(10)申請(qǐng)公布號(hào)CN114181050A(71)申請(qǐng)人浙江雙子智能裝備有限公司地址311100浙江省杭州市余杭區(qū)余杭經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)天荷路7號(hào)(72)發(fā)明人羅飛胡真真柳建勇李晴(54)發(fā)明名稱發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法本申請(qǐng)涉及大麻二酚提取領(lǐng)域，具體涉及發(fā)酵菌體大麻二酚處理方法，包括如下步驟：菌體預(yù)處理：將發(fā)酵菌體處理成菌體顆粒；亞臨界提取，得到提取液和菌渣；該步驟可進(jìn)行任意次提處理：對(duì)浸膏進(jìn)行脫羧后，進(jìn)一步分離得到大麻中的任意一種，或任意兩種及以上的混合體系。上述技術(shù)方案中，采用了亞臨界提取的方法，同時(shí)選取了上述溶劑，具有較高的收率和提取率，2菌體預(yù)處理：將發(fā)酵菌體處理成菌體顆粒；驟可進(jìn)行任意次2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法，其特征在于，每次進(jìn)行亞臨界提3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法，其特征在于，在亞臨界提取時(shí)，壓力為0.2～1.2MPa。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法，其特征在于，在亞臨界提取時(shí)，每次提取的時(shí)間為10～60min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法，其特征在于，提取溫度為20～506.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法，其特征在于，還包括如下步驟：菌渣處理：將亞臨界提取后得到的菌渣進(jìn)行減壓脫溶，減壓脫溶的壓力不高于-7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法，其特征在于，提取液處理步驟具體包括如下分步驟：將粗體液進(jìn)行冬化除雜，得到冬化混合液；8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法，其特征在于，提取液減壓濃縮的9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法，其特征在于，所述提取液減壓濃縮后，粗體液中固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～5%。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法，其特征在于，在菌體預(yù)處理步驟中，菌體顆粒的粒徑控制于10～120目。3發(fā)酵菌體大麻二酚提取方法技術(shù)領(lǐng)域[0001]本申請(qǐng)涉及大麻二酚提取領(lǐng)域，更具體地說，它涉及發(fā)酵菌體大麻二酚處理方法。背景技術(shù)[0002]大麻二酚是一種大麻素類化合物，具有較高的要用價(jià)值。大麻二酚的提取方法主要包括植物花葉組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法三種，具體的提取方法主要為提取罐靜態(tài)間歇法、超臨界流體萃取。[0003]在微生物發(fā)酵法中，由于微生物發(fā)酵菌體體系復(fù)雜，在菌體的提取過程中，采用一般溶劑靜態(tài)間歇提取時(shí)，提取收率較低。而采用超臨界流體萃取，盡管收率較高，但是其單次處理量較小，設(shè)備成本較高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)明內(nèi)容[0004]為了提供一種兼顧高收率和低設(shè)備成本的大麻二酚提取方法，本申請(qǐng)?zhí)峁┌l(fā)酵菌體大麻二酚處理方法。[0005]本申請(qǐng)中，所涉及的發(fā)酵菌體大麻二酚處理方法具體包括如下步驟：菌體預(yù)處理：將發(fā)酵菌體處理成菌體顆粒；亞臨界提?。