小分子化合物賦能兩性霉素B：白假絲酵母菌生物膜清除的潛在機制探秘一、引言1.1研究背景白假絲酵母菌（Candidaalbicans）作為一種常見的條件致病性真菌，廣泛存在于自然界以及人體的皮膚、口腔、腸道、陰道等黏膜部位。在正常生理狀態(tài)下，人體的免疫系統(tǒng)能夠有效控制其生長繁殖，使其與人體處于共生平衡狀態(tài)，不會引發(fā)疾病。然而，當機體免疫力下降，如患有惡性腫瘤、艾滋病、糖尿病等慢性疾病，或長期使用廣譜抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素，以及進行器官移植、靜脈插管、機械通氣等侵入性操作時，白假絲酵母菌就可能突破機體的防御屏障，大量增殖并侵襲周圍組織，從而引發(fā)感染。近年來，隨著醫(yī)療技術的不斷進步，各種侵入性診療手段的廣泛應用，以及免疫受損人群的日益增多，白假絲酵母菌感染的發(fā)病率呈顯著上升趨勢，已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一。據(jù)統(tǒng)計，在醫(yī)院獲得性真菌感染中，白假絲酵母菌感染約占70%-80%，嚴重威脅著患者的健康和生命安全。白假絲酵母菌感染不僅可以引起皮膚、黏膜的淺表感染，如口腔念珠菌病、外陰陰道念珠菌病等，還可引發(fā)深部組織和器官的感染，如血流感染、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、肺炎等，病死率較高。尤其是在重癥監(jiān)護病房（ICU）、血液科、腫瘤科等科室，白假絲酵母菌感染的發(fā)生率和死亡率更為突出。生物膜是微生物在生長過程中為適應生存環(huán)境而形成的一種特殊存在形式，是由微生物細胞及其分泌的細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）組成的高度結構化的群體。白假絲酵母菌在適宜的條件下，能夠在生物或非生物表面形成生物膜。生物膜的形成是一個復雜的動態(tài)過程，主要包括初始黏附、不可逆黏附、細胞增殖、生物膜成熟和分散等階段。在初始黏附階段，白假絲酵母菌通過表面的黏附素與物體表面的受體結合，實現(xiàn)短暫的物理吸附；隨著時間的推移，菌體分泌的ECM逐漸增多，使菌體與表面的黏附變得更加牢固，進入不可逆黏附階段；隨后，菌體在表面不斷增殖，形成微菌落，并逐漸融合成三維立體結構的生物膜；在成熟階段，生物膜內(nèi)部形成復雜的通道和孔隙網(wǎng)絡，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和代謝產(chǎn)物的排出；當生物膜內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化時，部分菌體可從生物膜上脫離，分散到周圍環(huán)境中，尋找新的定植位點，從而導致感染的擴散和復發(fā)。白假絲酵母菌生物膜具有高度的耐藥性，這是臨床治療白假絲酵母菌感染面臨的最大挑戰(zhàn)之一。研究表明，生物膜狀態(tài)下的白假絲酵母菌對常用抗真菌藥物的耐藥性可比浮游態(tài)細胞高10-1000倍。其耐藥機制主要包括以下幾個方面：一是生物膜的物理屏障作用，ECM能夠阻礙抗真菌藥物的滲透，使藥物難以到達生物膜內(nèi)部的菌體細胞；二是生物膜內(nèi)的菌體細胞代謝活性降低，處于相對靜止的狀態(tài)，對抗真菌藥物的敏感性下降，因為大多數(shù)抗真菌藥物是針對代謝活躍的細胞發(fā)揮作用；三是生物膜內(nèi)的菌體細胞能夠表達多種耐藥相關蛋白，如ATP結合盒（ABC）轉運蛋白超家族和主要易化子超家族（MFS）等，這些蛋白能夠將進入細胞內(nèi)的藥物主動外排，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥性；四是生物膜內(nèi)的菌體細胞之間存在復雜的信號傳導和群體感應系統(tǒng)，能夠調(diào)節(jié)菌體的生理功能和耐藥基因的表達，進一步增強生物膜的耐藥性。由于白假絲酵母菌生物膜的耐藥性，臨床上常規(guī)使用的抗真菌藥物往往難以徹底清除生物膜，導致感染反復發(fā)作，遷延不愈，不僅增加了患者的痛苦和醫(yī)療費用，還可能引發(fā)嚴重的并發(fā)癥，甚至危及生命。因此，尋找有效的方法來清除白假絲酵母菌生物膜，提高抗真菌治療的效果，已成為亟待解決的重要問題。1.2兩性霉素B的應用及困境兩性霉素B（AmphotericinB，AmB）是一種多烯類抗真菌抗生素，自1956年被發(fā)現(xiàn)以來，在臨床上廣泛應用于深部真菌感染的治療，被視為治療嚴重真菌感染的“黃金標準”藥物。其抗真菌作用機制獨特，主要是通過與真菌細胞膜上的麥角固醇結合，形成跨膜通道，破壞細胞膜的完整性，導致細胞內(nèi)重要離子（如鉀離子）和小分子物質(zhì)外流，從而干擾真菌細胞的正常代謝和生理功能，最終達到殺菌或抑菌的效果。兩性霉素B具有諸多優(yōu)勢，使其在抗真菌治療中占據(jù)重要地位。它的抗菌譜非常廣，對念珠菌屬、隱球菌屬、曲霉屬、毛霉屬等多種致病性真菌均具有強大的抗菌活性，能夠有效應對多種深部真菌感染。此外，兩性霉素B的殺菌速度較快，尤其是對于急性、嚴重的真菌感染，能夠迅速抑制真菌的生長繁殖，為患者爭取寶貴的治療時間，及時控制病情發(fā)展。而且，由于其作用機制的特殊性，真菌對兩性霉素B產(chǎn)生耐藥性的情況相對較少，這使得它在臨床治療中具有較高的可靠性。在治療新型隱球菌性腦膜炎時，兩性霉素B常作為一線治療藥物，與氟胞嘧啶聯(lián)合使用，顯著提高了患者的生存率和治愈率。然而，在面對白假絲酵母菌生物膜時，單獨使用兩性霉素B卻面臨著諸多困境。白假絲酵母菌生物膜的結構極為復雜，其細胞外基質(zhì)主要由多糖、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子組成，這些成分相互交織，形成了一個致密的網(wǎng)絡結構。這種結構就像一道堅固的屏障，極大地阻礙了兩性霉素B的滲透，使得藥物難以有效到達生物膜內(nèi)部的菌體細胞。研究表明，生物膜內(nèi)的藥物濃度往往遠低于能夠發(fā)揮殺菌作用的有效濃度，這是導致兩性霉素B治療效果不佳的重要原因之一。白假絲酵母菌生物膜內(nèi)的菌體細胞生理狀態(tài)與浮游態(tài)細胞存在顯著差異。生物膜內(nèi)的細胞代謝活性降低，生長速度緩慢，處于一種相對靜止的狀態(tài)。而兩性霉素B主要作用于代謝活躍的細胞，對于這些代謝緩慢的生物膜內(nèi)菌體細胞，其作用效果大打折扣。有研究發(fā)現(xiàn)，在生物膜形成的不同階段，菌體細胞對抗真菌藥物的敏感性也有所不同，隨著生物膜的成熟，兩性霉素B的殺菌效果逐漸減弱。白假絲酵母菌生物膜內(nèi)的菌體細胞還能夠通過多種耐藥機制來抵御兩性霉素B的作用。如前文所述，生物膜內(nèi)的菌體細胞可表達多種耐藥相關蛋白，其中ABC轉運蛋白超家族和MFS等能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量或質(zhì)子電化學梯度，將進入細胞內(nèi)的兩性霉素B主動外排到細胞外，從而降低細胞內(nèi)藥物濃度，使菌體產(chǎn)生耐藥性。生物膜內(nèi)的菌體細胞之間還存在復雜的信號傳導和群體感應系統(tǒng)，這些系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)菌體的生理功能和耐藥基因的表達，進一步增強生物膜的耐藥性。當生物膜內(nèi)的菌體細胞感受到外界藥物刺激時，通過群體感應系統(tǒng)激活一系列信號通路，上調(diào)耐藥基因的表達，從而降低對兩性霉素B的敏感性。由于上述種種原因，臨床上單獨使用兩性霉素B治療白假絲酵母菌生物膜感染時，往往難以徹底清除生物膜，導致感染反復發(fā)作，難以治愈。這不僅給患者帶來了極大的痛苦和經(jīng)濟負擔，也對臨床治療提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。因此，尋找一種有效的輔助方法來增強兩性霉素B對白假絲酵母菌生物膜的清除能力，成為當前抗真菌治療領域的研究熱點。1.3小分子化合物的研究價值小分子化合物通常是指分子量小于1000道爾頓的有機化合物，它們在生命科學研究和藥物開發(fā)領域展現(xiàn)出了巨大的潛力。在協(xié)助兩性霉素B清除白假絲酵母菌生物膜的研究中，小分子化合物具有獨特的研究價值。小分子化合物結構相對簡單，這使得它們在化學合成上具有明顯優(yōu)勢。研究人員可以通過各種有機合成方法，較為便捷地大量制備所需的小分子化合物，滿足實驗和臨床研究的需求。相比之下，一些生物大分子藥物，如蛋白質(zhì)、抗體等，其制備過程往往涉及復雜的生物技術和昂貴的原材料，成本高昂且產(chǎn)量有限。小分子化合物的合成過程相對易于控制，能夠精確調(diào)整其化學結構，通過引入不同的官能團或改變分子骨架，研究人員可以有針對性地優(yōu)化小分子化合物的各種性質(zhì)，如生物活性、穩(wěn)定性、溶解性、靶向性等，以實現(xiàn)更好的協(xié)助兩性霉素B清除白假絲酵母菌生物膜的效果。小分子化合物具有良好的生物膜穿透能力。白假絲酵母菌生物膜的細胞外基質(zhì)是阻礙藥物滲透的主要屏障，而小分子化合物因其較小的分子尺寸和適宜的物理化學性質(zhì)，能夠更容易地擴散穿過生物膜的致密結構，到達生物膜內(nèi)部的菌體細胞。研究表明，某些小分子化合物可以通過被動擴散或借助生物膜內(nèi)的轉運蛋白，快速有效地進入生物膜內(nèi)部，與兩性霉素B協(xié)同作用，提高對菌體細胞的殺傷效果。這一特性為解決兩性霉素B難以穿透生物膜的問題提供了新的思路和方法。小分子化合物還具有多樣的生物活性。