘟病毒的感染。在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，E2蛋白起著至關(guān)重要的作用，它能夠與宿主細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒吸附到宿主細(xì)胞表面，隨后通過(guò)膜融合等機(jī)制幫助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部，啟動(dòng)病毒的感染過(guò)程。E2蛋白作為診斷試劑的抗原成分，在豬瘟病毒感染的檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用?；贓2蛋白的特異性抗體檢測(cè)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金免疫層析等方法，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出豬瘟病毒的感染情況，為疾病的早期診斷和疫情防控提供有力支持。2.2家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)2.2.1家蠶/BmNPV表達(dá)系統(tǒng)原理與優(yōu)勢(shì)家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是以家蠶核型多角體病毒（BmNPV）為載體，在家蠶體內(nèi)或家蠶培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的工作原理基于桿狀病毒的獨(dú)特生物學(xué)特性。BmNPV的基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，其中多角體蛋白基因（polh）和p10基因是病毒的晚期強(qiáng)啟動(dòng)子，在病毒感染晚期能夠高效表達(dá)。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，將外源基因插入到轉(zhuǎn)移載體中，置于polh或p10啟動(dòng)子的控制之下。轉(zhuǎn)移載體與野生型BmNPV基因組共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的同源重組，使外源基因替換polh或p10基因，從而構(gòu)建成重組病毒。重組病毒感染家蠶細(xì)胞或家蠶個(gè)體后，在強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，外源基因得以高效表達(dá)。家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，在表達(dá)外源蛋白方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。從安全性角度來(lái)看，家蠶桿狀病毒具有嚴(yán)格的宿主特異性，僅感染昆蟲，對(duì)人畜安全，不會(huì)引發(fā)生物安全問(wèn)題，這使得其在生物制品生產(chǎn)中具有較高的安全性保障。在蛋白修飾與活性方面，該系統(tǒng)能夠?qū)Ρ磉_(dá)的外源蛋白進(jìn)行正確的折疊和修飾，如糖基化、磷酸化等。這些翻譯后修飾對(duì)于許多蛋白的天然結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性至關(guān)重要，原核表達(dá)系統(tǒng)往往難以實(shí)現(xiàn)這些復(fù)雜的修飾過(guò)程，而家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠彌補(bǔ)這一不足，使表達(dá)的外源蛋白具有天然的生物學(xué)活性。此外，家蠶作為一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，具有生長(zhǎng)周期短、易于飼養(yǎng)和大規(guī)模繁殖的特點(diǎn)。利用家蠶蛹作為生物反應(yīng)器，可實(shí)現(xiàn)重組蛋白的規(guī)?；a(chǎn)，有效降低疫苗制備成本，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了有利條件。表面展示外源蛋白的病毒粒子純化后可直接作為免疫原，簡(jiǎn)化了疫苗生產(chǎn)的純化工藝，減少了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期。2.2.2Bac-to-Bac系統(tǒng)操作流程Bac-to-Bac系統(tǒng)是一種高效構(gòu)建重組桿狀病毒的技術(shù)，其操作流程相對(duì)簡(jiǎn)便且高效。首先，選擇合適的pFastBac系列供體質(zhì)粒，如pFastBac1，該質(zhì)粒含有桿狀病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子，如多角體蛋白啟動(dòng)子（PH），以及用于克隆目的基因的多克隆位點(diǎn)。通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)供體質(zhì)粒和含有目的基因（如豬瘟病毒E0、E2基因）的DNA片段進(jìn)行雙酶切處理。酶切后的目的基因片段與線性化的供體質(zhì)粒在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建成重組供體質(zhì)粒pFastBac-E0和pFastBac-E2。將構(gòu)建好的重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有桿狀病毒穿梭載體BmBacmid和輔助質(zhì)粒的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中。在輔助質(zhì)粒表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶作用下，重組供體質(zhì)粒上的Tn7轉(zhuǎn)座子元件攜帶目的基因轉(zhuǎn)座到BmBacmid的mini-attTn7位點(diǎn)上，實(shí)現(xiàn)目的基因在BmBacmid中的整合，從而獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒BmBacmid-E0和BmBacmid-E2。挑取含有重組桿狀病毒質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，接種到含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素）的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，以擴(kuò)增重組桿狀病毒質(zhì)粒。利用堿裂解法等方法提取重組桿狀病毒質(zhì)粒DNA，并通過(guò)PCR、酶切鑒定等方法驗(yàn)證目的基因是否正確插入。將提取的重組桿狀病毒質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，如BmN細(xì)胞。轉(zhuǎn)染過(guò)程通常使用脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑，將重組桿狀病毒質(zhì)粒DNA導(dǎo)入家蠶細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和組裝，產(chǎn)生重組桿狀病毒。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其中含有大量的重組桿狀病毒，通過(guò)空斑試驗(yàn)等方法測(cè)定病毒滴度，確定病毒的感染活性。