涸诩訅籂顟B(tài)下，通過溶劑A對(duì)菌體顆粒進(jìn)行提取，得到提取液和菌渣；該步驟可進(jìn)行任意次提取液處理：提取液減壓除去溶劑，得到浸膏；浸膏處理：對(duì)浸膏進(jìn)行脫羧后，進(jìn)一步分離得到大麻二酚；其中，溶劑A位戊烷、己烷、庚烷、甲醇、乙醇中的任意一種，或任意兩種及以上的混合體系。[0006]在上述技術(shù)方案中，采用了亞臨界提取的方法，相較于超臨界提取，亞臨界提取的條件更加溫和，對(duì)設(shè)備的要求也較小，可以直接通過密閉的提取罐經(jīng)加壓處理進(jìn)行，提取完畢后提取罐內(nèi)的液體可以直接通過高壓氣體壓送至其他設(shè)備中，整體流程較為簡單，適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。[0007]采用亞臨界提取得方式，相較于直接采用溶劑進(jìn)行萃取，一方面可以在較低得溫度下進(jìn)行提取，另一方面也具有較高得提取效果，收率相較于直接萃取更高。[0008]在本申請(qǐng)中，采用了戊烷、己烷、庚烷、甲醇、乙醇中的任意數(shù)量種作為溶劑進(jìn)行萃取，上述溶劑具有較小的粘度和較小的表面張力，溶劑的擴(kuò)散系數(shù)較大，可以實(shí)現(xiàn)較為快速的提取的同時(shí)，由于縮短了提取的時(shí)間，降低了所需的提取溫度，因此也可以減少大麻二酚的破壞和損失，進(jìn)一步提高了收率。[0009]可選的，每次進(jìn)行亞臨界提取，菌體和溶劑A的質(zhì)量體積比為1g:(1～8mL)。[0010]采用上述的溶質(zhì)比，可以在不高于六次的提取次數(shù)中，將菌體中的大麻二酚組分盡可能多的提出，同時(shí)對(duì)后續(xù)處理的要求也較低。在上述溶質(zhì)比范圍內(nèi)，是最為經(jīng)濟(jì)的實(shí)際操作方法。4[0012]在上述壓力范圍內(nèi)，對(duì)設(shè)備的要求較小，比較容易實(shí)現(xiàn)，且該范圍內(nèi)流體的流動(dòng)性、擴(kuò)散性均較好，有助于充分提取菌體顆粒中[0013]可選的，在亞臨界提取時(shí)，每次提取的時(shí)間為10～60min。[0014]在上述技術(shù)方案中，提取10～60min,基本上可以實(shí)現(xiàn)單次提取的溶解平衡，同時(shí)，由于提取時(shí)間控制較短，因此大麻二酚不易在提取過程中損失。[0016]在上述溫度范圍內(nèi)，可以保證大麻二酚充分溶解于溶劑中的同時(shí)，減少因受熱造成的大麻二酚的損失，進(jìn)一步提高大麻二酚的收率。菌渣處理：將亞臨界提取后得到的菌渣進(jìn)行減壓脫溶，減壓脫溶的壓力不高于-[0018]上述技術(shù)方案對(duì)菌渣進(jìn)行了處理，將菌渣脫溶后，溶劑可以回收，續(xù)用作肥料或飼料的原料，有助于企業(yè)節(jié)約成本。對(duì)提取液進(jìn)行減壓濃縮，得到粗提液；將粗體液進(jìn)行冬化除雜，得到冬化混合液；冬化混合液進(jìn)一步負(fù)壓脫溶，得到浸膏。[0020]上述技術(shù)方案中，對(duì)提取液進(jìn)行減壓濃縮，再冬化除雜后，進(jìn)一步負(fù)過程中，減壓濃縮并冬化除雜后，可以將提取液中的殘留脂肪成分除去，同時(shí)對(duì)大麻二酚基本沒有影響，進(jìn)一步脫溶得到浸膏，這樣浸膏中的大麻二酚含量較高，雜質(zhì)較少，便于后續(xù)進(jìn)一步分離。[0022]在上述溫度范圍內(nèi)，溶劑可以快速除去，同時(shí)對(duì)大麻二酚的影響較小，可選的，所述提取液減壓濃縮后，粗體液中固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～5%。[0023]保留1～5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的固體組分進(jìn)入冬化步驟，提高冬化除雜效果的同時(shí)保證盡可能少的大麻二酚在冬化除雜過程中損失。[0025]上述粒徑范圍內(nèi)的菌體顆粒比較容易體粒徑較大，對(duì)設(shè)備的要求較低，且不易造成粉碎過程中的大麻二酚損失。