(12)發(fā)明專利(22)申請日2020.10.12(43)申請公布日2022.05.2762/913,9332019.10.11USPCT/SG2020/0505822020WO2021/071437EN地址新加坡新加坡市下肯特嶺路(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京高沃律師事務(wù)所11569C12N9/10(56)對比文件權(quán)利要求書1頁說明書5頁序列表10頁附圖6頁使用芳香異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶生物合成大麻一種通過使底物和香葉基焦磷酸或焦磷酸法尼酯與NphB直系同源物接觸來生產(chǎn)大麻素前體，所述底物可以是2,4-二羥基-6-戊基苯甲酸或2,4-二羥基-6-丙基苯甲酸。本文還公開了解脂耶氏酵母的重組細(xì)胞，在其基因組中攜帶編碼來自除大麻以外的生物體的NphB直系同源物的21.一種生產(chǎn)大麻素前體的方法，所述方法包括(a)使2,4-二羥基-6-戊基苯甲酸和香葉基焦磷酸與NphB直系同源物接觸，得到5-香葉基橄欖酸、4-0-香葉基橄欖酸或2-0-香葉基橄欖酸；(b)使2,4-二羥基-6-丙基苯甲酸和香葉基焦磷酸與NphB直系同源物接觸，得到具有下式的化合物：或(c)使2,4-二羥基-6-丙基苯甲酸和焦磷酸法尼酯與NphB直系同源物接觸，得到具有下式的化合物：其中，所述NphB直系同源物具有SEQIDNO:1-8中任一個的氨基酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述底物是橄欖酸，所述焦磷酸鹽是香葉基焦磷酸，并且所述大麻素前體通過LC/MS分析確定具有359.22的質(zhì)荷比和超過6.1分鐘的保留時3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述NphB直系同源物來自玫瑰色鏈霉菌亞種未培養(yǎng)細(xì)菌esnapd16.1。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述NphB直系同源物是在解脂耶氏酵母中產(chǎn)生的重組酶。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述NphB直系同源物來自玫瑰色鏈霉菌亞種未培養(yǎng)細(xì)菌esnapd16.1。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述NphB直系同源物是在解脂耶氏酵母中產(chǎn)生的重組酶。7.一種解脂耶氏酵母的重組細(xì)胞，在所述重組細(xì)胞基因組中包含編碼NphB直系同源物的核酸，其中所述NphB直系同源物來自玫瑰色鏈霉菌亞種oscitans、紅色鏈霉菌、杯狀曲霉、克拉里黃梭菌、巴西諾卡氏菌和未培養(yǎng)細(xì)菌esnapd16.1,并且所述NphB直系同源物在所述重組細(xì)胞中表達(dá)，所述NphB直系同源物具有SEQIDNO:1、3-5和7-8中任一個的氨基酸序3使用芳香異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶生物合成大麻素前體背景技術(shù)[0001]鏈霉菌(Streptomycessp.)菌株CL190中芳香異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(NphB)的結(jié)構(gòu)和Zirpel等人，J.Biotechnol.2017,259:204-212,其表明NphB能夠利用與來自大麻植物的膜結(jié)合型香葉基焦磷酸：二羥基戊基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶(geranylpyrophosphate:olivetolategeranyltransferase)相同的底物形成大麻素前體大麻萜酚酸(CBGA)。[0002]眾所周知，CBGA是大麻植物中發(fā)現(xiàn)的大麻素生物合成途徑的第一個分支點(diǎn)，野生[0003]仍亟需合成已知的大麻素前體和具有特異性及高產(chǎn)率的新型大麻素前體的酶與方法。發(fā)明內(nèi)容[0004]本文公開了一種生產(chǎn)大麻素前體的方法。所述方法包括使底物和香葉基焦磷酸或焦磷酸法尼酯與NphB直系同源物接觸的步驟。所述底物可以是例如2,4-二羥基-6-戊基苯甲酸或2,4-二羥基-6-丙基苯甲酸，并且NphB直系同源物來自大麻以外的生物體。[0005]本文還提供了解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的重組細(xì)胞，在其基因組中攜帶編碼NphB直系同源物的核酸。來自大麻以外的生物體的NphB直系同源物在重組細(xì)胞中表達(dá)。[0006]在下文的說明書和實(shí)施例中對一個或多個實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)描述。根據(jù)詳細(xì)描附圖說明[0008]圖1示出了使用橄欖酸和香葉基焦磷酸作為底物的大麻素產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)。所有可能產(chǎn)物的分子式和分子量分別為C2?H?10?和359.22。黑色：由三個單位的丙二酸單酰輔酶A衍生而來的橄欖酸的一部分；深灰色：由己酰-輔酶A衍生的橄欖酸的一部分；淺灰色：由直系同源物轉(zhuǎn)移的香葉基焦磷酸的一部分。[0009]圖2是用于將編碼NphB直系同源物的基因整合到解脂耶氏菌基因組中的pYLEX1載體的示意圖。