小鼠慢性應激模型下海馬tau蛋白磷酸化對線粒體軸漿運輸?shù)挠绊懱骄恳?、緒論1.1研究背景與意義抑郁癥作為一種常見的精神障礙，嚴重影響著全球范圍內(nèi)大量人群的身心健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約有3.5億抑郁癥患者，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，預計到2030年將成為全球疾病負擔排名第一的疾病。抑郁癥不僅給患者本人帶來極大的痛苦，導致情緒低落、興趣減退、自責自罪、甚至出現(xiàn)自殺傾向等嚴重后果，還對家庭和社會造成沉重的經(jīng)濟負擔和社會壓力。然而，盡管經(jīng)過多年的研究，抑郁癥的發(fā)病機制至今仍未完全明確，這嚴重阻礙了有效治療方法和藥物的研發(fā)。在探索抑郁癥發(fā)病機制的過程中，神經(jīng)系統(tǒng)的研究成為關鍵領域。線粒體作為細胞的能量工廠，在神經(jīng)元的正常功能維持中起著不可或缺的作用。線粒體的軸漿運輸是一個高度有序且復雜的過程，它負責將線粒體從細胞體運輸?shù)捷S突末梢，以滿足神經(jīng)元不同部位對能量的需求。在抑郁癥患者中，已有研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙，包括線粒體的形態(tài)、分布和功能異常，這可能與線粒體軸漿運輸?shù)氖軗p密切相關。而線粒體軸漿運輸?shù)漠惓Ｓ挚赡苓M一步影響神經(jīng)元的能量供應，導致神經(jīng)傳遞和突觸可塑性的改變，最終引發(fā)抑郁癥的相關癥狀。tau蛋白是一種主要存在于神經(jīng)元中的微管相關蛋白，在正常情況下，它能夠與微管蛋白結合，促進微管的組裝和穩(wěn)定，維持神經(jīng)元的正常結構和功能，尤其是在軸突內(nèi)的物質運輸中發(fā)揮重要作用。然而，當tau蛋白發(fā)生異常磷酸化時，其與微管的結合能力顯著下降，導致微管解聚，進而破壞神經(jīng)元的細胞骨架結構和軸漿運輸功能。越來越多的研究表明，tau蛋白磷酸化異常與多種神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病等密切相關。在抑郁癥的研究中，tau蛋白磷酸化的變化及其對線粒體軸漿運輸?shù)臐撛谟绊懼饾u受到關注，但目前相關研究仍相對較少，其具體機制尚不清楚。為了深入研究tau蛋白磷酸化在抑郁癥發(fā)病機制中的作用以及其對線粒體軸漿運輸?shù)挠绊?，小鼠慢性應激模型成為一種重要的研究工具。通過對小鼠施加長期的、不可預測的溫和應激刺激，如禁食、禁水、晝夜顛倒、潮濕環(huán)境、束縛等，可以模擬人類日常生活中所面臨的慢性應激狀態(tài)，誘導小鼠產(chǎn)生類似人類抑郁癥的行為學改變，如快感缺失、活動減少、社交回避等。利用這一模型，能夠在動物水平上研究抑郁癥的發(fā)病機制，為揭示tau蛋白磷酸化與線粒體軸漿運輸之間的關聯(lián)提供有力的實驗依據(jù)。本研究聚焦于小鼠慢性應激模型海馬中tau蛋白磷酸化及其對線粒體軸漿運輸?shù)挠绊?，具有重要的理論和實際意義。從理論方面來看，有助于進一步揭示抑郁癥的發(fā)病機制，豐富我們對神經(jīng)系統(tǒng)在抑郁癥中作用的認識，為神經(jīng)科學領域的理論發(fā)展提供新的見解。通過深入研究tau蛋白磷酸化與線粒體軸漿運輸之間的相互關系，可以更好地理解神經(jīng)元在慢性應激條件下的病理生理變化，為抑郁癥的早期診斷和干預提供潛在的生物標志物和治療靶點。從實際應用角度出發(fā)，對開發(fā)新型抗抑郁藥物和治療方法具有重要的指導意義。目前臨床上常用的抗抑郁藥物存在起效慢、療效有限、副作用大等問題，通過揭示tau蛋白磷酸化和線粒體軸漿運輸在抑郁癥中的關鍵作用，有望為研發(fā)更加安全、有效的抗抑郁藥物提供新的方向，從而改善抑郁癥患者的治療效果和生活質量，減輕社會和家庭的負擔。1.2抑郁癥病因假說抑郁癥的病因復雜，涉及遺傳、神經(jīng)生化、神經(jīng)內(nèi)分泌、心理社會等多個方面，目前尚無統(tǒng)一的定論，存在多種假說。單胺類遞質缺乏假說：該假說認為，抑郁癥的發(fā)生與大腦中某些單胺類神經(jīng)遞質，如5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）的水平降低密切相關。5-HT在情緒調節(jié)、睡眠、食欲等生理過程中發(fā)揮著關鍵作用。當5-HT水平下降時，會導致情緒低落、焦慮、睡眠障礙等癥狀。研究表明，大多數(shù)抗抑郁藥物通過抑制5-HT的再攝取，增加突觸間隙中5-HT的濃度，從而改善抑郁癥狀。NE能神經(jīng)元參與調節(jié)覺醒、注意力和情緒等，NE水平的降低可能導致患者出現(xiàn)動力不足、興趣減退等表現(xiàn)。DA與獎賞系統(tǒng)和動機相關，其功能異?？赡芤l(fā)快感缺失和動機缺乏。雖然單胺類遞質缺乏假說得到了許多臨床研究和藥物治療效果的支持，但它無法解釋所有抑郁癥患者的發(fā)病機制，且部分患者對傳統(tǒng)的單胺類遞質調節(jié)藥物反應不佳，這表明抑郁癥的發(fā)病機制可能更為復雜。神經(jīng)內(nèi)分泌假說：此假說強調下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能失調在抑郁癥發(fā)病中的重要作用。在正常情況下，當機體受到應激刺激時，HPA軸被激活，促使腎上腺皮質分泌皮質醇，以應對壓力。然而，長期處于應激狀態(tài)或遺傳因素等可能導致HPA軸的負反饋調節(jié)機制失靈，使得皮質醇持續(xù)高水平分泌。高濃度的皮質醇對海馬等腦區(qū)的神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，損傷神經(jīng)元的結構和功能，導致神經(jīng)發(fā)生減少、突觸可塑性改變以及神經(jīng)遞質系統(tǒng)紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者中約有50%-70%存在HPA軸功能異常，表現(xiàn)為血漿皮質醇水平升高、地塞米松抑制試驗（DST）不被抑制等。