1、在本申請(qǐng)中，采用亞臨界提取的方法對(duì)發(fā)酵菌體中的大麻二酚進(jìn)行提取，并以大麻二酚含量，進(jìn)而為后續(xù)進(jìn)一步分離奠定良好的基礎(chǔ)。具體實(shí)施方式[0028]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說明。[0029]在本實(shí)施例中，所用的菌體為統(tǒng)一批次發(fā)酵得到的菌體，發(fā)酵菌種為青霉菌。5[0030]大麻二酚的測(cè)定通過液相色譜進(jìn)行，將待測(cè)樣本粉碎并充分溶解制成溶液，配置標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后帶入回歸方程測(cè)定溶液中的大麻二酚濃度，并進(jìn)一步計(jì)算浸膏中的大麻二酚含量和大麻二酚的提取率。液相色譜所用流動(dòng)相為乙腈和水以1:1的質(zhì)量比配置得到的混合相。[0031]實(shí)施例1-1,以庚烷為溶劑，提取菌體中的大麻二酚，具體操作包括如下步驟：菌體預(yù)處理：稱取大麻二酚菌體樣本1000g(含大麻二酚16.3mg/g),經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，篩取粒度為10～120目之間的組分，得到菌體顆粒；亞臨界提?。簩⒕w顆粒置于密閉提取罐中，抽至真空，加入庚烷溶劑，控制溫度波動(dòng)范圍為20～25℃,壓力為0.85～0.88MPa,混合攪拌，溶劑用量、提取次數(shù)和每次提取時(shí)間見表1所示。[0032]提取液處理：提取液通過壓縮空氣打入到蒸發(fā)罐中，控制蒸發(fā)罐內(nèi)溫度在40～45℃范圍內(nèi)波動(dòng)并開啟真空泵，控制氣壓低于-0.085MPa,進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至含固量為1.5wt%,得到粗體液；粗體液在常溫下降溫至-65℃進(jìn)行冬化，冬化時(shí)間為8h,冬化完畢后過濾得到冬化液，再對(duì)冬化液進(jìn)行進(jìn)一步負(fù)壓脫溶，控制壓力低于-0.085MPa,脫除溶劑后得到大麻浸膏。[0033]實(shí)施例1-2～1-7中，在實(shí)施例1-1的基礎(chǔ)上，對(duì)提取時(shí)間、溶劑用量和提取次數(shù)進(jìn)行了調(diào)整，具體的提取參數(shù)如表1所示。實(shí)施例編號(hào)單次提取時(shí)間溶劑用量數(shù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)提取率實(shí)施例1-133實(shí)施例1-233實(shí)施例1-333實(shí)施例1-4實(shí)施例1-55實(shí)施例1-681實(shí)施例1-71[0034]實(shí)施例1～8～1-12,相較于實(shí)施例1-3,在同樣使用庚烷作為溶劑的情況下，對(duì)超臨界提取的溫度和壓力進(jìn)行了調(diào)整，結(jié)果如表2所示。表2、實(shí)施例1-8～1-12中不同亞臨界狀態(tài)的調(diào)整實(shí)施例編號(hào)提取溫度壓力控制質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)實(shí)施例1-8實(shí)施例1-9實(shí)施例1-10實(shí)施例1-11實(shí)施例1-12實(shí)施例1-3[0035]在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)提取液的處理進(jìn)行調(diào)整，得到如下實(shí)施例。6[0036]實(shí)施例1-13,與實(shí)施例1-3的區(qū)別在于，濃縮后粗體液的含固量為3%,浸膏中的大麻二酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.2%,提取率為96.8%。[0037]實(shí)施例1-14,與實(shí)施例1-3的區(qū)別在于，濃縮后粗體液的含固量為5%,浸膏中的大麻二酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.0%,提取率為96.9%。