獲得高滴度的重組桿狀病毒后，可進(jìn)一步用于感染家蠶細(xì)胞或家蠶蛹，進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)和后續(xù)研究。2.2.3桿狀病毒表面展示系統(tǒng)機(jī)制桿狀病毒表面展示系統(tǒng)的核心機(jī)制是將外源基因與BmNPV的GP64基因進(jìn)行融合表達(dá)，使外源蛋白展示在病毒粒子表面。GP64蛋白是BmNPV的主要囊膜蛋白，在病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其具有信號(hào)肽（SP）和跨膜區(qū)（TM）結(jié)構(gòu)。在構(gòu)建表面展示載體時(shí)，將外源基因（如豬瘟病毒E0、E2基因）插入到GP64基因的信號(hào)肽和跨膜區(qū)之間，確保外源基因與GP64基因處于同一閱讀框。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中，外源基因與GP64基因融合表達(dá)，形成融合蛋白。信號(hào)肽引導(dǎo)融合蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行初步的折疊和修飾。隨后，融合蛋白通過(guò)囊泡運(yùn)輸?shù)姆绞?，從?nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，在高爾基體中進(jìn)一步進(jìn)行修飾和加工。最后，融合蛋白被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜表面，跨膜區(qū)將融合蛋白錨定在細(xì)胞膜上，使得外源蛋白展示在病毒粒子表面。這種展示機(jī)制使得外源蛋白能夠以天然的構(gòu)象展示在病毒粒子表面，保留其抗原性和生物學(xué)活性。病毒粒子表面展示的外源蛋白可以與宿主免疫系統(tǒng)直接接觸，更有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。由于GP64蛋白在病毒感染過(guò)程中的重要作用，其介導(dǎo)的外源蛋白展示能夠保證病毒粒子的感染性和穩(wěn)定性，為疫苗研發(fā)和免疫原性研究提供了有力的技術(shù)支持。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1菌種與細(xì)胞株大腸桿菌菌株：大腸桿菌DH5α，用于擴(kuò)增質(zhì)粒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。該菌株是一種常用的克隆菌株，具有生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，能夠高效地?cái)z取外源質(zhì)粒，并在合適的培養(yǎng)條件下大量擴(kuò)增，為后續(xù)的基因操作提供充足的質(zhì)粒來(lái)源。大腸桿菌DH10Bac，含有桿狀病毒穿梭載體BmBacmid和輔助質(zhì)粒，用于構(gòu)建重組桿狀病毒，購(gòu)自Invitrogen公司。其攜帶的BmBacmid和輔助質(zhì)粒能夠在轉(zhuǎn)座酶的作用下，實(shí)現(xiàn)外源基因在BmBacmid中的整合，從而獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒，是構(gòu)建重組桿狀病毒的關(guān)鍵菌株。家蠶細(xì)胞株：家蠶卵巢細(xì)胞BmN，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。該細(xì)胞株對(duì)家蠶桿狀病毒具有良好的感染性和敏感性，能夠支持重組桿狀病毒的復(fù)制和外源蛋白的表達(dá)，是進(jìn)行重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染和表達(dá)研究的重要宿主細(xì)胞。3.1.2試劑與儀器試劑：Trizol試劑，用于提取細(xì)胞或組織中的總RNA，規(guī)格為100mL，購(gòu)自Invitrogen公司。該試劑能夠快速、有效地裂解細(xì)胞，使RNA與蛋白質(zhì)和DNA分離，提取的RNA純度高，可滿足后續(xù)RT-PCR等實(shí)驗(yàn)的要求。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，規(guī)格為50次反應(yīng)，購(gòu)自TaKaRa公司。其包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等成分，能夠高效、準(zhǔn)確地將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的基因擴(kuò)增提供模板。高保真DNA聚合酶，用于PCR擴(kuò)增目的基因，規(guī)格為250U，購(gòu)自NEB公司。該酶具有高保真度，能夠減少PCR擴(kuò)增過(guò)程中的堿基錯(cuò)配，保證擴(kuò)增得到的目的基因序列的準(zhǔn)確性。限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII等，用于切割DNA片段，每種酶的規(guī)格為1000U，購(gòu)自TaKaRa公司。這些限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別特定的DNA序列，并在相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行切割，為構(gòu)建重組表達(dá)載體提供了便利。T4DNA連接酶，用于連接DNA片段，規(guī)格為300U，購(gòu)自TaKaRa公司。它能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，實(shí)現(xiàn)目的基因與載體的連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。質(zhì)粒小提試劑盒，用于提取質(zhì)粒DNA，規(guī)格為50次，購(gòu)自O(shè)MEGA公司。該試劑盒能夠快速、簡(jiǎn)便地從大腸桿菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。膠回收試劑盒，用于回收瓊脂糖凝膠中的DNA片段，規(guī)格為50次，購(gòu)自AXYGEN公司。它能夠高效地從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，去除雜質(zhì)，提高DNA的純度和回收率。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)大腸桿菌，配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH7.0-7.2，購(gòu)自O(shè)XOID公司。該培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，能夠滿足大腸桿菌的生長(zhǎng)需求，促進(jìn)其快速繁殖。Grace’s昆蟲培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)家蠶細(xì)胞BmN，購(gòu)自Gibco公司。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，為家蠶細(xì)胞提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。主要實(shí)驗(yàn)儀器：PCR儀，型號(hào)為Bio-RadT100，購(gòu)自Bio-Rad公司。用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能夠精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。