此外，下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸和下丘腦-垂體-生長激素（HPGH）軸等神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的異常也與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展相關，但具體機制尚未完全明確。神經(jīng)內(nèi)分泌假說為抑郁癥的研究提供了新的視角，但它也只是部分解釋了抑郁癥的發(fā)病原因，不能涵蓋抑郁癥的所有病理生理過程。神經(jīng)可塑性假說：神經(jīng)可塑性是指神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育過程中和成年期受內(nèi)、外環(huán)境刺激時，其結構和功能所發(fā)生的適應性變化。神經(jīng)可塑性假說認為，抑郁癥患者存在神經(jīng)可塑性受損，表現(xiàn)為海馬、前額葉皮質等腦區(qū)的神經(jīng)元萎縮、樹突棘密度減少、神經(jīng)發(fā)生降低以及神經(jīng)營養(yǎng)因子表達異常。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是一種對神經(jīng)元的存活、生長、分化和突觸可塑性起重要調節(jié)作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子。在抑郁癥患者中，BDNF的表達水平顯著降低，這可能導致神經(jīng)元的存活和修復能力下降，影響神經(jīng)回路的正常功能?？挂钟羲幬锖托睦碇委煹雀深A措施可以通過上調BDNF的表達，促進神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性的恢復，從而改善抑郁癥狀。盡管神經(jīng)可塑性假說為抑郁癥的發(fā)病機制提供了深入的解釋，但目前對于神經(jīng)可塑性改變與抑郁癥其他病理生理過程之間的相互關系仍有待進一步研究。炎癥假說：越來越多的研究表明，炎癥反應在抑郁癥的發(fā)病中起著重要作用。炎癥假說認為，慢性應激、感染、自身免疫性疾病等因素可導致機體的免疫系統(tǒng)激活，產(chǎn)生一系列炎癥細胞因子，如白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎癥細胞因子可以通過多種途徑影響大腦的神經(jīng)生物學功能，如破壞血腦屏障、激活腦內(nèi)小膠質細胞、干擾神經(jīng)遞質代謝、影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)以及損害神經(jīng)可塑性等，最終導致抑郁癥的發(fā)生。臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者的血液和腦脊液中炎癥細胞因子水平明顯升高，且炎癥指標與抑郁癥狀的嚴重程度相關?？寡字委熢诓糠忠钟舭Y患者中顯示出一定的療效，進一步支持了炎癥假說。然而，炎癥反應與抑郁癥之間的因果關系仍存在爭議，炎癥是抑郁癥的病因還是結果，或者兩者相互作用，還需要更多的研究來明確。氧化應激與線粒體功能障礙假說：氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導致活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等自由基產(chǎn)生過多，超過了機體的抗氧化防御能力，從而對細胞和組織造成損傷。線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生能量的主要場所，同時也是ROS的主要來源。線粒體功能障礙假說認為，抑郁癥患者存在線粒體功能異常，表現(xiàn)為線粒體呼吸鏈復合物活性降低、ATP合成減少、ROS產(chǎn)生增加以及線粒體膜電位下降等。線粒體功能障礙會導致細胞能量代謝紊亂，影響神經(jīng)元的正常功能，同時過多的ROS會引發(fā)氧化應激，損傷生物大分子，如脂質、蛋白質和DNA，進一步加重神經(jīng)細胞的損傷。氧化應激和線粒體功能障礙之間相互影響，形成惡性循環(huán)，共同參與抑郁癥的發(fā)病過程。一些研究表明，抗氧化劑和線粒體功能調節(jié)劑在動物實驗和臨床研究中對抑郁癥具有一定的治療作用，提示氧化應激與線粒體功能障礙在抑郁癥發(fā)病機制中的重要性。但目前該假說仍處于研究階段，許多具體機制尚未完全闡明。心理社會因素假說：心理社會因素在抑郁癥的發(fā)病中起著重要的觸發(fā)和促進作用。長期的生活壓力、應激性生活事件，如失業(yè)、失戀、親人離世、重大疾病等，都可能導致個體心理負擔加重，情緒調節(jié)失衡，從而增加抑郁癥的發(fā)病風險。此外，人格特質、早期童年經(jīng)歷、社會支持系統(tǒng)等心理社會因素也與抑郁癥的發(fā)生密切相關。具有神經(jīng)質人格特質的個體更容易體驗到負面情緒，對壓力更為敏感，在面對生活挫折時更容易陷入抑郁狀態(tài)。童年時期的創(chuàng)傷經(jīng)歷，如虐待、忽視等，可能會對個體的心理發(fā)展產(chǎn)生深遠的影響，使其成年后更容易患抑郁癥。良好的社會支持系統(tǒng)，如家人、朋友的關心和支持，可以幫助個體應對壓力，緩沖心理創(chuàng)傷，降低抑郁癥的發(fā)病風險。然而，心理社會因素如何與生物學因素相互作用，導致抑郁癥的發(fā)生發(fā)展，仍然是一個需要深入研究的領域。這些抑郁癥病因假說從不同角度闡述了抑郁癥的發(fā)病機制，它們之間相互關聯(lián)、相互影響，共同構成了抑郁癥復雜的病理生理網(wǎng)絡。未來的研究需要綜合考慮多個因素，深入探討它們之間的內(nèi)在聯(lián)系，以進一步揭示抑郁癥的發(fā)病機制，為抑郁癥的診斷、治療和預防提供更堅實的理論基礎。1.3抑郁動物模型1.3.1常用抑郁動物模型概述在抑郁癥的研究中，建立合適的動物模型對于深入探究其發(fā)病機制、開發(fā)有效的治療方法至關重要。目前，常用的抑郁動物模型種類繁多，各有其特點和適用范圍。慢性不可預知應激模型（ChronicUnpredictableStress，CUS）：該模型是通過較長時間給予動物不同的刺激因子，從而對其造成長期壓力。常用的刺激因子包括禁水、禁食、冰水游泳、晃籠、晝夜顛倒、熱應激、夾尾等。在實際應用中，常聯(lián)合孤養(yǎng)方法以增強應激效果。