[0038]實(shí)施例1-15,與實(shí)施例1-3的區(qū)別在于，濃縮后粗體液的含固量為8%,浸膏中的大麻二酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.1%,提取率為95.8%。[0039]實(shí)施例1-16,與實(shí)施例1-3的區(qū)別在于，濃縮后粗體液的含固量為1%,浸膏中的大麻二酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.2%,提取率為96.9%。[0040]實(shí)施例1-17,與實(shí)施例1-3的區(qū)別在于，粗體液減壓濃縮時(shí)，控制溫度范圍為55~60℃,浸膏中的大麻二酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.9%,提取率為96.9%。[0041]實(shí)施例2,采用正己烷對(duì)菌體中的大麻二酚進(jìn)行提取，具體步驟如下：菌體預(yù)處理：稱取大麻二酚菌體樣本1000g(含大麻二酚16.3mg/g),經(jīng)粉碎機(jī)粉亞臨界提?。簩⒕w顆粒置于密閉提取罐中，抽至真空，加入正己烷溶劑，提取三次，每次提取時(shí)間為30min,每次溶劑的用量為3L,混合攪拌，提取具體參數(shù)見表3所示。[0042]提取液處理：提取液通過壓縮空氣打入到蒸發(fā)罐中，控制蒸發(fā)罐內(nèi)溫度在40～45℃范圍內(nèi)波動(dòng)并開啟真空泵，控制氣壓低于-0.085MPa,進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至含固量為1.5wt%,得到粗體液；粗體液在常溫下降溫至-65℃進(jìn)行冬化，冬化時(shí)間為8h,冬化完畢后過濾得到冬化液，再對(duì)冬化液進(jìn)行進(jìn)一步負(fù)壓脫溶，控制壓力低于-0.085MPa,脫除溶劑后得到大麻浸膏。表3、實(shí)施例2-1～2-6中不同亞臨界狀態(tài)的調(diào)整實(shí)施例編號(hào)提取溫度壓力控制質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)提取率實(shí)施例2-1實(shí)施例2-2實(shí)施例2-3實(shí)施例2-4實(shí)施例2-5實(shí)施例2-6[0043]實(shí)施例3,采用正戊烷對(duì)菌體中的大麻二酚進(jìn)行提取，具體步驟如下：菌體預(yù)處理：稱取大麻二酚菌體樣本1000g(含大麻二酚16.3mg/g),經(jīng)粉碎機(jī)粉亞臨界提?。簩⒕w顆粒置于密閉提取罐中，抽至真空，加入正戊烷溶劑，提取三次，每次提取時(shí)間為30min,每次溶劑的用量為3L,混合攪拌，提取具體參數(shù)見表4所示。[0044]提取液處理：提取液通過壓縮空氣打入到蒸發(fā)罐中，控制蒸發(fā)罐內(nèi)溫度在40～45℃范圍內(nèi)波動(dòng)并開啟真空泵，控制氣壓低于-0.085MPa,進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至含固量為1.5wt%,得到粗體液；粗體液在常溫下降溫至-65℃進(jìn)行冬化，冬化時(shí)間為8h,冬化完畢后過濾得到冬化液，再對(duì)冬化液進(jìn)行進(jìn)一步負(fù)壓脫溶，控制壓力低于-0.085MPa,脫除溶劑后得到大麻浸膏。7表4、實(shí)施例3-1～3-6中不同亞臨界狀態(tài)的調(diào)整實(shí)施例編號(hào)提取溫度壓力控制質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)提取率實(shí)施例3-1實(shí)施例3-2實(shí)施例3-3實(shí)施例3-4實(shí)施例3-5實(shí)施例3-6[0045]實(shí)施例4,采用甲醇對(duì)菌體中的大麻二酚進(jìn)行提取，具體步驟如下：菌體預(yù)處理：稱取大麻二酚菌體樣本1000g(含大麻二酚16.3mg/g),經(jīng)粉碎機(jī)粉每次提取時(shí)間為30min,每次溶劑的用量為3L,混合攪拌，提取具體參數(shù)見表5所示。