對蝦白斑癥病毒囊膜蛋白單克隆抗體的研制與中和抗體篩選：方法、應(yīng)用與展望一、引言1.1研究背景對蝦養(yǎng)殖業(yè)在全球水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域占據(jù)著舉足輕重的地位，為全球糧食安全、經(jīng)濟(jì)增長及國際貿(mào)易平衡做出了巨大貢獻(xiàn)。我國對蝦養(yǎng)殖起步于20世紀(jì)80年代初期，歷經(jīng)多年發(fā)展，目前產(chǎn)量已位居世界第一，在水產(chǎn)品出口市場上占據(jù)重要位置。然而，自20世紀(jì)80年代以來，隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，病害問題日益突出，其中對蝦白斑癥病毒（WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV）成為了制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。WSSV屬于線形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus），是一種含有囊膜的無包涵體桿狀雙鏈DNA病毒。其傳染能力極強(qiáng)，致死率高，宿主范圍廣泛，除了對蝦外，還能感染多種蝦、蟹類生物。自1993年WSSV在我國大規(guī)模暴發(fā)流行以來，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了沉重打擊。全國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量從1992年的22萬多噸，急劇下降到1994年的5.5萬噸，眾多對蝦養(yǎng)殖企業(yè)因無法控制病害，紛紛轉(zhuǎn)養(yǎng)其他經(jīng)濟(jì)種類海洋生物或放棄養(yǎng)殖，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此后，盡管對蝦養(yǎng)殖業(yè)逐漸恢復(fù)發(fā)展，但WSSV始終如高懸的達(dá)摩克利斯之劍，時刻威脅著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定與發(fā)展。一旦爆發(fā)，感染率可達(dá)100%，致死率高達(dá)90%以上，短時間內(nèi)即可導(dǎo)致養(yǎng)殖對蝦大規(guī)模死亡，給養(yǎng)殖戶帶來慘重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對對蝦病毒病，尤其是WSSV引起的病害，尚無特效治療藥物。雖然在對蝦養(yǎng)殖中添加抗生素在一定程度上可增強(qiáng)對蝦抗病性，但大量使用會抑制對蝦自身免疫力，還可能導(dǎo)致抗生素殘留等食品安全問題。因此，國內(nèi)外普遍采用以防為主的策略，通過提高對蝦自身免疫力來增強(qiáng)其抗病力。在眾多防控手段中，抗體技術(shù)因其高度特異性和敏感性，在WSSV的檢測、診斷及防治研究中展現(xiàn)出巨大潛力。單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、純度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，在病毒檢測和疾病診斷方面具有重要應(yīng)用價值。通過研制針對WSSV囊膜蛋白的單克隆抗體，可以建立更加靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法，實現(xiàn)對WSSV的早期快速檢測，為病害防控爭取寶貴時間。而中和抗體能夠特異性地與病毒結(jié)合，阻斷病毒對宿主細(xì)胞的吸附和侵入，從而起到抗病毒感染的作用，篩選出高效的中和抗體有望為對蝦白斑癥的防治提供新的有效途徑。綜上所述，開展對蝦白斑癥病毒囊膜蛋白單克隆抗體的研制及中和抗體篩選研究，對于有效防控WSSV，促進(jìn)對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。1.2研究目的與意義本研究旨在通過細(xì)胞融合技術(shù)，制備針對對蝦白斑癥病毒（WSSV）囊膜蛋白的單克隆抗體，并建立有效的中和抗體篩選方法，獲得具有高效中和活性的抗體。通過本研究，一方面期望建立高靈敏度、高特異性的WSSV檢測方法，實現(xiàn)對病毒的早期準(zhǔn)確診斷，為病害防控提供有力的技術(shù)支持；另一方面，篩選出的中和抗體有望開發(fā)為新型抗病毒制劑，用于對蝦白斑癥的預(yù)防和治療，從而減少病毒對蝦類的侵害，降低養(yǎng)殖損失，推動對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。對蝦白斑癥病毒給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅著這一重要產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，雖然在WSSV的檢測和防治方面取得了一些進(jìn)展，但現(xiàn)有的檢測方法在靈敏度和特異性上仍存在一定的局限性，無法滿足對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中早期快速檢測的需求。而針對WSSV的特效治療藥物或生物制劑的研發(fā)也面臨諸多挑戰(zhàn)，這使得對蝦白斑癥的防控形勢依然嚴(yán)峻。因此，本研究具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。從理論層面來看，深入研究WSSV囊膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，以及抗體與病毒之間的相互作用機(jī)制，有助于揭示對蝦白斑癥病毒的感染機(jī)制和致病機(jī)理，豐富病毒學(xué)和免疫學(xué)的理論知識，為進(jìn)一步開展對蝦病毒病的基礎(chǔ)研究奠定堅實的理論基礎(chǔ)。從實際應(yīng)用角度而言，研制的囊膜蛋白單克隆抗體可以作為一種重要的生物試劑，用于開發(fā)更加靈敏、準(zhǔn)確的WSSV檢測技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光技術(shù)（IFA）、膠體金免疫層析技術(shù)等，實現(xiàn)對WSSV的早期快速檢測和精準(zhǔn)診斷。這對于及時發(fā)現(xiàn)疫情、采取有效的防控措施、防止病害的大規(guī)模傳播具有至關(guān)重要的意義。此外，篩選得到的中和抗體不僅可以為對蝦白斑癥的治療提供新的有效手段，還可以為開發(fā)新型抗病毒疫苗和藥物提供關(guān)鍵的研究材料和理論依據(jù)，有助于推動對蝦養(yǎng)殖病害防控技術(shù)的創(chuàng)新和升級，促進(jìn)對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康、穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展，保障養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)利益，維護(hù)全球水產(chǎn)品市場的穩(wěn)定供應(yīng)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀對蝦白斑癥病毒（WSSV）作為嚴(yán)重危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原體，長期以來一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點對象。在WSSV囊膜蛋白單克隆抗體研制及中和抗體篩選領(lǐng)域，經(jīng)過多年的探索與研究，已取得了一系列具有重要意義的進(jìn)展。在國外，相關(guān)研究起步較早。早期，科研人員致力于WSSV的基礎(chǔ)生物學(xué)研究，包括病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組測序等，為后續(xù)的抗體研究奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。隨著單克隆抗體技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，國外學(xué)者率先開展了針對WSSV囊膜蛋白的單克隆抗體研制工作。例如，[具體文獻(xiàn)]通過免疫小鼠，成功制備出針對WSSV囊膜蛋白VP28的單克隆抗體，并利用該抗體建立了ELISA檢測方法，顯著提高了對WSSV的檢測靈敏度和特異性。在中和抗體篩選方面，[具體文獻(xiàn)]采用病毒中和試驗等方法，從眾多單克隆抗體中篩選出了具有中和活性的抗體，研究發(fā)現(xiàn)這些中和抗體能夠有效阻斷WSSV對宿主細(xì)胞的吸附和侵入，為對蝦白斑癥的防治提供了新的思路和潛在的生物制劑。此外，國外學(xué)者還深入研究了中和抗體的作用機(jī)制，通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，揭示了抗體與病毒囊膜蛋白之間的相互作用位點和方式，進(jìn)一步加深了對中和抗體抗病毒機(jī)制的理解。國內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究雖然起步相對較晚，但發(fā)展迅速，成果豐碩。在囊膜蛋白單克隆抗體研制方面，眾多科研團(tuán)隊積極開展工作，取得了一系列重要成果。[具體文獻(xiàn)]利用基因工程技術(shù)表達(dá)WSSV囊膜蛋白，以此作為免疫原免疫小鼠，經(jīng)過細(xì)胞融合和篩選，獲得了多株特異性高、親和力強(qiáng)的單克隆抗體。這些單克隆抗體不僅在WSSV的檢測中表現(xiàn)出良好的性能，還在病毒的免疫診斷和免疫病理研究中發(fā)揮了重要作用。在中和抗體篩選方面，國內(nèi)學(xué)者也進(jìn)行了大量的探索和實踐。[具體文獻(xiàn)]通過構(gòu)建噬菌體展示抗體庫，結(jié)合親和篩選技術(shù)，成功篩選出針對WSSV的中和抗體，并對其生物學(xué)特性和中和活性進(jìn)行了深入研究。研究結(jié)果表明，篩選得到的中和抗體能夠在體內(nèi)外有效抑制WSSV的感染和復(fù)制，具有潛在的應(yīng)用價值。此外，國內(nèi)學(xué)者還注重將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為實際應(yīng)用，積極探索中和抗體在對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用方式和效果，為對蝦白斑癥的防控提供了切實可行的技術(shù)方案。盡管國內(nèi)外在WSSV囊膜蛋白單克隆抗體研制及中和抗體篩選方面取得了一定的進(jìn)展，但目前仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。