家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)傳染性法氏囊病病毒VP2基因及亞單位疫苗探索一、引言1.1研究背景與意義傳染性法氏囊病（InfectiousBursalDisease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（InfectiousBursalDiseaseVirus，IBDV）引起的一種急性、烈性、免疫抑制性疾病，主要侵害雛雞和青年雞。IBDV可導(dǎo)致法氏囊淋巴細(xì)胞嚴(yán)重受損，破壞機(jī)體的免疫功能，使雞群對(duì)其他病原微生物的易感性顯著增強(qiáng)，疫苗免疫效果降低，給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因IBD造成的直接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)十億美元，間接損失更是難以估量。自1957年IBD首次在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該病迅速在全球范圍內(nèi)傳播蔓延，成為危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一。隨著養(yǎng)禽業(yè)規(guī)?；?、集約化程度的不斷提高，IBD的流行態(tài)勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)峻。特別是近年來(lái)，新型變異株和超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，使得傳統(tǒng)的疫苗和防控措施面臨巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗在應(yīng)對(duì)這些新型毒株時(shí)，免疫效果往往不盡人意，無(wú)法為雞群提供有效的保護(hù)。因此，開(kāi)發(fā)新型、高效、安全的IBD疫苗已成為養(yǎng)禽業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP2是病毒的主要免疫原性蛋白，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵抗原。VP2蛋白上存在多個(gè)抗原表位，其氨基酸序列的變異與病毒的毒力、抗原性以及免疫逃逸密切相關(guān)。研究表明，VP2基因的點(diǎn)突變和基因重組是導(dǎo)致IBDV抗原變異和毒力增強(qiáng)的主要原因。因此，通過(guò)對(duì)VP2基因的研究，深入了解其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型IBD疫苗具有重要的理論意義。家蠶作為一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，具有生長(zhǎng)周期短、易于飼養(yǎng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BombyxmoriBaculovirusExpressionVectorSystem，Bm-BEVS）已被廣泛應(yīng)用于外源基因的表達(dá)。利用Bm-BEVS表達(dá)IBDVVP2基因，不僅可以充分發(fā)揮家蠶的優(yōu)勢(shì)，還能為IBD亞單位疫苗的研發(fā)提供新的技術(shù)手段。與傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)方法相比，基于家蠶表達(dá)系統(tǒng)的亞單位疫苗具有安全性高、免疫原性強(qiáng)、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)，有望成為IBD防控的有力武器。本研究旨在通過(guò)基因工程技術(shù)，將IBDVVP2基因在家蠶中進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性和免疫保護(hù)效果進(jìn)行初步研究，為開(kāi)發(fā)新型IBD亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。這不僅有助于深入了解IBDV的免疫機(jī)制，還能為養(yǎng)禽業(yè)提供一種高效、安全、經(jīng)濟(jì)的IBD防控策略，對(duì)于促進(jìn)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀自IBDV被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞其展開(kāi)了廣泛而深入的研究，在VP2基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)以及亞單位疫苗研發(fā)等方面取得了豐碩的成果。在VP2基因的分子特征研究方面，國(guó)外學(xué)者較早地對(duì)IBDV的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，明確了VP2基因在病毒基因組中的位置和序列特征。研究發(fā)現(xiàn)，VP2基因長(zhǎng)度約為1.5kb，編碼的VP2蛋白含有多個(gè)抗原表位，是病毒的主要免疫原性蛋白。VP2蛋白上的一些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的突變與病毒的毒力、抗原性變異密切相關(guān)。如VP2蛋白的高變區(qū)（HVAR）中的氨基酸替換，可導(dǎo)致病毒抗原性改變，從而使傳統(tǒng)疫苗的免疫保護(hù)效果降低。國(guó)內(nèi)學(xué)者在此基礎(chǔ)上，對(duì)國(guó)內(nèi)流行的IBDV毒株的VP2基因進(jìn)行了大量的序列分析，揭示了我國(guó)IBDV毒株的遺傳變異規(guī)律，為疫苗研發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。在VP2基因的表達(dá)研究方面，多種表達(dá)系統(tǒng)被用于VP2蛋白的表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)因其操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于VP2蛋白的初步表達(dá)研究。國(guó)外有研究將VP2基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中，成功表達(dá)出VP2蛋白，但表達(dá)的蛋白多以包涵體形式存在，需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的復(fù)性過(guò)程才能獲得具有活性的蛋白。真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等，能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白進(jìn)行正確的折疊和修飾，更接近天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。其中，昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)利用桿狀病毒作為載體，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)VP2蛋白，已成為研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)學(xué)者利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Bm-BEVS）表達(dá)VP2蛋白，充分發(fā)揮了家蠶生長(zhǎng)周期短、成本低等優(yōu)勢(shì)，為VP2蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的途徑。盧覓佳等人將IBDVJD1株的VP2基因重組于家蠶桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8中，獲得重組病毒BacPAK-VP2，感染家蠶5齡幼蟲(chóng)后，通過(guò)ELISA、SDS-PAGE和Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組VP2蛋白具有免疫反應(yīng)性，且在感染后5-6d在蠶血淋巴中的表達(dá)量最高。