ICS65.150CCSB41DB21SpecificationforhealthassessmentofthegutmicrobiotaofPhocalargha遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB21/T3646—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院、大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心、大連圣亞旅游控股股份有限公司、長海縣海洋與漁業(yè)綜合行政執(zhí)法隊(duì)、沈陽市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)服務(wù)中心。本文件主要起草人：田甲申、鹿志創(chuàng)、李多慧、孔重人、趙德輝、王震、高祥剛、張勝久、于丹。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院（大連市沙河口區(qū)黑石礁街50號聯(lián)系電話DB21/T3646—20221斑海豹腸道微生物菌群健康評估規(guī)范本文件規(guī)定了斑海豹腸道微生物菌群的取樣方法、檢測方法及微生物菌群指標(biāo)評估的技術(shù)要求。本文件適用于斑海豹主管部門、科研院所、水族館等可進(jìn)行斑海豹救助和飼養(yǎng)的機(jī)構(gòu)開展斑海豹腸道微生物菌群健康評估。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。SC/TSC/TSC/T6073水生哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施要求9409水生哺乳動(dòng)物譜系記錄規(guī)范9606斑海豹飼養(yǎng)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1斑海豹spottedseal分布在我國黃、渤海海域的斑海豹為野生斑海豹；在水族館、動(dòng)物園、救助機(jī)構(gòu)等人工飼養(yǎng)條件下生活的斑海豹為豢養(yǎng)斑海豹。3.2斑海豹年齡ageofspottedseal斑海豹從出生時(shí)起到計(jì)算時(shí)止生存的時(shí)間長度，通常用年歲來表示。小于1歲為幼崽，1歲為幼年，2歲～3歲為青年，4歲以上為成年。3.3腸道微生物菌群gutmicrobiota腸道環(huán)境中存在的微生物群落，是其中生存的全體微生物的集合。4取樣方法4.1樣本要求2DB21/T3646—2022采集斑海豹的糞便作為樣本?；筐B(yǎng)斑海豹應(yīng)為按照SC/T6073、SC/T9409和SC/T9606的相關(guān)要求飼養(yǎng)的個(gè)體，且在90天內(nèi)未服用過抗生素類藥物。4.2取樣樣本應(yīng)在干燥區(qū)上采集。樣本應(yīng)新鮮，未粘水，無尿液混雜。取樣量5g以上，裝入密封袋、塑料管等無菌容器中。4.3保存取樣后應(yīng)低溫保存，-20℃環(huán)境條件下可保存7天。-80℃環(huán)境條件下可長期保存。5檢測方法5.1DNA提取采用DNA試劑盒提取基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取DNA的完整性。成功提取的DNA，使用微量分光光度計(jì)測定其濃度和純度，并于-20℃環(huán)境條件下保存。5.216SrRNA基因擴(kuò)增使用341F-806R引物擴(kuò)增DNA樣本中的16SrRNA基因，擴(kuò)增反應(yīng)為25μL體系。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。采用雙鏈DNA定量試劑盒測定回收PCR產(chǎn)物的濃度，等量混合樣品的PCR產(chǎn)物。采用DNA文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建測序文庫，并進(jìn)行測序。5.3物種分類學(xué)鑒定使用QIIME軟件對測得序列進(jìn)行質(zhì)量控制，得到高質(zhì)量的序列。將高質(zhì)量的序列按照97%的相似性進(jìn)行聚類，每一個(gè)聚類代表一個(gè)細(xì)菌屬。使用QIIME挑選每一個(gè)聚類的代表序列，與Greengenes數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行物種分類學(xué)注釋。根據(jù)注釋后每一個(gè)物種的序列數(shù)目計(jì)算其豐度。6微生物菌群指標(biāo)評估6.1糞便指標(biāo)健康斑海豹的糞便正常呈圓柱、彎曲等狀態(tài)，表面光滑，富有彈性且相對柔軟，顏色呈土黃色或紅褐色。稀軟、水狀、扁條、細(xì)條狀并伴有異常氣味的糞便為異常，應(yīng)進(jìn)行腸道微生物菌群檢測。6.2腸道微生物菌群健康指標(biāo)斑海豹不同年齡階段腸道微生物菌群健康指標(biāo)范圍參見表1。高于或低于某種菌屬的指標(biāo)范圍，說明斑海豹處于疾病或亞健康狀態(tài)，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的治療。表1斑海豹腸道微生物菌群健康指標(biāo)參考范圍多爾氏菌屬Dorea梭桿菌屬Fusobac