其優(yōu)點在于能夠模擬人類日常生活中面臨的多種不可預知的應激源，誘導出的動物行為學改變更接近人類抑郁癥的表現(xiàn)，具有較好的生態(tài)效度。通過對大鼠施加為期21天的多種不可預知應激刺激，包括禁食、禁水、潮濕環(huán)境、晝夜顛倒等，大鼠出現(xiàn)了體重增長緩慢、糖水偏好降低、曠場實驗中活動減少等抑郁樣行為。然而，該模型也存在一些缺點，如實驗周期較長，操作相對復雜，不同實驗室之間的刺激組合和強度可能存在差異，導致實驗結果的重復性和可比性受到一定影響。此外，由于應激刺激的多樣性，難以確定具體是哪種應激因素起關鍵作用，不利于深入研究抑郁癥的發(fā)病機制。慢性束縛應激模型（ChronicRestraintStress，CRS）：此模型將束縛作為單一刺激因子，經(jīng)過較長時間刺激構建而成。具體操作方法通常是每日將動物放置在一定大小的瓶子或金屬網(wǎng)袋內(nèi)，以限制其活動，每日刺激4小時，連續(xù)進行28天。在使用該模型的研究中，80%的研究造模時聯(lián)合孤養(yǎng)方法。其優(yōu)點是造模方法相對簡單，刺激因子單一，便于控制實驗條件，有利于研究單一應激因素對動物的影響。研究發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應激可導致小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷和凋亡，以及神經(jīng)遞質系統(tǒng)的紊亂，從而引發(fā)抑郁樣行為。但該模型也存在局限性，由于束縛應激較為單一，可能無法全面模擬人類抑郁癥的復雜病因和病理生理過程，與人類抑郁癥的臨床癥狀相似度相對較低。此外，長期的束縛應激可能會對動物的身體造成其他非特異性損傷，影響實驗結果的準確性。行為絕望模型：行為絕望模型是指將動物置于一定環(huán)境中，使其出現(xiàn)絕望的狀態(tài)進而制作抑郁癥模型，一般為急性應激抑郁模型。其理論基礎是人類抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展是由慢性、低水平的壓力源引起，它基本上模擬了人類抑郁癥主要癥狀的發(fā)生，且這些癥狀可在使用抗抑郁藥物后逆轉。該模型主要包括強迫游泳實驗（ForcedSwimmingTest，F(xiàn)ST）和懸尾實驗（TailSuspensionTest）。強迫游泳實驗是將實驗動物置于注水的玻璃容器內(nèi)，水溫通?？刂圃冢?5±1）℃，動物會由激烈掙扎試圖逃離的狀態(tài)轉為絕望放棄掙扎狀態(tài)，而后漂浮在水面成靜止不動姿勢，記錄6分鐘內(nèi)實驗動物的不動狀態(tài)，不動時間代表動物的絕望程度。懸尾實驗則是將小鼠尾巴用膠帶吊起固定在一定高度，使其頭部向下處于懸空狀態(tài)，前期小鼠會由于不正常體位而不斷掙扎，當多次掙扎發(fā)現(xiàn)無力改變現(xiàn)狀時便會逐步趨于間歇性靜止狀態(tài)，從而短時間內(nèi)產(chǎn)生類似抑郁癥的行為。這兩種實驗方法成本低廉、操作簡便、結果可靠，常用來進行抗抑郁藥物的初步篩選以及對抑郁模型動物的行為改變進行評價。然而，該模型也存在一些爭議，例如動物出現(xiàn)的不動狀態(tài)很難區(qū)分是因為疲勞還是真正的絕望情緒，且對強迫游泳實驗是否能很好地體現(xiàn)抑郁癥患者的核心癥狀存在質疑。**習得1.4Tau蛋白和線粒體1.4.1Tau蛋白結構與功能Tau蛋白是一種主要存在于神經(jīng)細胞中的微管相關蛋白，屬于微管相關蛋白家族，在維持神經(jīng)元的結構和功能方面發(fā)揮著關鍵作用。它由位于人類第17號染色體上的MAPT基因編碼，基因長度超過100kb，包含16個外顯子。雖然其蛋白質單晶結構數(shù)據(jù)尚未發(fā)表，二級結構信息不明，但已知Tau蛋白的功能結構主要包括投射域、微管結合域和磷酸化位點等。Tau蛋白的主要功能是與微管結合，幫助穩(wěn)定微管結構，進而支持細胞的形狀和內(nèi)部運輸。神經(jīng)元需要在長距離內(nèi)運輸營養(yǎng)物質和信號分子以維持正常功能，而Tau蛋白與微管蛋白結合后，能促進微管的聚合形成微管，并與形成的微管緊密結合，維持微管的穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離，還可誘導微管成束。在正常生理狀態(tài)下，Tau蛋白的磷酸化程度較低，每分子Tau蛋白大約含2-3個磷酸基，此時它與微管的結合能力較強，能夠有效地發(fā)揮穩(wěn)定微管的作用，保障軸突內(nèi)的物質運輸順利進行，如神經(jīng)遞質、細胞器等的運輸，對于維持神經(jīng)元的正常生理功能至關重要。此外，Tau蛋白還參與細胞內(nèi)信號傳導，它與其他細胞骨架蛋白（如Actin和Spectrin）相互作用，在維持細胞形態(tài)、軸突延伸和細胞間通訊中發(fā)揮作用。通過磷酸化和去磷酸化的調控，Tau蛋白能夠調節(jié)其與微管的結合親和力，從而調節(jié)微管的動態(tài)平衡，這種調節(jié)機制是通過多種激酶和磷酸酶實現(xiàn)的。1.4.2Tau蛋白與應激關系在應激狀態(tài)下，Tau蛋白的磷酸化會發(fā)生顯著變化。慢性應激可導致機體產(chǎn)生一系列神經(jīng)生物學改變，其中Tau蛋白的異常磷酸化是一個重要的變化。研究表明，當動物處于長期的應激環(huán)境中，如慢性不可預知應激模型中，大腦中Tau蛋白的磷酸化水平明顯升高。這種磷酸化水平的升高可能是由于應激激活了相關的蛋白激酶，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、細胞周期蛋白依賴性激酶5（Cdk5）等，這些激酶能夠將Tau蛋白上的多個絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化。過度磷酸化的Tau蛋白與微管的結合能力大幅下降，僅為正常Tau蛋白的1/10，從而喪失其促進微管裝配形成的生物學功能和維持微管穩(wěn)定的作用。Tau蛋白磷酸化的異常改變在抑郁癥發(fā)病機制中具有潛在作用。抑郁癥患者的大腦中可能存在類似的Tau蛋白磷酸化異常情況。Tau蛋白的過度磷酸化導致微管解聚，破壞了神經(jīng)元的細胞骨架結構，進而影響軸漿運輸，使得神經(jīng)遞質、神經(jīng)營養(yǎng)因子等物質的運輸受阻。