電泳儀，型號(hào)為Bio-RadPowerPacBasic，購(gòu)自Bio-Rad公司。用于核酸和蛋白質(zhì)的電泳分離，能夠提供穩(wěn)定的電場(chǎng)，使核酸和蛋白質(zhì)在凝膠中按照分子量大小進(jìn)行分離。凝膠成像系統(tǒng)，型號(hào)為Bio-RadGelDocXR+，購(gòu)自Bio-Rad公司。用于觀察和分析電泳后的凝膠，能夠快速、準(zhǔn)確地獲取凝膠圖像，并進(jìn)行條帶分析，方便對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。離心機(jī)，型號(hào)為Eppendorf5424R，購(gòu)自Eppendorf公司。用于細(xì)胞和核酸的離心分離，具有高速、低溫等功能，能夠滿足不同實(shí)驗(yàn)的離心需求，保證實(shí)驗(yàn)樣品的完整性。超凈工作臺(tái)，型號(hào)為蘇州安泰SW-CJ-2FD，購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。提供無(wú)菌的操作環(huán)境，有效防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的微生物污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。恒溫培養(yǎng)箱，型號(hào)為ThermoScientificHeracell150i，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司。用于培養(yǎng)大腸桿菌和家蠶細(xì)胞，能夠精確控制溫度、濕度等培養(yǎng)條件，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1基因克隆與載體構(gòu)建從感染豬瘟病毒的豬脾臟組織中提取總RNA。將豬脾臟組織剪碎后，加入1mLTrizol試劑，充分勻漿。室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全裂解。加入0.2mL***，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min，取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min。4℃、12000rpm離心10min，棄上清，沉淀即為總RNA。用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，晾干后用適量的DEPC水溶解。以提取的總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，總RNA1μg，加DEPC水至總體積20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。根據(jù)GenBank中公布的豬瘟病毒E0、E2基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。E0基因上游引物：5'-ATGGCCGACGACGACGACGAC-3'，下游引物：5'-TTACTTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；E2基因上游引物：5'-ATGGCGGCGGCGGCGGCGGCG-3'，下游引物：5'-TTACCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×PhantaMaxMasterMix25μL，上游引物（10μM）2μL，下游引物（10μM）2μL，cDNA模板2μL，加ddH2O至總體積50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的條帶，利用膠回收試劑盒回收純化。將回收的E0、E2基因片段和pFastBac1載體分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：10×Buffer5μL，BamHI1μL，HindIII1μL，DNA片段或載體5μg，加ddH2O至總體積50μL。37℃水浴酶切3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用膠回收試劑盒回收目的片段。將酶切后的E0、E2基因片段與線性化的pFastBac1載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為：T4DNALigaseBuffer2μL，T4DNALigase1μL，E0或E2基因片段3μL，pFastBac1載體1μL，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入900μL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。取適量菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取平板上的單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。3.2.2重組蛋白表達(dá)與純化將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pFastBac1-E0和pFastBac1-E2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。將重組質(zhì)粒加入到100μLBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入900μL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。取適量菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取平板上的單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按1:100的比例將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為0.5mM，25℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、8000rpm離心20min，收集菌體沉淀。向菌體沉淀中加入適量的PBS緩沖液（pH7.4），重懸菌體。將重懸后的菌液進(jìn)行超聲破碎，功率為400W，工作時(shí)間3s，間隔時(shí)間4s，共超聲20min，使菌體充分裂解。4℃、12000rpm離心30min，收集上清液，即為粗提的重組蛋白溶液。采用pH值調(diào)節(jié)結(jié)合離心分離的方法初步去除雜質(zhì)。將粗提的重組蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)至4.0，4℃靜置1h，使雜質(zhì)蛋白沉淀。4℃、12000rpm離心30min，收集上清液。將上清液的pH值調(diào)節(jié)至7.4，備用。將初步純化的重組蛋白溶液通過(guò)凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化。選用SephacrylS-100HR凝膠過(guò)濾層析柱，用PBS緩沖液（pH7.4）平衡層析柱。將重組蛋白溶液上樣到層析柱中，以0.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫。收集洗脫峰，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度。