一方面，現(xiàn)有的單克隆抗體檢測方法在靈敏度和特異性上仍有待進(jìn)一步提高，以滿足對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中早期快速檢測的需求。另一方面，中和抗體的生產(chǎn)成本較高，大規(guī)模制備技術(shù)還不夠成熟，限制了其在實際生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。此外，對于中和抗體的作用機(jī)制和體內(nèi)藥效學(xué)研究還不夠深入，需要進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，為其臨床應(yīng)用提供更堅實的理論支持。綜上所述，開展對蝦白斑癥病毒囊膜蛋白單克隆抗體的研制及中和抗體篩選研究具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值，未來仍需國內(nèi)外學(xué)者共同努力，不斷攻克技術(shù)難題，推動這一領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。二、對蝦白斑癥病毒及囊膜蛋白2.1對蝦白斑癥病毒概述對蝦白斑癥病毒（WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV），作為對蝦養(yǎng)殖業(yè)的“頭號殺手”，自被發(fā)現(xiàn)以來，就給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)帶來了沉重的打擊。它屬于線形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus），是一種含有囊膜的無包涵體桿狀雙鏈DNA病毒。從形態(tài)結(jié)構(gòu)上看，WSSV粒子呈桿狀，一端具有明顯的尾巴狀結(jié)構(gòu)。病毒粒子的大小通常為（270-380）nm×（120-150）nm，其囊膜主要由磷脂和蛋白質(zhì)組成，不僅對病毒粒子起到保護(hù)作用，還在病毒的感染過程中扮演著至關(guān)重要的角色，例如介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的識別與吸附。在囊膜內(nèi)部，是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的核衣殼，包裹著病毒的遺傳物質(zhì)——雙鏈DNA。WSSV的基因組為環(huán)形雙鏈DNA，大小約為300-305kb，包含180-184個開放閱讀框（ORFs）。這些ORFs編碼了多種病毒蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，它們在病毒的生命周期中各自發(fā)揮著獨特的功能。其中，結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒粒子的組裝和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，非結(jié)構(gòu)蛋白則參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程。例如，一些蛋白參與了病毒的吸附、侵入宿主細(xì)胞的過程，而另一些蛋白則在病毒的基因表達(dá)調(diào)控、核酸復(fù)制等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。WSSV的傳播途徑主要包括水平傳播和垂直傳播。水平傳播是其最主要的傳播方式，可通過多種途徑實現(xiàn)。病蝦、死蝦是重要的傳染源，健康對蝦接觸到被它們污染的水體、底泥，或者攝食了被病毒污染的餌料，都有可能感染W(wǎng)SSV。此外，一些媒介生物，如橈足類、蟹類等，也能攜帶病毒，在不同養(yǎng)殖區(qū)域之間傳播，擴(kuò)大病毒的傳播范圍。垂直傳播則是指親代對蝦將病毒傳遞給子代，這種傳播方式雖然相對較少，但卻對蝦苗的質(zhì)量和健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，一旦攜帶病毒的蝦苗被投放養(yǎng)殖，極易引發(fā)大規(guī)模的病害暴發(fā)。WSSV的宿主范圍極為廣泛，幾乎涵蓋了所有常見的養(yǎng)殖對蝦品種，如斑節(jié)對蝦、中國對蝦、日本對蝦、南美白對蝦等。同時，它還能感染其他水生甲殼類動物，如蟹類、螯蝦和龍蝦等。當(dāng)對蝦感染W(wǎng)SSV后，會出現(xiàn)一系列典型的癥狀。早期，病蝦表現(xiàn)為攝食量減少、活力下降，在池塘邊緩慢游動。隨著病情的發(fā)展，病蝦的頭胸甲和腹甲上會出現(xiàn)白色斑點，這些白斑大小不一，形狀不規(guī)則，有的呈細(xì)密的霧狀，有的則較大且明顯，直徑可達(dá)0.5-2.0mm，在光鏡下觀察，呈現(xiàn)出獨特的梅花瓣狀。此時，病蝦的肝胰腺顏色變淡，質(zhì)地變軟，腸胃空虛，血淋巴稀薄且不易凝固。病情嚴(yán)重時，病蝦對外界刺激反應(yīng)遲鈍，行動遲緩，最終死亡。WSSV具有極強(qiáng)的致死率，一旦在蝦池中暴發(fā)，短時間內(nèi)感染率可達(dá)100%，死亡率高達(dá)90%以上。從發(fā)現(xiàn)少量病蝦到整池對蝦大量死亡，往往只需短短一周左右的時間。這種高致死率和快速傳播的特點，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。以我國為例，1993年WSSV大規(guī)模暴發(fā)后，全國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量從1992年的22萬多噸急劇下降到1994年的5.5萬噸，眾多養(yǎng)殖戶血本無歸，許多對蝦養(yǎng)殖企業(yè)甚至被迫停產(chǎn)或轉(zhuǎn)產(chǎn)。此后，盡管對蝦養(yǎng)殖業(yè)逐漸恢復(fù)，但WSSV始終是高懸在養(yǎng)殖戶頭頂?shù)摹斑_(dá)摩克利斯之劍”，時刻威脅著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定與發(fā)展。2.2囊膜蛋白在病毒感染中的作用在對蝦白斑癥病毒（WSSV）的感染過程中，囊膜蛋白扮演著不可或缺的角色，其作用機(jī)制復(fù)雜且關(guān)鍵，涉及病毒感染的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。囊膜蛋白是病毒與宿主細(xì)胞接觸的“先遣部隊”，在病毒吸附與侵入宿主細(xì)胞的初始階段發(fā)揮著核心作用。以VP28為例，作為WSSV的主要囊膜蛋白之一，其N端存在潛在的跨膜區(qū)以及多個糖基化位點，這些特殊的結(jié)構(gòu)特征使其能夠特異性地識別并結(jié)合對蝦細(xì)胞膜上的受體。研究表明，VP28可以獨立與宿主細(xì)胞表面發(fā)生結(jié)合，這種特異性結(jié)合就如同鑰匙與鎖的精準(zhǔn)匹配，是病毒成功侵入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵第一步。通過定點突變實驗，當(dāng)改變VP28蛋白上與受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點時，病毒對宿主細(xì)胞的吸附能力顯著下降，甚至無法吸附，這充分證實了VP28在病毒吸附過程中的關(guān)鍵作用。除VP28外，其他囊膜蛋白如VP19等也被發(fā)現(xiàn)參與了病毒的吸附過程。VP19與VP28在病毒粒子表面可能形成特定的蛋白復(fù)合物，協(xié)同作用，增強(qiáng)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合力。它們各自發(fā)揮獨特的功能，共同促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的緊密接觸，為病毒的進(jìn)一步侵入奠定基礎(chǔ)。一旦病毒成功吸附到宿主細(xì)胞表面，囊膜蛋白又在病毒的侵入過程中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。在這個階段，囊膜蛋白的構(gòu)象變化至關(guān)重要。當(dāng)病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合后，囊膜蛋白受到細(xì)胞表面微環(huán)境的刺激，發(fā)生一系列的構(gòu)象改變。這種構(gòu)象變化就像是一個信號開關(guān)，觸發(fā)了病毒與宿主細(xì)胞膜的融合過程。以一些具有融合肽的囊膜蛋白為例，在構(gòu)象變化的過程中，融合肽被暴露并插入到宿主細(xì)胞膜中，就像一把銳利的匕首，為病毒膜與細(xì)胞膜的融合開辟道路。隨著融合過程的進(jìn)行，病毒的核酸得以順利進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部，從而開啟病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制周期。此外，囊膜蛋白還可能通過與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些分子相互作用，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生理狀態(tài)，為病毒的侵入創(chuàng)造有利條件。例如，某些囊膜蛋白可以激活宿主細(xì)胞內(nèi)的信號通路，使細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，變得更加有利于病毒的侵入。囊膜蛋白不僅在病毒感染的起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，還對病毒的組裝和釋放過程有著重要影響。在病毒的組裝過程中，囊膜蛋白作為病毒粒子的重要組成部分，參與了病毒結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。它們按照特定的順序和方式聚集在一起，與病毒的核酸和其他結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，共同形成完整的病毒粒子。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)囊膜蛋白的表達(dá)或功能受到抑制時，病毒的組裝過程會受到嚴(yán)重阻礙，無法形成正常的病毒粒子。在病毒的釋放階段，囊膜蛋白也發(fā)揮著不可或缺的作用。成熟的病毒粒子需要從宿主細(xì)胞中釋放出來，以便感染其他細(xì)胞，擴(kuò)大病毒的感染范圍。囊膜蛋白可能通過與宿主細(xì)胞膜的相互作用，幫助病毒粒子從宿主細(xì)胞中脫離。它們可能改變宿主細(xì)胞膜的物理性質(zhì)，使細(xì)胞膜局部發(fā)生變形，形成包裹病毒粒子的囊泡結(jié)構(gòu)，然后通過胞吐等方式將病毒粒子釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。