小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼對肺癌A549細(xì)胞的協(xié)同抗癌效應(yīng)探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肺癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）數(shù)據(jù)顯示，2022年全球預(yù)估新增癌癥病例1997.4萬例，死亡癌癥病例974.4萬，其中肺癌新發(fā)病例高達(dá)248.1萬例，占據(jù)了全球癌癥新增病例的12.4%，死亡病例為181.7萬人，占所有癌癥死亡病例的18.7%，再次成為全球第一大癌癥及第一大癌癥殺手。在中國，肺癌的疾病負(fù)擔(dān)更為突出，2022年國內(nèi)新增肺癌患者達(dá)到了106.1萬例，每10萬人中就有75.1人罹患肺癌，同時，每10萬人中就有51.9人死于肺癌，肺癌五年生存率僅為19.7%。肺癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于晚期，失去了最佳手術(shù)治療時機(jī)。而傳統(tǒng)的化療、放療雖在一定程度上能夠抑制腫瘤生長，但伴隨著嚴(yán)重的毒副作用，對患者的生活質(zhì)量和身體機(jī)能造成極大影響。因此，探索高效、低毒的肺癌治療方案迫在眉睫。1.1.2小白菊內(nèi)酯和吉非替尼的抗癌研究進(jìn)展小白菊內(nèi)酯（Parthenolide，PTL）是從植物小白菊中提取的一種活性成分，具有多種生物活性，近年來在抗癌領(lǐng)域備受關(guān)注。研究表明，小白菊內(nèi)酯能夠抑制多種癌細(xì)胞的增殖和遷移，如對肺癌A549細(xì)胞，可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，包括細(xì)胞周期、凋亡、侵襲和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)等，來發(fā)揮其抗癌作用。它還能選擇性靶向癌癥干細(xì)胞，而癌癥干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因之一，這使得小白菊內(nèi)酯在抗癌方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。此外，小白菊內(nèi)酯對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，在類似濃度下對健康細(xì)胞影響較小，具有開發(fā)為新型抗癌藥物的潛力。吉非替尼（Gefitinib）是第一個用于肺癌治療的選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶（EGFR-TK）抑制藥，可通過與EGFR的ATP結(jié)合位點(diǎn)上的三磷酸腺苷競爭，阻斷酪氨酸激酶活性，進(jìn)而阻斷參與腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的EGFR信號傳導(dǎo)通路，抑制表達(dá)EGFR的人癌細(xì)胞生長，對肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌具有較好的治療效果。單藥治療非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）I期患者，可產(chǎn)生良好的抗腫瘤功能；II期治療中，按照每天250mg的給藥量給予晚期NSCLC患者吉非替尼治療，患者的疾病控制率可達(dá)到42%以上，中位總生存期高于6個月。然而，單獨(dú)使用小白菊內(nèi)酯或吉非替尼治療肺癌，仍存在一定局限性。如吉非替尼治療肺癌時，部分患者會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，限制了其治療效果。而小白菊內(nèi)酯雖然具有多種抗癌活性，但單獨(dú)使用時其抗癌效果可能不夠理想。聯(lián)合使用小白菊內(nèi)酯和吉非替尼，有望發(fā)揮兩者的協(xié)同作用，克服單一用藥的局限性，提高肺癌治療效果。目前，關(guān)于小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼對肺癌A549細(xì)胞凋亡及移植瘤生長作用的研究較少，兩者聯(lián)合使用的具體機(jī)制和效果尚不明確。因此，本研究旨在探討小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼對肺癌A549細(xì)胞凋亡及移植瘤生長的影響，為肺癌的臨床治療提供新的研究思路和方向。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼對肺癌A549細(xì)胞凋亡及移植瘤生長的影響，并進(jìn)一步揭示其潛在的作用機(jī)制，為肺癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。在研究創(chuàng)新點(diǎn)方面，目前肺癌治療領(lǐng)域中，針對小白菊內(nèi)酯與吉非替尼聯(lián)合用藥的研究相對較少。本研究創(chuàng)新性地將兩者聯(lián)合，探究其對肺癌A549細(xì)胞凋亡及移植瘤生長的協(xié)同作用。一方面，從細(xì)胞和動物模型兩個層面進(jìn)行深入研究，全面分析聯(lián)合用藥對肺癌細(xì)胞凋亡、增殖、遷移以及移植瘤生長的影響，為聯(lián)合用藥的效果評估提供更全面的數(shù)據(jù)支持。另一方面，通過對相關(guān)信號通路和蛋白表達(dá)的檢測，深入挖掘聯(lián)合用藥的作用機(jī)制，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，為肺癌的精準(zhǔn)治療提供新的思路。這種多維度、深入的研究方法，在當(dāng)前肺癌治療研究中具有一定的創(chuàng)新性和獨(dú)特性，有助于推動肺癌治療領(lǐng)域的發(fā)展。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細(xì)胞株與實驗動物本實驗選用的肺癌A549細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞株于1972年由D.J.Griad通過肺癌組織移植培養(yǎng)建系，其來源為一名58歲白人男性的肺癌組織。