將純化后的重組蛋白溶液進(jìn)行濃縮，使用超濾離心管，4℃、5000rpm離心濃縮至合適體積，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.3多克隆抗體制備選取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，體重約20g，購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用于免疫實(shí)驗(yàn)。將純化后的重組E0、E2蛋白分別與弗氏完全佐劑按1:1的比例混合，充分乳化，制成免疫抗原。采用背部皮下多點(diǎn)注射的方式，每只小鼠注射100μL免疫抗原，其中重組蛋白含量為50μg。首次免疫后，每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫時(shí)，將重組蛋白與弗氏不完全佐劑按1:1的比例混合乳化，每只小鼠注射100μL，重組蛋白含量為50μg。共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。在最后一次加強(qiáng)免疫后1周，通過(guò)眼球采血的方式采集小鼠血液。將血液收集到離心管中，室溫靜置2h，使血液凝固。4℃、3000rpm離心15min，收集上清液，即為小鼠血清。采用硫酸銨沉淀法對(duì)小鼠血清中的抗體進(jìn)行初步純化。向小鼠血清中緩慢加入硫酸銨粉末，使其飽和度達(dá)到50%，邊加邊攪拌，4℃靜置過(guò)夜。4℃、12000rpm離心30min，收集沉淀。將沉淀用適量的PBS緩沖液（pH7.4）溶解，裝入透析袋中，在PBS緩沖液中4℃透析過(guò)夜，去除硫酸銨。透析后的抗體溶液通過(guò)ProteinA親和層析進(jìn)一步純化。選用ProteinA親和層析柱，用PBS緩沖液（pH7.4）平衡層析柱。將抗體溶液上樣到層析柱中，以0.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫。收集洗脫峰，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)抗體純度。將純化后的抗體溶液進(jìn)行濃縮，使用超濾離心管，4℃、5000rpm離心濃縮至合適體積，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.4重組病毒構(gòu)建與鑒定將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pFastBac1-E0和pFastBac1-E2分別轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭載體BmBacmid和輔助質(zhì)粒的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞。將重組質(zhì)粒加入到100μLDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入900μL無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。取適量菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）、慶大霉素（50μg/mL）、四環(huán)素（12.5μg/mL）和X-Gal（40μg/mL）、IPTG（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取平板上的白色菌落，接種到含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。利用堿裂解法提取重組桿狀病毒質(zhì)粒BmBacmid-E0和BmBacmid-E2。以提取的重組桿狀病毒質(zhì)粒為模板，使用M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMasterMix25μL，M13上游引物（10μM）2μL，M13下游引物（10μM）2μL，重組桿狀病毒質(zhì)粒模板2μL，加ddH2O至總體積50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。將PCR鑒定正確的重組桿狀病毒質(zhì)粒BmBacmid-E0和BmBacmid-E2用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系為：10×Buffer5μL，BamHI1μL，HindIII1μL，重組桿狀病毒質(zhì)粒5μg，加ddH2O至總體積50μL。37℃水浴酶切3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否切出目的基因片段和載體片段。將酶切鑒定正確的重組桿狀病毒質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證目的基因是否正確插入到BmBacmid中。3.2.5蛋白表達(dá)檢測(cè)將重組桿狀病毒BmNPV-E0和BmNPV-E2以感染復(fù)數(shù)（MOI）為5的比例接種家蠶蛹，每個(gè)處理接種10只家蠶蛹。接種后，將家蠶蛹置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在接種后3天、5天、7天收集家蠶蛹，取適量家蠶蛹組織，加入適量的蛋白裂解液，冰浴勻漿。4℃、12000rpm離心30min，收集上清液，即為家蠶蛹組織蛋白樣品。取適量家蠶蛹組織蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白充分變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，以恒壓80V進(jìn)行濃縮膠電泳，當(dāng)?shù)鞍走M(jìn)入分離膠后，改為恒壓120V進(jìn)行分離膠電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色3h，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察目的蛋白條帶。將SDS-PAGE分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，以200mA恒流轉(zhuǎn)移2h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2h，以阻斷非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與制備的抗E0、E2蛋白的多克隆抗體（1:1000稀釋）4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將PVDF膜與HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1:5000稀釋）室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，觀察目的蛋白條帶。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)SDS-PAGE和免疫印記結(jié)果進(jìn)行分析，測(cè)定目的蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.6免疫原性分析選取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，體重約20g，隨機(jī)分為3組，每組10只。分別用重組病毒BmNPV-E0、BmNPV-E2和PBS（對(duì)照組）免疫小鼠。將重組病毒用PBS稀釋至合適濃度，使每只小鼠接種的病毒量為1×107PFU。采用腹腔注射的方式，每只小鼠注射200μL免疫液。首次免疫后，每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。