2.3主要囊膜蛋白的研究現(xiàn)狀在對蝦白斑癥病毒（WSSV）的眾多組成部分中，囊膜蛋白因其在病毒感染過程中的關(guān)鍵作用，成為了研究的焦點。其中，VP28、VP19等主要囊膜蛋白的研究取得了較為豐富的成果，為深入理解WSSV的感染機(jī)制和開發(fā)有效的防控策略提供了重要的理論依據(jù)。VP28作為WSSV的主要囊膜蛋白之一，其結(jié)構(gòu)與功能的研究一直是該領(lǐng)域的熱點。VP28由WSSV基因組上的ORF421編碼，是一種相對分子質(zhì)量約為28kDa的蛋白質(zhì)。通過對其氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，VP28的N端存在潛在的跨膜區(qū)以及多個糖基化位點。趙新顏等通過計算機(jī)分析VP28的氨基酸殘基序列，發(fā)現(xiàn)其N端存在著一個強(qiáng)的疏水區(qū)，其中包括一個可能的穿膜α螺旋區(qū)。這些特殊的結(jié)構(gòu)特征賦予了VP28獨特的生物學(xué)功能。研究表明，VP28在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，主要參與病毒的吸附與侵入環(huán)節(jié)。劉非等研究發(fā)現(xiàn)VP28蛋白可獨立與宿主細(xì)胞表面發(fā)生結(jié)合，這一發(fā)現(xiàn)揭示了VP28在病毒感染初始階段的關(guān)鍵作用。進(jìn)一步的研究表明，VP28可以特異性地識別并結(jié)合對蝦細(xì)胞膜上的受體，從而介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的粘附。vanHulten等通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP28，并用兔子制備相應(yīng)的多克隆抗體，證明VP28的抗血清能中和WSSV對對蝦的感染，這進(jìn)一步證實了VP28在病毒感染過程中的重要性。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，VP28可能與其他囊膜蛋白相互作用，共同參與病毒的感染過程。VP19也是WSSV的重要囊膜蛋白，在病毒的感染過程中同樣發(fā)揮著不可或缺的作用。VP19的基因序列相對較短，但其編碼的蛋白質(zhì)在病毒粒子的結(jié)構(gòu)和功能中具有重要意義。從結(jié)構(gòu)上看，VP19含有多個保守的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域與VP19的功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，VP19參與了病毒的吸附和侵入過程。在病毒吸附階段，VP19可能與VP28等其他囊膜蛋白協(xié)同作用，增強(qiáng)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合力。在病毒侵入階段，VP19可能通過與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些分子相互作用，促進(jìn)病毒膜與細(xì)胞膜的融合，從而使病毒核酸順利進(jìn)入宿主細(xì)胞。有研究表明，VP19還可能在病毒的組裝和釋放過程中發(fā)揮作用。它可能參與了病毒粒子的結(jié)構(gòu)構(gòu)建，確保病毒粒子的完整性和穩(wěn)定性。在病毒釋放時，VP19可能通過與宿主細(xì)胞膜的相互作用，幫助病毒粒子從宿主細(xì)胞中脫離，進(jìn)而感染其他細(xì)胞。除了VP28和VP19外，其他一些囊膜蛋白如VP26、VP37等也逐漸受到關(guān)注。VP26在病毒粒子中含量豐富，雖然其具體功能尚未完全明確，但已有研究表明它可能與病毒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和感染性有關(guān)。VP37被確定為WSSV的粘附蛋白之一，通過地高辛標(biāo)記的對蝦血細(xì)胞膜和鰓細(xì)胞膜蛋白與印跡到硝酸纖維素膜上、通過SDS分離的病毒蛋白結(jié)合實驗，定位了VP37，質(zhì)譜分析獲知VP37是wsv254編碼的蛋白，且研究發(fā)現(xiàn)其含有“RGD”結(jié)合結(jié)構(gòu)域的9個氨基酸功能小肽（LIQERGDEI）對結(jié)合活性起重要作用，這暗示著VP37在病毒與宿主細(xì)胞的識別和粘附過程中可能發(fā)揮著重要作用。然而，目前對于這些囊膜蛋白的研究還相對較少，其具體的結(jié)構(gòu)和功能仍有待進(jìn)一步深入探索。三、囊膜蛋白單克隆抗體的研制3.1抗原的制備與純化抗原的獲取是研制單克隆抗體的首要關(guān)鍵步驟，其質(zhì)量直接關(guān)乎后續(xù)抗體的特異性和效價。在本研究中，針對對蝦白斑癥病毒（WSSV）囊膜蛋白，我們采用基因工程表達(dá)的方法來獲取高純度的抗原。首先，從感染W(wǎng)SSV的對蝦組織中提取總DNA。這一步需要嚴(yán)格控制操作環(huán)境，避免DNA受到核酸酶的降解。采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法，利用酚和氯仿對蛋白質(zhì)和核酸不同的溶解性，使蛋白質(zhì)變性沉淀，而核酸保留在水相中。經(jīng)過多次抽提和離心后，收集含有DNA的上清液，再通過乙醇沉淀法進(jìn)一步純化DNA，去除雜質(zhì)和鹽分。通過設(shè)計特異性引物，以提取的WSSV基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增目的囊膜蛋白基因。引物的設(shè)計至關(guān)重要，需依據(jù)已公布的WSSV基因組序列，確保引物與目的基因的特異性結(jié)合，同時避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。在PCR反應(yīng)體系中，精確控制各種成分的比例，包括模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。反應(yīng)條件經(jīng)過多次優(yōu)化，包括變性溫度、退火溫度和延伸時間等，以保證高效、特異性地擴(kuò)增目的基因。將擴(kuò)增得到的目的基因片段與合適的表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。這里選用的表達(dá)載體需具備強(qiáng)啟動子、多克隆位點和篩選標(biāo)記等元件，以確保目的基因能夠在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，并便于后續(xù)的篩選和鑒定。采用限制性內(nèi)切酶切割載體和目的基因片段，使其產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，再利用DNA連接酶將兩者連接起來。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，通過在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上篩選，獲得含有重組表達(dá)質(zhì)粒的陽性克隆。將陽性克隆接種至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長至對數(shù)生長期時，加入誘導(dǎo)劑（如IPTG）誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)時間需經(jīng)過優(yōu)化，以獲得最大量的可溶性表達(dá)蛋白。在誘導(dǎo)表達(dá)過程中，通過SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析蛋白表達(dá)情況，監(jiān)測目的蛋白的表達(dá)水平和純度。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，采用超聲破碎法或高壓勻漿法破碎細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白釋放出來。破碎后的細(xì)胞裂解液通過離心去除細(xì)胞碎片和不溶性雜質(zhì)，得到含有目的蛋白的上清液。為了獲得高純度的抗原，需要對上清液進(jìn)行進(jìn)一步的純化。采用親和層析法，利用目的蛋白與特異性配體之間的高親和力，實現(xiàn)目的蛋白的特異性分離。例如，若目的囊膜蛋白帶有His標(biāo)簽，可選用Ni-NTA（鎳-次氮基三乙酸）親和層析柱。將細(xì)胞裂解液上清液緩慢通過Ni-NTA親和層析柱，His標(biāo)簽蛋白會特異性地結(jié)合到柱上的鎳離子上，而其他雜質(zhì)蛋白則被洗脫下來。然后，通過梯度洗脫的方式，使用含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液將結(jié)合在柱上的目的蛋白洗脫下來。收集洗脫峰中的蛋白，通過SDS-PAGE和Westernblot分析其純度和特異性。若純度未達(dá)到要求，可進(jìn)一步采用凝膠過濾層析或離子交換層析等方法進(jìn)行精制，以去除殘留的雜質(zhì)蛋白，最終獲得高純度的囊膜蛋白抗原。3.2動物免疫與細(xì)胞融合動物免疫是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而細(xì)胞融合則是制備單克隆抗體的核心技術(shù)，二者緊密相連，共同為后續(xù)的抗體篩選和鑒定奠定基礎(chǔ)。在動物免疫環(huán)節(jié)，我們選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為免疫對象。BALB/c小鼠具有免疫應(yīng)答能力強(qiáng)、繁殖性能好、遺傳背景清晰等優(yōu)點，在單克隆抗體制備中被廣泛應(yīng)用。免疫前，先對小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，確保小鼠健康狀態(tài)良好。免疫方案采用多點皮下注射結(jié)合腹腔注射的方式。將制備好的高純度囊膜蛋白抗原與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比充分乳化。弗氏完全佐劑含有滅活的分枝桿菌，能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。首次免疫時，每只小鼠在背部及腹部多個部位進(jìn)行皮下注射，注射劑量為100μg抗原/只。注射后，密切觀察小鼠的反應(yīng)，確保無不良反應(yīng)發(fā)生。2周后進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，此次使用弗氏不完全佐劑與抗原乳化，免疫方式改為腹腔注射，劑量仍為100μg抗原/只。弗氏不完全佐劑不含分枝桿菌，主要用于維持和增強(qiáng)免疫應(yīng)答。之后，每隔1周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3-4次。