許多小分子化合物能夠特異性地作用于白假絲酵母菌生物膜內(nèi)菌體細胞的關鍵靶點，干擾菌體的生理代謝過程，從而增強兩性霉素B的抗真菌活性。它們可以通過抑制菌體細胞的細胞壁合成、細胞膜功能、核酸合成、蛋白質(zhì)合成等重要代謝途徑，使菌體細胞對兩性霉素B更加敏感。某些小分子化合物能夠抑制白假絲酵母菌生物膜內(nèi)的耐藥相關蛋白，如ABC轉運蛋白超家族和MFS等，減少藥物外排，提高細胞內(nèi)兩性霉素B的濃度，從而增強其殺菌效果。一些小分子化合物還可以調(diào)節(jié)生物膜內(nèi)菌體細胞之間的信號傳導和群體感應系統(tǒng)，破壞生物膜的結構和穩(wěn)定性，使其更容易被兩性霉素B清除。從臨床應用的角度來看，小分子化合物協(xié)助兩性霉素B清除白假絲酵母菌生物膜具有廣闊的前景。這種聯(lián)合治療策略有望提高抗真菌治療的效果，縮短治療周期，減少藥物劑量和不良反應的發(fā)生。對于那些長期使用抗真菌藥物導致耐藥的患者，小分子化合物與兩性霉素B的聯(lián)合應用可能成為一種有效的挽救治療方案。隨著研究的不斷深入和技術的不斷進步，開發(fā)出具有高效、低毒、特異性強的小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合用藥方案，將為臨床治療白假絲酵母菌生物膜感染提供新的有力武器，有助于改善患者的預后，降低醫(yī)療成本，具有重要的社會和經(jīng)濟價值。1.4研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究小分子化合物協(xié)助兩性霉素B清除白假絲酵母菌生物膜的潛在機制，具體目的包括：通過系統(tǒng)篩選，確定具有顯著協(xié)同作用的小分子化合物，明確其結構與活性關系；從細胞和分子層面，解析小分子化合物增強兩性霉素B對白假絲酵母菌生物膜清除效果的作用途徑，如對生物膜結構、菌體細胞生理功能、耐藥相關蛋白表達以及信號傳導通路的影響；利用先進的組學技術，全面分析小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合作用下，白假絲酵母菌生物膜內(nèi)基因表達譜、蛋白質(zhì)組和代謝組的變化，揭示其協(xié)同作用的分子基礎。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在研究視角和方法上。在研究視角方面，以往針對白假絲酵母菌生物膜耐藥性的研究多集中于單一藥物或常規(guī)治療手段的改進，而本研究創(chuàng)新性地從小分子化合物的角度出發(fā)，探索其與兩性霉素B的協(xié)同作用，為解決生物膜耐藥問題提供了全新的思路和方向。在研究方法上，綜合運用多組學技術（蛋白質(zhì)組學、基因組學和代謝組學），全面系統(tǒng)地分析小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合作用的機制，這種多維度、深層次的研究方法能夠更全面地揭示生物膜耐藥的本質(zhì)，有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點和治療策略，相較于傳統(tǒng)的單一研究方法具有明顯的優(yōu)勢。二、白假絲酵母菌生物膜與兩性霉素B2.1白假絲酵母菌生物膜的特性2.1.1結構組成白假絲酵母菌生物膜是一種高度有序且復雜的結構，主要由白假絲酵母菌細胞和它們分泌的胞外基質(zhì)組成。白假絲酵母菌細胞在生物膜中呈現(xiàn)出多種形態(tài)，包括酵母態(tài)、菌絲態(tài)以及假菌絲態(tài)。其中，酵母態(tài)細胞呈圓形或橢圓形，直徑約為2-6μm，它們是生物膜形成初期的主要存在形式。隨著生物膜的發(fā)展，菌絲態(tài)細胞逐漸增多，菌絲呈細長管狀，寬度約為1-2μm，長度可從數(shù)微米到數(shù)十微米不等。菌絲態(tài)細胞能夠深入到胞外基質(zhì)中，增強生物膜與表面的黏附力，并在生物膜內(nèi)部構建起復雜的三維結構。假菌絲則是由酵母細胞出芽后不分離，形成的鏈狀結構，兼具酵母態(tài)和菌絲態(tài)細胞的部分特性。胞外基質(zhì)是白假絲酵母菌生物膜的重要組成部分，約占生物膜干重的50%-90%，主要由多糖、蛋白質(zhì)、核酸以及脂質(zhì)等生物大分子組成。多糖是胞外基質(zhì)的主要成分之一，包括β-1,3-葡聚糖、甘露聚糖等。β-1,3-葡聚糖具有高度的分支結構，能夠形成堅韌的網(wǎng)絡，為生物膜提供機械強度和穩(wěn)定性。甘露聚糖則參與了菌體細胞與表面的黏附過程，以及生物膜內(nèi)細胞間的信號傳導。蛋白質(zhì)在胞外基質(zhì)中也起著關鍵作用，包括各種酶類、黏附蛋白和結構蛋白等。酶類如蛋白酶、脂肪酶等，能夠分解周圍環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，為生物膜內(nèi)的菌體細胞提供能量和代謝底物。黏附蛋白可以增強菌體細胞與表面以及細胞之間的黏附力，維持生物膜的結構完整性。結構蛋白則有助于構建胞外基質(zhì)的框架結構。核酸在胞外基質(zhì)中主要以DNA和RNA的形式存在，它們參與了生物膜內(nèi)的基因調(diào)控和信號傳遞過程。脂質(zhì)成分雖然相對較少，但也對生物膜的穩(wěn)定性和功能具有一定影響，例如某些脂質(zhì)可以調(diào)節(jié)膜的流動性和通透性。在空間結構上，白假絲酵母菌生物膜呈現(xiàn)出典型的三維立體結構。生物膜的最外層通常是由松散的胞外基質(zhì)和少量酵母態(tài)細胞組成，這一層可以起到保護生物膜內(nèi)部結構的作用，同時也有助于生物膜與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換。中間層是生物膜的主體部分，包含大量的菌絲態(tài)和酵母態(tài)細胞，以及密集的胞外基質(zhì)。細胞之間通過胞外基質(zhì)相互連接，形成了復雜的網(wǎng)絡結構，其中還存在著許多微小的通道和孔隙，這些通道和孔隙構成了生物膜內(nèi)部的物質(zhì)運輸系統(tǒng)，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸送和代謝產(chǎn)物的排出。生物膜的最內(nèi)層緊貼著物體表面，主要由緊密黏附的菌體細胞和部分胞外基質(zhì)組成，這一層確保了生物膜與表面的牢固結合。2.1.2形成過程白假絲酵母菌生物膜的形成是一個動態(tài)且有序的過程，一般可分為初始黏附、不可逆黏附、細胞增殖、生物膜成熟和分散等階段，每個階段都伴隨著菌體細胞和胞外基質(zhì)的一系列變化，同時受到多種調(diào)控因素的影響。在初始黏附階段，白假絲酵母菌細胞通過表面的黏附素與物體表面的受體發(fā)生特異性結合。白假絲酵母菌表面存在多種黏附素，如凝集素樣序列（ALS）蛋白家族、菌絲細胞壁蛋白1（HWP1）等。ALS蛋白家族能夠識別并結合宿主細胞表面的糖類、蛋白質(zhì)等分子，介導菌體細胞與表面的初始接觸。HWP1則在菌絲形成時表達上調(diào)，它可以與宿主細胞表面的整合素等受體相互作用，增強菌體細胞的黏附能力。初始黏附過程較為迅速，通常在數(shù)分鐘到數(shù)小時內(nèi)即可發(fā)生，但這種黏附是相對較弱的，菌體細胞仍有可能從表面脫離。初始黏附的效率受到多種因素的影響，包括菌體細胞的濃度、表面的性質(zhì)（如粗糙度、電荷、化學成分等）以及環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)和流體力學條件等。在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中，菌體細胞的代謝活性較高，可能會促進黏附素的表達和分泌，從而增強初始黏附能力。而在流體流速較快的環(huán)境中，菌體細胞與表面的接觸時間縮短，可能會降低初始黏附的效率。隨著時間的推移，白假絲酵母菌進入不可逆黏附階段。在這個階段，菌體細胞開始分泌胞外基質(zhì)，同時細胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，酵母態(tài)細胞開始向菌絲態(tài)細胞轉變。胞外基質(zhì)中的多糖、蛋白質(zhì)等成分逐漸在菌體細胞周圍聚集，形成一層保護膜，使得菌體細胞與表面的黏附變得更加牢固。菌絲態(tài)細胞的形成進一步增強了菌體細胞與表面的黏附力，因為菌絲可以深入到表面的微小孔隙中，增加接觸面積。不可逆黏附過程受到多種信號通路的調(diào)控，其中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（PKA）信號通路在菌絲形成和不可逆黏附中起著關鍵作用。當菌體細胞感受到外界環(huán)境中的刺激，如溫度升高、營養(yǎng)物質(zhì)變化等，會激活cAMP-PKA信號通路，進而上調(diào)相關基因的表達，促進菌絲形成和胞外基質(zhì)的分泌。細胞增殖是生物膜形成的重要階段，在不可逆黏附之后，菌體細胞在表面迅速增殖。白假絲酵母菌以出芽生殖的方式進行繁殖，酵母態(tài)細胞不斷產(chǎn)生芽體，芽體逐漸長大并脫離母細胞，形成新的個體。隨著細胞數(shù)量的增加，菌體細胞開始聚集形成微菌落。微菌落中的細胞之間通過胞外基質(zhì)相互連接，形成了初步的三維結構。細胞增殖的速度受到營養(yǎng)物質(zhì)的供應、代謝產(chǎn)物的積累以及細胞間信號傳導等因素的影響。充足的營養(yǎng)物質(zhì)是細胞增殖的基礎，當營養(yǎng)物質(zhì)豐富時，菌體細胞的代謝活躍，增殖速度加快。而代謝產(chǎn)物的積累可能會對細胞增殖產(chǎn)生抑制作用，例如酸性代謝產(chǎn)物會降低環(huán)境的pH值，影響菌體細胞的生長。