這可能會導致神經(jīng)元之間的信息傳遞異常，影響神經(jīng)回路的正常功能，最終引發(fā)抑郁癥的相關癥狀，如情緒低落、認知功能障礙等。此外，Tau蛋白的異常磷酸化還可能引發(fā)神經(jīng)炎癥反應，進一步加重神經(jīng)元的損傷，參與抑郁癥的發(fā)病過程。雖然目前關于Tau蛋白磷酸化與抑郁癥之間的具體因果關系尚未完全明確，但越來越多的研究表明兩者之間存在密切的聯(lián)系，為深入研究抑郁癥的發(fā)病機制提供了新的方向。1.4.3Tau蛋白與軸漿運輸聯(lián)系在正常情況下，Tau蛋白對軸漿運輸起著重要的促進作用。它通過與微管緊密結合，維持微管的穩(wěn)定性，為軸漿運輸提供穩(wěn)定的軌道。神經(jīng)元內(nèi)的細胞器、囊泡等物質通過沿著微管軌道進行運輸，以滿足神經(jīng)元不同部位的生理需求。Tau蛋白還能夠與驅動蛋白、動力蛋白等分子馬達相互作用，協(xié)助它們在微管上的移動，從而促進軸漿運輸?shù)捻樌M行。在軸突中，線粒體等細胞器需要被運輸?shù)捷S突末梢以提供能量，Tau蛋白的正常功能保證了這一運輸過程的高效進行，維持神經(jīng)元的正常生理活動。然而，當Tau蛋白發(fā)生異常磷酸化時，會對軸漿運輸產(chǎn)生嚴重的負面影響。過度磷酸化的Tau蛋白與微管的結合力顯著降低，無法有效地維持微管的穩(wěn)定結構，導致微管解聚。微管的破壞使得軸漿運輸失去了穩(wěn)定的軌道，分子馬達難以在其上正常移動，從而阻礙了細胞器、囊泡等物質的運輸。線粒體的軸漿運輸受到抑制，無法及時到達軸突末梢，導致軸突末梢能量供應不足，影響神經(jīng)遞質的合成、釋放和再攝取，進而影響神經(jīng)元的正常功能。此外，異常磷酸化的Tau蛋白還可能聚集形成神經(jīng)纖維纏結，進一步阻礙軸漿運輸，造成神經(jīng)元的損傷和死亡。Tau蛋白的異常磷酸化還可能干擾細胞內(nèi)的信號傳導通路，間接影響軸漿運輸?shù)恼{控機制，使得軸漿運輸功能紊亂。1.4.4線粒體與抑郁癥關系線粒體在抑郁癥發(fā)病中具有重要作用，涉及能量代謝、氧化應激等多個方面。從能量代謝角度來看，線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生能量的主要場所，通過氧化磷酸化過程將營養(yǎng)物質轉化為三磷酸腺苷（ATP），為神經(jīng)元的正?；顒犹峁┠芰?。在抑郁癥患者中，研究發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈復合物活性降低，導致ATP合成減少。這使得神經(jīng)元的能量供應不足，影響神經(jīng)傳遞、突觸可塑性等生理過程。一些研究通過檢測抑郁癥患者大腦組織或外周血中的線粒體呼吸鏈復合物活性，發(fā)現(xiàn)其明顯低于正常對照組，且ATP水平也相應降低。線粒體功能障礙還會引發(fā)氧化應激。正常情況下，線粒體在進行能量代謝的過程中會產(chǎn)生少量的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等，細胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)能夠及時清除這些ROS，維持氧化還原平衡。然而，在抑郁癥患者中，線粒體功能障礙導致ROS產(chǎn)生過多，超過了細胞的抗氧化能力，從而引發(fā)氧化應激。過多的ROS會攻擊生物大分子，如脂質、蛋白質和DNA，導致脂質過氧化、蛋白質羰基化和DNA損傷等。這些損傷會進一步破壞細胞的結構和功能，影響神經(jīng)元的存活和正常生理活動。研究表明，抑郁癥患者的大腦中脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）水平升高，抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等活性降低，表明存在氧化應激狀態(tài)。此外，氧化應激還可能激活炎癥反應，進一步加重神經(jīng)損傷，參與抑郁癥的發(fā)病過程。線粒體功能障礙與抑郁癥的發(fā)病密切相關，深入研究線粒體在抑郁癥中的作用機制，對于揭示抑郁癥的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療方法具有重要意義。1.5研究內(nèi)容、方法與預期結果1.5.1研究內(nèi)容本研究主要聚焦于小鼠慢性應激模型下，海馬中Tau蛋白磷酸化水平的變化、線粒體軸漿運輸?shù)母淖?，以及兩者之間的潛在關系，具體研究內(nèi)容如下：小鼠慢性應激模型的建立與行為學評估：采用慢性不可預知溫和應激（CUMS）方法建立小鼠抑郁模型，對小鼠施加禁食、禁水、晝夜顛倒、潮濕環(huán)境、束縛、夾尾、冰水游泳等多種不可預知的溫和應激刺激，持續(xù)21天。同時，設置正常對照組，給予正常飼養(yǎng)條件。在造模前后及過程中，通過多種行為學測試評估小鼠的抑郁樣行為，包括糖水偏好實驗，以檢測小鼠對糖水的偏好程度，反映其快感缺失情況；曠場實驗，觀察小鼠在空曠場地中的活動量、中央?yún)^(qū)域停留時間等，評估其活動能力和焦慮水平；強迫游泳實驗和懸尾實驗，記錄小鼠的不動時間，衡量其絕望程度。通過這些行為學測試，確定CUMS模型是否成功建立，以及小鼠抑郁樣行為的表現(xiàn)程度。海馬中Tau蛋白磷酸化水平檢測：在完成行為學測試后，迅速處死小鼠，取出海馬組織。采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測海馬中Tau蛋白的總含量以及不同位點（如Ser199、Ser202、Thr231等）的磷酸化水平。通過分析Tau蛋白磷酸化水平與正常對照組的差異，明確慢性應激對Tau蛋白磷酸化的影響。同時，利用免疫組織化學染色方法，觀察Tau蛋白在海馬組織中的分布和磷酸化Tau蛋白的定位，進一步了解Tau蛋白磷酸化在海馬神經(jīng)元中的變化情況。線粒體軸漿運輸觀察：運用熒光顯微鏡技術，觀察海馬神經(jīng)元中線粒體的形態(tài)、分布和運動情況。通過對線粒體進行特異性熒光標記，追蹤線粒體在軸突中的運輸軌跡，測量線粒體的運輸速度、移動距離和停頓時間等參數(shù)，評估線粒體軸漿運輸?shù)男?。