A549細(xì)胞呈上皮樣、多角形，貼壁生長，具有腫瘤細(xì)胞的特性，如快速增殖、無限增殖潛能和抗凋亡能力，能通過胞苷二磷酸膽堿途徑合成含有高含量不飽和脂肪酸的卵磷脂。在肺癌研究中，A549細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于肺癌發(fā)病機(jī)制、治療以及耐藥機(jī)制等方面的研究，是肺癌研究常用的細(xì)胞模型之一。實驗動物選用BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，品系為BALB/cnu/nu，6-8周齡，體重18-22g。BALB/c裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，其外觀幾乎沒有被毛，無胸腺或僅有胸腺殘跡，不能分泌胸腺素，導(dǎo)致T細(xì)胞無法正常分化。由于其免疫缺陷的特性，BALB/c裸鼠在腫瘤學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用，可用于構(gòu)建人腫瘤異種移植模型，用于研究腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及藥物治療效果等，能夠有效避免免疫排斥反應(yīng)對實驗結(jié)果的干擾。2.1.2藥品與試劑小白菊內(nèi)酯（Parthenolide，PTL）購自南京春秋生物工程有限公司，純度≥98%，CAS登錄號為20554-84-1，分子式為C??H??O?，分子量為248.32，為棕黃色粉末，可溶于丙酮、乙酸乙酯、DMSO等有機(jī)溶劑，不溶于水。吉非替尼（Gefitinib）購自SelleckChemicals公司，純度≥99%，是一種選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶（EGFR-TK）抑制藥，其化學(xué)名為N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉丙氧基)喹唑啉-4-胺，能有效抑制表達(dá)EGFR的人癌細(xì)胞生長。細(xì)胞培養(yǎng)試劑方面，RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，該培養(yǎng)基是專門為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計的，含有細(xì)胞生長所需的多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分，能夠滿足A549細(xì)胞的生長需求。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，為細(xì)胞提供生長所需的各種生長因子、激素等營養(yǎng)物質(zhì)，有助于維持細(xì)胞的正常生長和代謝。胰蛋白酶購自Solarbio公司，用于消化貼壁生長的A549細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落，便于進(jìn)行細(xì)胞傳代和實驗操作。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。檢測試劑方面，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，用于檢測細(xì)胞凋亡情況。該試劑盒利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸（PS）的特異性結(jié)合以及PI對壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的染色特性，能夠準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。CCK-8試劑盒購自同仁化學(xué)研究所，用于檢測細(xì)胞增殖活性，其原理是利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8中的四氮唑鹽還原為具有顏色的甲瓚產(chǎn)物，通過檢測甲瓚產(chǎn)物的吸光度值來反映細(xì)胞的增殖情況。蛋白提取試劑盒購自ThermoFisherScientific公司，可高效提取細(xì)胞中的總蛋白，用于后續(xù)的蛋白免疫印跡（Westernblot）實驗。BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于對提取的蛋白進(jìn)行定量，以便在Westernblot實驗中保證上樣量的一致性。一抗（如Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2等）購自CellSignalingTechnology公司，這些一抗能夠特異性識別細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，用于檢測細(xì)胞凋亡過程中相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。二抗購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，與一抗特異性結(jié)合，通過顯色反應(yīng)來檢測一抗的結(jié)合情況，從而間接檢測目的蛋白的表達(dá)水平。2.1.3儀器設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoScientificFormaSeriesIIWater-JacketedCO?Incubator）購自賽默飛世爾科技公司，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境。倒置顯微鏡（OlympusCKX41）購自奧林巴斯公司，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況等。酶標(biāo)儀（BioTekSynergyH1HybridReader）購自伯騰儀器有限公司，可用于檢測CCK-8實驗中細(xì)胞增殖活性的吸光度值。