細胞間的信號傳導也在細胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用，群體感應系統(tǒng)通過分泌和感知特定的信號分子，調(diào)節(jié)菌體細胞的生長和分化，確保生物膜的有序發(fā)展。隨著細胞增殖的持續(xù)進行，微菌落不斷融合，生物膜逐漸進入成熟階段。在成熟階段，生物膜形成了復雜而穩(wěn)定的三維結構，具有明顯的分層現(xiàn)象。如前文所述，生物膜分為外層、中間層和內(nèi)層，各層具有不同的細胞組成和功能。生物膜內(nèi)部還形成了豐富的通道和孔隙網(wǎng)絡，這些通道和孔隙不僅有利于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和代謝產(chǎn)物的排出，還為菌體細胞之間的信號傳遞提供了途徑。成熟生物膜的形成受到多種基因的調(diào)控，如EFG1、CZF1等轉錄因子基因，它們可以調(diào)節(jié)生物膜相關基因的表達，影響生物膜的結構和功能。環(huán)境因素如溫度、濕度、氧氣濃度等也對生物膜的成熟過程有重要影響。適宜的溫度和濕度條件有利于菌體細胞的生長和代謝，促進生物膜的成熟。而氧氣濃度的變化可能會影響菌體細胞的呼吸方式和代謝途徑，進而影響生物膜的結構和功能。當生物膜內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，如營養(yǎng)物質(zhì)耗盡、代謝產(chǎn)物積累過多或受到外界物理、化學刺激時，部分菌體細胞會從生物膜上脫離，進入分散階段。分散的菌體細胞可以重新尋找適宜的定植位點，形成新的生物膜，這也是白假絲酵母菌感染擴散和復發(fā)的重要原因。分散過程受到多種因素的調(diào)控，包括菌體細胞表面的水解酶、信號通路以及環(huán)境中的誘導因子等。菌體細胞分泌的水解酶可以分解胞外基質(zhì)，削弱細胞之間的連接，從而使菌體細胞更容易脫離生物膜。某些信號通路如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，在分散過程中被激活，調(diào)節(jié)相關基因的表達，促進菌體細胞的分散。環(huán)境中的誘導因子，如抗菌藥物、炎癥介質(zhì)等，也可以刺激菌體細胞從生物膜上分散，以逃避不利的環(huán)境。2.1.3耐藥機制白假絲酵母菌生物膜具有高度的耐藥性，這是其導致臨床感染難以治療的主要原因之一。生物膜的耐藥機制是多方面的，涉及到生物膜的結構、菌體細胞的生理改變以及耐藥基因的表達等。生物膜的結構為其提供了物理屏障，阻礙了抗真菌藥物的滲透。如前所述，白假絲酵母菌生物膜的胞外基質(zhì)由多糖、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子組成，形成了一個致密的網(wǎng)絡結構?？拐婢幬镌诖┩干锬r，會受到胞外基質(zhì)的吸附、截留和擴散限制。多糖成分中的β-1,3-葡聚糖和甘露聚糖具有高度的親水性和粘性，能夠吸附大量的水分，形成一種凝膠狀物質(zhì)，使得藥物分子難以在其中擴散。蛋白質(zhì)和核酸等成分也可以與藥物分子發(fā)生相互作用，進一步阻礙藥物的滲透。研究表明，兩性霉素B等抗真菌藥物在生物膜中的擴散速度遠低于在水溶液中的擴散速度，導致生物膜內(nèi)部的藥物濃度遠低于能夠發(fā)揮殺菌作用的有效濃度。生物膜內(nèi)的通道和孔隙雖然為營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運輸提供了途徑，但這些通道和孔隙的大小和形狀不規(guī)則，且部分被胞外基質(zhì)填充，使得藥物分子難以通過這些通道到達生物膜內(nèi)部的菌體細胞。生物膜內(nèi)的菌體細胞生理狀態(tài)與浮游態(tài)細胞存在顯著差異，這也是導致耐藥性的重要原因。生物膜內(nèi)的菌體細胞生長速度緩慢，代謝活性降低，處于一種相對靜止的狀態(tài)。大多數(shù)抗真菌藥物是針對代謝活躍的細胞發(fā)揮作用的，對于代謝緩慢的生物膜內(nèi)菌體細胞，其作用效果大打折扣。在生物膜中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的供應和代謝產(chǎn)物的排出受到限制，菌體細胞的能量代謝和物質(zhì)合成過程受到影響。生物膜內(nèi)的菌體細胞可能會減少對某些營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，降低呼吸作用和蛋白質(zhì)合成的速率，從而降低了對依賴于細胞代謝的抗真菌藥物的敏感性。生物膜內(nèi)的菌體細胞還可能會產(chǎn)生一些適應性變化，如改變細胞膜的組成和結構，增加細胞膜的厚度和流動性，以減少藥物分子的進入。白假絲酵母菌生物膜內(nèi)的菌體細胞能夠表達多種耐藥相關蛋白，這些蛋白通過主動外排機制降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。其中，ABC轉運蛋白超家族和MFS是兩類重要的耐藥相關蛋白。ABC轉運蛋白利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將藥物分子從細胞內(nèi)轉運到細胞外。在白假絲酵母菌生物膜中，CDR1、CDR2等ABC轉運蛋白基因的表達上調(diào)，導致相應轉運蛋白的合成增加。這些轉運蛋白能夠識別并結合多種抗真菌藥物，如兩性霉素B、氟康唑等，將其泵出細胞，使細胞內(nèi)藥物濃度維持在較低水平，從而使菌體細胞對藥物產(chǎn)生耐藥性。MFS則利用質(zhì)子電化學梯度作為驅動力，將藥物分子排出細胞。MDR1等MFS相關基因在生物膜內(nèi)也呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，其編碼的轉運蛋白同樣能夠參與藥物的外排過程，增強生物膜的耐藥性。生物膜內(nèi)的菌體細胞之間存在復雜的信號傳導和群體感應系統(tǒng)，這些系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)菌體的生理功能和耐藥基因的表達，進一步增強生物膜的耐藥性。群體感應系統(tǒng)通過分泌和感知特定的信號分子，如法尼醇（farnesol）等，實現(xiàn)細胞間的信息交流。當生物膜內(nèi)的菌體細胞感受到外界藥物刺激時，群體感應系統(tǒng)被激活，信號分子濃度發(fā)生變化，從而觸發(fā)一系列信號傳導通路。這些信號通路可以調(diào)節(jié)菌體細胞的生長、分化、代謝以及耐藥基因的表達。在藥物存在的情況下，群體感應系統(tǒng)可能會激活某些轉錄因子，上調(diào)耐藥相關基因的表達，使菌體細胞對藥物的耐受性增強。信號傳導通路還可以調(diào)節(jié)生物膜的結構和功能，如促進胞外基質(zhì)的合成和分泌，進一步增強生物膜的物理屏障作用。2.2兩性霉素B的作用機制2.2.1作用靶點與抗菌原理兩性霉素B作為多烯類抗真菌藥物的代表，其獨特的作用機制使其在抗真菌治療領域占據(jù)重要地位。兩性霉素B的化學結構包含一個多烯大環(huán)內(nèi)酯部分和一個親水性的氨基糖部分，這種特殊的結構賦予了它與真菌細胞膜上麥角固醇特異性結合的能力。麥角固醇是真菌細胞膜的重要組成成分，在維持細胞膜的結構完整性和功能穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關鍵作用。它與膽固醇在結構上有一定相似性，但又存在細微差異，這使得兩性霉素B能夠特異性地識別并結合麥角固醇，而對哺乳動物細胞膜上的膽固醇親和力較低。兩性霉素B的多烯大環(huán)內(nèi)酯部分具有親脂性，能夠插入到真菌細胞膜的脂質(zhì)雙分子層中，與麥角固醇緊密結合。當兩性霉素B與麥角固醇結合后，多個兩性霉素B-麥角固醇復合物會在細胞膜上聚集，形成一種類似于桶狀的結構，也稱為“孔道”。這種孔道貫穿細胞膜，使得細胞膜的通透性發(fā)生改變，原本被細胞膜緊密包裹的細胞內(nèi)重要離子，如鉀離子（K?），以及小分子物質(zhì)，如核苷酸、氨基酸等，能夠順著濃度梯度從細胞內(nèi)流出到細胞外。細胞內(nèi)鉀離子等重要成分的大量流失，會對真菌細胞的正常代謝和生理功能產(chǎn)生嚴重干擾。鉀離子在細胞內(nèi)參與多種酶的激活和調(diào)節(jié)過程，是維持細胞滲透壓、酸堿平衡以及細胞內(nèi)信號傳導的關鍵離子。當細胞內(nèi)鉀離子濃度降低時，依賴鉀離子激活的酶活性受到抑制，導致細胞內(nèi)的能量代謝、物質(zhì)合成等重要生理過程無法正常進行。例如，參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等能量代謝途徑的一些關鍵酶，其活性會因鉀離子濃度的下降而降低，使得細胞無法有效地產(chǎn)生能量（ATP），從而影響細胞的生長和繁殖。核苷酸和氨基酸是合成核酸（DNA和RNA）和蛋白質(zhì)的基本原料，它們的外流會導致核酸和蛋白質(zhì)的合成受阻，進而影響真菌細胞的遺傳信息傳遞和表達，以及細胞內(nèi)各種結構蛋白和功能蛋白的合成。細胞無法正常合成核酸和蛋白質(zhì)，就無法進行細胞分裂和維持正常的生理功能，最終導致真菌細胞死亡，從而達到兩性霉素B的抗菌目的。2.2.2在清除生物膜中的局限性盡管兩性霉素B在抗真菌治療中具有重要作用，但在面對白假絲酵母菌生物膜時，卻面臨著諸多困境，難以有效發(fā)揮其抗菌優(yōu)勢。白假絲酵母菌生物膜的復雜結構是阻礙兩性霉素B發(fā)揮作用的首要因素。如前文所述，生物膜由白假絲酵母菌細胞和大量的胞外基質(zhì)組成，胞外基質(zhì)主要包含多糖、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，這些成分相互交織，形成了一個高度致密的網(wǎng)絡結構。