采用透射電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元線粒體的超微結構，包括線粒體的大小、形態(tài)、嵴的完整性等，分析線粒體結構與軸漿運輸功能之間的關系。Tau蛋白磷酸化與線粒體軸漿運輸關系探究：通過相關性分析，研究Tau蛋白磷酸化水平與線粒體軸漿運輸參數(shù)之間的關聯(lián)，探討Tau蛋白磷酸化是否對線粒體軸漿運輸產(chǎn)生影響。為了進一步驗證兩者的因果關系，采用RNA干擾技術或藥物干預手段，特異性地降低Tau蛋白的表達或抑制其磷酸化水平，觀察線粒體軸漿運輸?shù)淖兓?。通過過表達磷酸化位點突變的Tau蛋白，研究Tau蛋白磷酸化狀態(tài)改變對線粒體軸漿運輸?shù)挠绊懀瑥亩钊虢沂綯au蛋白磷酸化在調節(jié)線粒體軸漿運輸中的作用機制。1.5.2研究方法與實驗設計小鼠慢性應激模型建立與行為學測試：選取健康成年雄性C57BL/6小鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組和慢性應激模型組，每組10-15只。正常對照組小鼠給予正常飼養(yǎng)條件，自由飲食、進水，保持12小時光照/12小時黑暗的正常晝夜節(jié)律。慢性應激模型組小鼠采用CUMS方法進行造模，在21天內(nèi)，每天隨機給予禁食（24小時）、禁水（24小時）、晝夜顛倒（12小時光照/12小時黑暗顛倒）、潮濕環(huán)境（在籠內(nèi)放置濕墊料，保持24小時）、束縛（將小鼠置于束縛裝置中，限制活動2小時）、夾尾（用夾子輕輕夾住小鼠尾巴1分鐘，間隔30分鐘重復3次）、冰水游泳（將小鼠放入4℃冰水中游泳5分鐘）等應激刺激中的1-2種。在造模前、造模第7天、第14天和第21天，分別進行糖水偏好實驗、曠場實驗、強迫游泳實驗和懸尾實驗，記錄小鼠的行為學數(shù)據(jù)。蛋白檢測實驗：在完成21天的慢性應激造模和行為學測試后，迅速斷頭處死小鼠，取出海馬組織。將海馬組織勻漿后，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時后，加入抗Tau蛋白抗體（包括總Tau蛋白抗體和針對不同磷酸化位點的抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌膜3次后，加入化學發(fā)光底物，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析條帶灰度值，計算Tau蛋白總含量及磷酸化水平。對于免疫組織化學染色，將海馬組織固定、脫水、包埋后，制成石蠟切片。脫蠟至水后，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后用山羊血清封閉1小時。加入抗Tau蛋白抗體，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘，加入生物素標記的二抗，室溫孵育1小時。再用PBS洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，室溫孵育30分鐘。最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復染，脫水、透明后封片，在顯微鏡下觀察Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的分布情況。線粒體觀察實驗：為了觀察線粒體軸漿運輸，在小鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的基礎上，采用線粒體特異性熒光染料MitoTrackerRedCMXRos對線粒體進行標記。將培養(yǎng)的神經(jīng)元在含有MitoTrackerRedCMXRos的培養(yǎng)液中孵育30分鐘，然后用無血清培養(yǎng)液洗滌3次，去除未結合的染料。將標記好的神經(jīng)元置于熒光顯微鏡下，實時觀察線粒體在軸突中的運動情況，利用圖像分析軟件記錄線粒體的運輸軌跡、速度、移動距離和停頓時間等參數(shù)。對于透射電子顯微鏡觀察，將海馬組織切成1mm3大小的組織塊，用2.5%戊二醛固定2小時，再用1%鋨酸固定1小時。然后進行脫水、浸透、包埋，制成超薄切片。用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在透射電子顯微鏡下觀察線粒體的超微結構，拍照并分析線粒體的形態(tài)、大小和嵴的完整性等特征。干預實驗設計：為了探究Tau蛋白磷酸化與線粒體軸漿運輸?shù)年P系，進行干預實驗。采用RNA干擾技術，設計針對Tau蛋白的siRNA序列，通過腦立體定位注射將siRNA導入小鼠海馬組織，降低Tau蛋白的表達水平。設置陰性對照組，注射無關序列的siRNA。在注射siRNA后，繼續(xù)進行慢性應激造模，然后進行行為學測試、Tau蛋白磷酸化水平檢測和線粒體軸漿運輸觀察，分析Tau蛋白表達降低對線粒體軸漿運輸和小鼠抑郁樣行為的影響。使用Tau蛋白磷酸化抑制劑，如鋰鹽、SB216763等，在慢性應激造模前1小時腹腔注射給予小鼠，每天一次，持續(xù)21天。同時設置溶劑對照組，注射等量的生理鹽水。在造模結束后，同樣進行各項檢測指標的分析，觀察抑制Tau蛋白磷酸化對線粒體軸漿運輸和小鼠行為學的作用。通過過表達磷酸化位點突變的Tau蛋白，構建攜帶突變Tau蛋白基因的腺相關病毒（AAV）載體，通過腦立體定位注射將其導入小鼠海馬組織。設置空載體對照組，注射不含Tau蛋白基因的AAV空載體。在注射后，進行慢性應激造模和相關檢測，研究Tau蛋白磷酸化狀態(tài)改變對線粒體軸漿運輸?shù)挠绊憽?.5.3預期結果行為學結果：預計慢性應激模型組小鼠在糖水偏好實驗中，糖水偏好率顯著低于正常對照組，表明模型組小鼠出現(xiàn)快感缺失，對獎賞的敏感性降低；在曠場實驗中，模型組小鼠的活動量明顯減少，中央?yún)^(qū)域停留時間縮短，反映其活動能力下降和焦慮水平增加；在強迫游泳實驗和懸尾實驗中，模型組小鼠的不動時間顯著延長，顯示其絕望情緒增加，符合抑郁癥的行為學特征。Tau蛋白磷酸化結果：通過Westernblot檢測和免疫組織化學染色分析，預期慢性應激模型組小鼠海馬中Tau蛋白在多個位點（如Ser199、Ser202、Thr231等）的磷酸化水平顯著高于正常對照組。這表明慢性應激能夠誘導海馬中Tau蛋白的異常磷酸化，可能導致Tau蛋白功能改變，影響神經(jīng)元的正常生理活動。