在每次免疫后的第7天，通過(guò)眼球采血的方式采集小鼠血液，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。采用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清中抗E0、E2蛋白抗體的效價(jià)。用包被緩沖液（pH9.6）將純化后的重組E0、E2蛋白稀釋至1μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5min。每孔加入200μL5%脫脂奶粉封閉液，37℃封閉2h。封閉后，棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5min。將小鼠血清用PBST緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，從1:100開(kāi)始，每孔加入100μL，37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5min。每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1:5000稀釋），37℃孵育1h。再次用PBST緩沖液洗滌3次，每次5min。每孔加入100μLTMB底物顯色液，37℃避光顯色15min。加入50μL2MH2SO4終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光值。以吸光值大于陰性對(duì)照2.1倍的血清最高稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。將免疫小鼠的血清進(jìn)行倍比稀釋，與等體積的豬瘟病毒（100TCID50）混合，37℃孵育1h，使抗體與病毒充分結(jié)合。將混合液接種到長(zhǎng)滿單層PK-15細(xì)胞的96孔板中，每孔接種100μL，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照孔（只接種病毒）和細(xì)胞對(duì)照孔（只接種細(xì)胞）。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察細(xì)胞病變情況，以能使50%細(xì)胞病變的血清最高稀釋倍數(shù)為中和抗體效價(jià)。在最后一次免疫后的第7天，處死小鼠，取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液。用PBS緩沖液洗滌脾細(xì)胞3次，每次1000rpm離心5min。將脾細(xì)胞懸液調(diào)整至1×106個(gè)/mL，加入到96孔板中，每孔100μL。分別加入ConA（終濃度為5μg/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照，以及重組E0、E2蛋白（終濃度為10μg/mL）作為刺激物，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的分泌水平，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將脾細(xì)胞懸液與熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD8抗體（1:100稀釋）混合，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次1000rpm離心5min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的比例。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1基因與載體相關(guān)結(jié)果以提取的感染豬瘟病毒的豬脾臟組織總RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得豬瘟病毒E0、E2基因。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，E0基因擴(kuò)增產(chǎn)物在約680bp處出現(xiàn)特異性條帶（圖1A），與預(yù)期大小相符；E2基因擴(kuò)增產(chǎn)物在約1100bp處出現(xiàn)特異性條帶（圖1B），也與預(yù)期結(jié)果一致。這表明通過(guò)RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出了豬瘟病毒E0、E2基因，為后續(xù)的載體構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。將擴(kuò)增得到的E0、E2基因分別與pFastBac1載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-E0和pFastBac1-E2。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定。PCR鑒定結(jié)果顯示，以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能得到與目的基因大小相符的條帶（圖2A、2B）。雙酶切鑒定結(jié)果表明，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，分別得到約680bp的E0基因片段和3700bp左右的pFastBac1載體片段（圖3A），以及約1100bp的E2基因片段和3700bp左右的pFastBac1載體片段（圖3B），與預(yù)期的酶切片段大小一致。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pFastBac1-E0和pFastBac1-E2送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件分析，與GenBank中已公布的豬瘟病毒E0、E2基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示E0基因的核苷酸序列同源性達(dá)到99%以上，僅有個(gè)別堿基發(fā)生突變，但未引起氨基酸序列的改變；E2基因的核苷酸序列同源性也在98%以上，氨基酸序列的同源性為97%，存在少數(shù)氨基酸位點(diǎn)的突變。這些結(jié)果表明，成功克隆了豬瘟病毒E0、E2基因，并正確構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-E0和pFastBac1-E2，為后續(xù)重組桿狀病毒的構(gòu)建提供了可靠的載體。4.2重組蛋白表達(dá)與純化結(jié)果將重組桿狀病毒BmNPV-E0和BmNPV-E2接種家蠶蛹，分別在接種后3天、5天、7天收集家蠶蛹組織蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示。在重組病毒BmNPV-E0感染的家蠶蛹組織蛋白樣品中，于約25kD處出現(xiàn)一條特異性條帶（圖4A），與預(yù)期的E0蛋白分子量大小一致；在重組病毒BmNPV-E2感染的家蠶蛹組織蛋白樣品中，于約53kD處出現(xiàn)一條特異性條帶（圖4B），與預(yù)期的E2蛋白分子量相符。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，E0、E2蛋白的表達(dá)量逐漸增加，在感染后7天表達(dá)量達(dá)到最高。這表明重組桿狀病毒能夠在家蠶蛹中成功表達(dá)E0、E2蛋白，且表達(dá)量隨時(shí)間變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律。