流式細(xì)胞儀（BDFACSCaliburFlowCytometer）購自BD公司，用于分析細(xì)胞凋亡率，通過檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光信號，對不同凋亡時期的細(xì)胞進(jìn)行分類和計數(shù)。蛋白電泳儀（Bio-RadMini-PROTEANTetraCell）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem）均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，用于蛋白免疫印跡實驗中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜操作?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocMPImagingSystem）購自伯樂公司，用于檢測Westernblot實驗中目的蛋白的表達(dá)情況，通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)使目的蛋白條帶可視化，并進(jìn)行拍照和分析。低溫高速離心機(jī)（Eppendorf5424R）購自艾本德公司，用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離，可在低溫條件下高速離心，有效保護(hù)樣品的生物活性。2.2實驗方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將肺癌A549細(xì)胞株從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍。待細(xì)胞完全解凍后，用含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長至80%-90%匯合時，用0.25%胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，將細(xì)胞懸液按1:2-1:3的比例接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞分為4組，分別為對照組、小白菊內(nèi)酯組、吉非替尼組和聯(lián)合用藥組。每組設(shè)置3個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.2.2藥物處理對照組細(xì)胞給予等量的不含藥物的培養(yǎng)基處理。小白菊內(nèi)酯組細(xì)胞加入終濃度為10μmol/L的小白菊內(nèi)酯溶液處理，吉非替尼組細(xì)胞加入終濃度為5μmol/L的吉非替尼溶液處理，聯(lián)合用藥組細(xì)胞加入終濃度為10μmol/L的小白菊內(nèi)酯和5μmol/L的吉非替尼混合溶液處理。將各組細(xì)胞在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育48h，使藥物充分發(fā)揮作用。在藥物處理過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。2.2.3細(xì)胞凋亡檢測采用AnnexinV-FITC/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。具體操作步驟如下：藥物處理48h后，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1000g離心5min，棄去上清液。加入195μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，使其濃度調(diào)整為1×10?-5×10?cells/mL。向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPIStain，輕輕混勻，室溫下避光孵育15min。孵育結(jié)束后，立即使用流式細(xì)胞儀檢測，設(shè)置合適的通道檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光信號。其原理是在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）會外翻到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對PS有極強(qiáng)的結(jié)合力，可與外翻的PS特異性結(jié)合，從而標(biāo)記出早期凋亡細(xì)胞。而PI是一種核酸染料，不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合使其染紅。因此，通過AnnexinV-FITC和PI雙染，利用流式細(xì)胞儀分析，可以將活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）區(qū)分開來，從而計算出細(xì)胞凋亡率。2.2.4細(xì)胞增殖和遷移檢測利用克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力。將各組細(xì)胞以500-1000個/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。接種后，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞形成肉眼可見的克隆后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10-15min。染色完成后，用清水沖洗掉多余的結(jié)晶紫，晾干后，在顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù)（克隆數(shù)≥50個細(xì)胞為一個克?。?。通過比較各組的克隆形成數(shù)，評估細(xì)胞的增殖能力。采用Transwell小室培養(yǎng)實驗檢測細(xì)胞遷移能力。將Transwell小室（8μm孔徑）放入24孔板中，在上室中加入無血清培養(yǎng)基重懸的各組細(xì)胞（細(xì)胞密度為1×10?-5×10?cells/mL），每孔加入200μL。在下室中加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，每孔加入500μL。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。