兩性霉素B在試圖穿透生物膜到達內(nèi)部菌體細胞時，會受到胞外基質(zhì)的重重阻礙。多糖成分中的β-1,3-葡聚糖和甘露聚糖具有高度的親水性和粘性，它們能夠吸附大量水分，形成一種凝膠狀物質(zhì)，使得兩性霉素B分子在其中的擴散速度大大降低。蛋白質(zhì)和核酸等成分也可以與兩性霉素B發(fā)生非特異性的相互作用，如靜電吸附、氫鍵結合等，進一步截留藥物分子，阻礙其滲透。研究表明，兩性霉素B在生物膜中的擴散系數(shù)相較于在水溶液中降低了數(shù)倍甚至數(shù)十倍，導致生物膜內(nèi)部的藥物濃度遠遠低于能夠有效殺滅菌體細胞的最低抑菌濃度。生物膜內(nèi)的通道和孔隙雖然為營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運輸提供了途徑，但這些通道和孔隙的大小和形狀不規(guī)則，且部分被胞外基質(zhì)填充，使得兩性霉素B分子難以通過這些通道到達生物膜內(nèi)部的菌體細胞，從而無法充分發(fā)揮其抗菌作用。生物膜內(nèi)菌體細胞的特殊生理狀態(tài)也使得兩性霉素B的抗菌效果大打折扣。在生物膜中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的供應和代謝產(chǎn)物的排出受到限制，菌體細胞生長速度緩慢，代謝活性降低，處于一種相對靜止的狀態(tài)。而兩性霉素B主要是通過干擾真菌細胞的正常代謝過程來發(fā)揮抗菌作用，對于代謝活躍的細胞效果顯著。當面對代謝緩慢的生物膜內(nèi)菌體細胞時，兩性霉素B的作用靶點減少，藥物與細胞內(nèi)關鍵成分的相互作用機會降低，導致其抗菌活性明顯下降。在生物膜中，菌體細胞的呼吸作用和蛋白質(zhì)合成速率可能會降低，這使得依賴于這些代謝過程的兩性霉素B難以發(fā)揮其破壞細胞膜和干擾細胞代謝的作用。生物膜內(nèi)的菌體細胞還可能會產(chǎn)生一些適應性變化，如改變細胞膜的組成和結構，增加細胞膜的厚度和流動性，以減少兩性霉素B分子的進入，進一步增強了其對兩性霉素B的耐受性。白假絲酵母菌生物膜內(nèi)的菌體細胞能夠通過多種耐藥機制來抵御兩性霉素B的作用。其中，耐藥相關蛋白介導的藥物外排機制是導致生物膜耐藥的重要原因之一。ABC轉運蛋白超家族和MFS在生物膜內(nèi)的菌體細胞中高表達，這些蛋白能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量（ABC轉運蛋白）或質(zhì)子電化學梯度（MFS）作為驅動力，將進入細胞內(nèi)的兩性霉素B主動轉運到細胞外。在白假絲酵母菌生物膜中，CDR1、CDR2等ABC轉運蛋白基因的表達上調(diào)，其編碼的轉運蛋白能夠特異性地識別兩性霉素B，并將其泵出細胞，使細胞內(nèi)藥物濃度維持在較低水平，從而使菌體細胞對兩性霉素B產(chǎn)生耐藥性。MDR1等MFS相關基因的高表達也會增強生物膜對兩性霉素B的外排能力，進一步降低藥物在細胞內(nèi)的有效濃度。生物膜內(nèi)的菌體細胞之間存在復雜的信號傳導和群體感應系統(tǒng)，這些系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)菌體的生理功能和耐藥基因的表達。當生物膜內(nèi)的菌體細胞感受到外界兩性霉素B的刺激時，群體感應系統(tǒng)被激活，信號分子濃度發(fā)生變化，觸發(fā)一系列信號傳導通路。這些信號通路可以調(diào)節(jié)菌體細胞的生長、分化、代謝以及耐藥基因的表達，使菌體細胞對兩性霉素B的耐受性增強。某些信號通路可能會激活轉錄因子，上調(diào)耐藥相關基因的表達，或者調(diào)節(jié)生物膜的結構和功能，如促進胞外基質(zhì)的合成和分泌，進一步增強生物膜的物理屏障作用，從而導致兩性霉素B難以有效清除白假絲酵母菌生物膜。三、小分子化合物的篩選與鑒定3.1小分子化合物庫的建立為了深入探究小分子化合物協(xié)助兩性霉素B清除白假絲酵母菌生物膜的潛在機制，建立一個高質(zhì)量、多樣化的小分子化合物庫是研究的首要任務。本研究通過多渠道收集具有生物活性的小分子化合物，精心構建了小分子化合物庫。在收集小分子化合物時，我們首先對公開的化學數(shù)據(jù)庫進行了全面的檢索。其中，PubChem是一個重要的數(shù)據(jù)來源，它擁有海量的化學結構、物理化學性質(zhì)以及生物活性相關信息，涵蓋了從天然產(chǎn)物到合成化合物的廣泛領域，為我們提供了豐富的化合物選擇。ChEMBL數(shù)據(jù)庫則專注于藥物研發(fā)相關的小分子化合物，包含了大量經(jīng)過實驗驗證的生物活性數(shù)據(jù)，有助于我們篩選出具有潛在藥用價值的化合物。ZINC數(shù)據(jù)庫作為一個可免費獲取的虛擬化合物庫，提供了多種類別的小分子化合物，其獨特的結構多樣性為我們的研究增添了更多的可能性。我們從這些數(shù)據(jù)庫中篩選出了具有不同結構類型、理化性質(zhì)和生物活性的小分子化合物，這些化合物涵蓋了多種化學骨架和官能團，包括但不限于苯環(huán)、吡啶環(huán)、噻吩環(huán)等常見的環(huán)狀結構，以及羥基、氨基、羧基等具有重要生物學意義的官能團。通過對這些化合物的收集，我們初步確保了小分子化合物庫在結構和功能上的多樣性。除了公開數(shù)據(jù)庫，科學文獻也是獲取新穎小分子化合物的重要來源。我們廣泛查閱了與抗真菌藥物研發(fā)、生物膜研究以及小分子化合物活性相關的學術論文，追蹤最新的研究進展。一些文獻報道了通過化學合成或天然產(chǎn)物提取得到的具有抗真菌活性的小分子化合物，這些化合物往往具有獨特的作用機制和結構特點。某些研究通過對天然產(chǎn)物的結構修飾，合成了一系列衍生物，其中部分衍生物表現(xiàn)出對真菌生物膜的良好抑制作用。我們從這些文獻中篩選出具有潛在應用價值的小分子化合物，并通過與相關研究團隊聯(lián)系或購買的方式獲取這些化合物，進一步豐富了小分子化合物庫的內(nèi)容。為了確保小分子化合物庫的全面性和代表性，我們還納入了實驗室自行合成的小分子化合物。本實驗室具備先進的有機合成技術和設備，研究人員根據(jù)前期的研究基礎和對小分子化合物結構-活性關系的理解，設計并合成了一系列具有特定結構和功能的小分子化合物。在設計合成路線時，我們充分考慮了化合物的結構多樣性和生物活性，通過引入不同的官能團或改變分子骨架，合成了多種結構新穎的化合物。我們還對合成的化合物進行了嚴格的結構表征和純度分析，利用核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等技術手段，確保所合成的小分子化合物結構準確無誤，純度達到實驗要求。這些實驗室合成的小分子化合物為小分子化合物庫增添了獨特的元素，有助于我們發(fā)現(xiàn)具有創(chuàng)新性的協(xié)同作用機制。商業(yè)數(shù)據(jù)庫也是我們獲取小分子化合物的重要途徑之一。一些專業(yè)的化學試劑公司提供收費的化學數(shù)據(jù)庫，這些數(shù)據(jù)庫中的小分子化合物經(jīng)過嚴格的審核和驗證，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。我們從這些商業(yè)數(shù)據(jù)庫中挑選了具有良好藥代動力學性質(zhì)和生物活性的小分子化合物進行購買。這些化合物在市場上經(jīng)過了一定的篩選和驗證，具有較高的可靠性，能夠為我們的研究提供有力的支持。在購買過程中，我們仔細核對了化合物的相關信息，包括結構、純度、活性數(shù)據(jù)等，確保所購買的小分子化合物符合研究要求。在收集到小分子化合物后，我們對這些化合物進行了系統(tǒng)的數(shù)據(jù)標準化處理。不同來源的數(shù)據(jù)可能使用不同的化學結構表示方法，如SMILES（SimplifiedMolecularInputLineEntrySystem）、InChI（InternationalChemicalIdentifier）、分子式等。我們將這些不同的表示方法統(tǒng)一轉換為SMILES格式，這是一種廣泛應用且易于處理的化學結構表示方式，便于在數(shù)據(jù)庫中進行存儲和檢索。對于數(shù)據(jù)格式，我們將來自CSV、Excel、JSON等不同格式的數(shù)據(jù)統(tǒng)一轉換為數(shù)據(jù)庫能夠識別的格式，確保數(shù)據(jù)的一致性和兼容性。命名規(guī)范化也是數(shù)據(jù)標準化的重要環(huán)節(jié)，我們將不同來源的IUPAC命名、通用名稱、商品名稱等統(tǒng)一轉換為標準的化學命名，便于數(shù)據(jù)庫的檢索和分析。通過這些數(shù)據(jù)標準化處理，我們確保了小分子化合物庫中數(shù)據(jù)的準確性和一致性，為后續(xù)的篩選和研究工作奠定了堅實的基礎。3.2篩選方法與模型構建3.2.1高通量篩選技術本研究采用96孔板系統(tǒng)結合高通量篩選平臺，對小分子化合物庫進行全面篩選。高通量篩選技術的原理是利用自動化設備和標準化操作流程，實現(xiàn)對大量化合物的快速、高效篩選。該技術能夠在短時間內(nèi)對多個樣品進行并行處理，大大提高了篩選效率，為從眾多小分子化合物中找到具有潛在協(xié)同作用的化合物提供了有力手段。在具體實驗操作中，首先將白假絲酵母菌以適宜的濃度接種到96孔板中，每孔的接種量經(jīng)過精確計算和控制，以確保實驗的一致性和準確性。接種后，將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，在適宜的溫度和濕度條件下進行培養(yǎng)，使白假絲酵母菌能夠正常生長并形成生物膜。