每次加強(qiáng)免疫后7-10天，采集小鼠少量尾靜脈血，通過間接ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）檢測血清抗體效價。ELISA是一種常用的免疫檢測技術(shù)，其原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合，通過酶標(biāo)記物催化底物顯色，根據(jù)顏色深淺來判斷抗體含量。當(dāng)血清抗體效價達(dá)到1:10000以上時，表明小鼠已產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，可進(jìn)行細(xì)胞融合實驗。細(xì)胞融合是將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成既能無限增殖又能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞的過程。本研究選用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，該細(xì)胞株具有不分泌抗體、對8-氮鳥嘌呤敏感、易于融合等特點。在融合前，將SP2/0細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其處于對數(shù)生長期，細(xì)胞活力大于95%。融合當(dāng)天，斷頸處死免疫小鼠，無菌取出脾臟，置于盛有預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基的平皿中。用鑷子輕輕研磨脾臟，使其分散成單細(xì)胞懸液，然后通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，去除組織碎片。將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500r/min離心5min，棄上清，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2-3次，計數(shù)脾細(xì)胞數(shù)量。按照脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞5:1-10:1的比例，將兩種細(xì)胞混合于50ml離心管中，1500r/min離心5min，棄上清，盡量吸凈殘留液體。輕輕彈擊離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散均勻。將離心管置于37℃水浴中，緩慢加入50%PEG（聚乙二醇）溶液1ml，邊加邊輕輕攪拌，持續(xù)90s，促進(jìn)細(xì)胞融合。PEG是一種常用的細(xì)胞融合劑，其作用機(jī)制是通過改變細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，使相鄰細(xì)胞的膜相互接觸、融合。隨后，在1min內(nèi)緩慢加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基10ml，終止PEG的作用。1500r/min離心5min，棄上清，用含20%胎牛血清、HAT（次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）的RPMI-1640選擇培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。HAT培養(yǎng)基中的氨基蝶呤能夠阻斷細(xì)胞的正常核苷酸合成途徑，只有融合后的雜交瘤細(xì)胞（同時具備脾細(xì)胞的次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和骨髓瘤細(xì)胞的無限增殖能力）才能在HAT培養(yǎng)基中利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷進(jìn)行DNA合成，從而存活并增殖。將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞生長情況，每隔2-3天更換一次含有HAT的選擇培養(yǎng)基，去除未融合的細(xì)胞和死亡細(xì)胞。大約7-10天后，可見雜交瘤細(xì)胞逐漸生長并形成克隆，此時可進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選。3.3雜交瘤細(xì)胞的篩選與鑒定3.3.1篩選方法在細(xì)胞融合完成后，眾多融合細(xì)胞中并非所有都能產(chǎn)生我們期望的針對對蝦白斑癥病毒（WSSV）囊膜蛋白的特異性抗體，因此需要通過有效的篩選方法來找出陽性雜交瘤細(xì)胞。本研究采用間接ELISA作為主要的篩選方法，其原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合以及酶對底物的催化顯色反應(yīng)。操作流程如下：首先，將純化后的WSSV囊膜蛋白抗原用包被緩沖液（如碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至合適濃度（一般為1-10μg/mL），以每孔100μL的量加入到96孔酶標(biāo)板中。將酶標(biāo)板置于4℃冰箱中包被過夜，使抗原牢固地吸附在酶標(biāo)板的固相載體表面。包被完成后，棄去板中的液體，用洗滌緩沖液（如含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液，PBST）洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次洗滌后在濾紙上拍干，以去除未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。每孔加入150μL封閉液（如5%脫脂奶粉的PBST溶液），室溫下封閉2-3小時，封閉的目的是防止后續(xù)檢測過程中抗體的非特異性吸附。封閉結(jié)束后，再次用PBST洗滌酶標(biāo)板3-5次。將培養(yǎng)孔中的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為待測樣品，從1:100開始進(jìn)行倍比稀釋，以每孔100μL的量加入到酶標(biāo)板中，每個稀釋度設(shè)3-5個復(fù)孔。同時設(shè)置陰性對照孔（加入未免疫小鼠血清或正常細(xì)胞培養(yǎng)上清液）和陽性對照孔（加入已知的針對WSSV囊膜蛋白的陽性血清）。將酶標(biāo)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-2小時，使樣品中的抗體與包被在酶標(biāo)板上的抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌酶標(biāo)板5-6次，徹底去除未結(jié)合的抗體。每孔加入100μL稀釋好的酶標(biāo)二抗（如辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，稀釋度根據(jù)說明書確定），37℃孵育1小時。酶標(biāo)二抗能夠特異性地識別并結(jié)合待測樣品中的抗體，從而形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。孵育完成后，用PBST洗滌酶標(biāo)板6-8次，去除未結(jié)合的酶標(biāo)二抗。每孔加入100μL底物溶液（如TMB底物），室溫下避光反應(yīng)5-15分鐘，酶標(biāo)二抗上的辣根過氧化物酶會催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，使溶液顏色發(fā)生變化。當(dāng)顏色變化達(dá)到合適程度時，每孔加入50μL終止液（如2M硫酸溶液）終止反應(yīng)。最后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)OD值判斷雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中是否含有特異性抗體，一般以陰性對照孔OD值的2.1倍作為判斷陽性的標(biāo)準(zhǔn)，OD值大于該標(biāo)準(zhǔn)的孔即為陽性孔，對應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞即為陽性雜交瘤細(xì)胞。除了間接ELISA法，還可結(jié)合免疫熒光技術(shù)（IFA）對篩選結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗證。IFA的原理是利用熒光素標(biāo)記的二抗與結(jié)合在細(xì)胞或組織抗原上的一抗結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光信號，從而判斷抗體與抗原的結(jié)合情況。將感染W(wǎng)SSV的對蝦組織切片或培養(yǎng)的對蝦細(xì)胞固定在載玻片上，滴加雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37℃孵育1小時。用PBS洗滌后，滴加熒光素標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育30分鐘。再次用PBS洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察，若細(xì)胞或組織切片上出現(xiàn)特異性熒光，則表明雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有針對WSSV囊膜蛋白的特異性抗體。通過多種篩選方法的結(jié)合使用，可以提高陽性雜交瘤細(xì)胞篩選的準(zhǔn)確性和可靠性。3.3.2鑒定內(nèi)容對篩選得到的單克隆抗體進(jìn)行全面的鑒定，是深入了解其生物學(xué)特性和應(yīng)用價值的關(guān)鍵步驟，主要包括特異性、親和力、亞型等方面的鑒定。特異性鑒定是判斷單克隆抗體是否只與目標(biāo)抗原發(fā)生特異性結(jié)合，而不與其他無關(guān)抗原產(chǎn)生交叉反應(yīng)。本研究采用Westernblot和競爭ELISA兩種方法進(jìn)行特異性鑒定。在Westernblot實驗中，將純化的WSSV囊膜蛋白以及其他可能存在交叉反應(yīng)的蛋白（如其他對蝦病毒的囊膜蛋白、對蝦組織中的常見蛋白等）進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，通過電轉(zhuǎn)印的方法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上。將NC膜用5%脫脂奶粉的PBST溶液封閉1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液（一抗），室溫孵育1-2小時。用PBST洗滌NC膜3-5次，每次洗滌5-10分鐘。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗），室溫孵育1小時。