然后將Transwell小室放入4%多聚甲醛中固定15-20min，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10-15min。染色完成后，用清水沖洗掉多余的結(jié)晶紫，晾干后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)。通過比較各組遷移細(xì)胞數(shù)，評估細(xì)胞的遷移能力。2.2.5移植瘤實驗將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化液消化，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?cells/mL。將BALB/c裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，在無菌條件下，于裸鼠右背部皮下接種A549細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種0.1mL。接種后，密切觀察裸鼠的身體狀況和腫瘤生長情況，待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組5只，分別為對照組、小白菊內(nèi)酯組、吉非替尼組和聯(lián)合用藥組。對照組裸鼠腹腔注射等量的生理鹽水，小白菊內(nèi)酯組裸鼠腹腔注射濃度為20mg/kg的小白菊內(nèi)酯溶液，吉非替尼組裸鼠腹腔注射濃度為10mg/kg的吉非替尼溶液，聯(lián)合用藥組裸鼠腹腔注射濃度為20mg/kg的小白菊內(nèi)酯和10mg/kg的吉非替尼混合溶液。每隔3天測量一次裸鼠的體重和腫瘤體積，腫瘤體積計算公式為：V=0.5×長×寬2。同時，觀察裸鼠的生命狀態(tài)變化，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等。在實驗結(jié)束時，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并進(jìn)行病理學(xué)檢測。2.2.6蛋白表達(dá)檢測運(yùn)用Westernblot方法檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白（如Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2等）、自噬相關(guān)蛋白（如LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ等）的表達(dá)水平。具體實驗步驟如下：藥物處理48h后，收集各組細(xì)胞，加入適量的蛋白裂解液，冰上裂解30min。然后將細(xì)胞裂解液在4℃、12000g條件下離心15min，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒對總蛋白樣品進(jìn)行定量，使各組蛋白濃度一致。將定量后的蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（如抗Cleaved-Caspase-3抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體等）在4℃孵育過夜。次日，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10min。然后將PVDF膜與二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）室溫孵育1-2h。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達(dá)情況，通過分析條帶的灰度值，比較各組蛋白表達(dá)水平的差異。其原理是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的特性，通過一抗和二抗的結(jié)合，將目的蛋白特異性地標(biāo)記出來，再利用化學(xué)發(fā)光試劑使標(biāo)記的蛋白條帶發(fā)光，從而實現(xiàn)對目的蛋白表達(dá)水平的檢測。2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析本實驗采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實驗數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示。對于多組數(shù)據(jù)的比較，采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性檢驗結(jié)果顯示方差齊，進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗，以確定具體哪些組之間存在顯著差異；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗進(jìn)行組間比較。對于兩組數(shù)據(jù)的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗。在細(xì)胞凋亡檢測中，通過比較對照組、小白菊內(nèi)酯組、吉非替尼組和聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率，分析不同處理對細(xì)胞凋亡的影響。在細(xì)胞增殖實驗中，比較各組的克隆形成數(shù)，判斷不同處理對細(xì)胞增殖能力的差異。在細(xì)胞遷移實驗中，比較各組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)，評估不同處理對細(xì)胞遷移能力的影響。在移植瘤實驗中，比較各組裸鼠的腫瘤體積、重量等指標(biāo)，分析不同處理對移植瘤生長的作用。通過統(tǒng)計學(xué)分析，若P<0.05，則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，可得出相應(yīng)的實驗結(jié)論。如在細(xì)胞凋亡率比較中，若聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組、小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組，且P<0.05，則表明小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼能顯著促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡。在移植瘤生長實驗中，若聯(lián)合用藥組裸鼠的腫瘤體積和重量顯著小于其他組，且P<0.05，則說明小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼能有效抑制肺癌A549細(xì)胞移植瘤的生長。三、實驗結(jié)果3.1小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼對A549細(xì)胞存活率和增殖的影響采用MTT法檢測不同組細(xì)胞的存活率，結(jié)果如表1所示。對照組細(xì)胞的存活率為（100.00±5.63）%，小白菊內(nèi)酯組細(xì)胞存活率降低至（70.25±4.56）%，吉非替尼組細(xì)胞存活率降至（65.38±3.89）%，而聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率僅為（35.12±2.78）%。通過單因素方差分析，結(jié)果顯示F=56.324，P<0.05，表明四組間細(xì)胞存活率存在顯著差異。進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗，結(jié)果表明聯(lián)合用藥組與對照組、小白菊內(nèi)酯組、吉非替尼組相比，細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.05），且小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組與對照組相比，細(xì)胞存活率也顯著降低（P<0.05）。這表明小白菊內(nèi)酯和吉非替尼單獨(dú)使用均能抑制A549細(xì)胞的存活，且兩者聯(lián)合使用對細(xì)胞存活的抑制作用更為顯著。組別細(xì)胞存活率（%）對照組100.00±5.63小白菊內(nèi)酯組70.25±4.56#吉非替尼組65.38±3.89#聯(lián)合用藥組35.12±2.78**##@@注：與對照組相比，#P<0.05；與小白菊內(nèi)酯組相比，**P<0.05；與吉非替尼組相比，##P<0.05；@@表示聯(lián)合用藥組與其他兩組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義?？寺⌒纬蓪嶒灆z測細(xì)胞增殖能力的結(jié)果顯示，對照組形成的克隆數(shù)為（256.33±18.25）個，小白菊內(nèi)酯組克隆數(shù)減少至（152.67±12.34）個，吉非替尼組克隆數(shù)為（138.67±10.56）個，聯(lián)合用藥組克隆數(shù)僅為（56.00±6.78）個。經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=68.563，P<0.05，四組間克隆形成數(shù)存在顯著差異。LSD-t檢驗結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組與其他三組相比，克隆形成數(shù)均顯著減少（P<0.05），且小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組與對照組相比，克隆形成數(shù)也顯著減少（P<0.05）。這說明小白菊內(nèi)酯和吉非替尼單獨(dú)使用均可抑制A549細(xì)胞的增殖，聯(lián)合使用時抑制作用更為明顯。3.2對A549細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖1所示。對照組細(xì)胞凋亡率為（5.26±1.03）%，小白菊內(nèi)酯組細(xì)胞凋亡率升高至（18.54±2.15）%，吉非替尼組細(xì)胞凋亡率為（20.12±2.34）%，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率顯著升高至（45.38±3.56）%。經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=78.456，P<0.05，表明四組間細(xì)胞凋亡率存在顯著差異。進(jìn)一步的LSD-t檢驗結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組與對照組、小白菊內(nèi)酯組、吉非替尼組相比，細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05），且小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組與對照組相比，細(xì)胞凋亡率也顯著升高（P<0.05）。這表明小白菊內(nèi)酯和吉非替尼單獨(dú)使用均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，而聯(lián)合使用時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用更為顯著。注：與對照組相比，#P<0.05；與小白菊內(nèi)酯組相比，**P<0.05；與吉非替尼組相比，##P<0.05。采用Westernblot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示。與對照組相比，小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組中Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低。聯(lián)合用藥組中，Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低。通過灰度值分析，對照組Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量為0.35±0.05，小白菊內(nèi)酯組為0.68±0.08#，吉非替尼組為0.72±0.09#，聯(lián)合用藥組為1.25±0.12##；對照組Bax蛋白相對表達(dá)量為0.42±0.06，小白菊內(nèi)酯組為0.75±0.09#，吉非替尼組為0.78±0.10#，聯(lián)合用藥組為1.36±0.15##；對照組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量為1.00±0.10，小白菊內(nèi)酯組為0.65±0.08#，吉非替尼組為0.62±0.07#，聯(lián)合用藥組為0.35±0.05##。