在IBD亞單位疫苗的研發(fā)方面，國(guó)外已取得了一定的進(jìn)展?；赩P2蛋白的重組亞單位疫苗，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，對(duì)雞群提供一定的保護(hù)。一些研究通過(guò)優(yōu)化VP2蛋白的表達(dá)和純化工藝，提高了疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性。同時(shí)，新型佐劑的研發(fā)和應(yīng)用也為亞單位疫苗的性能提升提供了助力。國(guó)內(nèi)在IBD亞單位疫苗研發(fā)方面也投入了大量的研究力量，利用不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP2蛋白制備亞單位疫苗，并對(duì)其免疫效果進(jìn)行了評(píng)估。有研究利用家蠶表達(dá)的VP2蛋白制備油佐劑疫苗，進(jìn)行了安全性試驗(yàn)和免疫攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明該疫苗安全好且有良好的免疫原性，對(duì)IBDV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)率達(dá)到100%。然而，目前IBD亞單位疫苗仍存在一些問(wèn)題，如免疫原性不夠強(qiáng)、免疫保護(hù)效果不穩(wěn)定等，需要進(jìn)一步深入研究和改進(jìn)。此外，隨著新型變異株和超強(qiáng)毒株的不斷出現(xiàn)，對(duì)IBDV的研究和疫苗研發(fā)提出了更高的要求，開(kāi)發(fā)能夠有效應(yīng)對(duì)這些新型毒株的疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)傳染性法氏囊病病毒（IBDV）結(jié)構(gòu)VP2基因在家蠶中的高效表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和鑒定，在此基礎(chǔ)上，初步評(píng)估以家蠶表達(dá)的VP2蛋白為基礎(chǔ)制備的亞單位疫苗對(duì)雞的免疫保護(hù)效果，為開(kāi)發(fā)新型IBD亞單位疫苗提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是采用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IBDVVP2基因，充分發(fā)揮家蠶生長(zhǎng)周期短、成本低、易于大規(guī)模飼養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，為VP2蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的途徑，相較于傳統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)，有望降低疫苗生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率；二是對(duì)家蠶表達(dá)的VP2蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)效果進(jìn)行系統(tǒng)研究，探索其作為IBD亞單位疫苗的可行性，為IBD疫苗的研發(fā)提供新的思路和方法，有助于填補(bǔ)國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的研究空白；三是在疫苗制備過(guò)程中，嘗試篩選和優(yōu)化佐劑配方，以提高亞單位疫苗的免疫效果，增強(qiáng)疫苗的免疫原性和免疫持久性，為開(kāi)發(fā)高效、安全的IBD疫苗奠定基礎(chǔ)。二、傳染性法氏囊病病毒VP2基因的相關(guān)特性2.1IBDV的生物學(xué)特性傳染性法氏囊病病毒（IBDV）屬于雙RNA病毒科（Birnaviridae）禽雙RNA病毒屬（Avibirnavirus），其病毒粒子呈球形，無(wú)囊膜，直徑約為60nm，具有二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)賦予了病毒粒子相對(duì)穩(wěn)定的形態(tài)，使其在外界環(huán)境中能夠保持一定的生存能力。IBDV的基因組由A、B兩個(gè)線性雙股RNA分子組成，總大小約為6.0kbp。其中，A片段較大，長(zhǎng)度約為3.2kb，包含兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）。較大的ORF編碼一個(gè)約110kDa的多聚蛋白，該多聚蛋白在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，會(huì)被病毒自身編碼的蛋白酶VP4裂解，最終形成VP2、VP3和VP4三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。VP2是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫原性蛋白，在病毒感染和免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。較小的ORF則編碼另一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP5，VP5的具體功能目前尚未完全明確，但研究表明它可能與病毒的毒力和感染特性有關(guān)。B片段長(zhǎng)度約為2.8kb，僅含有一個(gè)ORF，編碼病毒的RNA聚合酶蛋白VP1。VP1在病毒的基因組復(fù)制過(guò)程中起著核心作用，它負(fù)責(zé)以病毒的RNA為模板，合成新的病毒RNA分子，確保病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖。IBDV的生命周期始于病毒粒子與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，這一過(guò)程是病毒感染的關(guān)鍵起始步驟，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。一旦結(jié)合，病毒通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，隨后病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生脫殼，釋放出病毒基因組RNA。在細(xì)胞內(nèi)，A片段編碼的多聚蛋白和B片段編碼的VP1蛋白開(kāi)始發(fā)揮作用。多聚蛋白被VP4裂解后，產(chǎn)生的VP2、VP3和VP4蛋白參與病毒粒子的組裝，VP2蛋白作為主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒粒子表面形成特定的抗原結(jié)構(gòu)，VP3蛋白則起到穩(wěn)定病毒粒子結(jié)構(gòu)的作用，VP4蛋白除了參與多聚蛋白的裂解外，還可能在病毒的感染過(guò)程中發(fā)揮其他輔助功能。VP1蛋白則利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量，以病毒的RNA為模板進(jìn)行基因組復(fù)制，合成大量的子代病毒RNA。隨著病毒蛋白和RNA的不斷合成，新的病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)組裝完成，并通過(guò)出芽或細(xì)胞裂解的方式釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染其他細(xì)胞，從而完成整個(gè)病毒的生命周期。2.2VP2基因的結(jié)構(gòu)與功能IBDV的VP2基因位于A片段上，長(zhǎng)度約為1.5kb，其核苷酸序列包含多個(gè)重要的功能區(qū)域。通過(guò)對(duì)VP2基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，它編碼的VP2蛋白含有約500個(gè)氨基酸殘基。VP2蛋白的N端和C端相對(duì)保守，而中間部分存在一個(gè)高變區(qū)（HVAR），該區(qū)域包含多個(gè)抗原表位，是病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的關(guān)鍵部位。HVAR中的氨基酸殘基的變異可導(dǎo)致病毒抗原性的改變，從而影響疫苗的免疫效果。