再次用PBST洗滌NC膜5-6次，然后加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL底物），在暗室中曝光顯影。如果在與WSSV囊膜蛋白相對應(yīng)的位置出現(xiàn)特異性條帶，而在其他無關(guān)蛋白位置沒有條帶出現(xiàn)，則表明單克隆抗體具有良好的特異性。競爭ELISA則是將一定量的已知特異性抗體與待測單克隆抗體同時加入到包被有WSSV囊膜蛋白抗原的酶標(biāo)板中，孵育后加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行檢測。如果待測單克隆抗體與已知特異性抗體能夠競爭結(jié)合抗原，導(dǎo)致檢測信號降低，則說明待測單克隆抗體與已知特異性抗體識別相同或相近的抗原表位，進(jìn)一步驗證了其特異性。特異性鑒定的意義在于確保單克隆抗體在后續(xù)的檢測和應(yīng)用中能夠準(zhǔn)確地識別目標(biāo)抗原，避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。親和力是指單克隆抗體與抗原結(jié)合的緊密程度，親和力的高低直接影響抗體在檢測和治療中的效果。采用ELISA競爭抑制法測定單克隆抗體的親和力。首先，將WSSV囊膜蛋白抗原包被在酶標(biāo)板上，然后加入一系列不同濃度的未標(biāo)記抗原和固定濃度的標(biāo)記抗原（如生物素標(biāo)記的抗原），再加入待測單克隆抗體。孵育后，加入鏈霉親和素標(biāo)記的酶（如鏈霉親和素-辣根過氧化物酶），通過檢測酶催化底物顯色的程度來計算不同濃度未標(biāo)記抗原對標(biāo)記抗原與單克隆抗體結(jié)合的抑制率。以抑制率為縱坐標(biāo)，未標(biāo)記抗原濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制競爭抑制曲線。根據(jù)競爭抑制曲線，計算出半數(shù)抑制濃度（IC??），IC??值越小，表明單克隆抗體與抗原的親和力越高。親和力的鑒定對于評估單克隆抗體的質(zhì)量和應(yīng)用潛力具有重要意義。在檢測應(yīng)用中，高親和力的單克隆抗體能夠更靈敏地檢測到低濃度的抗原，提高檢測的靈敏度；在治療應(yīng)用中，高親和力的中和抗體能夠更有效地結(jié)合病毒，阻斷病毒的感染，增強(qiáng)治療效果。單克隆抗體的亞型鑒定可以明確抗體的類別，為后續(xù)的抗體純化、標(biāo)記和應(yīng)用提供重要依據(jù)。采用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒（如鼠單克隆抗體亞型鑒定ELISA試劑盒）進(jìn)行鑒定。按照試劑盒說明書的操作步驟，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入到包被有抗鼠IgG、IgA、IgM等不同亞型抗體的酶標(biāo)板孔中，孵育后加入酶標(biāo)二抗，最后加入底物顯色。通過酶標(biāo)儀測定各孔的OD值，根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線和判定方法，確定單克隆抗體的亞型。不同亞型的單克隆抗體在理化性質(zhì)、生物學(xué)功能和應(yīng)用方面可能存在差異。例如，IgG亞型抗體具有較好的穩(wěn)定性和較長的半衰期，在檢測和治療中應(yīng)用較為廣泛；而IgM亞型抗體通常具有較高的親和力，但分子量較大，在某些應(yīng)用中可能受到限制。了解單克隆抗體的亞型，有助于選擇合適的抗體純化方法和標(biāo)記技術(shù)，優(yōu)化抗體的應(yīng)用效果。3.4單克隆抗體的大量制備與純化獲得陽性雜交瘤細(xì)胞后，需大量制備單克隆抗體，以滿足后續(xù)研究和應(yīng)用需求。本研究采用腹水法和體外培養(yǎng)法進(jìn)行單克隆抗體的大量制備，并通過親和層析技術(shù)進(jìn)行純化。腹水法是一種常用的大量制備單克隆抗體的方法，具有產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點。在制備前，先向8-10周齡的雌性BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射0.5mL液體石蠟，以刺激小鼠腹腔產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，為雜交瘤細(xì)胞的生長提供適宜環(huán)境。7-10天后，將處于對數(shù)生長期的陽性雜交瘤細(xì)胞用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?-5×10?個/mL，以每只小鼠腹腔注射0.5-1.0mL的量接種到小鼠腹腔中。接種后，密切觀察小鼠的狀態(tài)，一般在7-14天左右，小鼠腹腔內(nèi)會產(chǎn)生大量腹水。當(dāng)小鼠腹部明顯膨大時，用無菌注射器抽取腹水。抽取腹水時，需注意嚴(yán)格無菌操作，避免污染。為了提高腹水的產(chǎn)量和質(zhì)量，可在抽取腹水前1-2天，給小鼠腹腔注射適量的弗氏不完全佐劑，以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。腹水抽取后，可通過離心去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液，即為含有單克隆抗體的腹水。體外培養(yǎng)法具有操作簡便、無污染等優(yōu)點，適合大規(guī)模制備單克隆抗體。將陽性雜交瘤細(xì)胞接種到細(xì)胞工廠或生物反應(yīng)器中，使用含10%-20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，需嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，溫度保持在37℃，CO?濃度為5%，并定期更換培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的生長和代謝。為了提高單克隆抗體的產(chǎn)量，可在培養(yǎng)基中添加一些生長因子或營養(yǎng)成分，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒等。此外，還可采用懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)等技術(shù)，提高細(xì)胞的培養(yǎng)密度和抗體產(chǎn)量。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后期，細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時，收集培養(yǎng)上清液，即為含有單克隆抗體的培養(yǎng)液。腹水或培養(yǎng)液中除了含有單克隆抗體外，還含有大量的雜蛋白和其他雜質(zhì)，需要進(jìn)行純化以提高抗體的純度和質(zhì)量。本研究采用ProteinA親和層析法進(jìn)行單克隆抗體的純化。ProteinA是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離出來的蛋白質(zhì)，它能夠特異性地與IgG的Fc段結(jié)合。將腹水或培養(yǎng)液用0.22μm的濾膜過濾，去除較大的顆粒雜質(zhì)。將過濾后的樣品緩慢通過ProteinA親和層析柱，單克隆抗體（IgG亞型）會特異性地結(jié)合到柱上的ProteinA上，而其他雜質(zhì)蛋白則被洗脫下來。用含有低pH值（一般為2.5-3.0）的洗脫緩沖液洗脫結(jié)合在柱上的單克隆抗體，收集洗脫峰。為了避免抗體在低pH條件下失活，收集的洗脫液需立即用中和緩沖液（如1MTris-HCl，pH8.0）進(jìn)行中和。將純化后的單克隆抗體通過透析或超濾的方法進(jìn)行緩沖液置換，去除洗脫緩沖液中的鹽分和雜質(zhì)，最終得到高純度的單克隆抗體。通過SDS-PAGE和Westernblot分析純化后的單克隆抗體的純度和特異性，結(jié)果顯示，純化后的單克隆抗體純度高，特異性強(qiáng)，滿足后續(xù)研究和應(yīng)用的需求。四、中和抗體的篩選4.1中和抗體篩選方法概述中和抗體篩選在病毒研究和抗病毒藥物開發(fā)領(lǐng)域具有至關(guān)重要的地位，是發(fā)現(xiàn)有效抗病毒生物制劑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，常用的中和抗體篩選方法主要包括病毒中和試驗（VirusNeutralizationTest，VNT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）衍生法以及基于細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect，CPE）的檢測方法等，每種方法都有其獨特的原理、優(yōu)缺點及適用場景。病毒中和試驗是一種經(jīng)典且直接的中和抗體篩選方法，其原理基于中和抗體能夠特異性地與病毒結(jié)合，阻斷病毒對宿主細(xì)胞的吸附和侵入，從而抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖。在實驗操作中，將不同稀釋度的待測抗體與一定量的病毒混合，孵育一段時間，使抗體與病毒充分結(jié)合，形成病毒-抗體復(fù)合物。然后將混合物接種到敏感的宿主細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。通過觀察細(xì)胞的病變情況，如細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞死亡等，來判斷病毒的感染情況。如果待測抗體具有中和活性，那么病毒對細(xì)胞的感染就會受到抑制，細(xì)胞病變程度減輕。通常以能夠抑制50%細(xì)胞病變的抗體稀釋度（TCID??）作為判斷中和抗體效價的指標(biāo)。病毒中和試驗的優(yōu)點是能夠直接反映中和抗體對病毒感染的抑制作用，結(jié)果直觀可靠，是評估中和抗體活性的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，該方法也存在一些明顯的缺點，如操作過程繁瑣，需要使用活病毒，對實驗條件和操作人員的要求較高，實驗周期較長，一般需要數(shù)天甚至數(shù)周才能得到結(jié)果。此外，病毒中和試驗難以實現(xiàn)高通量篩選，限制了其在大規(guī)?？贵w篩選中的應(yīng)用。因此，病毒中和試驗適用于對中和抗體活性的精準(zhǔn)驗證和深入研究，但在初步篩選大量抗體時效率較低。酶聯(lián)免疫吸附試驗衍生法是在傳統(tǒng)ELISA技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，用于中和抗體篩選的方法。其原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，將病毒抗原或抗體固定在固相載體表面，通過檢測抗體與抗原結(jié)合后形成的復(fù)合物，間接反映中和抗體的存在和活性。