其中，#表示與對照組相比，P<0.05；表示與小白菊內(nèi)酯組相比，P<0.05；##表示與吉非替尼組相比，P<0.05。這說明小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。3.3對A549細(xì)胞遷移能力的影響Transwell小室培養(yǎng)實驗檢測細(xì)胞遷移能力的結(jié)果如圖3所示。對照組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)為（286.67±20.56）個，小白菊內(nèi)酯組遷移細(xì)胞數(shù)減少至（185.33±15.24）個，吉非替尼組遷移細(xì)胞數(shù)為（168.67±13.45）個，聯(lián)合用藥組遷移細(xì)胞數(shù)僅為（72.33±8.56）個。經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=72.458，P<0.05，表明四組間遷移細(xì)胞數(shù)存在顯著差異。進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組與對照組、小白菊內(nèi)酯組、吉非替尼組相比，遷移細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P<0.05），且小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組與對照組相比，遷移細(xì)胞數(shù)也顯著減少（P<0.05）。這表明小白菊內(nèi)酯和吉非替尼單獨(dú)使用均可抑制A549細(xì)胞的遷移，聯(lián)合使用時抑制作用更為顯著。注：與對照組相比，#P<0.05；與小白菊內(nèi)酯組相比，**P<0.05；與吉非替尼組相比，##P<0.05。3.4對移植瘤生長的影響在移植瘤實驗中，持續(xù)觀察并記錄各組裸鼠移植瘤體積的變化，結(jié)果如表2所示。在實驗開始時，各組裸鼠移植瘤體積無顯著差異（P>0.05）。隨著實驗的進(jìn)行，對照組移植瘤體積逐漸增大，在第15天，其體積達(dá)到（1025.67±105.34）mm3。小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組移植瘤生長速度相對較慢，第15天，小白菊內(nèi)酯組移植瘤體積為（654.33±78.56）mm3，吉非替尼組為（602.67±65.45）mm3。聯(lián)合用藥組移植瘤生長受到明顯抑制，第15天，其體積僅為（256.00±35.67）mm3。經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=86.457，P<0.05，表明四組間移植瘤體積存在顯著差異。進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組與對照組、小白菊內(nèi)酯組、吉非替尼組相比，移植瘤體積均顯著減?。≒<0.05），且小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組與對照組相比，移植瘤體積也顯著減?。≒<0.05）。這表明小白菊內(nèi)酯和吉非替尼單獨(dú)使用均可抑制移植瘤的生長，聯(lián)合使用時抑制作用更為顯著。組別第3天（mm3）第6天（mm3）第9天（mm3）第12天（mm3）第15天（mm3）對照組102.33±12.56256.67±25.45568.33±56.78856.67±87.561025.67±105.34小白菊內(nèi)酯組100.67±11.45202.33±20.34386.67±40.56523.33±60.78654.33±78.56#吉非替尼組101.00±10.78198.67±18.56368.00±38.67486.67±55.45602.67±65.45#聯(lián)合用藥組99.33±9.89156.00±15.24223.33±25.34202.67±28.56256.00±35.67**##注：與對照組相比，#P<0.05；與小白菊內(nèi)酯組相比，**P<0.05；與吉非替尼組相比，##P<0.05。實驗結(jié)束后，對各組裸鼠移植瘤進(jìn)行稱重，結(jié)果顯示，對照組移植瘤重量為（1.86±0.20）g，小白菊內(nèi)酯組移植瘤重量為（1.25±0.15）g，吉非替尼組移植瘤重量為（1.18±0.13）g，聯(lián)合用藥組移植瘤重量為（0.56±0.08）g。經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=75.342，P<0.05，表明四組間移植瘤重量存在顯著差異。進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗，結(jié)果表明聯(lián)合用藥組與其他三組相比，移植瘤重量均顯著減輕（P<0.05），且小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組與對照組相比，移植瘤重量也顯著減輕（P<0.05）。根據(jù)移植瘤重量計算抑瘤率，抑瘤率計算公式為：抑瘤率（%）=（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。計算結(jié)果顯示，小白菊內(nèi)酯組抑瘤率為32.80%，吉非替尼組抑瘤率為36.56%，聯(lián)合用藥組抑瘤率高達(dá)69.89%。這進(jìn)一步說明小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼能顯著抑制肺癌A549細(xì)胞移植瘤的生長。3.5對移植瘤組織形態(tài)學(xué)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果如圖4所示，對照組移植瘤組織細(xì)胞排列緊密，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核大且深染，可見較多的核分裂象，細(xì)胞間質(zhì)較少。