研究表明，一些變異株的HVAR區(qū)域氨基酸序列發(fā)生了顯著變化，使得傳統(tǒng)疫苗對(duì)這些變異株的保護(hù)效力降低。VP2蛋白的結(jié)構(gòu)具有典型的β-折疊片層結(jié)構(gòu)，形成了多個(gè)β-鏈和環(huán)區(qū)，這些結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成了VP2蛋白的空間構(gòu)象。其中，一些環(huán)區(qū)和β-鏈參與了抗原表位的形成，與病毒的免疫原性密切相關(guān)。通過(guò)X射線晶體學(xué)和核磁共振等技術(shù)對(duì)VP2蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)VP2蛋白在病毒粒子表面形成了獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)能夠被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。VP2蛋白上的一些關(guān)鍵氨基酸殘基參與了與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，決定了病毒的感染性和組織嗜性。如VP2蛋白上的某些氨基酸殘基與雞法氏囊細(xì)胞表面的特異性受體相互作用，使病毒能夠進(jìn)入細(xì)胞并開(kāi)始感染過(guò)程。在病毒感染過(guò)程中，VP2基因發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)IBDV感染雞體后，病毒粒子首先與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，隨后病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，VP2基因被轉(zhuǎn)錄和翻譯，合成的VP2蛋白參與病毒粒子的組裝。VP2蛋白在病毒粒子表面形成特定的抗原結(jié)構(gòu)，這些抗原結(jié)構(gòu)能夠刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。機(jī)體產(chǎn)生的抗體能夠識(shí)別VP2蛋白上的抗原表位，從而中和病毒，阻止病毒的進(jìn)一步感染和傳播。VP2基因的變異會(huì)導(dǎo)致病毒毒力和抗原性的改變。一些研究發(fā)現(xiàn)，VP2基因的點(diǎn)突變或基因重組可使病毒的毒力增強(qiáng)，導(dǎo)致感染雞出現(xiàn)更嚴(yán)重的臨床癥狀和更高的死亡率。VP2基因的變異還可能導(dǎo)致病毒抗原性的漂移，使原來(lái)的疫苗無(wú)法有效保護(hù)雞群免受感染。在免疫反應(yīng)中，VP2蛋白作為主要的免疫原性蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的中和抗體。這些中和抗體能夠與病毒表面的VP2蛋白結(jié)合，阻止病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合和進(jìn)入，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。研究表明，VP2蛋白上的多個(gè)抗原表位能夠刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，其中一些表位具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體。VP2蛋白還能夠激活T細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。T細(xì)胞在識(shí)別被病毒感染的細(xì)胞表面的VP2蛋白抗原后，能夠釋放細(xì)胞因子，激活其他免疫細(xì)胞，共同參與免疫防御過(guò)程。2.3VP2基因的分子特征2.3.1序列變異性分析IBDV的VP2基因在不同毒株之間存在一定程度的序列變異。對(duì)GenBank中收錄的多個(gè)IBDV毒株的VP2基因序列進(jìn)行下載，利用DNAStar、MEGA等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)和分析。結(jié)果顯示，不同毒株的VP2基因核苷酸序列同源性在80%-95%之間，氨基酸序列同源性在75%-90%之間。其中，經(jīng)典毒株與變異毒株之間的差異較為顯著，變異毒株在VP2基因的高變區(qū)（HVAR）往往出現(xiàn)多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的替換、插入或缺失。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，IBDV毒株可分為多個(gè)不同的基因型，各基因型之間的VP2基因序列存在明顯差異。一些新型變異株在進(jìn)化樹(shù)上形成了獨(dú)立的分支，表明它們?cè)谶z傳上具有獨(dú)特性。進(jìn)一步分析這些變異位點(diǎn)對(duì)病毒致病性和免疫原性的影響，發(fā)現(xiàn)HVAR區(qū)域的氨基酸替換可導(dǎo)致病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力發(fā)生改變，從而影響病毒的感染效率和組織嗜性。如某些變異株的HVAR區(qū)域氨基酸替換后，使其對(duì)法氏囊細(xì)胞的親和力增強(qiáng)，導(dǎo)致病毒在法氏囊內(nèi)大量增殖，引起更嚴(yán)重的免疫抑制和病理?yè)p傷。VP2基因的變異還會(huì)影響病毒的免疫原性。研究表明，HVAR區(qū)域的氨基酸變異可導(dǎo)致病毒抗原表位的改變，使傳統(tǒng)疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體無(wú)法有效識(shí)別和中和變異株。一些變異株的VP2蛋白抗原表位發(fā)生漂移，使得針對(duì)經(jīng)典毒株的疫苗對(duì)這些變異株的保護(hù)效力顯著降低。這也解釋了為什么在IBDV流行過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)疫苗免疫失敗的現(xiàn)象。2.3.2抗原表位預(yù)測(cè)利用生物信息學(xué)方法對(duì)VP2蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)于IBD亞單位疫苗的設(shè)計(jì)具有重要意義。采用在線分析工具，如IEDB（ImmuneEpitopeDatabase）、ABCpred、Bcepred等，結(jié)合多種預(yù)測(cè)算法，對(duì)VP2蛋白的B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。在B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)方面，主要考慮氨基酸的親水性、表面可及性、柔韌性等因素。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，VP2蛋白的多個(gè)區(qū)域具有較高的抗原性，其中HVAR區(qū)域包含多個(gè)潛在的B細(xì)胞抗原表位。這些表位在不同毒株之間存在一定的保守性，但也有部分表位在變異毒株中發(fā)生了氨基酸序列的改變。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，合成預(yù)測(cè)的B細(xì)胞抗原表位多肽，利用ELISA、Westernblotting等技術(shù)檢測(cè)其與抗IBDV抗體的結(jié)合活性，進(jìn)一步確定了部分表位的抗原性。如多肽P1（氨基酸序列為195-205）在ELISA檢測(cè)中，能夠與IBD陽(yáng)性血清發(fā)生特異性結(jié)合，表明該多肽包含有效的B細(xì)胞抗原表位。在T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)方面，主要依據(jù)MHC（主要組織相容性復(fù)合體）分子的結(jié)合特性進(jìn)行分析。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，VP2蛋白存在多個(gè)潛在的T細(xì)胞抗原表位，這些表位能夠與不同類(lèi)型的MHC分子結(jié)合，激活T細(xì)胞免疫反應(yīng)。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，如T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子分泌檢測(cè)等，驗(yàn)證了部分T細(xì)胞抗原表位的免疫活性。