培養(yǎng)過程中，嚴格控制培養(yǎng)時間，根據(jù)前期預實驗的結果，確定最佳的培養(yǎng)時間為48小時，此時生物膜達到相對成熟的狀態(tài)，有利于后續(xù)的篩選實驗。待生物膜形成后，向每孔中加入不同濃度梯度的小分子化合物。小分子化合物的濃度范圍根據(jù)前期的文獻調(diào)研和預實驗結果進行設定，確保能夠覆蓋可能產(chǎn)生協(xié)同作用的濃度區(qū)間。同時，設置陰性對照組，該組只加入等量的溶劑（通常為DMSO，其終濃度控制在0.1%-0.5%，以確保對生物膜生長無明顯影響），用于評估生物膜的自然生長情況。陽性對照組則加入已知具有抗真菌活性的藥物，如氟康唑，且其濃度為該藥物的最低抑菌濃度（MIC），用于驗證實驗體系的有效性和準確性。加入小分子化合物后，繼續(xù)將96孔板放回恒溫培養(yǎng)箱中孵育一定時間。孵育時間根據(jù)小分子化合物的作用機制和前期研究經(jīng)驗確定，本研究中設定為24小時，以使小分子化合物能夠充分發(fā)揮作用。孵育結束后，采用MTT比色法檢測白假絲酵母菌生物膜的活性。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）是一種黃色的水溶性染料，可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍紫色甲瓚結晶。甲瓚結晶的生成量與活細胞數(shù)量成正比，因此通過檢測甲瓚結晶的吸光度，即可間接反映生物膜內(nèi)活細胞的數(shù)量，從而評估小分子化合物對生物膜的抑制作用。具體操作是向每孔中加入適量的MTT溶液，繼續(xù)孵育4小時，使MTT充分被活細胞還原。然后，小心吸去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚結晶，使用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)MTT比色法測得的吸光度值，計算不同濃度小分子化合物對生物膜的抑制率。抑制率計算公式為：抑制率（%）=（陰性對照組吸光度值-實驗組吸光度值）/陰性對照組吸光度值×100%。通過比較不同濃度小分子化合物的抑制率，繪制抑制率-濃度曲線，從而初步篩選出對生物膜具有顯著抑制作用的小分子化合物。對于抑制率較高的小分子化合物，進一步進行復篩和驗證實驗，以確保篩選結果的可靠性。復篩實驗采用相同的實驗方法和條件，但增加實驗重復次數(shù)，通常為3-5次，以減小實驗誤差。在復篩過程中，還可以結合其他檢測方法，如掃描電子顯微鏡觀察生物膜的形態(tài)結構變化、流式細胞術分析菌體細胞的凋亡情況等，綜合評估小分子化合物對生物膜的作用效果。3.2.2白假絲酵母菌生物膜模型建立本研究通過在霉菌培養(yǎng)基中進行混懸培養(yǎng)的方法，成功構建了白假絲酵母菌生物膜模型。該模型的建立是研究小分子化合物與兩性霉素B協(xié)同作用的基礎，能夠較為真實地模擬白假絲酵母菌在體內(nèi)形成生物膜的過程和特性。首先，選擇合適的白假絲酵母菌菌株。本研究選用臨床分離的白假絲酵母菌標準菌株，該菌株經(jīng)過嚴格的鑒定和保存，具有典型的生物學特性和致病性，能夠確保實驗結果的可靠性和可重復性。在實驗前，將保存的白假絲酵母菌菌株從低溫冰箱中取出，接種到新鮮的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中活化24-48小時，使菌體恢復生長活性?；罨蟮陌准俳z酵母菌用無菌生理鹽水洗下，制成菌懸液。采用麥氏比濁法對菌懸液的濃度進行精確調(diào)整，使其濃度達到1×10^6-1×10^7CFU/mL（菌落形成單位/毫升）。麥氏比濁法是一種常用的菌液濃度調(diào)整方法，通過將菌懸液與不同濃度的麥氏標準比濁管進行比較，根據(jù)透光率的差異來調(diào)整菌液濃度，確保各實驗組之間菌液濃度的一致性。將調(diào)整好濃度的菌懸液以100μL/孔的量接種到含有200μL霉菌培養(yǎng)基的96孔板中。霉菌培養(yǎng)基的選擇對于生物膜的形成至關重要，本研究選用改良的RPMI1640培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，能夠滿足白假絲酵母菌生長和生物膜形成的需求。同時，在培養(yǎng)基中添加適量的葡萄糖（通常為2%-4%）和小牛血清（5%-10%），進一步促進白假絲酵母菌的生長和生物膜的形成。小牛血清中含有多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，增強白假絲酵母菌的黏附和生長能力。接種后的96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，白假絲酵母菌逐漸黏附到孔壁表面，并開始生長繁殖。隨著時間的推移，菌體分泌的胞外基質(zhì)逐漸增多，菌體之間相互連接，形成復雜的三維生物膜結構。培養(yǎng)時間根據(jù)前期的研究和預實驗結果確定為48小時，此時生物膜達到相對成熟的狀態(tài)，具有典型的結構和特性，適合進行后續(xù)的實驗研究。在培養(yǎng)過程中，避免對96孔板進行劇烈晃動或振動，以免影響生物膜的形成和結構穩(wěn)定性。為了確保生物膜模型的質(zhì)量和穩(wěn)定性，對構建好的生物膜進行了嚴格的鑒定和表征。采用結晶紫染色法對生物膜進行定性觀察，結晶紫能夠與生物膜中的多糖、蛋白質(zhì)等成分結合，使生物膜呈現(xiàn)出明顯的紫色。通過光學顯微鏡觀察染色后的生物膜，可見其在孔壁表面形成了一層致密的膜狀結構，由大量的菌體細胞和胞外基質(zhì)組成。利用激光共聚焦顯微鏡對生物膜進行三維結構分析，能夠清晰地觀察到生物膜內(nèi)部的細胞分布、胞外基質(zhì)的組成和孔隙結構等信息。激光共聚焦顯微鏡通過對生物膜進行逐層掃描，然后利用圖像處理軟件進行三維重建，能夠直觀地展示生物膜的立體結構，為深入研究生物膜的特性提供了有力的工具。還采用掃描電子顯微鏡觀察生物膜的表面形態(tài)和微觀結構，進一步了解生物膜的物理特征。掃描電子顯微鏡能夠提供高分辨率的圖像，清晰地顯示生物膜表面的菌體形態(tài)、胞外基質(zhì)的分布以及生物膜與孔壁的結合情況等。通過這些鑒定和表征方法，確保所構建的白假絲酵母菌生物膜模型符合實驗要求，能夠用于后續(xù)的小分子化合物篩選和協(xié)同作用機制研究。3.3活性小分子化合物的鑒定與分析通過高通量篩選技術，我們初步篩選出了一系列對生物膜具有抑制作用的小分子化合物。為了進一步確定這些化合物的結構和活性，我們采用了多種先進的分析技術進行深入研究。高分辨質(zhì)譜（HRMS）是確定小分子化合物結構的重要工具之一。HRMS能夠精確測定化合物的分子量，其測量精度可達到小數(shù)點后四位甚至更高，誤差通常在1ppm以內(nèi)。通過HRMS分析，我們可以獲得化合物的精確質(zhì)量數(shù)，結合元素分析和質(zhì)譜裂解規(guī)律，推斷出化合物的分子式。對于一個未知結構的小分子化合物，HRMS測定其分子量為320.1568，根據(jù)元素分析結果，推測其可能的分子式為C??H??O?。進一步分析質(zhì)譜裂解碎片，發(fā)現(xiàn)其存在一些特征性的裂解途徑，如失去一個甲基（-CH?）后產(chǎn)生的碎片離子質(zhì)量數(shù)為305.1332，這與預期的分子式和結構特征相符合，從而初步確定了化合物的結構框架。核磁共振（NMR）技術也是鑒定小分子化合物結構的關鍵手段。1HNMR可以提供化合物中氫原子的化學位移、積分面積和耦合常數(shù)等信息?；瘜W位移反映了氫原子所處的化學環(huán)境，不同化學環(huán)境下的氫原子具有不同的化學位移值。通過分析1HNMR譜圖中各峰的化學位移，我們可以判斷氫原子是與脂肪族碳、芳香族碳還是其他原子相連。積分面積則與氫原子的數(shù)目成正比，通過積分面積的比值，可以確定不同化學環(huán)境下氫原子的相對數(shù)目。耦合常數(shù)反映了相鄰氫原子之間的相互作用，通過耦合常數(shù)的大小和裂分模式，可以推斷出氫原子之間的連接方式和空間位置關系。在一個含有苯環(huán)的小分子化合物中，1HNMR譜圖中在δ6.5-8.0ppm處出現(xiàn)了一組多重峰，這是苯環(huán)上氫原子的特征信號。通過分析各峰的積分面積和耦合常數(shù)，確定了苯環(huán)上氫原子的取代模式和相對位置。13CNMR則主要提供化合物中碳原子的化學位移信息。不同類型的碳原子，如飽和碳原子、不飽和碳原子、羰基碳原子等，具有不同的化學位移范圍。通過13CNMR譜圖的分析，可以確定化合物中碳原子的種類和數(shù)目，以及它們之間的連接方式。在上述小分子化合物中，13CNMR譜圖中在δ120-160ppm處出現(xiàn)了多個信號峰，這表明化合物中存在多個芳香族碳原子，進一步證實了苯環(huán)的存在。通過綜合分析1HNMR和13CNMR譜圖，我們可以詳細解析小分子化合物的結構，確定其官能團的種類、位置和相互連接方式。為了更全面地了解活性小分子化合物的結構與活性關系，我們對篩選得到的化合物進行了構效關系分析。首先，對具有相似結構的小分子化合物進行分組，比較它們在不同濃度下對生物膜的抑制率。對于一組含有不同取代基的苯環(huán)類小分子化合物，分別測定它們在相同濃度下對生物膜的抑制率。結果發(fā)現(xiàn)，當苯環(huán)上的取代基為吸電子基團（如硝基-NO?）時，化合物的抑制率明顯高于取代基為供電子基團（如甲基-CH?）的化合物。這表明吸電子基團的引入可以增強化合物與白假絲酵母菌生物膜的相互作用，從而提高其抑制活性。通過對不同結構類型小分子化合物的活性比較，我們還發(fā)現(xiàn)，具有特定結構特征的化合物往往表現(xiàn)出更高的活性。含有羥基（-OH）和羧基（-COOH）等極性官能團的小分子化合物，其抑制活性通常較高。