第十二章DNA的復(fù)制、修復(fù)與重組轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制遺傳信息的傳遞遺傳信息的體現(xiàn)

分子生物學(xué)中心法則(centraldogma)1958年Crick

1970年Temin和Baltimore

DNARNA蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制第一節(jié)DNA復(fù)制的原則半保存復(fù)制(semiconservativereplication)半不持續(xù)復(fù)制(semi-discontimuousreplication)RNA引物復(fù)制起始點(diǎn)和復(fù)制方向一、半保存復(fù)制定義：親代DNA分子的兩條鏈能夠分別作為模板，按堿基互補(bǔ)配對原則，指導(dǎo)DNA新鏈的合成。新合成的兩個子代DNA分子，堿基序列與親代DNA分子完全同樣，但一條鏈來自親代DNA鏈，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻腄NA鏈。二、半不持續(xù)復(fù)制5`3`3`5`3`5`5`5`3`3`5`3`3`5`定義：DNA復(fù)制時，一條鏈?zhǔn)浅掷m(xù)復(fù)制，另一條鏈?zhǔn)遣怀掷m(xù)復(fù)制，稱半不持續(xù)復(fù)制。前導(dǎo)鏈(leadingstrand)：在引物的3`端按5`→3`方向持續(xù)不停地合成的DNA鏈。隨從鏈(laggingstrand)：在引物的3`端按5`→3`方向不持續(xù)合成的DNA鏈。岡崎片段（Okazakifragment）：后隨鏈上不持續(xù)合成的1000～2000或100～200個核苷酸構(gòu)成的DNA小片段。三、RNA引物定義：DNA復(fù)制時，子鏈5`端的一段寡聚核糖核苷酸鏈，能為DNA聚合酶提供聚合新的脫氧核糖核苷酸所需的3`OH，最后可被切除。意義：提供新的脫氧核糖核苷酸聚合所需的3`OH確保復(fù)制起始部位的真實性3`5`DNA模板3`5`DNA模板RNA引物5`OH-3`RNA引物5`OH-3`3`引物酶（RNA聚合酶）第二節(jié)參加DNA復(fù)制的某些酶類和蛋白質(zhì)一、原核生物大腸埃希菌的DNA聚合酶1、DNA聚合酶Ⅰ（Kornberg酶）發(fā)現(xiàn):1955年Arshur.Kornberg（阿瑟.康恩伯格）1959年諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎活性:大片段5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性小片段5`→3`外切酶活性5`→3`外切5`→3`聚合3`→5`外切N`C`大片段Klenow片段小片段羅杰.科恩伯格接受父親（左）的祝賀

TheNobelPrizeinChemistry2006"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription"RogerD.Kornberg羅杰.科恩伯格5`→3`外切酶活性功效：切除RNA引物切除突變片段，在DNA損傷修復(fù)中起作用5`→3`聚合酶活性

功效：彌補(bǔ)片段切除后的空缺3`→5`外切酶活性TＧＣＡＣＡＴＡＡＣＧＴＧＴＡＣ5`3`5`3`T功效：校讀功效（proofreading）意義：確保DNA復(fù)制的高度真實性