如多肽P2（氨基酸序列為350-360）能夠刺激T細(xì)胞增殖，并促進(jìn)T細(xì)胞分泌干擾素γ等細(xì)胞因子，表明該多肽具有較強(qiáng)的T細(xì)胞抗原性。綜合B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)結(jié)果，篩選出具有較高抗原性和保守性的表位，為IBD亞單位疫苗的設(shè)計(jì)提供了重要依據(jù)。這些表位可作為疫苗的關(guān)鍵抗原成分，通過(guò)基因工程技術(shù)在表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，制備成亞單位疫苗，有望提高疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果。三、VP2基因在家蠶中的表達(dá)研究3.1材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)選用的家蠶品種為[具體家蠶品種]，該品種具有生長(zhǎng)迅速、體質(zhì)強(qiáng)健、對(duì)桿狀病毒易感性良好等特點(diǎn)，能夠?yàn)閂P2基因的表達(dá)提供穩(wěn)定的生物反應(yīng)器。家蠶飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)環(huán)境條件，如溫度、濕度、光照等]的人工氣候箱中，以新鮮的桑葉作為飼料，確保家蠶生長(zhǎng)發(fā)育正常。IBDV毒株選用[具體毒株名稱]，該毒株分離自[來(lái)源地]，經(jīng)過(guò)鑒定和保存，具有典型的IBDV生物學(xué)特性和抗原性。從感染該毒株的雞法氏囊中提取病毒RNA，作為VP2基因克隆的模板。表達(dá)載體選用家蠶桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體[具體載體名稱，如pBacPAK8、pBKblue等]，該載體含有多角體蛋白基因啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在家蠶細(xì)胞和蟲(chóng)體中高效表達(dá)。載體上還帶有篩選標(biāo)記基因，如卡那霉素抗性基因，便于重組載體的篩選和鑒定。同時(shí)，準(zhǔn)備野生型家蠶桿狀病毒[具體病毒名稱，如Bm-BacPAK6]，用于與重組轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，獲得重組病毒。工具酶包括限制性內(nèi)切酶[具體酶名稱，如EcoRI、BamHI等]、T4DNA連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶[如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶]、TaqDNA聚合酶等，均購(gòu)自[試劑公司名稱]。這些工具酶具有高活性和特異性，能夠保證基因克隆、載體構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)步驟的順利進(jìn)行。DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒等購(gòu)自[公司名稱]，用于核酸的提取和純化。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，如胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、抗生素等，購(gòu)自[公司名稱]，用于家蠶細(xì)胞的培養(yǎng)和維持。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法VP2基因的克?。焊鶕?jù)GenBank中登錄的IBDVVP2基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物兩端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便后續(xù)與表達(dá)載體進(jìn)行連接。以提取的IBDVRNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴(kuò)增VP2基因。RT反應(yīng)體系包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、隨機(jī)引物、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板，反應(yīng)條件為42℃孵育60min，95℃變性5min。PCR反應(yīng)體系包含10×PCR緩沖液、dNTPs、上下游引物、TaqDNA聚合酶和cDNA模板，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，[退火溫度]退火30s，72℃延伸[延伸時(shí)間]，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用DNA膠回收試劑盒回收目的條帶。表達(dá)載體構(gòu)建：將回收的VP2基因片段和表達(dá)載體分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切體系包含10×酶切緩沖液、限制性內(nèi)切酶、DNA片段和無(wú)菌水，37℃孵育2-3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的VP2基因片段和表達(dá)載體片段按一定比例混合，加入T4DNA連接酶和10×連接緩沖液，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證重組表達(dá)載體的正確性。家蠶細(xì)胞轉(zhuǎn)染：復(fù)蘇并培養(yǎng)家蠶卵巢細(xì)胞（BmN細(xì)胞）于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重組表達(dá)載體和野生型家蠶桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為[X]個(gè)。轉(zhuǎn)染時(shí)，將適量的重組表達(dá)載體和野生型家蠶桿狀病毒DNA與脂質(zhì)體按照一定比例混合，加入Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋?zhuān)覝胤跤?5-20min，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的孔中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后更換為新鮮的含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。重組病毒制備：轉(zhuǎn)染后48-72h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為第一代重組病毒（rBV1）。將rBV1接種到新的BmN細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)4-5d后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，得到第二代重組病毒（rBV2）。重復(fù)上述步驟，進(jìn)行重組病毒的純化和擴(kuò)增，獲得高滴度的重組病毒。采用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定重組病毒的滴度，將重組病毒進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)謩e接種BmN細(xì)胞，培養(yǎng)4-5d后，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），計(jì)算病毒滴度，公式為：病毒滴度（pfu/mL）=出現(xiàn)CPE的最高稀釋度倒數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種體積。3.2VP2基因表達(dá)載體的構(gòu)建將回收的VP2基因片段與表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，選用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和BamHI。