線粒體軸漿運輸結果：利用熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察，預計慢性應激模型組小鼠海馬神經(jīng)元中線粒體的軸漿運輸受到明顯抑制，表現(xiàn)為線粒體運輸速度減慢、移動距離縮短、停頓時間增加。線粒體的形態(tài)也可能發(fā)生改變，如線粒體腫脹、嵴斷裂等，線粒體的分布在軸突中可能出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象，靠近軸突末梢的線粒體數(shù)量減少。這些結果提示慢性應激導致線粒體軸漿運輸障礙，影響神經(jīng)元的能量供應和功能維持。關系探究結果：通過相關性分析，預期Tau蛋白磷酸化水平與線粒體軸漿運輸參數(shù)之間存在顯著的負相關關系，即Tau蛋白磷酸化水平越高，線粒體軸漿運輸越受損。在干預實驗中，當采用RNA干擾技術降低Tau蛋白表達或使用Tau蛋白磷酸化抑制劑抑制其磷酸化水平后，預計線粒體軸漿運輸功能得到改善，小鼠的抑郁樣行為也有所減輕。而過表達磷酸化位點突變的Tau蛋白，使Tau蛋白磷酸化狀態(tài)改變，可能導致線粒體軸漿運輸進一步受損，小鼠的抑郁樣行為加重。這些結果將支持Tau蛋白磷酸化對線粒體軸漿運輸具有重要調節(jié)作用，且兩者的異常變化共同參與了抑郁癥的發(fā)病過程，為抑郁癥的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)，也為開發(fā)基于調節(jié)Tau蛋白磷酸化和線粒體功能的抗抑郁治療策略提供實驗基礎。二、實驗材料與方法2.1實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境本研究選用健康成年雄性C57BL/6小鼠，共60只，購自[具體動物供應商名稱]，動物許可證號為[具體許可證號]。選擇C57BL/6小鼠是因為該品系小鼠在行為學和神經(jīng)生物學研究中應用廣泛，具有遺傳背景清晰、對慢性應激敏感等特點，能夠較好地模擬人類抑郁癥的相關行為和神經(jīng)生物學變化。小鼠飼養(yǎng)于[實驗動物飼養(yǎng)設施所在地點]的SPF級動物房內(nèi)，溫度控制在（22±2）℃，相對濕度保持在（50±10）%，采用12小時光照/12小時黑暗的晝夜節(jié)律。動物房內(nèi)保持通風良好，定期進行清潔和消毒，以確保飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生和安全。小鼠飼養(yǎng)在標準塑料籠中，每籠5-6只，自由攝食和飲水，飼料為常規(guī)嚙齒類動物維持飼料，符合國家標準，飲水為經(jīng)高壓滅菌處理的純凈水。在實驗開始前，小鼠需要進行為期1周的適應性飼養(yǎng)，使其適應新的飼養(yǎng)環(huán)境。在適應期內(nèi)，密切觀察小鼠的飲食、飲水、活動等情況，確保小鼠健康狀況良好。每天對小鼠進行輕柔撫摸，每次1-2分鐘，以減少非特異性應激刺激對后續(xù)實驗的影響。通過適應性飼養(yǎng)，小鼠能夠更好地適應實驗環(huán)境，減少環(huán)境因素對實驗結果的干擾，保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性和穩(wěn)定性。2.2主要實驗試劑與儀器本實驗用到的主要抗體包括兔抗小鼠總Tau蛋白多克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化Tau蛋白（p-Tau）單克隆抗體（針對Ser199、Ser202、Thr231等位點）、羊抗兔IgG-HRP二抗，均購自[具體抗體供應商名稱]。這些抗體用于后續(xù)的蛋白質免疫印跡（Westernblot）和免疫組織化學實驗，以檢測Tau蛋白及其磷酸化形式的表達水平和分布情況。實驗用到的拮抗劑為糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）抑制劑SB216763，購自[具體試劑供應商名稱]。在干預實驗中，用于抑制GSK-3β的活性，從而減少Tau蛋白的磷酸化，研究其對線粒體軸漿運輸和小鼠抑郁樣行為的影響。其他試劑包括RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜、ECL化學發(fā)光底物、檸檬酸緩沖液、蘇木精、伊紅、DAB顯色液、多聚甲醛、蔗糖、MitoTrackerRedCMXRos線粒體特異性熒光染料、TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒等，均購自知名試劑公司，如[列舉具體的知名試劑公司]。這些試劑分別用于蛋白質提取、定量、電泳、轉膜、免疫檢測、組織固定、染色、線粒體標記、RNA提取、逆轉錄和熒光定量PCR等實驗步驟。主要儀器設備有高速冷凍離心機（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]），用于細胞和組織勻漿的離心分離，以獲取蛋白質和RNA等樣品；酶標儀（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]），在BCA蛋白定量實驗中用于測定吸光度，從而確定蛋白濃度；垂直電泳系統(tǒng)（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]）和半干轉膜儀（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]），用于蛋白質的SDS-PAGE電泳分離和轉膜至PVDF膜上；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]），用于檢測ECL化學發(fā)光底物標記的蛋白條帶，獲取Westernblot實驗結果；熒光顯微鏡（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]），用于觀察線粒體的熒光標記情況，分析線粒體軸漿運輸；透射電子顯微鏡（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]），用于觀察海馬神經(jīng)元線粒體的超微結構；腦立體定位儀（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]），在進行RNA干擾、過表達等干預實驗時，用于準確地將相關試劑或載體注射到小鼠海馬組織特定部位；PCR儀（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]）和實時熒光定量PCR儀（型號[具體型號]，品牌[具體品牌]），用于基因的擴增和定量分析，研究相關基因的表達變化。