DNA聚合酶Ⅰ多功效酶Klenow片段慣用的工具酶5`3`3`5`2、DNA聚合酶Ⅱ活性：5`→3`聚合酶活性3`→5`外切酶活性功效：不確切

3、DNA聚合酶Ⅲ構(gòu)成：多亞基復(fù)和物全酶

核心酶（αεθ）×2

連接二聚體（τ2）

單個運(yùn)載夾鉗復(fù)合物（γ2δδ`χψ）

β4

ααττεεθθδδ`γ2ψχββββ功效：α亞基—5`→3`聚合ε亞基—3`→5`外切τ亞基—連接γ2δδ`χψ亞基復(fù)合物—鉗夾β亞基—鉗夾、滑動

特點(diǎn)：高續(xù)進(jìn)性（≥50萬個脫氧核糖核苷酸）高效性（≈1000個脫氧核糖核苷酸/秒）高保真實性（校讀功效）二、真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶：α、β、γ、δ、ε五種功效：DNA聚合酶α—聚合隨從鏈DNA聚合酶δ—聚合前導(dǎo)鏈（協(xié)同增殖細(xì)胞核抗原PCNA）DNA聚合酶γ—聚合線粒體DNADNA聚合酶β、ε—校讀功效、參加DNA損傷修復(fù)三、解鏈、解旋酶類和蛋白質(zhì)（大腸桿菌E.coli）1、DNA解鏈酶功效：解開DNA雙鏈條件：需要ATP供能，2個ATP/對堿基2、單鏈DNA結(jié)合蛋白功效：維持模板單鏈狀態(tài)保護(hù)模板不受核酸酶水解DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ功效：臨時切斷雙鏈中的一股，另一股鏈旋轉(zhuǎn)通過該缺口，張力下降后，再連接缺口DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ功效：臨時切斷雙鏈中的兩股，斷端旋轉(zhuǎn)，張力下降后，再連接缺口條件：需要ATP供能3、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶4、引發(fā)體組分：DnaA識別并結(jié)合至復(fù)制起始部位DnaB解鏈酶作用DnaC協(xié)助DnaB結(jié)合至復(fù)制起始部位引物酶RNA聚合酶，合成RNA引物5、連接酶功效：催化兩段DNA鏈間形成3`5`磷酸二酯鍵特點(diǎn)：只能催化雙鏈DNA鏈上的一股或兩股鏈的連接5`5`3`3`5`5`3`3`3`5`5`5`5`5`3`3`3`3`第三節(jié)DNA復(fù)制過程（大腸埃希菌）模板：單鏈DNA引物：RNA引物原料：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）聚合酶：DNA聚合酶輔助因子：Mg2＋其它：酶和蛋白因子方向：5`→3`一、復(fù)制的起始1、復(fù)制起始部位oriC單一：原核生物普通只有一種復(fù)制起始點(diǎn)特定：高度保守序列GATCTNTTNTTTTDnaA結(jié)合位點(diǎn)

真核生物有多個復(fù)制起始點(diǎn)GATCTNTTNTTTTTTATCCACADnaADnaADnaADnaADnaA:結(jié)合至oriC的4個DnaA結(jié)合位點(diǎn)，形成起始復(fù)合物作用于oriC的3個13bp序列，DNA在此處解鏈，形成開放型起始復(fù)合物DnaC:DnaB:解開復(fù)制起始部位的DNA雙鏈協(xié)助DnaB結(jié)合至復(fù)制起始部位單鏈結(jié)合蛋白：穩(wěn)定并保護(hù)已解開的DNA單鏈引物酶：RNA聚合酶，合成RNA引物維持模板單鏈狀態(tài)2、復(fù)制方向雙向復(fù)制復(fù)制眼（泡）：DNA復(fù)制時，局部解開DNA的雙鏈，在電鏡下呈眼泡狀突起復(fù)制叉：DNA復(fù)制時，局部DNA雙鏈解開，在復(fù)制邁進(jìn)部位兩側(cè)形成的Y型或叉狀構(gòu)造真核生物DNA復(fù)制原核生物DNA復(fù)制二、復(fù)制的延長DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋DNA聚合酶Ⅲ

催化3`5`磷酸二酯鍵形成，聚合DNA新鏈復(fù)制叉前進(jìn)“前導(dǎo)鏈和隨從鏈同時同方向合成”問題的解決——隨從鏈摸板圍繞二、復(fù)制的終止DNA聚合酶Ⅰ切除引物彌補(bǔ)空缺5`3`3`3`3`5`5`5`DNA連接酶連接前后兩個片段間的缺口5`3`3`3`3`5`5`5`四、真核生物端粒DNA的復(fù)制1、端粒：真核生物線性DNA的兩個末端構(gòu)造：由數(shù)百個串聯(lián)排列的GT豐富的寡聚核苷酸序列構(gòu)成人(AGGGTT)n四膜蟲(GGGGTT)n功效：維持染色體DNA的穩(wěn)定性2、端粒酶：避免端?？s短的一種逆轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)成：由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)—DNA聚合酶RNA—模板唯一攜帶RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄酶功效：復(fù)制端粒序列，避免端?？s短。