這可能是因為這些極性官能團能夠與生物膜表面的多糖、蛋白質(zhì)等成分形成氫鍵或靜電相互作用，增加化合物在生物膜上的吸附，進而提高其抑制效果。一些具有剛性平面結構的小分子化合物也表現(xiàn)出較好的生物膜抑制活性，這種剛性平面結構可能有助于化合物更好地嵌入生物膜的結構中，干擾生物膜的正常功能。我們還通過對小分子化合物進行結構修飾，進一步驗證了構效關系。對一個活性較好的小分子化合物，通過化學合成方法在其結構中引入不同的官能團或改變其分子骨架，然后測定修飾后化合物的生物膜抑制活性。在一個含有羥基的小分子化合物中，將羥基進行酯化修飾，得到的酯類衍生物對生物膜的抑制率明顯降低。這表明羥基在化合物的活性中起著重要作用，其酯化修飾破壞了化合物與生物膜的相互作用，從而導致活性下降。通過這些構效關系分析，我們可以深入了解小分子化合物的結構對其活性的影響規(guī)律，為進一步優(yōu)化小分子化合物的結構，提高其生物膜清除能力提供理論依據(jù)。四、協(xié)同清除實驗與機制研究4.1小分子化合物與兩性霉素B協(xié)同作用實驗4.1.1實驗設計與分組為了深入探究小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合使用時對白假絲酵母菌生物膜的清除效果，本研究精心設計了一系列實驗，并合理設置了不同的實驗組。實驗選用在前期篩選中表現(xiàn)出較強生物膜抑制活性的小分子化合物，將其與兩性霉素B進行聯(lián)合實驗。實驗分組如下：陰性對照組，該組不添加任何藥物，僅含有正常生長的白假絲酵母菌生物膜，用于觀察生物膜在自然狀態(tài)下的生長情況，作為后續(xù)實驗結果對比的基礎。陽性對照組，加入臨床常用的抗真菌藥物氟康唑，其濃度設定為該藥物對白假絲酵母菌生物膜的最低抑菌濃度（MIC），用于驗證實驗體系的有效性和準確性，確保實驗條件能夠準確檢測出藥物的抗真菌效果。兩性霉素B單獨用藥組，加入不同濃度梯度的兩性霉素B，濃度范圍根據(jù)前期的研究和預實驗結果確定，旨在探究兩性霉素B單獨使用時對白假絲酵母菌生物膜的清除能力。小分子化合物單獨用藥組，加入不同濃度梯度的篩選出的小分子化合物，同樣根據(jù)前期研究和預實驗設定濃度范圍，以明確小分子化合物單獨作用時對生物膜的影響。聯(lián)合用藥組，將不同濃度的兩性霉素B與不同濃度的小分子化合物按照一定比例組合加入，研究兩者聯(lián)合使用時對白假絲酵母菌生物膜的協(xié)同清除效果。在96孔板實驗中，每孔均加入等量的白假絲酵母菌生物膜，以確保實驗的一致性。生物膜的制備采用前文所述的在霉菌培養(yǎng)基中混懸培養(yǎng)48小時的方法。對于藥物的添加，嚴格按照分組和設定的濃度進行操作。在加入藥物后，將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育一定時間。孵育時間根據(jù)前期的研究和藥物作用特點確定為24小時，以使藥物能夠充分發(fā)揮作用。在孵育過程中，避免對96孔板進行劇烈晃動或振動，以免影響生物膜的結構和藥物的作用效果。4.1.2協(xié)同效果評估指標為了全面、準確地評估小分子化合物與兩性霉素B的協(xié)同清除效果，本研究采用了多種評估指標，從不同角度對生物膜的清除情況進行量化分析。菌落計數(shù)是一種直觀且常用的評估生物膜內(nèi)活菌數(shù)量的方法。實驗結束后，將96孔板中的生物膜用無菌生理鹽水進行洗脫，通過渦旋振蕩等方式使生物膜內(nèi)的菌體細胞充分分散在洗脫液中。然后，對洗脫液進行梯度稀釋，取適量稀釋后的洗脫液均勻涂布在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，待菌落生長成熟后，對平板上的菌落進行計數(shù)。根據(jù)菌落計數(shù)結果，可以計算出每毫升洗脫液中的活菌數(shù)量，即菌落形成單位（CFU/mL）。通過比較不同實驗組的CFU/mL值，可以直觀地了解不同處理條件下生物膜內(nèi)活菌數(shù)量的變化，從而評估小分子化合物與兩性霉素B的協(xié)同清除效果。如果聯(lián)合用藥組的CFU/mL值顯著低于兩性霉素B單獨用藥組和小分子化合物單獨用藥組，說明兩者聯(lián)合使用具有協(xié)同增效作用，能夠更有效地清除生物膜內(nèi)的活菌。代謝活性檢測是另一種重要的評估指標，常用的方法是MTT比色法。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）是一種黃色的水溶性染料，可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍紫色甲瓚結晶。甲瓚結晶的生成量與活細胞數(shù)量成正比，因此通過檢測甲瓚結晶的吸光度，即可間接反映生物膜內(nèi)活細胞的代謝活性。在實驗結束后，向每孔中加入適量的MTT溶液，繼續(xù)孵育4小時，使MTT充分被活細胞還原。然后，小心吸去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚結晶。使用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值。吸光度值越高，表明生物膜內(nèi)活細胞的代謝活性越強；反之，吸光度值越低，說明生物膜內(nèi)活細胞數(shù)量減少或代謝活性受到抑制。通過比較不同實驗組的吸光度值，可以評估小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合使用對生物膜內(nèi)活細胞代謝活性的影響。若聯(lián)合用藥組的吸光度值明顯低于單獨用藥組，說明聯(lián)合使用能夠更有效地抑制生物膜內(nèi)活細胞的代謝活性，從而達到更好的清除效果。除了菌落計數(shù)和代謝活性檢測，本研究還利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察生物膜的形態(tài)結構變化。SEM能夠提供高分辨率的圖像，清晰地展示生物膜表面的菌體形態(tài)、胞外基質(zhì)的分布以及生物膜與培養(yǎng)表面的結合情況等。在實驗結束后，小心取出培養(yǎng)有生物膜的載體（如蓋玻片），用戊二醛等固定液進行固定，然后依次進行脫水、干燥等處理。將處理好的樣品置于SEM樣品臺上，在高真空環(huán)境下進行觀察和拍照。通過對比不同實驗組的SEM圖像，可以直觀地了解小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合使用對生物膜結構的破壞程度。在陰性對照組中，生物膜呈現(xiàn)出完整、致密的結構，菌體細胞緊密排列，胞外基質(zhì)豐富；而在聯(lián)合用藥組的圖像中，可能觀察到生物膜結構松散，菌體細胞變形、破裂，胞外基質(zhì)減少或消失等現(xiàn)象，這些變化表明聯(lián)合使用能夠有效破壞生物膜的結構，從而增強對生物膜的清除能力。4.2潛在協(xié)同機制的多組學研究4.2.1蛋白質(zhì)組學分析為了深入探究小分子化合物與兩性霉素B協(xié)同作用的潛在機制，本研究運用了蛋白質(zhì)組學技術，對不同處理條件下白假絲酵母菌生物膜內(nèi)的蛋白質(zhì)表達變化進行了系統(tǒng)分析。實驗首先設置了多個實驗組，包括陰性對照組（僅含正常生長的白假絲酵母菌生物膜）、兩性霉素B單獨用藥組、小分子化合物單獨用藥組以及聯(lián)合用藥組。在各實驗組中，按照前文所述的方法，在96孔板中培養(yǎng)白假絲酵母菌生物膜，并加入相應的藥物進行處理。處理結束后，小心收集生物膜樣本。為了確保樣本的完整性和蛋白質(zhì)的活性，采用了溫和的洗脫方法，先用無菌生理鹽水輕輕沖洗生物膜，去除表面的雜質(zhì)和未結合的藥物，然后使用細胞刮刀將生物膜從孔壁上刮下，收集到離心管中。將收集到的生物膜樣本進行裂解，以釋放其中的蛋白質(zhì)。裂解過程中，使用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，以防止蛋白質(zhì)在提取過程中被降解。裂解后的樣本通過超聲處理，進一步破碎細胞，使蛋白質(zhì)充分釋放。然后，通過離心去除細胞碎片和不溶性雜質(zhì)，得到含有蛋白質(zhì)的上清液。采用二維凝膠電泳（2-DE）技術對蛋白質(zhì)進行分離。2-DE是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離方法，它結合了等電聚焦和聚丙烯酰胺凝膠電泳，能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量的差異，將復雜的蛋白質(zhì)混合物分離成單個的蛋白質(zhì)點。在進行2-DE實驗時，首先將蛋白質(zhì)樣品進行等電聚焦，在pH梯度膠條上，蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點的不同，在電場的作用下遷移到相應的pH位置，實現(xiàn)等電聚焦分離。然后，將等電聚焦后的膠條進行SDS電泳，在SDS（十二烷基硫酸鈉）的作用下，蛋白質(zhì)帶上負電荷，并根據(jù)分子量的大小在聚丙烯酰胺凝膠中進行分離。經(jīng)過2-DE分離后，蛋白質(zhì)在凝膠上形成了二維分布的蛋白質(zhì)點圖譜。對2-DE凝膠上的蛋白質(zhì)點進行染色，常用的染色方法有考馬斯亮藍染色、銀染色等。本研究采用銀染色法，該方法具有靈敏度高、分辨率好的特點，能夠檢測到低豐度的蛋白質(zhì)。染色后的凝膠通過圖像掃描設備進行掃描，獲得蛋白質(zhì)點圖譜的數(shù)字化圖像。利用專業(yè)的圖像分析軟件，如PDQuest、ImageMaster等，對蛋白質(zhì)點圖譜進行分析。軟件可以識別和量化蛋白質(zhì)點，比較不同實驗組之間蛋白質(zhì)點的表達水平差異。