[0010]圖3A示出了由三個NphB直系同源物生物合成的m/z=359.22的大麻素前體的LC-MS圖譜：第1行=CBGA標(biāo)準(zhǔn)品，第2行=P3E2,第3行=無酶陰性對照，第4行=P3A5,第5行=P3E8,第6行=NphB陽性對照，第7行=1BF1,第8行=Y1C5。通過保留時間和相對峰面積確定[0011]圖3B示出了從另外三個NphB直系同源物生物合成的m/z=359.22的大麻素前體的LC-MS圖譜：第1行=10μg/mlCBGA標(biāo)準(zhǔn)品，第2行=無酶陰性對照，第3行=NphB陽性對照，第4行=P3F5,第5行=P3A6,第6行=1BC2。通過保留時間和相對峰面積確定峰。4[0012]圖4示出了使用二芳酸(divarinicacid)(頂行)生物合成的潛在大麻素產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，所述二芳酸與橄欖酸相比，碳單元少兩個，從而產(chǎn)生比CBGA少兩個碳的CBGVA,或者使用焦磷酸法呢酯(底行)代替香葉基焦磷酸，從而產(chǎn)生新的大麻素前體。具體實(shí)施方式[0013]本文公開了通過將異戊二烯單元從某些焦磷酸鹽(如香葉基焦磷酸)轉(zhuǎn)移到芳族聚酮化合物(如2,4-二羥基-6-戊基苯甲酸(即橄欖酸)和2,4-二羥基-6-丙基苯甲酸)中來催化大麻素前體生物合成的酶。這些酶來自大麻以外的生物體，可在大腸桿菌(Escherichiacoli)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)中重組表達(dá)，隨后用于其異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性。[0014]如上所述，本文公開了一種生產(chǎn)大麻素前體的方法。在一個具體的實(shí)施例中，底物是橄欖酸，焦磷酸鹽是香葉基焦磷酸，生產(chǎn)的大麻素前體具有359.22的質(zhì)荷比和超過6.1分鐘的保留時間(通過LC/MS分析確定)。本文所述的大麻素前體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(Streptomycesroseochromogenus)亞種oscitans、紅色鏈霉菌(Streptomycesrubidus)、(Nocardiabrasiliensis)和未培養(yǎng)細(xì)菌esnapd16.1。[0016]在所述方法的一個特定方面，NphB直系同源物具有SEQIDNO:1-8中任一個的氨基酸序列?；蛘撸琋phB直系同源物可具有與SEQIDNO:1-8中任一個至少70%相同(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%和99%)的氨基酸序列，并具有芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶[0017]在一個示例性方法中，NphB直系同源物是重組酶。重組酶可以在例如大腸桿菌和解脂耶氏酵母中產(chǎn)生。[0018]上文還提到了解脂耶氏酵母的重組細(xì)胞，在其基因組中包括編碼NphB直系同源物[0019]NphB直系同源物的示例性來源是玫瑰色鏈霉菌(Streptomycesroseochromogenus)亞種Oscitans、紅色鏈霉菌(Streptomycesrubidus)、肉桂地鏈霉菌(Aspergillusterreus)、克拉里黃梭菌(Clostridiumclariflavum)、巴西諾卡氏菌(Nocardiabrasiliensis)和未培養(yǎng)細(xì)菌esnapd16.1。[0020]在特定重組細(xì)胞中，NphB直系同源物具有SEQIDNO:1-8中任一個的氨基酸序列。在另一個實(shí)施例中，NphB直系同源物可以具有與SEQIDNO:1-8中任一個至少70%相同(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%和99%)的氨基酸序列，并且具有芳族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性。[0021]無需進(jìn)一步詳述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于本文的公開內(nèi)容最大程度地利用本公開內(nèi)容。因此，以下具體實(shí)施例應(yīng)被解釋為僅僅是描述性的，而不是以任何方式限制本公開的其余部分。本文引用的所有出版物均通過引用整體并入本文作為參考。5[0023]通過搜索可用的序列數(shù)據(jù)庫，鑒定出105個與NphB相關(guān)的基因直系同源物，這些直系同源物也在UniProt數(shù)據(jù)庫中注明為潛在的芳香族異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。合成基因并克隆到含有T7啟動子和終止子的修飾pES2載體中。使用化學(xué)處理將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。隨后收獲細(xì)胞并在-20℃下儲存，直至蛋白純化。咪唑的結(jié)合緩沖液中。隨后通過超聲裂解細(xì)胞，并在4℃下通過離心30min去除細(xì)胞碎片。使用Ni2+親和層析純化含有His標(biāo)記蛋白的上清液，并用含有20mMTris-HC1(pH7.9)、蛋白的濃度，并將純化的NphB直系同源物儲存在4℃下。[0025]使用體外異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)檢測NphB直系同源物的異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。