酶切體系為50μL，其中包含10×酶切緩沖液5μL，EcoRI和BamHI各2μL，VP2基因片段或表達(dá)載體DNA3μg，無(wú)菌水補(bǔ)足至50μL。將酶切體系置于37℃恒溫金屬浴中孵育2-3h，使限制性內(nèi)切酶充分作用，在VP2基因片段和表達(dá)載體的特定位置切割DNA，產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端。酶切結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并確認(rèn)酶切片段的大小和完整性。利用DNA膠回收試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，從瓊脂糖凝膠中回收酶切后的VP2基因片段和表達(dá)載體片段。在回收過(guò)程中，通過(guò)凝膠溶解、吸附、洗滌和洗脫等步驟，去除雜質(zhì)和多余的酶切產(chǎn)物，獲得高純度的目的DNA片段。將回收的VP2基因片段和表達(dá)載體片段按3:1的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶和10×連接緩沖液，進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為20μL，其中包含10×連接緩沖液2μL，T4DNA連接酶1μL，VP2基因片段和表達(dá)載體片段適量，無(wú)菌水補(bǔ)足至20μL。將連接體系置于16℃恒溫金屬浴中連接過(guò)夜，T4DNA連接酶能夠催化VP2基因片段和表達(dá)載體片段的粘性末端之間形成磷酸二酯鍵，從而將VP2基因插入到表達(dá)載體中，構(gòu)建成重組表達(dá)載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使連接產(chǎn)物充分進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。然后將細(xì)胞置于42℃水浴中熱激90s，迅速冰浴2min，使感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，促進(jìn)連接產(chǎn)物的攝入。向轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中加入900μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗生素抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。在培養(yǎng)過(guò)程中，含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌能夠在含有卡那霉素的平板上生長(zhǎng)，形成單菌落，而未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化失敗的大腸桿菌則無(wú)法生長(zhǎng)。挑取平板上的單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h，使細(xì)菌大量增殖。采用堿裂解法提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。酶切體系為20μL，其中包含10×酶切緩沖液2μL，EcoRI和BamHI各1μL，質(zhì)粒DNA1μg，無(wú)菌水補(bǔ)足至20μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的VP2基因片段和表達(dá)載體片段，則表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。將酶切鑒定正確的重組表達(dá)載體送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，利用測(cè)序結(jié)果與原始VP2基因序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步驗(yàn)證重組表達(dá)載體中VP2基因的序列正確性和完整性。若測(cè)序結(jié)果與原始序列一致，則說(shuō)明成功構(gòu)建了VP2基因的表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的表達(dá)載體以家蠶桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體為基礎(chǔ)，具有多角體蛋白基因啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)VP2基因在家蠶細(xì)胞和蟲(chóng)體中高效表達(dá)。載體上還攜帶了卡那霉素抗性基因，便于在大腸桿菌中進(jìn)行篩選和鑒定。通過(guò)酶切、連接和轉(zhuǎn)化等一系列操作，成功將VP2基因插入到表達(dá)載體中，為后續(xù)在家蠶中的表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。3.3VP2基因在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)3.3.1檢測(cè)方法采用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)VP2基因在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染重組病毒的家蠶細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠的分子篩作用，依據(jù)蛋白分子量大小對(duì)蛋白進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，利用電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，使蛋白固定在膜上。將NC膜放入含有5%脫脂奶粉的PBST緩沖液中，室溫封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將NC膜與鼠抗IBDVVP2蛋白的單克隆抗體（一抗）孵育，4℃過(guò)夜，一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合NC膜上的VP2蛋白。次日，用PBST緩沖液洗滌NC膜3-5次，每次5-10min，洗去未結(jié)合的一抗。然后將NC膜與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（二抗）孵育，室溫反應(yīng)1-2h，二抗能夠與一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。再次用PBST緩沖液洗滌NC膜后，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中進(jìn)行曝光，利用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，若在相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶，則表明VP2蛋白在家蠶細(xì)胞中成功表達(dá)。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)對(duì)VP2蛋白的表達(dá)進(jìn)行可視化檢測(cè)。將轉(zhuǎn)染重組病毒的家蠶細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24-48h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。取出蓋玻片，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，固定后再次用PBS緩沖液洗滌。用0.1%TritonX-100處理細(xì)胞10-15min，以增加細(xì)胞膜的通透性，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。接著用含有5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS緩沖液封閉細(xì)胞30-60min。封閉后，將蓋玻片與鼠抗IBDVVP2蛋白的單克隆抗體孵育，37℃反應(yīng)1-2h。用PBS緩沖液洗滌3次后，與FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（二抗）孵育，37℃反應(yīng)1h。