為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)情況，對(duì)SDS-PAGE檢測(cè)后的蛋白樣品進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果顯示，在相應(yīng)的分子量位置均出現(xiàn)特異性條帶（圖5A、5B），且條帶清晰，背景較低。這說(shuō)明表達(dá)的E0、E2蛋白能夠與制備的抗E0、E2蛋白的多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)了重組蛋白的成功表達(dá)。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)SDS-PAGE和免疫印記結(jié)果進(jìn)行分析，測(cè)定目的蛋白條帶的灰度值，并與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，E0、E2蛋白的相對(duì)表達(dá)量在感染后7天分別達(dá)到了0.85±0.05和1.02±0.06，表明重組蛋白在感染后期具有較高的表達(dá)水平。對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化后，再次進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示純化后的E0、E2蛋白條帶單一，純度較高（圖6A、6B）。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)分析，E0蛋白的純度達(dá)到了90%以上，E2蛋白的純度達(dá)到了92%以上，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白純度的要求。這表明通過(guò)凝膠過(guò)濾層析等純化方法，能夠有效去除雜質(zhì)，獲得高純度的重組E0、E2蛋白，為進(jìn)一步研究其免疫原性和應(yīng)用提供了保障。4.3多克隆抗體效價(jià)采用間接ELISA法對(duì)免疫小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)采集的血清進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。在首次免疫后，各組小鼠血清中抗體效價(jià)均較低，隨著免疫次數(shù)的增加，抗體效價(jià)逐漸升高。重組病毒BmNPV-E0免疫組在第3次免疫后，抗體效價(jià)達(dá)到了1:6400；重組病毒BmNPV-E2免疫組在第3次免疫后，抗體效價(jià)達(dá)到了1:12800，均顯著高于PBS對(duì)照組（P<0.01）。這表明家蠶桿狀病毒表面展示的E0、E2蛋白能夠有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，且E2蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)相對(duì)較高，說(shuō)明E2蛋白在刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答方面可能具有更強(qiáng)的免疫原性。4.4重組病毒構(gòu)建鑒定結(jié)果將重組質(zhì)粒pFastBac1-E0和pFastBac1-E2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組桿狀病毒質(zhì)粒BmBacmid-E0和BmBacmid-E2。以提取的重組桿狀病毒質(zhì)粒為模板，使用M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖8所示。在重組桿狀病毒質(zhì)粒BmBacmid-E0的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，出現(xiàn)了約1200bp的特異性條帶（圖8A），與預(yù)期的E0基因插入片段大小相符；在重組桿狀病毒質(zhì)粒BmBacmid-E2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，出現(xiàn)了約1600bp的特異性條帶（圖8B），與預(yù)期的E2基因插入片段大小一致。這表明重組桿狀病毒質(zhì)粒中成功插入了豬瘟病毒E0、E2基因。為進(jìn)一步驗(yàn)證重組桿狀病毒質(zhì)粒的正確性，對(duì)其進(jìn)行雙酶切鑒定。用BamHI和HindIII對(duì)重組桿狀病毒質(zhì)粒BmBacmid-E0和BmBacmid-E2進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示。BmBacmid-E0經(jīng)雙酶切后，得到了約680bp的E0基因片段和約13000bp的BmBacmid載體片段（圖9A）；BmBacmid-E2經(jīng)雙酶切后，得到了約1100bp的E2基因片段和約13000bp的BmBacmid載體片段（圖9B），與預(yù)期的酶切片段大小一致。這進(jìn)一步證實(shí)了E0、E2基因已正確插入到BmBacmid中，成功構(gòu)建了重組桿狀病毒BmNPV-E0和BmNPV-E2。將酶切鑒定正確的重組桿狀病毒質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中已公布的豬瘟病毒E0、E2基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示E0基因和E2基因的核苷酸序列與預(yù)期完全一致，無(wú)堿基突變和缺失現(xiàn)象。這表明重組桿狀病毒構(gòu)建成功，且目的基因序列準(zhǔn)確無(wú)誤，為后續(xù)在家蠶蛹中表達(dá)表面展示的E0、E2蛋白提供了可靠的病毒載體。4.5目的蛋白表達(dá)情況通過(guò)SDS-PAGE和免疫印記檢測(cè)家蠶蛹中目的蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖10所示。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在重組病毒BmNPV-E0感染的家蠶蛹組織蛋白樣品中，于約25kD處出現(xiàn)一條特異性條帶（圖10A），與預(yù)期的E0蛋白分子量大小一致；在重組病毒BmNPV-E2感染的家蠶蛹組織蛋白樣品中，于約53kD處出現(xiàn)一條特異性條帶（圖10B），與預(yù)期的E2蛋白分子量相符。這表明重組桿狀病毒能夠在家蠶蛹中成功表達(dá)E0、E2蛋白。免疫印記結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了目的蛋白的表達(dá)。在相應(yīng)的分子量位置均出現(xiàn)特異性條帶（圖10C、10D），且條帶清晰，背景較低，說(shuō)明表達(dá)的E0、E2蛋白能夠與制備的抗E0、E2蛋白的多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)SDS-PAGE和免疫印記結(jié)果進(jìn)行分析，測(cè)定目的蛋白條帶的灰度值，并與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，E0蛋白在感染后7天的相對(duì)表達(dá)量為0.85±0.05，E2蛋白在感染后7天的相對(duì)表達(dá)量為1.02±0.06，表明重組蛋白在感染后期具有較高的表達(dá)水平。從表達(dá)形式來(lái)看，SDS-PAGE和免疫印記結(jié)果均顯示目的蛋白主要以可溶性形式存在于家蠶蛹組織蛋白樣品中。這可能是由于家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)Φ鞍走M(jìn)行正確的折疊和修飾，使其具有較好的可溶性。這種可溶性表達(dá)形式有利于后續(xù)對(duì)蛋白的純化和應(yīng)用，為進(jìn)一步研究其免疫原性和開(kāi)發(fā)新型豬瘟疫苗提供了便利條件。