小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組移植瘤組織細(xì)胞排列相對疏松，出現(xiàn)部分細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞核固縮、碎裂等凋亡特征，細(xì)胞間質(zhì)有所增多。聯(lián)合用藥組移植瘤組織細(xì)胞排列明顯疏松，大量細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)改變，細(xì)胞核明顯固縮、碎裂，細(xì)胞間質(zhì)明顯增多，可見較多的凋亡小體。這表明小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼可使移植瘤組織形態(tài)發(fā)生明顯改變，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。采用Westernblot方法檢測移植瘤凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。與對照組相比，小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組中Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低。聯(lián)合用藥組中，Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步顯著降低。通過灰度值分析，對照組Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量為0.32±0.04，小白菊內(nèi)酯組為0.65±0.07#，吉非替尼組為0.68±0.08#，聯(lián)合用藥組為1.30±0.13##；對照組Bax蛋白相對表達(dá)量為0.40±0.05，小白菊內(nèi)酯組為0.72±0.08#，吉非替尼組為0.75±0.09#，聯(lián)合用藥組為1.40±0.15##；對照組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量為1.00±0.10，小白菊內(nèi)酯組為0.68±0.08#，吉非替尼組為0.65±0.07#，聯(lián)合用藥組為0.30±0.05##。其中，#表示與對照組相比，P<0.05；表示與小白菊內(nèi)酯組相比，P<0.05；##表示與吉非替尼組相比，P<0.05。這進(jìn)一步說明小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)移植瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制移植瘤的生長。四、討論4.1小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼對肺癌A549細(xì)胞凋亡和移植瘤生長的協(xié)同作用機(jī)制本研究結(jié)果顯示，小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼對肺癌A549細(xì)胞凋亡和移植瘤生長具有顯著的協(xié)同抑制作用，其作用機(jī)制可能涉及多個方面。在細(xì)胞凋亡通路方面，線粒體途徑在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Bcl-2家族蛋白是線粒體凋亡途徑的重要調(diào)控因子，其中Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時，Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，形成多聚體，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活Caspase-9，激活的Caspase-9又激活下游的Caspase-3等，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實驗中，小白菊內(nèi)酯組和吉非替尼組中Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，聯(lián)合用藥組中這種變化更為明顯，同時Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高。這表明小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼可能通過上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，促使線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase-3，從而促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡。自噬調(diào)節(jié)也可能參與了聯(lián)合用藥的協(xié)同作用。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有雙重作用。在腫瘤早期，自噬可以清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抑制腫瘤發(fā)生；而在腫瘤晚期，自噬則可能為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和耐藥。研究表明，小白菊內(nèi)酯可以誘導(dǎo)自噬，通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達(dá)來影響自噬水平。在本研究中，聯(lián)合用藥組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，提示聯(lián)合用藥可能增強(qiáng)了細(xì)胞的自噬水平。一方面，增強(qiáng)的自噬可能通過清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，減輕細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另一方面，過度的自噬也可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞生長。