小鵝瘟腸道損傷機(jī)制的研究與VP3基因重組腺病毒的構(gòu)建一、研究背景小鵝瘟（Gooseparvovirus,GPV）是由細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的鵝細(xì)小病毒引起的雛鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性敗血性傳染病。該病主要侵害3-20日齡雛鵝，發(fā)病率和死亡率極高，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。GPV感染后，腸道是主要的靶器官，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷，但其具體的腸道損傷機(jī)制尚不明確。同時(shí)，構(gòu)建VP3基因重組腺病毒有望開(kāi)發(fā)出高效的小鵝瘟新型疫苗，為防控該病提供新的策略。二、小鵝瘟腸道損傷機(jī)制的研究（一）病毒感染模型的建立選用1日齡健康雛鵝，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組雛鵝經(jīng)口服途徑接種適量的GPV病毒液，對(duì)照組雛鵝給予等量的無(wú)菌生理鹽水。接種后，密切觀察雛鵝的臨床表現(xiàn)，如精神狀態(tài)、采食情況、腹瀉等癥狀。（二）腸道組織病理學(xué)觀察在接種病毒后的不同時(shí)間點(diǎn)（如1天、3天、5天、7天），分別從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中隨機(jī)選取一定數(shù)量的雛鵝進(jìn)行安樂(lè)死。迅速采集腸道組織（包括十二指腸、空腸、回腸），用4%多聚甲醛固定。經(jīng)過(guò)脫水、透明、石蠟包埋等常規(guī)組織學(xué)處理后，制作5μm厚的切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察腸道組織的病理變化，如腸絨毛的完整性、上皮細(xì)胞的脫落情況、固有層的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。（三）細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用TUNEL（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）法檢測(cè)腸道組織中的細(xì)胞凋亡情況。按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，對(duì)腸道切片進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。計(jì)算凋亡指數(shù)（AI），即凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，分析病毒感染對(duì)腸道細(xì)胞凋亡的影響。（四）炎癥因子的檢測(cè)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)腸道組織中炎癥因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α等）mRNA的表達(dá)水平。提取腸道組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算炎癥因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)腸道組織勻漿中炎癥因子的蛋白含量，進(jìn)一步明確病毒感染引發(fā)的腸道炎癥反應(yīng)機(jī)制。（五）氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定檢測(cè)腸道組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，如丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性等。采用相應(yīng)的試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟，對(duì)腸道組織勻漿進(jìn)行測(cè)定。分析病毒感染是否導(dǎo)致腸道組織氧化應(yīng)激失衡，以及氧化應(yīng)激在腸道損傷中的作用。三、VP3基因重組腺病毒的構(gòu)建（一）VP3基因的克隆病毒基因組提取：從感染GPV的鵝胚尿囊液中提取病毒基因組DNA。采用酚-氯仿抽提法，具體步驟如下：取適量尿囊液，加入等體積的細(xì)胞裂解液，混勻后，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）混合液，振蕩混勻，12000rpm離心10min。吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）混合液，再次振蕩混勻，12000rpm離心10min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新管，加入1/10體積的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min。12000rpm離心10min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，晾干后，用適量的TE緩沖液溶解DNA。PCR擴(kuò)增VP3基因：根據(jù)GenBank中已發(fā)表的GPVVP3基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物：5'-[引入合適的酶切位點(diǎn)]--3'；下游引物：5'-[引入合適的酶切位點(diǎn)]--3'。以提取的病毒基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：模板DNA1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，10×PCRBuffer5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，加ddH?O至50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切取目的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化。（二）重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建酶切與連接：將回收的VP3基因片段和腺病毒穿梭質(zhì)粒（如pAdTrack-CMV）分別用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切體系：DNA1μg，10×Buffer2μL，限制性?xún)?nèi)切酶1（10U/μL）0.5μL，限制性?xún)?nèi)切酶2（10U/μL）0.5μL，加ddH?O至20μL。37℃酶切2-3h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別回收目的片段。將酶切后的VP3基因片段與腺病毒穿梭質(zhì)粒用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接體系：VP3基因片段3μL，腺病毒穿梭質(zhì)粒1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase（3U/μL）1μL，加ddH?O至10μL。16℃連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化與篩選：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入900μLLB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。取適量菌液涂布于含卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定，篩選出陽(yáng)性重組穿梭質(zhì)粒。（三）重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建同源重組：將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒（如pAdEasy-1）共轉(zhuǎn)化至BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組。取1μg重組穿梭質(zhì)粒和0.1μg腺病毒骨架質(zhì)?；旌?，加入到100μLBJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，電穿孔轉(zhuǎn)化（參數(shù)：25μF，200Ω，2.5kV）。電擊后迅速加入1mLSOC液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。取適量菌液涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。篩選與鑒定：挑取單菌落接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒DNA，用PacI酶進(jìn)行線性化酶切鑒定。陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切后，會(huì)產(chǎn)生預(yù)期大小的片段。將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行大量提取和純化，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。（四）重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增轉(zhuǎn)染293細(xì)胞：將293細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，按照脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。病毒包裝與觀察：轉(zhuǎn)染后，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。一般在轉(zhuǎn)染后3-5天，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)CPE，如細(xì)胞變圓、脫落等。當(dāng)70%-80%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為第一代重組腺病毒（rAd-VP3）。病毒擴(kuò)增：將第一代重組腺病毒接種到長(zhǎng)滿(mǎn)單層的293細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE后，反復(fù)凍融細(xì)胞3次，離心收集上清，即為第二代重組腺病毒。按照同樣的方法進(jìn)行多次擴(kuò)增，獲得高滴度的重組腺病毒。（五）重組腺病毒的鑒定PCR鑒定：提取重組腺病毒基因組DNA，以其為模板，用VP3基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶，以驗(yàn)證VP3基因是否成功整合到腺病毒基因組中。westernblot鑒定：將重組腺病毒感染293細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用抗VP3蛋白的特異性抗體進(jìn)行孵育，然后用HRP標(biāo)記的二抗孵育。最后用化學(xué)發(fā)光底物顯色，觀察是否出現(xiàn)特異性條帶，以確定VP3蛋白是否在重組腺病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)。病毒滴度測(cè)定：