機(jī)制：端粒、端粒酶與腫瘤：生殖細(xì)胞、干細(xì)胞：端粒酶活性保持體細(xì)胞：端粒酶活性下降，正常衰老現(xiàn)象惡性腫瘤細(xì)胞：端粒酶的活性恢復(fù)，使細(xì)胞永生化，形成惡性增殖1994年，Couter人卵巢細(xì)胞端粒酶體現(xiàn)1997年，人端粒酶基因克隆85%腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性升高第四節(jié)DNA的損傷與修復(fù)一、DNA損傷的因素1、自發(fā)因素環(huán)境中溶劑分子隨即熱碰撞N-糖苷鍵斷裂，A、G脫落磷酸戊糖堿基2、物理因素紫外線電離輻射共價交聯(lián)，嘧啶二聚體單（雙）鏈斷裂，堿基脫落破壞，分子交聯(lián)，脫氧核糖破壞3、化學(xué)因素亞硝酸鹽CU二、DNA損傷的類型1、點(diǎn)突變轉(zhuǎn)換同型堿基顛換異型堿基調(diào)控序列影響基因體現(xiàn)編碼序列故意突變—變化蛋白質(zhì)功效無意突變—個別氨基酸變化，蛋白質(zhì)功效不變靜止突變—個別堿基變化，氨基酸不變鐮刀型紅細(xì)胞貧血N-Val.His.Leu.Thr.Pro.Glu.Glu…….-C

N-Val.His.Leu.Thr.Pro.Val.Glu…….-C

5`-***.***.***.***.***.CTC.***………-3`5`-***.***.***.***.***.CAC.***………-3`2、缺失一種核苷酸、一段核苷酸、一種基因Lesch-Nyhan`s綜合癥次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）基因丟失3、插入一種堿基、一段核苷酸芳香族分子等移碼突變4、倒位二、DNA損傷的修復(fù)機(jī)制1、光修復(fù)機(jī)制低等生物解聚嘧啶二聚體不需要光復(fù)活酶

需要光復(fù)活酶2、切除修復(fù)機(jī)制（暗修復(fù)）全部生物切割3`5`磷酸二酯鍵（擴(kuò)創(chuàng)）、彌補(bǔ)、連接UV特異的核酸內(nèi)切酶著色性干皮病

②AP特異的核酸內(nèi)切酶③

DNA聚合酶I（5`→3`外切）PPPPOOOO5`3`④

DNA聚合酶I（5`→3`聚合）3、堿基切除修復(fù)機(jī)制①DNA糖苷酶⑤

DNA連接酶①切割錯誤堿基→②切割3`5`磷酸二酯鍵→③切除、彌補(bǔ)→④連接DNA糖苷酶：特異識別一種DNA分子中變化的堿基，并水解該堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵,形成AP位點(diǎn)。AP特異的核酸內(nèi)切酶：切割3`5`磷酸二酯鍵DNA聚合酶I：切除損傷鏈，彌補(bǔ)缺口連接酶：連接切口為什么構(gòu)成DNA是ATCG，而構(gòu)成RNA是AUCG？尿嘧啶-DNA糖苷酶的發(fā)現(xiàn)尿嘧啶

胸腺嘧啶5`C甲基化5`C去甲基“分辨正常的尿嘧啶與胞嘧啶脫氨形成的尿嘧啶”的需要455111復(fù)制的真實性1、半保存復(fù)制2、堿基互補(bǔ)配對原則3、RNA引物4、DNA聚合酶：校讀功效5、端粒與端粒酶6、DNA的損傷修復(fù)機(jī)制7、尿嘧啶-DNA糖苷酶DNA（T）RNA（U）第五節(jié)重組DNA技術(shù)1、DNA重組：指兩個DNA分子之間，或一種DNA分子的兩個不同部位之間，通過鏈斷裂和片段的交換重接，變化了基因的組合與序列。這種現(xiàn)象可發(fā)生在同一細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，甚至不同物種的DNA分子間。

2、DNA重組技術(shù)：在實驗室內(nèi)，用人工辦法將不同來源的DNA分子拼接成一種重組(recombinant)DNA分子，并將其引入活細(xì)胞內(nèi)，使其大量復(fù)制或體現(xiàn)，這種技術(shù)稱為DNA重組技術(shù)或基因工程