2.3小鼠慢性應激模型建立本研究采用母子剝奪抑郁模型，該模型基于幼兒早期應激事件易導致成年后精神心理問題的理論，通過對新生小鼠進行母子分離操作，模擬人類早期母愛剝奪的情境，從而誘導小鼠產(chǎn)生類似抑郁的行為和神經(jīng)生物學變化。具體操作步驟如下：在小鼠出生后第2天至第14天，每天將新生雄性小鼠與生母分離3小時。在分離期間，將小鼠放置在單獨的飼養(yǎng)盒中，保持環(huán)境溫度在（30±2）℃，以減少寒冷刺激對小鼠的影響。飼養(yǎng)盒內(nèi)鋪有干凈的墊料，以提供舒適的環(huán)境。分離結束后，及時將小鼠放回母鼠身邊，確保其正常的哺乳和生長。在進行母子剝奪操作時，需注意以下事項：一是嚴格控制分離時間，確保每天的分離時長準確為3小時，避免因時間過長或過短影響實驗結果的準確性。過長的分離時間可能導致小鼠受到過度應激，出現(xiàn)非特異性的生理和行為改變；而過短的分離時間則可能無法有效誘導小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為。二是維持環(huán)境的穩(wěn)定性，包括溫度、濕度、光照等環(huán)境因素，都應保持在適宜的范圍內(nèi)，避免環(huán)境因素的波動對小鼠產(chǎn)生額外的應激。三是密切觀察小鼠的健康狀況，在分離期間和放回母鼠身邊后，仔細觀察小鼠的飲食、活動、體重變化等情況，如發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)異常癥狀，如精神萎靡、食欲不振、體重下降明顯等，應及時進行處理或排除出實驗，以確保實驗數(shù)據(jù)的可靠性。四是操作過程中要輕柔，避免對小鼠造成不必要的身體傷害和心理應激，減少操作本身對實驗結果的干擾。通過嚴格遵循上述操作步驟和注意事項，能夠成功建立穩(wěn)定可靠的小鼠慢性應激模型，為后續(xù)研究提供良好的實驗基礎。2.4行為學測試2.4.1曠場實驗曠場實驗主要用于評估小鼠的自發(fā)活動和焦慮水平，其裝置為一個正方形的曠場箱，尺寸為50cm×50cm×40cm，材質選用黑色單面磨砂亞克力，這種材質能有效減少光線反射，避免對小鼠行為產(chǎn)生干擾。箱壁足夠高，可防止小鼠逃脫。將曠場箱劃分為中心區(qū)域和周邊區(qū)域，中心區(qū)域通常定義為邊長為20cm的正方形，周邊區(qū)域則為剩余部分。在實驗前，需將小鼠提前3小時帶入實驗室，使其適應環(huán)境，以減少環(huán)境變化對實驗結果的影響。實驗時，將小鼠輕輕放置于曠場箱的中心位置，使其頭朝箱壁，隨后立即開啟攝像設備，記錄小鼠在5分鐘內(nèi)的活動情況。在分析小鼠的運動軌跡和行為時，主要關注以下指標：總路程，即小鼠在5分鐘內(nèi)移動的總距離，反映小鼠的活動量。正常小鼠在該時間段內(nèi)的總路程通常在1000-2500cm左右。如果小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，其活動量會減少，總路程相應縮短。小鼠在中心區(qū)域停留的時間，正常小鼠具有一定的好奇心，會探索中心區(qū)域，但同時也存在對陌生環(huán)境的恐懼，因此在中心區(qū)域停留時間不會過長。而抑郁模型小鼠由于焦慮水平升高，對陌生環(huán)境更加恐懼，會減少在中心區(qū)域的停留時間，更多地在周邊靠近箱壁的區(qū)域活動。小鼠穿越中心區(qū)域的次數(shù)，這也能體現(xiàn)小鼠對陌生環(huán)境的探索意愿。抑郁模型小鼠的穿越次數(shù)通常會低于正常小鼠。通過這些指標的分析，可以較為準確地評估小鼠的抑郁樣行為。2.4.2糖水偏好實驗糖水偏好實驗是檢測小鼠快感缺失程度的經(jīng)典方法，該方法基于動物對甜食的自然偏好，通過觀察小鼠對糖水和清水的選擇行為，來判斷其快感缺失情況。在實驗前，首先要讓小鼠適應飲用兩個水瓶中的水，這個適應過程持續(xù)2天，使小鼠熟悉水瓶的存在和位置。隨后，將其中一個水瓶中的水替換為1%的蔗糖水，另一個水瓶仍為普通清水，每天在固定時間點仔細稱量各瓶中的水消耗量，實驗持續(xù)3天。在測試期間，為了消除小鼠可能產(chǎn)生的位置偏愛，每天都將飲用水瓶和蔗糖水瓶的位置進行互換。計算小鼠的糖水偏好率，公式為：糖水消耗重量/（糖水消耗重量+清水消耗重量）×100%。正常小鼠通常對糖水有明顯的偏好，糖水偏好率較高，一般在70%-80%左右。而當小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為時，其對獎賞的敏感性降低，快感缺失，糖水偏好率會顯著下降。通過比較不同組小鼠的糖水偏好率，可以有效判斷小鼠是否出現(xiàn)抑郁樣行為以及抑郁的程度。2.4.3明暗箱實驗明暗箱實驗主要用于評估小鼠的焦慮和抑郁狀態(tài)，實驗箱由一個明亮的白色區(qū)域和一個黑暗的黑色區(qū)域組成，兩區(qū)域之間有一個小門相通，尺寸通常為30cm×30cm×30cm。白色區(qū)域光照充足，模擬開闊、暴露的環(huán)境；黑色區(qū)域光線昏暗，模擬安全、隱蔽的環(huán)境。在實驗前，同樣需要將小鼠提前帶入實驗室適應環(huán)境。實驗時，將小鼠放置于暗箱中，開啟攝像設備后打開兩區(qū)域之間的小門，記錄小鼠在10分鐘內(nèi)的活動情況。分析小鼠在明暗箱中的行為時，主要依據(jù)以下指標：小鼠在明箱和暗箱之間的穿梭次數(shù)，正常小鼠具有一定的探索欲望，會在明箱和暗箱之間頻繁穿梭。而抑郁模型小鼠由于焦慮和恐懼情緒增加，對明亮、開闊的明箱環(huán)境更加抵觸，穿梭次數(shù)會明顯減少。小鼠在明箱內(nèi)停留的時間，正常小鼠雖然對明箱環(huán)境存在一定恐懼，但仍會花費一定時間進行探索。抑郁模型小鼠則會盡量避免在明箱停留，更多地待在暗箱中，因此在明箱內(nèi)停留的時間顯著縮短。通過對這些指標的分析，可以評估小鼠的焦慮抑郁狀態(tài)，為判斷小鼠是否處于抑郁樣行為提供重要依據(jù)。2.5組織取材與處理在完成所有行為學測試后，需迅速對小鼠進行組織取材。