[0046]提取液處理：提取液通過壓縮空氣打入到蒸發(fā)罐中，控制蒸發(fā)罐內(nèi)溫度在40～45℃范圍內(nèi)波動(dòng)并開啟真空泵，控制氣壓低于-0.085MPa,進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至含固量為1.5wt%,得到粗體液；粗體液在常溫下降溫至-65℃進(jìn)行冬化，冬化時(shí)間為8h,冬化完畢后過濾得到冬化液，再對(duì)冬化液進(jìn)行進(jìn)一步負(fù)壓脫溶，控制壓力低于-0.085MPa,脫除溶劑后得到大麻浸膏。表5、實(shí)施例4-1～4-6中不同亞臨界狀態(tài)的調(diào)整實(shí)施例編號(hào)壓力控制質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)提取率實(shí)施例4-1實(shí)施例4-2實(shí)施例4-3實(shí)施例4-4實(shí)施例4-5實(shí)施例4-6[0047]實(shí)施例5,采用乙醇對(duì)菌體中的大麻二酚進(jìn)行提取，具體步驟如下：菌體預(yù)處理：稱取大麻二酚菌體樣本1000g(含大麻二酚16.3mg/g),經(jīng)粉碎機(jī)粉每次提取時(shí)間為30min,每次溶劑的用量為3L,混合攪拌，提取具體參數(shù)見表6所示。[0048]提取液處理：提取液通過壓縮空氣打入到蒸發(fā)罐中，控制蒸發(fā)罐內(nèi)溫度在40～45℃范圍內(nèi)波動(dòng)并開啟真空泵，控制氣壓低于-0.085MPa,進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至含固量為1.5wt%,得到粗體液；粗體液在常溫下降溫至-65℃進(jìn)行冬化，冬化時(shí)間為8h,冬化完畢后過濾得到冬化液，再對(duì)冬化液進(jìn)行進(jìn)一步負(fù)壓脫溶，控制壓力低于-0.085MPa,脫除溶劑后得到大麻浸膏。表6、實(shí)施例5-1～5-6中不同亞臨界狀態(tài)的調(diào)整8實(shí)施例編號(hào)提取溫度壓力控制實(shí)施例5-1實(shí)施例5-2實(shí)施例5-3實(shí)施例5-4實(shí)施例5-5實(shí)施例5-6[0050]對(duì)比例1,采用石油醚對(duì)菌體中的大麻二酚進(jìn)行提取，具體步驟如下：菌體預(yù)處理：稱取大麻二酚菌體樣本1000g(含大麻二酚16.3mg/g),經(jīng)粉碎機(jī)粉亞臨界提?。簩⒕w顆粒置于密閉提取罐中，抽至真空，加入石油醚溶劑，提取三次，每次提取時(shí)間為30min,每次溶劑的用量為3L,混合攪拌，提取具體參數(shù)見表7所示。[0051]提取液處理：提取液通過壓縮空氣打入到蒸發(fā)罐中，控制蒸發(fā)罐內(nèi)溫度在40～45℃范圍內(nèi)波動(dòng)并開啟真空泵，控制氣壓低于-0.085MPa,進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮至含固量為1.5wt%,得到粗體液；粗體液在常溫下降溫至-65℃進(jìn)行冬化，冬化時(shí)間為8h,冬化完畢后過濾得到冬化液，再對(duì)冬化液進(jìn)行進(jìn)一步負(fù)壓脫溶，控制壓力低于-0.085MPa,脫除溶劑后得到大麻浸膏。表7、對(duì)比例1-1～1-6中不同亞臨界狀態(tài)的調(diào)整對(duì)比例提取溫度壓力控制質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)提取率對(duì)比例1-1常壓常壓[0052]對(duì)比例2,采用丙酮對(duì)菌體中的大麻二酚進(jìn)行提取，具體步驟如下：菌體預(yù)處理：稱取大麻二酚菌體樣本1000g(含大麻二酚16.3mg/g),經(jīng)粉碎機(jī)粉每次提取時(shí)間為30min,每次溶劑的用量為3L,混合攪拌，提取具體參數(shù)見表8所示。[0053]提取液處理：提取液通過壓縮空氣打入到蒸發(fā)罐中，控制蒸發(fā)罐內(nèi)溫度在40～45℃范圍內(nèi)波動(dòng)并開啟真空泵，控制氣壓低于-0.085MPa,進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