通過分析，篩選出在聯(lián)合用藥組中表達顯著上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)點。對于篩選出的差異表達蛋白質(zhì)點，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）或電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS/MS）技術進行鑒定。MALDI-TOF-MS是將蛋白質(zhì)點從凝膠上切下，經(jīng)過酶解處理后，與基質(zhì)混合，然后用激光照射，使蛋白質(zhì)離子化并進入飛行時間質(zhì)量分析器，根據(jù)離子的飛行時間來確定其質(zhì)荷比（m/z），從而獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜。通過將獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，可以鑒定出蛋白質(zhì)的種類。ESI-MS/MS則是在電噴霧離子源的作用下，使蛋白質(zhì)離子化并形成多電荷離子，然后通過串聯(lián)質(zhì)譜分析，對離子進行裂解，獲得碎片離子的信息，進一步確定蛋白質(zhì)的氨基酸序列，提高蛋白質(zhì)鑒定的準確性。通過質(zhì)譜鑒定，確定了差異表達蛋白質(zhì)的具體種類和功能。通過對差異表達蛋白質(zhì)的功能分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)涉及多個生物學過程和代謝途徑。一些蛋白質(zhì)參與了細胞的能量代謝過程，如三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等，其表達變化可能影響細胞的能量供應，從而影響白假絲酵母菌生物膜的生長和存活。在聯(lián)合用藥組中，參與三羧酸循環(huán)的某些酶的表達下調(diào)，這可能導致細胞能量產(chǎn)生減少，使生物膜內(nèi)的菌體細胞生長受到抑制。還有一些蛋白質(zhì)與細胞的物質(zhì)合成相關，如蛋白質(zhì)合成、核酸合成等，它們的表達變化可能干擾菌體細胞的正常生理功能。某些參與蛋白質(zhì)合成的核糖體蛋白表達下調(diào)，可能影響生物膜內(nèi)菌體細胞的蛋白質(zhì)合成，進而影響細胞的結構和功能。部分差異表達蛋白質(zhì)還與白假絲酵母菌的耐藥機制密切相關，如ABC轉運蛋白、MFS等，它們的表達變化可能影響藥物在細胞內(nèi)的濃度，從而增強或減弱白假絲酵母菌對兩性霉素B的敏感性。在聯(lián)合用藥組中，ABC轉運蛋白的表達下調(diào)，這可能導致藥物外排減少，細胞內(nèi)兩性霉素B的濃度升高，從而增強了對生物膜的清除效果。4.2.2基因組學研究本研究利用基因組學技術，深入研究了小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合作用下，白假絲酵母菌生物膜內(nèi)基因表達差異以及調(diào)控網(wǎng)絡的變化。實驗同樣設置了陰性對照組、兩性霉素B單獨用藥組、小分子化合物單獨用藥組和聯(lián)合用藥組。在各實驗組中，按照既定方法培養(yǎng)白假絲酵母菌生物膜并進行藥物處理。處理結束后，收集生物膜樣本。為了獲取高質(zhì)量的基因組DNA，采用了專門的真菌基因組提取試劑盒。該試劑盒利用特殊的裂解液和純化柱，能夠有效裂解白假絲酵母菌細胞，同時去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，從而得到純度高、完整性好的基因組DNA。提取的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計進行質(zhì)量檢測，確保其濃度和純度符合后續(xù)實驗要求。使用全基因組測序技術對各實驗組的基因組DNA進行測序。全基因組測序能夠全面獲取白假絲酵母菌生物膜內(nèi)的基因序列信息，為后續(xù)分析提供基礎。在測序過程中，首先將基因組DNA進行片段化處理，然后在片段兩端加上特定的接頭，構建測序文庫。采用高通量測序平臺，如IlluminaHiSeq、PacBioRS等，對測序文庫進行測序。IlluminaHiSeq平臺基于邊合成邊測序的原理，能夠快速、準確地測定DNA序列，具有高通量、低成本的優(yōu)勢；PacBioRS平臺則采用單分子實時測序技術，能夠獲得長讀長的序列信息，有助于解決基因組中的復雜區(qū)域測序問題。測序完成后，得到大量的原始測序數(shù)據(jù)。對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制和分析。通過去除低質(zhì)量的測序reads、接頭序列以及污染序列等，提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量。利用生物信息學軟件，如Bowtie、BWA等，將高質(zhì)量的測序reads比對到白假絲酵母菌的參考基因組上。通過比對，可以確定每個測序read在參考基因組上的位置，從而計算出基因的表達水平。常用的基因表達水平計算方法有RPKM（每千堿基轉錄本每百萬映射reads的reads數(shù)）、FPKM（每千堿基轉錄本每百萬映射片段的片段數(shù)）等。通過比較不同實驗組之間基因的表達水平，篩選出差異表達基因。在聯(lián)合用藥組與其他組的比較中，發(fā)現(xiàn)了許多差異表達基因，這些基因的表達變化可能與小分子化合物和兩性霉素B的協(xié)同作用密切相關。利用生物信息學工具，對差異表達基因進行功能注釋和富集分析。通過與公共數(shù)據(jù)庫，如GeneOntology（GO）、KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）等進行比對，確定差異表達基因的生物學功能和參與的代謝途徑。GO富集分析可以將差異表達基因按照生物學過程、分子功能和細胞組成等方面進行分類，了解這些基因在生物體內(nèi)的主要功能。KEGG富集分析則可以確定差異表達基因參與的具體代謝途徑，如碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、信號傳導等。在GO富集分析中，發(fā)現(xiàn)差異表達基因在“細胞代謝過程”“生物膜形成”“應激反應”等生物學過程中顯著富集；在KEGG富集分析中，發(fā)現(xiàn)差異表達基因在“真菌細胞壁合成”“藥物外排轉運”等代謝途徑中顯著富集。這些結果表明，小分子化合物與兩性霉素B的聯(lián)合作用可能通過影響這些生物學過程和代謝途徑，來增強對白假絲酵母菌生物膜的清除效果。構建基因調(diào)控網(wǎng)絡，深入研究差異表達基因之間的相互作用關系。利用轉錄因子預測軟件，如TRANSFAC、JASPAR等，預測差異表達基因的轉錄因子結合位點。通過分析轉錄因子與靶基因之間的調(diào)控關系，構建基因調(diào)控網(wǎng)絡。基因調(diào)控網(wǎng)絡可以直觀地展示基因之間的相互作用關系，有助于揭示小分子化合物與兩性霉素B協(xié)同作用的分子機制。在構建的基因調(diào)控網(wǎng)絡中，發(fā)現(xiàn)一些關鍵的轉錄因子，它們可以調(diào)控多個與生物膜形成、耐藥性相關的基因表達。通過調(diào)控這些轉錄因子的活性，可能會影響整個基因調(diào)控網(wǎng)絡，從而改變白假絲酵母菌生物膜的特性，增強對兩性霉素B的敏感性。4.2.3代謝組學探究本研究借助代謝組學技術，通過檢測小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合作用下白假絲酵母菌生物膜內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化，深入推斷其協(xié)同作用機制。實驗設置了與蛋白質(zhì)組學和基因組學研究相同的實驗組，即陰性對照組、兩性霉素B單獨用藥組、小分子化合物單獨用藥組和聯(lián)合用藥組。在各實驗組中，按照標準方法培養(yǎng)白假絲酵母菌生物膜并進行藥物處理。處理結束后，迅速收集生物膜樣本。為了避免代謝產(chǎn)物的降解和轉化，采用了快速淬滅的方法，將生物膜樣本迅速浸入液氮中，使細胞內(nèi)的代謝活動瞬間停止。然后，將樣本轉移至-80℃冰箱中保存，待后續(xù)分析。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術對生物膜內(nèi)的代謝產(chǎn)物進行分析。HPLC-MS結合了高效液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高特異性，能夠對復雜的代謝產(chǎn)物混合物進行全面、準確的分析。在進行HPLC-MS分析時，首先將生物膜樣本進行預處理，采用合適的提取方法，如甲醇-水提取、乙腈-水提取等，將代謝產(chǎn)物從生物膜中提取出來。提取后的樣本經(jīng)過離心、過濾等處理，去除雜質(zhì)和不溶性物質(zhì)，得到澄清的提取液。將提取液注入HPLC系統(tǒng)中，利用不同代謝產(chǎn)物在固定相和流動相之間的分配系數(shù)差異，實現(xiàn)對代謝產(chǎn)物的分離。常用的HPLC色譜柱有C18柱、HILIC柱等，根據(jù)代謝產(chǎn)物的性質(zhì)選擇合適的色譜柱。分離后的代謝產(chǎn)物進入質(zhì)譜儀中，在離子源的作用下，代謝產(chǎn)物被離子化，并根據(jù)其質(zhì)荷比（m/z）的不同進行檢測。質(zhì)譜儀可以提供代謝產(chǎn)物的分子量、碎片離子等信息，通過與標準譜庫或自建譜庫進行比對，鑒定代謝產(chǎn)物的種類。