例如，競爭ELISA法是將一定量的已知特異性抗體與待測抗體同時加入到包被有病毒抗原的酶標(biāo)板中，孵育后加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行檢測。如果待測抗體與已知特異性抗體能夠競爭結(jié)合抗原，導(dǎo)致檢測信號降低，則說明待測抗體與已知特異性抗體識別相同或相近的抗原表位，可能具有中和活性。此外，還有夾心ELISA法等，通過不同的抗原抗體組合方式，實現(xiàn)對中和抗體的檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗衍生法的優(yōu)點是操作相對簡便，檢測速度快，能夠在較短時間內(nèi)處理大量樣本，適合大規(guī)模的中和抗體初步篩選。而且該方法靈敏度較高，能夠檢測到低水平的中和抗體。然而，該方法也存在一定的局限性，它只能間接反映中和抗體的活性，不能直接觀察病毒對細(xì)胞的感染情況，結(jié)果可能受到非特異性結(jié)合等因素的干擾。因此，酶聯(lián)免疫吸附試驗衍生法通常用于中和抗體的初步篩選，篩選出的陽性樣本還需要進(jìn)一步通過其他方法進(jìn)行驗證。基于細(xì)胞病變效應(yīng)的檢測方法是利用病毒感染宿主細(xì)胞后引起的細(xì)胞病變現(xiàn)象來篩選中和抗體。當(dāng)病毒感染敏感細(xì)胞時，會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)生改變，如細(xì)胞變圓、裂解、脫落等，這些變化可以通過顯微鏡直接觀察或借助其他檢測手段進(jìn)行量化。在中和抗體篩選中，將待測抗體與病毒混合后接種到細(xì)胞中，觀察細(xì)胞病變程度的變化。如果抗體能夠中和病毒，細(xì)胞病變效應(yīng)就會減弱或消失。這種方法的優(yōu)點是操作相對簡單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，能夠直觀地觀察到中和抗體對病毒感染細(xì)胞的影響。同時，它也具有一定的靈敏度，能夠檢測到具有中和活性的抗體。然而，該方法也存在一些不足之處，細(xì)胞病變效應(yīng)的判斷在一定程度上依賴于操作人員的經(jīng)驗和主觀判斷，容易產(chǎn)生誤差。而且，不同病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)可能存在差異，需要針對不同病毒建立相應(yīng)的檢測體系。此外，該方法對于一些不引起明顯細(xì)胞病變的病毒可能不適用?；诩?xì)胞病變效應(yīng)的檢測方法適用于對中和抗體的初步快速篩選，尤其是在對病毒感染機(jī)制和細(xì)胞病變特征較為了解的情況下，能夠快速有效地篩選出具有潛在中和活性的抗體。4.2基于細(xì)胞病變效應(yīng)的篩選方法4.2.1方法原理與操作步驟基于細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect，CPE）的篩選方法，其核心原理是利用病毒感染宿主細(xì)胞后引發(fā)的一系列特征性變化來判斷中和抗體的存在及活性。當(dāng)對蝦白斑癥病毒（WSSV）感染敏感細(xì)胞時，會破壞細(xì)胞的正常生理功能和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變現(xiàn)象。這些病變表現(xiàn)形式多樣，包括細(xì)胞形態(tài)改變，如細(xì)胞變圓、腫脹、皺縮等；細(xì)胞生理功能異常，如細(xì)胞代謝紊亂、增殖能力下降；以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，如細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞裂解脫落等。在篩選中和抗體時，若存在中和抗體，它能夠與病毒特異性結(jié)合，阻斷病毒對宿主細(xì)胞的吸附和侵入過程，從而有效抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖和擴(kuò)散，使細(xì)胞病變效應(yīng)顯著減弱甚至完全消失。在本研究中，采用的是對蝦胚胎細(xì)胞（PE細(xì)胞）作為宿主細(xì)胞，進(jìn)行基于細(xì)胞病變效應(yīng)的中和抗體篩選實驗。具體操作步驟如下：細(xì)胞準(zhǔn)備：將PE細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種密度為5×10?個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基，置于28℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長至80%-90%融合度時，即可用于后續(xù)實驗。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，確保細(xì)胞生長健康，無污染現(xiàn)象。病毒稀釋：將WSSV病毒液進(jìn)行梯度稀釋，一般從10?1開始，進(jìn)行10倍系列稀釋，如10?2、10?3、10??等。每個稀釋度設(shè)置3-5個復(fù)孔，以便準(zhǔn)確測定病毒滴度。病毒稀釋過程需在無菌條件下進(jìn)行，使用無菌移液器和吸頭，避免病毒污染和交叉污染?？贵w稀釋：將待篩選的單克隆抗體進(jìn)行梯度稀釋，起始稀釋度為1:100，然后進(jìn)行倍比稀釋，如1:200、1:400、1:800等。每個稀釋度同樣設(shè)置3-5個復(fù)孔?？贵w稀釋時，需使用無菌的PBS緩沖液，并確保稀釋過程準(zhǔn)確無誤，以保證實驗結(jié)果的可靠性。病毒與抗體混合：將不同稀釋度的病毒液與相應(yīng)稀釋度的抗體液等體積混合，充分混勻后，置于37℃恒溫孵育箱中孵育1-2小時。在孵育過程中，病毒與抗體充分接觸，若抗體具有中和活性，會與病毒結(jié)合形成復(fù)合物，從而影響病毒的感染能力。接種細(xì)胞：將孵育后的病毒-抗體混合液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的PE細(xì)胞上，每孔接種100μL。同時設(shè)置病毒對照孔（只接種病毒液，不接種抗體）和細(xì)胞對照孔（只接種細(xì)胞，不接種病毒和抗體）。接種時，需注意避免產(chǎn)生氣泡，確保病毒-抗體混合液均勻覆蓋在細(xì)胞表面。培養(yǎng)與觀察：將接種后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于28℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，記錄細(xì)胞病變的程度和出現(xiàn)病變的時間。細(xì)胞病變程度可分為0-4級，0級表示無細(xì)胞病變，細(xì)胞形態(tài)正常；1級表示少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)病變，如變圓、脫落等；2級表示約50%的細(xì)胞出現(xiàn)病變；3級表示大部分細(xì)胞出現(xiàn)病變；4級表示幾乎所有細(xì)胞均出現(xiàn)病變，細(xì)胞完全裂解脫落。4.2.2結(jié)果分析與判定根據(jù)基于細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）篩選中和抗體實驗的結(jié)果，我們可以通過以下方法進(jìn)行分析與判定。在結(jié)果分析方面，我們重點關(guān)注細(xì)胞病變效應(yīng)的變化情況。將病毒對照孔與接種了抗體的孔進(jìn)行對比，若接種抗體后，細(xì)胞病變程度明顯減輕，出現(xiàn)病變的時間顯著延遲，這表明抗體可能具有中和活性。以不同稀釋度的抗體孔為例，隨著抗體稀釋度的增加，若細(xì)胞病變程度逐漸加重，出現(xiàn)病變的時間逐漸提前，說明抗體的中和活性隨著稀釋度的增大而減弱。我們還可以通過繪制細(xì)胞病變效應(yīng)曲線來更直觀地分析結(jié)果。以抗體稀釋度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞病變程度或出現(xiàn)病變的時間為縱坐標(biāo)，繪制曲線。若曲線呈現(xiàn)下降趨勢，即隨著抗體稀釋度增加，細(xì)胞病變程度減輕或出現(xiàn)病變時間延遲，進(jìn)一步證明抗體具有中和活性。判定中和抗體活性時，一般以能夠抑制50%細(xì)胞病變的抗體稀釋度（TCID??）作為關(guān)鍵指標(biāo)。具體計算方法可采用Reed-Muench法。假設(shè)我們設(shè)置了多個抗體稀釋度，每個稀釋度有多個復(fù)孔，通過觀察記錄各復(fù)孔的細(xì)胞病變情況，統(tǒng)計不同稀釋度下出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)和未出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)。按照Reed-Muench法的計算公式，計算出TCID??值。例如，當(dāng)計算得到某抗體的TCID??值為1:400時，意味著該抗體在1:400的稀釋度下，能夠抑制50%的細(xì)胞發(fā)生病變，從而判斷該抗體具有一定的中和活性。通常，TCID??值越大，表明抗體的中和活性越強(qiáng)。若某抗體在較低的稀釋度下就能抑制50%的細(xì)胞病變，說明其對病毒的中和能力較強(qiáng)；反之，若需要較高的稀釋度才能達(dá)到相同效果，則表明該抗體的中和活性相對較弱。在實際判定中，還需結(jié)合實驗?zāi)康暮鸵?，確定一個合理的中和抗體活性判定標(biāo)準(zhǔn)。對于一些應(yīng)用場景，可能需要中和活性較強(qiáng)的抗體，即TCID??值較高的抗體；而在其他情況下，相對較低中和活性的抗體也可能具有一定的研究價值。4.3基于病毒定量檢測的篩選方法4.3.1實時熒光定量PCR技術(shù)在篩選中的應(yīng)用實時熒光定量PCR（Real-TimeFluorescentQuantitativePCR，qPCR）技術(shù)，作為一種在分子生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的先進(jìn)技術(shù)，在對蝦白斑癥病毒（WSSV）中和抗體篩選中展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢和重要的應(yīng)用價值。該技術(shù)的核心原理基于在PCR反應(yīng)體系中巧妙地加入熒光基團(tuán)，借助熒光信號的累積變化，實現(xiàn)對整個PCR進(jìn)程的實時動態(tài)監(jiān)測，進(jìn)而能夠精準(zhǔn)地對起始模板進(jìn)行定量分析。在PCR擴(kuò)增過程中，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號也隨之增強(qiáng)。通過設(shè)定合適的熒光閾值，當(dāng)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號強(qiáng)度達(dá)到該閾值時，所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被定義為Ct值（CycleThreshold）。