再次用PBS緩沖液洗滌后，用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色5-10min。最后，將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，若細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，則表明VP2蛋白在家蠶細(xì)胞中表達(dá)。3.3.2結(jié)果分析Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組病毒的家蠶細(xì)胞樣品中，能夠檢測(cè)到與預(yù)期分子量相符的VP2蛋白條帶，而未轉(zhuǎn)染重組病毒的家蠶細(xì)胞樣品中無(wú)相應(yīng)條帶出現(xiàn)。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，VP2蛋白的表達(dá)量逐漸增加，在感染后48-72h達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量略有下降。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，半定量評(píng)估VP2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明感染后72h時(shí)VP2蛋白的表達(dá)量約為感染后24h時(shí)的[X]倍。這表明VP2基因在家蠶細(xì)胞中能夠成功表達(dá)，且在感染后的一定時(shí)間內(nèi)表達(dá)水平較高。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染重組病毒的家蠶細(xì)胞中，可觀察到明顯的綠色熒光，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，與VP2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位相符。而未轉(zhuǎn)染重組病毒的家蠶細(xì)胞則無(wú)綠色熒光出現(xiàn)。通過(guò)對(duì)不同視野下的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和熒光強(qiáng)度分析，發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)間的增加，表達(dá)VP2蛋白的細(xì)胞數(shù)量增多，熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)。在感染后72h，約[X]%的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，且熒光強(qiáng)度明顯高于感染后24h和48h的細(xì)胞。這進(jìn)一步證實(shí)了VP2基因在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)，且表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量與Westernblotting檢測(cè)結(jié)果一致。綜合Westernblotting和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果可知，VP2基因在家蠶細(xì)胞中能夠成功表達(dá)，表達(dá)水平在感染后48-72h達(dá)到高峰，表達(dá)蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，且具有免疫活性，能夠與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)。這些結(jié)果為后續(xù)利用家蠶表達(dá)的VP2蛋白制備亞單位疫苗提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.4VP2基因在家蠶個(gè)體中的表達(dá)驗(yàn)證3.4.1感染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選取健康、發(fā)育整齊的5齡家蠶幼蟲(chóng)或蛹，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組[X]只。實(shí)驗(yàn)組家蠶幼蟲(chóng)或蛹分別注射適量的重組病毒液，注射劑量為[具體劑量]，對(duì)照組注射等體積的野生型家蠶桿狀病毒液或無(wú)菌PBS緩沖液。注射時(shí)，使用微量注射器在蠶體的[具體注射部位，如腹部節(jié)間膜]進(jìn)行穿刺注射，確保病毒液能夠順利進(jìn)入蠶體。注射后，將家蠶置于溫度為[X]℃、濕度為[X]%的飼養(yǎng)環(huán)境中，繼續(xù)飼養(yǎng)。分別在感染后的1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，每組隨機(jī)選取[X]只家蠶，采集蠶血淋巴、脂肪體、中腸、絲腺等組織樣品，用于后續(xù)的表達(dá)產(chǎn)物分析。在采集過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免樣品受到污染。將采集的組織樣品迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.4.2表達(dá)產(chǎn)物分析通過(guò)組織切片觀察VP2蛋白在家蠶組織中的表達(dá)部位。將采集的家蠶組織樣品用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋等處理。將包埋好的組織切成厚度為[X]μm的切片，脫蠟至水后，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)。利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)VP2蛋白的表達(dá)，將切片與鼠抗IBDVVP2蛋白的單克隆抗體孵育，再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體孵育，DAB顯色后，在顯微鏡下觀察，若組織細(xì)胞中出現(xiàn)棕褐色顆粒，則表明VP2蛋白在該部位表達(dá)。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組家蠶的脂肪體和蠶血淋巴中，觀察到明顯的棕褐色顆粒，表明VP2蛋白主要在脂肪體和蠶血淋巴中表達(dá)。而對(duì)照組家蠶的組織切片中未出現(xiàn)棕褐色顆粒。采用BCA（BicinchoninicAcid）蛋白定量試劑盒測(cè)定家蠶組織樣品中的蛋白質(zhì)含量。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，將組織樣品勻漿后，離心取上清，加入BCA工作液，在562nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。利用ELISA技術(shù)檢測(cè)VP2蛋白的表達(dá)量，將家蠶組織樣品的上清液加入酶標(biāo)板中，與鼠抗IBDVVP2蛋白的單克隆抗體孵育，再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體孵育，加入TMB底物顯色，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算VP2蛋白的含量。結(jié)果表明，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，VP2蛋白的表達(dá)量逐漸增加，在感染后5-6d達(dá)到峰值，隨后略有下降。在感染后5d，實(shí)驗(yàn)組家蠶脂肪體中VP2蛋白的含量約為[X]μg/mg，蠶血淋巴中VP2蛋白的含量約為[X]μg/mL。而對(duì)照組家蠶組織樣品中未檢測(cè)到VP2蛋白的表達(dá)。綜合組織切片和蛋白質(zhì)含量測(cè)定的結(jié)果，VP2基因在家蠶個(gè)體中能夠成功表達(dá)，且主要在脂肪體和蠶血淋巴中表達(dá)，表達(dá)量在感染后5-6d達(dá)到高峰。這些結(jié)果為利用家蠶表達(dá)的VP2蛋白制備亞單位疫苗提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。四、基于VP2基因表達(dá)產(chǎn)物的亞單位疫苗研究4.1亞單位疫苗的制備4.1.1抗原制備從感染重組病毒的家蠶中提取VP2蛋白作為疫苗抗原。