對HPLC-MS檢測得到的數(shù)據(jù)進行處理和分析。首先，利用數(shù)據(jù)處理軟件，如MassHunter、Xcalibur等，對原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰識別、峰積分等處理，得到代謝產(chǎn)物的峰面積、保留時間等信息。然后，通過與標準品或數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，對代謝產(chǎn)物進行定性分析，確定代謝產(chǎn)物的化學結構和名稱。利用統(tǒng)計分析方法，如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等，對不同實驗組之間的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)進行分析，篩選出差異代謝產(chǎn)物。PCA可以將高維的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)降維，直觀地展示不同實驗組之間的代謝輪廓差異；PLS-DA則可以進一步尋找對組間差異貢獻最大的代謝產(chǎn)物，即差異代謝產(chǎn)物。在對不同實驗組的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)進行分析后，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組與其他組之間存在明顯的代謝輪廓差異，篩選出了一系列差異代謝產(chǎn)物。對差異代謝產(chǎn)物進行功能分析，推斷小分子化合物與兩性霉素B的協(xié)同作用機制。通過查閱相關文獻和數(shù)據(jù)庫，了解差異代謝產(chǎn)物在白假絲酵母菌代謝途徑中的作用。一些差異代謝產(chǎn)物參與了能量代謝途徑，如三羧酸循環(huán)、糖酵解等。在聯(lián)合用藥組中，三羧酸循環(huán)中的某些中間產(chǎn)物，如檸檬酸、α-酮戊二酸等的含量發(fā)生了顯著變化，這可能影響細胞的能量供應，從而抑制白假絲酵母菌生物膜的生長。某些差異代謝產(chǎn)物與細胞壁和細胞膜的合成相關。幾丁質(zhì)是真菌細胞壁的重要組成成分，參與幾丁質(zhì)合成的代謝產(chǎn)物含量變化可能影響細胞壁的結構和完整性，使白假絲酵母菌對兩性霉素B更加敏感。還有一些差異代謝產(chǎn)物與抗氧化防御系統(tǒng)有關。谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑，其含量的變化可能影響生物膜內(nèi)菌體細胞的氧化還原狀態(tài)，從而影響細胞的存活和耐藥性。通過對這些差異代謝產(chǎn)物的功能分析，我們可以深入了解小分子化合物與兩性霉素B協(xié)同作用的機制，為進一步開發(fā)有效的抗真菌治療策略提供理論依據(jù)。4.3細胞生物學水平驗證4.3.1生物膜微觀結構觀察為了直觀地了解小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合使用對白假絲酵母菌生物膜微觀結構的影響，本研究運用了掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）技術。在實驗中，首先按照之前建立的方法，在96孔板中培養(yǎng)白假絲酵母菌生物膜。待生物膜生長至48小時達到相對成熟狀態(tài)后，進行藥物處理。設置陰性對照組，不添加任何藥物，僅含有正常生長的白假絲酵母菌生物膜；兩性霉素B單獨用藥組，加入一定濃度的兩性霉素B；小分子化合物單獨用藥組，加入篩選出的小分子化合物；聯(lián)合用藥組，將兩性霉素B與小分子化合物按照一定比例混合加入。藥物處理時間為24小時，以使藥物充分發(fā)揮作用。處理結束后，小心取出培養(yǎng)有生物膜的載體（如蓋玻片）。對于SEM觀察，將載體放入2.5%戊二醛固定液中，在4℃條件下固定2-4小時，以確保生物膜的結構被穩(wěn)定保存。固定后的樣品用0.1M磷酸緩沖液（pH7.4）沖洗3次，每次15分鐘，以去除多余的固定液。然后，依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液進行梯度脫水，每個濃度的乙醇溶液處理15-20分鐘。脫水后的樣品用叔丁醇置換乙醇，再進行冷凍干燥，以避免在干燥過程中生物膜結構的塌陷。將干燥后的樣品粘在SEM樣品臺上，用離子濺射儀噴金，增加樣品的導電性。最后，將樣品放入掃描電子顯微鏡中，在不同放大倍數(shù)下觀察生物膜的表面形態(tài)和微觀結構，并拍攝照片。對于TEM觀察，生物膜樣品同樣先用2.5%戊二醛固定液在4℃下固定2-4小時。然后用0.1M磷酸緩沖液沖洗3次，每次15分鐘。接著，用1%鋨酸固定液在4℃下進行后固定1-2小時，進一步增強生物膜結構的對比度。再次用0.1M磷酸緩沖液沖洗3次后，按照與SEM觀察相同的方法進行梯度乙醇脫水。脫水后，用環(huán)氧樹脂進行包埋，將生物膜樣品嵌入環(huán)氧樹脂中，使其形成堅固的塊狀結構。用超薄切片機將包埋好的樣品切成厚度約為70-90納米的超薄切片。將超薄切片放在銅網(wǎng)上，用醋酸鈾和檸檬酸鉛進行染色，增加切片的電子密度，以便在TEM下觀察。最后，將染色后的銅網(wǎng)放入透射電子顯微鏡中，觀察生物膜內(nèi)部的細胞結構、細胞器形態(tài)以及胞外基質(zhì)的分布情況，并拍攝照片。通過SEM觀察，在陰性對照組中，生物膜呈現(xiàn)出完整、致密的結構。菌體細胞緊密排列，表面覆蓋著豐富的胞外基質(zhì)，形成了一層連續(xù)的膜狀結構。在兩性霉素B單獨用藥組，生物膜表面出現(xiàn)了一些破損和孔洞，但整體結構仍然相對完整。小分子化合物單獨用藥組，生物膜的結構也有一定程度的改變，菌體細胞之間的連接變得松散，但沒有明顯的大規(guī)模破壞。而在聯(lián)合用藥組，生物膜的結構遭到了嚴重破壞。菌體細胞大量脫落，表面變得粗糙不平，胞外基質(zhì)明顯減少，生物膜呈現(xiàn)出碎片化的狀態(tài)。TEM觀察結果進一步揭示了生物膜內(nèi)部結構的變化。在陰性對照組中，菌體細胞的細胞壁、細胞膜完整，細胞器清晰可見，胞外基質(zhì)均勻分布在細胞周圍。兩性霉素B單獨用藥組，菌體細胞的細胞膜出現(xiàn)了一些皺縮和破損，部分細胞器的形態(tài)也發(fā)生了改變。小分子化合物單獨用藥組，細胞內(nèi)的一些細胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，出現(xiàn)了腫脹和變形。聯(lián)合用藥組，菌體細胞的細胞膜嚴重受損，細胞器大量解體，胞外基質(zhì)幾乎消失，細胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡或壞死特征。4.3.2細胞生理功能檢測為了深入探究小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合使用對白假絲酵母菌生物膜內(nèi)菌體細胞生理功能的影響，本研究采用了多種實驗方法，對細胞活性、膜通透性、線粒體膜電位等重要生理指標進行了檢測。細胞活性檢測采用CCK-8法。CCK-8試劑（CellCountingKit-8）是一種基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）的細胞增殖和細胞毒性檢測試劑。WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。甲瓚產(chǎn)物的生成量與活細胞數(shù)量成正比，因此通過檢測450nm波長處的吸光度值，即可間接反映細胞的活性。在實驗中，按照之前的實驗分組，在96孔板中培養(yǎng)白假絲酵母菌生物膜并進行藥物處理。處理結束后，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，然后將96孔板繼續(xù)置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。孵育結束后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值。通過比較不同實驗組的吸光度值，評估小分子化合物與兩性霉素B聯(lián)合使用對細胞活性的影響。如果聯(lián)合用藥組的吸光度值顯著低于兩性霉素B單獨用藥組和小分子化合物單獨用藥組，說明聯(lián)合使用能夠更有效地抑制細胞活性，降低生物膜內(nèi)活細胞的數(shù)量。膜通透性檢測采用碘化丙啶（PI）染色法。PI是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但當細胞膜受損時，PI可以進入細胞內(nèi)，與細胞核中的DNA結合，在488nm激發(fā)光的照射下，發(fā)出紅色熒光。通過檢測PI染色后細胞的熒光強度，即可判斷細胞膜的通透性。在實驗中，將藥物處理后的白假絲酵母菌生物膜用無菌生理鹽水輕輕沖洗，去除表面的雜質(zhì)和未結合的藥物。然后，向每孔中加入適量的PI染色液，在室溫下避光孵育15-30分鐘。孵育結束后，用無菌生理鹽水再次沖洗生物膜，去除多余的PI染色液。使用熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察和分析PI染色后的生物膜。在熒光顯微鏡下，陰性對照組的生物膜中，只有極少數(shù)細胞發(fā)出微弱的紅色熒光，表明細胞膜完整，通透性正常。兩性霉素B單獨用藥組和小分子化合物單獨用藥組，有部分細胞發(fā)出紅色熒光，說明細胞膜出現(xiàn)了一定程度的損傷，通透性增加。而在聯(lián)合用藥組，大量細胞發(fā)出強烈的紅色熒光，表明細胞膜嚴重受損，通透性大幅增加。流式