Ct值與起始模板量之間存在著緊密的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即起始模板量越多，達(dá)到熒光閾值所需的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小。這一特性使得我們能夠依據(jù)Ct值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法，準(zhǔn)確地推算出樣本中起始模板的含量。在中和抗體篩選中，實時熒光定量PCR技術(shù)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。具體操作流程如下：首先，將不同稀釋度的待測抗體與一定量的WSSV病毒液充分混合，在適宜的溫度條件下孵育一段時間，使抗體與病毒充分結(jié)合，形成病毒-抗體復(fù)合物。隨后，從混合液中提取病毒核酸，以此作為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中，使用特異性的引物和探針，確保能夠準(zhǔn)確地擴(kuò)增WSSV的特定基因片段。例如，針對WSSV的保守基因序列設(shè)計引物和TaqMan探針，TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，其5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。在PCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)DNA聚合酶延伸至探針結(jié)合部位時，會利用其5'-3'外切酶活性將探針切斷，使得熒光報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而釋放出熒光信號。隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的不斷增加，熒光信號也逐漸增強(qiáng)，通過檢測熒光信號的變化，即可實時監(jiān)測PCR擴(kuò)增進(jìn)程。通過比較加入抗體前后病毒核酸的擴(kuò)增情況，能夠準(zhǔn)確判斷抗體對病毒的中和效果。若加入抗體后，病毒核酸的擴(kuò)增受到顯著抑制，Ct值明顯增大，這表明抗體能夠有效地中和病毒，阻止病毒的復(fù)制和傳播。反之，若Ct值變化不明顯，則說明抗體的中和活性較弱或無中和活性。在實際篩選過程中，通常會設(shè)置多個抗體稀釋度和多個重復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時，還會設(shè)置陽性對照（已知具有中和活性的抗體）和陰性對照（未加抗體的病毒液），用于對比和驗證實驗結(jié)果。通過對不同抗體樣本的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計分析，能夠篩選出具有較高中和活性的抗體，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供有力的支持。4.3.2其他病毒定量檢測技術(shù)除了實時熒光定量PCR技術(shù)，數(shù)字PCR（DigitalPCR，dPCR）等新興病毒定量檢測技術(shù)也在中和抗體篩選領(lǐng)域逐漸嶄露頭角，展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢和應(yīng)用潛力。數(shù)字PCR技術(shù)作為一種全新的核酸定量分析方法，與傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR技術(shù)有著顯著的區(qū)別。它的核心原理是將一個PCR反應(yīng)體系精確地分割成數(shù)萬個甚至數(shù)百萬個微小的反應(yīng)單元，每個單元中僅包含一個或少數(shù)幾個核酸分子。在這些微小的反應(yīng)單元中，分別進(jìn)行獨立的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，通過檢測每個反應(yīng)單元中是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物，來確定樣本中核酸分子的數(shù)量。例如，在對蝦白斑癥病毒（WSSV）中和抗體篩選中，將含有病毒核酸的樣本進(jìn)行稀釋后，均勻分配到數(shù)字PCR芯片的各個微反應(yīng)孔中。每個微反應(yīng)孔中的病毒核酸在適宜的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，利用熒光檢測系統(tǒng)對每個微反應(yīng)孔進(jìn)行檢測，有擴(kuò)增產(chǎn)物的微反應(yīng)孔會發(fā)出熒光信號，而沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的則無熒光信號。通過統(tǒng)計有熒光信號的微反應(yīng)孔數(shù)量，結(jié)合泊松分布原理，即可準(zhǔn)確計算出樣本中病毒核酸的絕對拷貝數(shù)。與實時熒光定量PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有諸多顯著的優(yōu)勢。首先，數(shù)字PCR技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對核酸分子的絕對定量，無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，這大大提高了定量的準(zhǔn)確性和可靠性。在中和抗體篩選中，能夠更精確地測定病毒核酸的含量，從而更準(zhǔn)確地評估抗體對病毒的中和效果。其次，數(shù)字PCR技術(shù)對低豐度核酸的檢測靈敏度極高，即使樣本中病毒核酸含量極低，也能準(zhǔn)確檢測和定量。這使得在篩選中和抗體時，能夠檢測到微弱的中和效應(yīng)，提高了篩選的靈敏度和效率。此外，數(shù)字PCR技術(shù)具有較強(qiáng)的抗干擾能力，能夠有效減少樣本中雜質(zhì)和抑制劑對檢測結(jié)果的影響。在實際應(yīng)用中，對蝦養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，樣本中可能存在各種干擾物質(zhì)，數(shù)字PCR技術(shù)的這一優(yōu)勢能夠確保在復(fù)雜樣本中準(zhǔn)確檢測病毒核酸，為中和抗體篩選提供可靠的數(shù)據(jù)支持。在中和抗體篩選中，數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用流程與實時熒光定量PCR技術(shù)類似。先將待測抗體與病毒液混合孵育，然后提取病毒核酸，進(jìn)行數(shù)字PCR檢測。通過比較加入抗體前后病毒核酸的絕對拷貝數(shù)變化，判斷抗體的中和活性。若加入抗體后，病毒核酸的絕對拷貝數(shù)顯著降低，說明抗體能夠有效地中和病毒，具有較高的中和活性。數(shù)字PCR技術(shù)在中和抗體篩選中的應(yīng)用，不僅能夠提高篩選的準(zhǔn)確性和靈敏度，還為深入研究中和抗體的作用機(jī)制提供了有力的技術(shù)手段。通過精確測定病毒核酸的含量變化，能夠更深入地了解中和抗體對病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程的影響，為開發(fā)高效的抗病毒生物制劑奠定堅實的基礎(chǔ)。4.4動物實驗驗證中和抗體效果4.4.1實驗動物選擇與分組在驗證中和抗體效果的動物實驗中，實驗動物的選擇和分組是實驗成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究選用健康的南美白對蝦（Litopenaeusvannamei）作為實驗動物。南美白對蝦是全球養(yǎng)殖最為廣泛的對蝦品種之一，具有生長速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)、養(yǎng)殖產(chǎn)量高等特點。同時，它也是對蝦白斑癥病毒（WSSV）的高度易感宿主，感染W(wǎng)SSV后會出現(xiàn)典型的癥狀并導(dǎo)致高死亡率，這使得南美白對蝦成為研究WSSV感染機(jī)制和防控措施的理想實驗動物。在實驗開始前，從正規(guī)的對蝦種苗場采購體長為5-6cm的南美白對蝦幼蝦。將采購的對蝦暫養(yǎng)于實驗室的養(yǎng)殖系統(tǒng)中，養(yǎng)殖系統(tǒng)配備有完善的水質(zhì)調(diào)控設(shè)備，包括增氧機(jī)、過濾裝置和水溫控制系統(tǒng)等，以確保養(yǎng)殖水體的溶解氧含量保持在5mg/L以上，水溫穩(wěn)定在28-30℃，pH值維持在7.8-8.6之間，氨氮和亞硝酸鹽含量均低于0.1mg/L。暫養(yǎng)期間，投喂優(yōu)質(zhì)的對蝦配合飼料，每天投喂3-4次，投喂量根據(jù)對蝦的攝食情況進(jìn)行調(diào)整，以保證對蝦的健康生長。暫養(yǎng)一周后，隨機(jī)抽取部分對蝦進(jìn)行WSSV檢測，確保實驗用蝦均未感染W(wǎng)SSV。將健康的南美白對蝦隨機(jī)分為三組，每組設(shè)置3個平行，每個平行包含30尾對蝦。第一組為實驗組，每尾對蝦腹腔注射篩選得到的中和抗體溶液，注射劑量為10μg/g體重。第二組為陽性對照組，每尾對蝦腹腔注射等量的PBS緩沖液，作為感染病毒但未接受中和抗體治療的對照。第三組為陰性對照組，每尾對蝦腹腔注射等量的PBS緩沖液，且不進(jìn)行病毒感染，用于觀察正常養(yǎng)殖條件下對蝦的生長和健康狀況。分組完成后，將三組對蝦分別養(yǎng)殖于獨立的養(yǎng)殖水箱中，養(yǎng)殖條件保持一致，以排除環(huán)境因素對實驗結(jié)果的影響。4.4.2實驗過程與結(jié)果分析在完成實驗動物的分組后，正式開展動物實驗以驗證中和抗體的效果。實驗過程嚴(yán)格按照既定方案進(jìn)行，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實驗開始時，對實驗組和陽性對照組的對蝦進(jìn)行對蝦白斑癥病毒（WSSV）感染。將保存的WSSV病毒液進(jìn)行梯度稀釋，通過預(yù)實驗確定合適的感染劑量，使病毒感染后能夠在陽性對照組對蝦中引發(fā)典型的白斑癥癥狀和高死亡率。本研究中，選用的感染劑量為1×10?TCID??/mL，每尾對蝦腹腔注射100μL病毒液。陰性對照組對蝦則注射等量的PBS緩沖液。感染病毒后，每天定時觀察并記錄各組對蝦的行為、外觀癥狀和死亡情況。在行為方面，密切關(guān)注對蝦的游動活力、攝食情況等；外觀癥狀主要觀察對蝦體表是否出現(xiàn)白色斑點、甲殼是否變軟、肝胰腺是否萎縮等典型的白斑癥癥狀。對死亡的對蝦及時進(jìn)行統(tǒng)計和處理，避免對養(yǎng)殖水體造成污染。在感染病毒后的第1天，實驗組和陽性對照組的對蝦均未出現(xiàn)明顯的癥狀，攝食和游動正常。隨著時間的推移，陽性對照組的對蝦逐漸出現(xiàn)異常。