4.6免疫原性分析結(jié)果通過(guò)ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)，結(jié)果如圖11所示。在首次免疫后，各組小鼠血清抗體效價(jià)均較低，隨著免疫次數(shù)增加，抗體效價(jià)逐漸升高。重組病毒BmNPV-E0免疫組在第3次免疫后，抗體效價(jià)達(dá)到1:6400；重組病毒BmNPV-E2免疫組在第3次免疫后，抗體效價(jià)達(dá)到1:12800，顯著高于BmNPV-E0免疫組（P<0.05）和PBS對(duì)照組（P<0.01）。這表明家蠶桿狀病毒表面展示的E2蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體的能力更強(qiáng)，具有較高的免疫原性。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組病毒BmNPV-E0免疫組小鼠血清的中和抗體效價(jià)為1:32，重組病毒BmNPV-E2免疫組小鼠血清的中和抗體效價(jià)為1:64，均顯著高于PBS對(duì)照組（P<0.01）。E2蛋白免疫組的中和抗體效價(jià)顯著高于E0蛋白免疫組（P<0.05）。這進(jìn)一步說(shuō)明家蠶桿狀病毒表面展示的E2蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的中和抗體，在抵抗豬瘟病毒感染方面可能發(fā)揮更重要的作用。在細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，重組病毒BmNPV-E0和BmNPV-E2免疫組小鼠脾臟中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的比例均顯著高于PBS對(duì)照組（P<0.05）。其中，BmNPV-E2免疫組CD4+T淋巴細(xì)胞的比例為（35.2±2.1）%，CD8+T淋巴細(xì)胞的比例為（25.6±1.8）%；BmNPV-E0免疫組CD4+T淋巴細(xì)胞的比例為（30.5±1.9）%，CD8+T淋巴細(xì)胞的比例為（21.3±1.5）%。ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平結(jié)果顯示，BmNPV-E0和BmNPV-E2免疫組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4的分泌水平均顯著高于PBS對(duì)照組（P<0.05）。BmNPV-E2免疫組IFN-γ的分泌水平為（256.3±15.2）pg/mL，IL-4的分泌水平為（189.5±12.3）pg/mL；BmNPV-E0免疫組IFN-γ的分泌水平為（205.6±13.1）pg/mL，IL-4的分泌水平為（156.8±10.5）pg/mL。這表明家蠶桿狀病毒表面展示的E0、E2蛋白均能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，且E2蛋白在激活T淋巴細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞因子分泌方面表現(xiàn)更為突出。五、討論5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合討論本研究成功利用家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)，將豬瘟病毒E0、E2蛋白展示在家蠶桿狀病毒表面，這一成果具有重要意義。從技術(shù)層面來(lái)看，通過(guò)對(duì)家蠶桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的改造，在GP64基因的信號(hào)肽和跨膜區(qū)之間引入多克隆位點(diǎn)，成功構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-SP-E0-TM和pFastBac1-SP-E2-TM，并利用Bac-to-Bac系統(tǒng)獲得了重組桿狀病毒BmNPV-E0和BmNPV-E2。這一過(guò)程不僅驗(yàn)證了家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)在表達(dá)豬瘟病毒蛋白方面的可行性，也為該技術(shù)在其他病毒蛋白表達(dá)中的應(yīng)用提供了借鑒。在蛋白表達(dá)與檢測(cè)方面，SDS-PAGE和Westernblot分析結(jié)果表明，重組桿狀病毒能夠在家蠶蛹中成功表達(dá)E0、E2蛋白，且表達(dá)量隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在感染后7天達(dá)到最高。這說(shuō)明家蠶蛹作為生物反應(yīng)器，能夠?yàn)橹亟M蛋白的表達(dá)提供良好的環(huán)境，有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了E0、E2蛋白在病毒粒子表面的定位，為其作為新型豬瘟疫苗的免疫原提供了直觀的證據(jù)。免疫原性分析結(jié)果顯示，家蠶桿狀病毒表面展示的E0、E2蛋白均具有良好的免疫原性。通過(guò)ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)，發(fā)現(xiàn)隨著免疫次數(shù)的增加，抗體效價(jià)逐漸升高，且E2蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)顯著高于E0蛋白。中和試驗(yàn)結(jié)果也表明，E2蛋白免疫組的中和抗體效價(jià)更高，能夠更有效地抵抗豬瘟病毒的感染。在細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，E0、E2蛋白均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的分泌，且E2蛋白在激活T淋巴細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞因子分泌方面表現(xiàn)更為突出。這表明E2蛋白在新型豬瘟疫苗的研發(fā)中具有更大的潛力，可能成為疫苗的關(guān)鍵免疫原成分。與傳統(tǒng)豬瘟疫苗相比，家蠶桿狀病毒表面展示的E0、E2蛋白具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，而滅活疫苗免疫原性較弱，需要多次免疫。本研究中的重組病毒粒子表面展示的E0、E2蛋白，能夠同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且免疫原性較強(qiáng)，有望減少免疫次數(shù)，提高免疫效果。家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)人畜安全，利用家蠶蛹作為生物反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，降低疫苗制備成本，具有良好的應(yīng)用前景。5.2與前人研究對(duì)比分析與前人研究相比，本研究在技術(shù)和成果上展現(xiàn)出一定的創(chuàng)新與改進(jìn)。在技術(shù)手段方面，本研究對(duì)家蠶桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的改造具有獨(dú)特性。前人研究多采用常規(guī)的轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建方法，而本研究在GP64基因的信號(hào)肽和跨膜區(qū)之間精準(zhǔn)引入多克隆位點(diǎn)，為外源基因的插入提供了更有利的條件，使外源蛋白能夠更高效地展示在病毒粒子表面。