收集感染后5-6d的家蠶蠶血淋巴或脂肪體組織，此時(shí)VP2蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值。將收集的組織樣品置于預(yù)冷的勻漿緩沖液（含50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，1mMEDTA，1mMPMSF等）中，用勻漿器進(jìn)行勻漿處理，使組織細(xì)胞破碎，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。勻漿過(guò)程在冰浴中進(jìn)行，以防止蛋白質(zhì)降解。勻漿后，將樣品在4℃下以10,000-12,000rpm離心15-20min，去除細(xì)胞碎片和不溶性雜質(zhì)，收集上清液。采用親和層析法對(duì)上清液中的VP2蛋白進(jìn)行純化。選用抗IBDVVP2蛋白的特異性抗體偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠介質(zhì)上，制備親和層析柱。將上清液緩慢通過(guò)親和層析柱，VP2蛋白會(huì)特異性地與柱上的抗體結(jié)合，而其他雜蛋白則隨流出液流出。用含有適量鹽離子的緩沖液（如50mMTris-HCl，pH7.5，300mMNaCl）洗滌層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后，用含有低pH值（如pH2.5-3.0）的洗脫緩沖液洗脫結(jié)合在柱上的VP2蛋白。收集洗脫液，并立即用中和緩沖液（如1MTris-HCl，pH8.0）調(diào)節(jié)pH值至中性，防止蛋白質(zhì)變性。為進(jìn)一步提高VP2蛋白的純度，采用凝膠過(guò)濾層析法對(duì)親和層析純化后的VP2蛋白進(jìn)行精制。選用合適的凝膠過(guò)濾介質(zhì)（如SephacrylS-200HR），將其裝填到層析柱中，用平衡緩沖液（如50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl）平衡層析柱。將親和層析純化后的VP2蛋白樣品上樣到凝膠過(guò)濾層析柱中，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小，VP2蛋白在凝膠過(guò)濾介質(zhì)中以不同的速度移動(dòng)，從而與其他雜質(zhì)分離。收集含有VP2蛋白的洗脫峰，通過(guò)SDS-PAGE電泳和Westernblotting檢測(cè)其純度和特異性。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)兩步純化后，VP2蛋白的純度達(dá)到95%以上，且具有良好的免疫活性，能夠與抗IBDV抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。將純化后的VP2蛋白用無(wú)菌的PBS緩沖液（pH7.4）進(jìn)行透析，去除緩沖液中的鹽分和小分子雜質(zhì)。透析過(guò)程在4℃下進(jìn)行，每隔4-6h更換一次透析液，共透析24-36h。透析結(jié)束后，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定VP2蛋白的濃度，調(diào)整蛋白濃度至合適的水平，用于后續(xù)的疫苗制備。4.1.2佐劑選擇佐劑能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，提高疫苗的免疫效果。為篩選適合VP2蛋白的佐劑，選用了幾種常見(jiàn)的佐劑，如弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）、鋁佐劑、MontanideISA71VG等，分別與純化的VP2蛋白按一定比例混合，制備成不同佐劑配方的疫苗。將制備好的不同佐劑配方的疫苗分別免疫SPF雞，每組[X]只。免疫途徑為肌肉注射，免疫劑量為每只雞[X]μgVP2蛋白。首免后14d進(jìn)行二免，二免后7d、14d、21d分別采集雞血清，采用ELISA法檢測(cè)血清中抗IBDV抗體的水平。同時(shí)，在二免后21d，對(duì)免疫雞進(jìn)行IBDV強(qiáng)毒攻擊，觀察雞的發(fā)病情況和死亡率，評(píng)估疫苗的免疫保護(hù)效果。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，弗氏完全佐劑組和弗氏不完全佐劑組在免疫后7d時(shí)，抗體水平相對(duì)較高，但隨著時(shí)間推移，抗體水平下降較快。鋁佐劑組和MontanideISA71VG組的抗體水平在免疫后14d逐漸升高，且在免疫后21d時(shí)，MontanideISA71VG組的抗體水平顯著高于其他佐劑組。在免疫保護(hù)效果方面，弗氏完全佐劑組和弗氏不完全佐劑組雖然在免疫初期抗體水平較高，但攻毒后仍有部分雞發(fā)病，保護(hù)率分別為[X]%和[X]%。鋁佐劑組攻毒后保護(hù)率為[X]%，MontanideISA71VG組攻毒后保護(hù)率達(dá)到[X]%，顯著高于其他佐劑組。綜合考慮抗體水平和免疫保護(hù)效果，MontanideISA71VG佐劑與VP2蛋白混合制備的疫苗表現(xiàn)出較好的免疫效果，能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，提高對(duì)IBDV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)能力。因此，選擇MontanideISA71VG佐劑作為制備IBD亞單位疫苗的佐劑。按照抗原與佐劑的體積比為[X]，將純化的VP2蛋白與MontanideISA71VG佐劑充分混合，采用乳化機(jī)進(jìn)行乳化，制備成油包水型的亞單位疫苗。乳化過(guò)程中，控制乳化速度和時(shí)間，確保疫苗的穩(wěn)定性和均勻性。4.2亞單位疫苗的安全性評(píng)估4.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用4周齡的SPF雞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組[X]只。實(shí)驗(yàn)組雞分別肌肉注射不同劑量的亞單位疫苗，設(shè)置低劑量組、中劑量組和高劑量組，低劑量組每只雞注射疫苗劑量為[X]μg，中劑量組每只雞注射疫苗劑量為[X]μg，高劑量組每只雞注射疫苗劑量為[X]μg。對(duì)照組雞肌肉注射等體積的無(wú)菌PBS緩沖液。在疫苗注射后的14d內(nèi)，每天觀察并記錄雞的采食、飲水、精神狀態(tài)、行為活動(dòng)等一般狀況，密切關(guān)注雞是否出現(xiàn)異常反應(yīng)，如發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難、精神萎靡等。每天定時(shí)測(cè)量雞的體溫，記錄體溫變化情況。若發(fā)現(xiàn)有雞出現(xiàn)異常癥狀，及時(shí)進(jìn)行詳細(xì)的觀察和記錄，并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的診斷和處理。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)所有雞進(jìn)行剖檢，觀察疫苗注射部位及內(nèi)臟器官、肌肉、皮下等組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，檢查是否有炎癥、損傷等病理變化。4.2.2安全性指標(biāo)檢測(cè)在疫苗注射后的第3d、7d、14d，分別采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組雞的血液樣本，進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。血常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白含量（Hb）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）等。通過(guò)檢測(cè)這些指標(biāo)，評(píng)估疫苗對(duì)雞血液系統(tǒng)的影響，判斷是否會(huì)引起貧血、白細(xì)胞增多或減少、血小板異常等情況。同時(shí)，采集血液樣本進(jìn)行肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)。