從第2天開始，部分對蝦攝食量減少，游動緩慢，在養(yǎng)殖水箱底部聚集。第3天，部分對蝦體表開始出現(xiàn)白色斑點，肝胰腺顏色變淡，腸胃空虛。到第5天，陽性對照組對蝦的死亡率急劇上升，死亡對蝦數(shù)量明顯增加，且出現(xiàn)的白斑癥癥狀愈發(fā)嚴(yán)重。而實驗組的對蝦在注射中和抗體后，感染癥狀明顯減輕。在感染后的前3天，實驗組對蝦的行為和外觀與陰性對照組相似，攝食和游動正常，未出現(xiàn)明顯的感染癥狀。從第4天開始，雖然部分對蝦出現(xiàn)了輕微的攝食減少和活力下降，但體表白色斑點的出現(xiàn)時間明顯延遲，且斑點數(shù)量較少，癥狀程度較輕。在整個實驗過程中，實驗組對蝦的死亡率顯著低于陽性對照組。通過統(tǒng)計分析，在感染病毒后的第7天，陽性對照組的累計死亡率達(dá)到80%以上，而實驗組的累計死亡率僅為30%左右。對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用卡方檢驗比較實驗組和陽性對照組的死亡率差異。結(jié)果顯示，兩組之間的死亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這表明中和抗體能夠顯著降低對蝦感染W(wǎng)SSV后的死亡率，對感染病毒的對蝦具有明顯的保護(hù)作用。進(jìn)一步對存活的對蝦進(jìn)行病毒載量檢測，采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定對蝦組織中的WSSVDNA拷貝數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組存活對蝦的病毒載量顯著低于陽性對照組，這進(jìn)一步證實了中和抗體能夠有效抑制WSSV在對蝦體內(nèi)的復(fù)制和增殖，從而減輕病毒感染對蝦造成的損害，提高對蝦的存活率。五、單克隆抗體與中和抗體的應(yīng)用潛力5.1在病毒檢測中的應(yīng)用單克隆抗體憑借其高度的特異性和敏感性，在對蝦白斑癥病毒（WSSV）檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，為開發(fā)高效、準(zhǔn)確的病毒檢測方法提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐?；趩慰寺】贵w的免疫熒光技術(shù)（IFA）是一種常用的病毒檢測方法。其原理是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體與WSSV囊膜蛋白特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下，被感染的細(xì)胞會發(fā)出特定顏色的熒光，從而直觀地顯示病毒的存在和分布情況。在實驗操作中，首先將感染W(wǎng)SSV的對蝦組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞固定在載玻片上，然后滴加熒光素標(biāo)記的單克隆抗體，在適宜的溫度和濕度條件下孵育一段時間，使抗體與病毒抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用緩沖液充分洗滌載玻片，去除未結(jié)合的抗體，最后在熒光顯微鏡下觀察。如果細(xì)胞或組織中存在WSSV，就會出現(xiàn)明亮的熒光信號。免疫熒光技術(shù)具有快速、直觀的優(yōu)點，能夠在短時間內(nèi)對大量樣本進(jìn)行初步檢測。它可以直接觀察病毒在細(xì)胞內(nèi)的定位和感染情況，對于研究病毒的感染機(jī)制和傳播途徑具有重要意義。然而，該方法也存在一定的局限性，需要專業(yè)的熒光顯微鏡設(shè)備和熟練的操作人員，且結(jié)果的判斷在一定程度上依賴于主觀經(jīng)驗，容易受到背景熒光等因素的干擾。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）也是一種基于單克隆抗體的常用病毒檢測方法。其基本原理是將單克隆抗體或抗原固定在固相載體表面，通過抗原抗體特異性結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的二抗，利用酶對底物的催化作用，使底物發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺來判斷樣本中病毒的含量。在檢測WSSV時，通常采用雙抗體夾心法。首先將針對WSSV囊膜蛋白的單克隆抗體包被在酶標(biāo)板的孔中，形成固相抗體。然后加入待檢測的樣本，樣本中的WSSV抗原會與固相抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的雜質(zhì)后，加入酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗會與結(jié)合在固相抗體上的病毒抗原結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。最后加入底物，酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀測定吸光值，根據(jù)吸光值的大小來定量分析樣本中WSSV的含量。ELISA方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便、可同時檢測大量樣本等優(yōu)點。它能夠檢測出低濃度的病毒抗原，適用于對蝦養(yǎng)殖現(xiàn)場的大規(guī)模檢測和疾病監(jiān)測。而且該方法可以實現(xiàn)自動化檢測，提高檢測效率和準(zhǔn)確性。然而，ELISA方法也存在一些不足之處，如檢測時間相對較長，一般需要數(shù)小時才能完成檢測；對實驗條件和試劑的要求較高，容易受到外界因素的影響。與傳統(tǒng)的病毒檢測方法相比，基于單克隆抗體的檢測方法具有顯著的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的檢測方法如電鏡觀察、組織病理學(xué)檢查等，雖然能夠直觀地觀察病毒的形態(tài)和病變情況，但操作復(fù)雜、耗時較長，且對設(shè)備和技術(shù)人員的要求較高。而分子生物學(xué)方法如PCR技術(shù)，雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)，但需要專業(yè)的儀器設(shè)備和熟練的分子生物學(xué)操作技能，且容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果?；趩慰寺】贵w的檢測方法則結(jié)合了免疫學(xué)和生物學(xué)的優(yōu)勢，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出WSSV，且操作相對簡便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。它可以在對蝦養(yǎng)殖現(xiàn)場進(jìn)行快速檢測，及時發(fā)現(xiàn)病毒感染，為病害防控提供寶貴的時間。此外，單克隆抗體還可以與其他技術(shù)如納米技術(shù)、微流控技術(shù)等相結(jié)合，開發(fā)出更加靈敏、便攜的檢測設(shè)備，進(jìn)一步提高病毒檢測的效率和準(zhǔn)確性。5.2在疾病防治中的應(yīng)用前景中和抗體作為一種極具潛力的生物制劑，在對蝦白斑癥的治療和預(yù)防領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，為解決對蝦養(yǎng)殖中這一嚴(yán)峻的病害問題提供了新的有效途徑。從治療角度來看，中和抗體具有獨特的抗病毒機(jī)制，能夠特異性地與對蝦白斑癥病毒（WSSV）結(jié)合，精準(zhǔn)阻斷病毒對宿主細(xì)胞的吸附和侵入過程，從而有效抑制病毒在對蝦體內(nèi)的增殖和擴(kuò)散。在實際養(yǎng)殖環(huán)境中，一旦對蝦感染W(wǎng)SSV，及時注射中和抗體能夠迅速發(fā)揮作用，降低病毒載量，減輕病毒對機(jī)體的損害，提高對蝦的存活率。與傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療相比，中和抗體具有高度的特異性，僅針對WSSV發(fā)揮作用，不會對養(yǎng)殖環(huán)境和對蝦體內(nèi)的有益微生物群落造成破壞，避免了化學(xué)藥物帶來的環(huán)境污染和藥物殘留等問題。而且中和抗體作為生物制劑，具有良好的生物相容性，對蝦的耐受性較好，不易產(chǎn)生不良反應(yīng)，為對蝦白斑癥的治療提供了一種安全、有效的選擇。例如，在動物實驗中，給感染W(wǎng)SSV的對蝦注射中和抗體后，對蝦的死亡率顯著降低，存活對蝦的生長狀況和健康指標(biāo)也明顯優(yōu)于未接受治療的對蝦。這充分證明了中和抗體在對蝦白斑癥治療中的有效性和可行性。在預(yù)防方面，中和抗體同樣具有重要的應(yīng)用價值。可以將中和抗體添加到對蝦的飼料或養(yǎng)殖水體中，讓對蝦在日常攝食或生活過程中攝取抗體，從而在體內(nèi)建立起一道免疫防線。當(dāng)中和抗體存在于對蝦體內(nèi)時，即使遇到WSSV的侵襲，抗體也能夠迅速與病毒結(jié)合，阻止病毒感染細(xì)胞，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。這種預(yù)防性應(yīng)用方式具有操作簡便、成本較低的優(yōu)點，適合在大規(guī)模對蝦養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用。此外，中和抗體還可以與疫苗聯(lián)合使用，增強(qiáng)疫苗的免疫效果。疫苗能夠刺激對蝦自身的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而中和抗體則可以在疫苗免疫的初期階段，即對蝦自身免疫力尚未完全建立起來時，發(fā)揮抗病毒作用，為對蝦提供即時的保護(hù)。同時，中和抗體還可以調(diào)節(jié)對蝦的免疫反應(yīng)，促進(jìn)疫苗誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化和增殖，提高疫苗的免疫效率，延長免疫保護(hù)期。例如，在一些研究中，將中和抗體與WSSV疫苗同時使用，對蝦的抗體水平和免疫保護(hù)率都得到了顯著提高，有效降低了對蝦感染W(wǎng)SSV的風(fēng)險。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究圍繞對蝦白斑癥病毒（WSSV）囊膜蛋白單克隆抗體的研制及中和抗體篩選展開，取得了一系列具有重要意義的成果。在囊膜蛋白單克隆抗體研制方面，通過基因工程表達(dá)技術(shù)成功制備并純化了高純度的WSSV囊膜蛋白抗原。利用該抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)獲得了雜交瘤細(xì)胞。通過間接ELISA和免疫熒光技術(shù)等方法，從眾多雜交瘤細(xì)胞中篩選出了多株能夠穩(wěn)定分泌針對WSSV囊膜蛋白特異性單克