在化合物底物(例如橄欖酸和二芳酸)、20μL的10mM香葉基焦磷酸和50μg的純化NphB直系同源物混合，并在30℃下培養(yǎng)。同時制備了不含酶[0026]24小時后，用6MHC1將反應(yīng)混合物酸化至pH3.0,并用乙酸乙酯萃取三次。將樣本在真空下干燥，并重新溶于甲醇中，以便使用負(fù)離子模式進(jìn)行LC-MS分析。為每份樣本生成了m/z=359.22(如果使用橄欖酸)和m/z=331.19(如果使用二芳酸)的萃取離子色譜圖(EIC),以確定潛在大麻素前體的生物合成是否是由NphB直系同源物催化?？墒褂瞄蠙焖岷拖闳~基焦磷酸作為底物生物合成的潛在大麻素前體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。分析中被鑒定為新峰。特定的直系同源物也顯示了CBGA的更高產(chǎn)量。選擇這樣的直系同源物用于隨后克隆到解脂耶氏酵母中。將它們亞克隆到修飾的pYLEX1載體中(YeasternBiotech;見圖2)并使用化學(xué)處理轉(zhuǎn)化為解脂耶氏酵母。在不含亮氨酸的YNB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體，并用于隨后的產(chǎn)量優(yōu)化分析。[0028]在所測試的105個直系同源物中，8個直系同源物表現(xiàn)出良好的蛋白表達(dá)和新的異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性。下表1中列出了這8個直系同源物，以及相應(yīng)的蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(Uniprot)ID和來源生物體。[0029]表1具有新的異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性的NphB直系同源物。6直系同源物生物體與NphB的同12紅色鏈霉菌34未培養(yǎng)細(xì)菌esnapd16.15肉桂地鏈霉菌6克拉里黃梭菌7巴西諾卡氏菌8顯示至少一個新峰，其分子式也為C?2H?10?(FW=359.22)。[0032]如圖3A和圖3B所示，所有8個直系同源物以及野生型NphB均可產(chǎn)生CBGA(保留時和P3E2均在7.23-7.24min的保留時間內(nèi)產(chǎn)生大量m/z=359.2225的新異戊二烯化產(chǎn)物。這在使用野生型NphB的反應(yīng)中未觀察到。[0033]m/z=359.22且在圖3A和圖3B中鑒定的新產(chǎn)物匯總于下表2。這些產(chǎn)品具有野生型NphB酶產(chǎn)生的產(chǎn)物所沒有的保留時間。[0034]表2由香葉基焦磷酸和橄欖酸通過直系同源物生產(chǎn)的新產(chǎn)物直系同源物保留時間(分鐘)[0036]一項(xiàng)研究表明，對應(yīng)于UniprotID的兩個直系同源物：C4PWA1和Q9L9F1僅產(chǎn)生微量的新的異戊二烯化產(chǎn)物，這表明這些直系同源物在與野生型NphB不同的位點(diǎn)對橄欖酸進(jìn)行了異戊二烯化。[0037]此外，可以將不同的底物與NphB直系同源物共同孵育，以確定是否可以產(chǎn)生新的大麻素前體。圖4顯示了當(dāng)橄欖酸或香葉基焦磷酸或兩者被取代時可能形成的潛在產(chǎn)物。隨后可以用下游大麻素合成酶檢測新的大麻素前體，以使大麻素化合物庫多樣化。[0038]其他實(shí)施例7[0039]本說明書中公開的所有特征可以以任何組合方式組合。本說明書中公開的每個特征可以被用于相同、等同或類似目的的替代特征所代替。因此，除非另有明確說明，否則所公開的每個特征僅是一系列等效或類似特征的示例。[0040]通過以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修改，以使其適應(yīng)各種用途和條件。因此，其他實(shí)施例也在所附權(quán)利要CN114555797B序列表1/10頁8[0002]<110>新加坡國立大學(xué)[0003]<120>使用新型芳香異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶生物合成大麻素前體[0012]<213>玫瑰色鏈霉菌亞種oscitans[0018]ArgLeuThrAspThr[0024]AspAlaGlyLeuLeuAspAla[0032]GlnAlaArgLeu[0034]PheAlaAla[0036]GlyLysGlCN114555797B序列表2/10頁9[0041]210[0049]275[0076]LeuLeuLysAsnCN114555797B序列表3/10頁[0078]PheAspHis[0089]225[0093][0095]275[0106]GluAspGl[0111]CN114555797B序列表4/10頁11[0117]<213>紅色鏈霉菌[0129]AsnGlyLeu[0146]210[0149]ThrThrLe[0154]275CN114555797B序列表5/10頁[0162]<213>杯狀曲霉[0186]MetAsnLeuTyrP[0191]210[0193]225[0209]<223>未培養(yǎng)細(xì)菌esnapd16.1CN114555797B序列表7/10頁[0238]210[0254]<213>肉桂地鏈霉菌[0260]ProIleLeuAlaCN114555797B序列表8/10頁[0283]210[0297]<213>克拉里黃梭菌[0305]ValThrGlu[0307]PhePheArgCN114555797B序列表9/10頁[0326]210[0330][0334]275[0350]<213>巴西諾卡氏菌CN114555797B序列表10/10頁