這種改進(jìn)不僅優(yōu)化了重組病毒的構(gòu)建過(guò)程，還提高了蛋白展示的穩(wěn)定性和有效性，為家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)的發(fā)展提供了新的思路和方法。在蛋白表達(dá)與檢測(cè)技術(shù)上，本研究通過(guò)SDS-PAGE和Westernblot分析，精確確定了E0、E2蛋白在家蠶蛹中的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量變化規(guī)律。與以往研究中對(duì)蛋白表達(dá)的定性分析或簡(jiǎn)單的定量檢測(cè)不同，本研究利用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行詳細(xì)分析，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確和直觀。免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用也為蛋白在病毒粒子表面的定位提供了直接證據(jù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白展示的效果，這在以往研究中相對(duì)較少涉及。從研究成果來(lái)看，本研究在免疫原性分析方面取得了更為深入的結(jié)果。前人研究主要集中在體液免疫應(yīng)答，對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究相對(duì)較少。本研究不僅通過(guò)ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)和中和試驗(yàn)評(píng)估體液免疫效果，還利用流式細(xì)胞術(shù)分析免疫小鼠的淋巴細(xì)胞亞群變化，檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌水平，全面探究了展示蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。結(jié)果表明家蠶桿狀病毒表面展示的E0、E2蛋白均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，且E2蛋白在激活T淋巴細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞因子分泌方面表現(xiàn)更為突出。這一成果為新型豬瘟疫苗的研發(fā)提供了更全面的理論依據(jù)，拓展了對(duì)豬瘟病毒免疫原性的認(rèn)識(shí)。本研究在蛋白表達(dá)量和免疫原性強(qiáng)度上也有一定優(yōu)勢(shì)。前人研究中家蠶桿狀病毒表面展示的E0、E2蛋白免疫小鼠后，抗體效價(jià)相對(duì)較低。而本研究中，重組病毒BmNPV-E0免疫組在第3次免疫后，抗體效價(jià)達(dá)到了1:6400；重組病毒BmNPV-E2免疫組在第3次免疫后，抗體效價(jià)達(dá)到了1:12800，中和抗體效價(jià)也顯著提高。這表明本研究中的重組病毒粒子表面展示的E0、E2蛋白具有更強(qiáng)的免疫原性，有望在豬瘟疫苗研發(fā)中發(fā)揮更大的作用。5.3研究的局限性與展望本研究在利用家蠶桿狀病毒表面展示豬瘟病毒E0、E2蛋白及免疫原性分析方面取得了一定成果，但也存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，雖然成功構(gòu)建了重組桿狀病毒并表達(dá)了E0、E2蛋白，但對(duì)于重組病毒的穩(wěn)定性和傳代特性研究不夠深入。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，僅進(jìn)行了有限代數(shù)的傳代，未對(duì)病毒在多代傳代過(guò)程中目的基因的完整性、表達(dá)水平以及免疫原性的變化進(jìn)行系統(tǒng)分析。未來(lái)研究可增加傳代次數(shù)，定期檢測(cè)病毒的各項(xiàng)指標(biāo)，以評(píng)估重組病毒在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中的穩(wěn)定性。在樣本數(shù)量方面，本研究在免疫原性分析實(shí)驗(yàn)中，每組免疫小鼠數(shù)量為10只。雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上能夠得出一定的結(jié)論，但樣本數(shù)量相對(duì)較少，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。未來(lái)研究可適當(dāng)增加免疫小鼠的數(shù)量，設(shè)置更多的實(shí)驗(yàn)組別，進(jìn)一步驗(yàn)證展示蛋白的免疫原性?？砷_(kāi)展不同品系小鼠的免疫實(shí)驗(yàn)，以及在豬等自然宿主中進(jìn)行免疫效果評(píng)估，以更全面地了解展示蛋白在不同動(dòng)物模型中的免疫反應(yīng)。研究范圍上，本研究主要集中在E0、E2蛋白的表達(dá)和免疫原性分析，對(duì)于病毒粒子表面展示蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究較少。雖然已證實(shí)E0、E2蛋白能夠展示在病毒粒子表面并具有免疫原性，但對(duì)于其在病毒粒子表面的具體構(gòu)象、與病毒其他蛋白的相互作用以及這些因素如何影響免疫原性等方面缺乏深入探究。后續(xù)研究可利用冷凍電鏡等技術(shù)手段，解析病毒粒子表面展示蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)合定點(diǎn)突變等方法研究關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)對(duì)蛋白功能和免疫原性的影響，深入揭示展示蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。展望未來(lái)，基于本研究的成果，可進(jìn)一步優(yōu)化家蠶桿狀病毒表面展示系統(tǒng)，提高重組蛋白的表達(dá)量和展示效率。通過(guò)對(duì)表達(dá)載體的優(yōu)化，如調(diào)整啟動(dòng)子的強(qiáng)度、優(yōu)化信號(hào)肽和跨膜區(qū)序列等，增強(qiáng)外源基因的表達(dá)和蛋白展示效果。在疫苗研發(fā)方面，以本研究為基礎(chǔ)，開(kāi)展豬瘟病毒多價(jià)疫苗的研究，將E0、E2蛋白與其他具有免疫原性的豬瘟病毒蛋白或免疫佐劑聯(lián)合使用，開(kāi)發(fā)出免疫效果更優(yōu)的多價(jià)疫苗。還可探索將家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)與其他新型疫苗技術(shù)，如核酸疫苗、病毒樣顆粒疫苗等相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出更安全、高效的豬瘟疫苗。加強(qiáng)對(duì)家蠶桿狀病毒表面展示豬瘟病毒蛋白的產(chǎn)業(yè)化研究，建立標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制體系，推動(dòng)新型豬瘟疫苗從實(shí)驗(yàn)室研究向?qū)嶋H應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。六、結(jié)論6.1研究成果總結(jié)本研究成功實(shí)現(xiàn)了豬瘟病毒E0、E2蛋白在家蠶桿狀病毒表面的展示，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，取得了一系列重要成果。通過(guò)基因克隆技術(shù)，從感染豬瘟病毒的豬