肝功能檢測(cè)指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）等，腎功能檢測(cè)指標(biāo)包括肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）等。這些指標(biāo)能夠反映肝臟和腎臟的功能狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)可以判斷疫苗是否對(duì)肝腎功能造成損害。利用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。檢測(cè)完成后，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如t檢驗(yàn)、方差分析等）比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間各項(xiàng)指標(biāo)的差異。若實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異（P>0.05），則表明該亞單位疫苗對(duì)雞的血常規(guī)和肝腎功能無(wú)明顯影響，具有較好的安全性。若發(fā)現(xiàn)有指標(biāo)存在顯著差異，進(jìn)一步分析差異產(chǎn)生的原因，評(píng)估疫苗對(duì)動(dòng)物健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)。4.3亞單位疫苗的免疫原性分析4.3.1免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用4周齡的SPF雞作為免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組[X]只。實(shí)驗(yàn)組雞肌肉注射制備的亞單位疫苗，免疫劑量為每只雞[X]μgVP2蛋白，對(duì)照組雞肌肉注射等體積的無(wú)菌PBS緩沖液。免疫程序?yàn)槭状蚊庖吆?4d進(jìn)行二免，二免后14d進(jìn)行三免。在每次免疫后的7d、14d、21d、28d，分別從每組中隨機(jī)選取[X]只雞，采集血液樣本，分離血清，用于檢測(cè)抗體水平。同時(shí)，在二免后21d，采集部分雞的脾臟和胸腺組織，用于檢測(cè)細(xì)胞免疫反應(yīng)。在免疫過(guò)程中，密切觀察雞的采食、飲水、精神狀態(tài)等一般狀況，記錄是否出現(xiàn)不良反應(yīng)。4.3.2免疫效果評(píng)價(jià)指標(biāo)抗體滴度檢測(cè)采用ELISA方法，利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算抗體滴度?？贵w滴度是衡量機(jī)體體液免疫應(yīng)答水平的重要指標(biāo)，較高的抗體滴度表明機(jī)體對(duì)疫苗產(chǎn)生了較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，能夠產(chǎn)生大量的特異性抗體，這些抗體能夠與病毒表面的抗原結(jié)合，從而中和病毒，阻止病毒的感染和傳播。中和抗體活性通過(guò)中和試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，將血清與一定量的IBDV病毒液混合，孵育后接種到雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）上，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），計(jì)算中和抗體效價(jià)。中和抗體能夠直接中和病毒的感染性，是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的關(guān)鍵指標(biāo)之一。中和抗體活性高意味著疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能夠有效地阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，從而保護(hù)機(jī)體免受病毒感染。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTT法，取脾臟和胸腺組織制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度后加入96孔板中，分別加入ConA（刀豆蛋白A）作為陽(yáng)性對(duì)照，培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，以及適量的VP2蛋白作為刺激物。培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)，然后加入DMSO溶解結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖率。淋巴細(xì)胞增殖率反映了機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，VP2蛋白能夠刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，表明疫苗能夠激活機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。細(xì)胞因子檢測(cè)采用ELISA試劑盒，檢測(cè)脾臟和胸腺組織培養(yǎng)上清中干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素2（IL-2）等細(xì)胞因子的含量。IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子在細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，它們能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖、分化和活化，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。檢測(cè)細(xì)胞因子的含量可以了解疫苗對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的影響，評(píng)估疫苗的免疫效果。4.4亞單位疫苗的保護(hù)效力研究4.4.1攻毒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用4周齡的SPF雞作為攻毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為免疫組和對(duì)照組，每組[X]只。免疫組雞肌肉注射制備的亞單位疫苗，免疫劑量為每只雞[X]μgVP2蛋白，按照前面確定的免疫程序進(jìn)行免疫，即首次免疫后14d進(jìn)行二免，二免后14d進(jìn)行三免。對(duì)照組雞肌肉注射等體積的無(wú)菌PBS緩沖液。在三免后21d，對(duì)免疫組和對(duì)照組雞進(jìn)行IBDV強(qiáng)毒攻擊。強(qiáng)毒攻擊選用[具體強(qiáng)毒株名稱]，攻毒劑量為[具體劑量，如100LD50（半數(shù)致死量）]，攻毒途徑為肌肉注射或口服感染。在攻毒后的14d內(nèi)，每天觀察并記錄雞的發(fā)病情況，包括精神狀態(tài)、采食、飲水、腹瀉、法氏囊病變等癥狀。若雞出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、腹瀉、法氏囊腫大或萎縮等典型的IBD癥狀，則判定為發(fā)病。記錄雞的死亡時(shí)間和死亡數(shù)量，計(jì)算死亡率。在攻毒后7d和14d，分別從免疫組和對(duì)照組中隨機(jī)選取[X]只雞進(jìn)行剖檢，觀察法氏囊、脾臟、胸腺等免疫器官的病理變化，采集法氏囊組織進(jìn)行病理切片觀察，評(píng)估疫苗對(duì)免疫器官的保護(hù)作用。4.4.2保護(hù)率計(jì)算與分析疫苗保護(hù)率的計(jì)算公式為：保護(hù)率（%）=（對(duì)照組死亡率-免疫組死亡率）/對(duì)照組死亡率×100%。根據(jù)攻毒實(shí)驗(yàn)中記錄的死亡數(shù)量，計(jì)算免疫組和對(duì)照組的死亡率，進(jìn)而計(jì)算出疫苗的保護(hù)率。假設(shè)對(duì)照組死亡率為[X]%，免疫組死亡率為[X]%，則該亞單位疫苗的保護(hù)率為[具體保護(hù)率數(shù)值]%。對(duì)不同免疫劑量的亞單位疫苗的保護(hù)效果進(jìn)行比較分析，設(shè)置低劑量免疫組、中劑量免疫組和高劑量免疫組，分別給予不同劑量的疫苗進(jìn)行免疫。結(jié)果顯示