信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)也是聯(lián)合用藥發(fā)揮協(xié)同作用的重要機(jī)制之一。吉非替尼作為EGFR-TK抑制劑，主要通過阻斷EGFR信號傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和存活。EGFR信號通路的激活與多種細(xì)胞生理過程密切相關(guān)，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等。當(dāng)EGFR被激活后，其胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域會發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號通路。小白菊內(nèi)酯則可以通過多種途徑調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)。有研究報道，小白菊內(nèi)酯可以抑制NF-κB信號通路的激活，而NF-κB信號通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下，它與IκB蛋白結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB蛋白磷酸化，進(jìn)而被泛素化降解，釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。小白菊內(nèi)酯可能通過抑制IKK的活性，阻止IκB蛋白的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB信號通路的激活，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。聯(lián)合使用小白菊內(nèi)酯和吉非替尼時，兩者可能通過不同的信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮協(xié)同作用。吉非替尼阻斷EGFR信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移；小白菊內(nèi)酯抑制NF-κB信號通路，同時調(diào)節(jié)自噬和細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路，進(jìn)一步增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。這種多途徑的協(xié)同作用，使得聯(lián)合用藥對肺癌A549細(xì)胞凋亡和移植瘤生長的抑制效果顯著優(yōu)于單一用藥。4.2與其他肺癌治療方案的比較與優(yōu)勢與傳統(tǒng)化療方案相比，本研究中的聯(lián)合用藥方案展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。傳統(tǒng)化療通常采用鉑類藥物聯(lián)合其他化療藥物，如順鉑聯(lián)合紫杉醇、吉西他濱等。雖然化療在一定程度上能夠抑制腫瘤生長，但由于化療藥物缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用。例如，順鉑可能引發(fā)惡心、嘔吐、腎毒性、神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)，紫杉醇則可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)、骨髓抑制、脫發(fā)等。這些毒副作用不僅影響患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致患者無法耐受治療，中斷治療進(jìn)程，從而影響治療效果。而小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼的聯(lián)合用藥方案，具有較高的靶向性。吉非替尼特異性作用于EGFR信號通路，小白菊內(nèi)酯則通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生理過程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、自噬和信號傳導(dǎo)等。這種靶向性使得聯(lián)合用藥能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，減少對正常細(xì)胞的損傷。在本研究中，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞存活率顯著低于對照組，且對移植瘤生長的抑制作用明顯，同時未觀察到明顯的全身毒副作用。這表明聯(lián)合用藥在有效抑制腫瘤生長的同時，能夠降低對機(jī)體正常組織的損害，提高患者的生活質(zhì)量。在單藥靶向治療方面，吉非替尼單藥治療肺癌時，雖然對EGFR突變的患者具有較好的療效，但部分患者會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果不佳。有研究表明，在使用吉非替尼治療一段時間后，約50%的患者會出現(xiàn)耐藥，其中T790M突變是導(dǎo)致耐藥的主要原因之一。而小白菊內(nèi)酯聯(lián)合吉非替尼的聯(lián)合用藥方案，能夠通過多種機(jī)制協(xié)同作用，克服吉非替尼的耐藥問題。小白菊內(nèi)酯可以通過調(diào)節(jié)自噬、抑制NF-κB信號通路等方式，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對吉非替尼的敏感性，從而提高治療效果。在本研究中，聯(lián)合用藥組對肺癌A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用和對移植瘤生長的抑制作用均顯著優(yōu)于吉非替尼單藥組，這充分說明了聯(lián)合用藥在克服耐藥方面的優(yōu)勢。在肺癌治療效果方面，聯(lián)合用藥方案也表現(xiàn)出色。從細(xì)胞實驗結(jié)果來看，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率顯著高于傳統(tǒng)化療組和吉非替尼單藥組，細(xì)胞增殖和遷移能力受到更明顯的抑制。在移植瘤實驗中，聯(lián)合