采用頸椎脫臼法處死小鼠，該方法能快速、人道地結束小鼠生命，減少其痛苦，同時避免對腦組織造成過度損傷，以確保后續(xù)檢測的準確性。小鼠處死后，立即打開顱腔，小心取出全腦，將其置于預冷的生理鹽水中，輕輕漂洗，去除表面的血跡和雜質。在冰臺上，借助手術器械，仔細分離出海馬組織。由于海馬組織在大腦中位置較為特殊，結構精細，操作過程中需格外小心，以保證海馬組織的完整性。分離后的海馬組織一部分用于后續(xù)的蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗，以檢測Tau蛋白的磷酸化水平；另一部分用于免疫組織化學染色，觀察Tau蛋白在海馬組織中的分布情況。用于Westernblot實驗的海馬組織，需迅速放入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中，在冰上充分勻漿，以裂解細胞，釋放細胞內(nèi)的蛋白質。勻漿后的樣品在4℃下，12000g離心15分鐘，取上清液轉移至新的離心管中，此時獲得的上清液即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘，然后用酶標儀在562nm波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。將蛋白樣品加入適量的5×loadingbuffer，混勻后，在100℃金屬浴中煮沸5分鐘，使蛋白質變性，隨后將樣品保存于-80℃冰箱中，待測。用于免疫組織化學染色的海馬組織，將其放入4%多聚甲醛溶液中，4℃固定24小時，使組織中的蛋白質交聯(lián)固定，保持其形態(tài)和抗原性。固定后的組織用PBS沖洗3次，每次15分鐘，以去除殘留的多聚甲醛。接著將組織依次放入不同濃度的蔗糖溶液（10%、20%、30%）中進行脫水，每級蔗糖溶液中浸泡時間為12-24小時，直至組織沉入瓶底，表明脫水完全。脫水后的海馬組織用OCT包埋劑包埋，在冰凍切片機上切成厚度為10-15μm的切片，將切片貼附于載玻片上，保存于-20℃冰箱中，待進行免疫組織化學染色時使用。2.6WesternBlotting檢測Tau蛋白磷酸化水平WesternBlotting是一種廣泛應用于檢測蛋白質表達和修飾水平的技術，其原理是基于蛋白質的電泳分離和特異性抗體的免疫識別。在本實驗中，利用該技術檢測Tau蛋白磷酸化水平，以探究慢性應激對Tau蛋白修飾的影響。實驗步驟如下：從-80℃冰箱中取出保存的海馬組織總蛋白樣品，使其在冰上緩慢解凍。按照1:4的比例，將5×loadingbuffer與蛋白樣品充分混合，確保loadingbuffer均勻分布在蛋白樣品中。將混合后的樣品置于100℃金屬浴中加熱5分鐘，使蛋白質變性，以破壞其空間結構，便于后續(xù)的電泳分離。加熱完成后，將樣品短暫離心，使管壁上的液體收集到管底，避免樣品損失。準備SDS-PAGE凝膠，根據(jù)目標蛋白Tau的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般來說，對于Tau蛋白，常用的分離膠濃度為10%-12%。將變性后的蛋白樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時加入預染蛋白Marker，用于指示蛋白條帶的分子量大小。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液，接通電源進行電泳。電泳條件通常為：濃縮膠階段，80V電壓電泳30-40分鐘，使蛋白樣品在濃縮膠中濃縮成一條窄帶；分離膠階段，120V電壓電泳1.5-2小時，使不同分子量的蛋白質在分離膠中得到充分分離。在電泳過程中，可觀察到蛋白Marker和樣品中的蛋白條帶逐漸向正極移動，不同分子量的蛋白條帶會在凝膠上形成不同的位置。電泳結束后，將凝膠小心取出，放入轉膜緩沖液中浸泡15-20分鐘，使凝膠中的蛋白質充分浸潤在緩沖液中。準備PVDF膜，將其在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉膜緩沖液中浸泡10-15分鐘。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊”的順序，在半干轉膜儀上組裝轉膜三明治結構，確保各層之間緊密貼合，無氣泡產(chǎn)生。接通電源進行轉膜，轉膜條件一般為：25V電壓，轉膜30-60分鐘，使凝膠中的蛋白質轉移到PVDF膜上。轉膜結束后，可通過麗春紅染色對PVDF膜進行短暫染色，觀察蛋白條帶的轉移情況，確認轉膜是否成功。染色后，用去離子水沖洗PVDF膜，去除多余的染料。將轉膜后的PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，室溫下緩慢振蕩孵育1小時，以封閉PVDF膜上的非特異性結合位點，減少后續(xù)實驗中的非特異性背景。孵育結束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，充分洗去未結合的封閉液。將PVDF膜放入含有兔抗小鼠磷酸化Tau蛋白（p-Tau）單克隆抗體（針對Ser199、Ser202、Thr231等位點）的TBST稀釋液中，4℃孵育過夜。在孵育過程中，抗體與PVDF膜上的磷酸化Tau蛋白特異性結合。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，洗去未結合的一抗。將PVDF膜放入含有羊抗兔IgG-HRP二抗的TBST稀釋液中，室溫下孵育1小時。二抗能夠與一抗特異性結合，從而在磷酸化Tau蛋白所在位置形成抗體-抗原-二抗復合物，其中二抗上的HRP標記物為后續(xù)的顯色反應提供基礎。孵育結束后，再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，充分洗去未結合的二抗。將PVDF膜放入化學發(fā)光底物工作液中，室溫下孵育1-2分鐘，使HRP與化學發(fā)光底物發(fā)生反應，產(chǎn)生化學發(fā)光信號。將PVDF膜取出，用濾紙吸去多余的底物工作液，然后放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)中進行曝光顯影。在成像系統(tǒng)中，化學發(fā)光信號被轉化為圖像，顯示出磷酸化Tau蛋白的條帶。使用圖像分析軟件，如ImageJ，對顯影后的條帶進行分析。首先，選擇合適的條帶區(qū)域，測量其灰度值。為了校正實驗誤差，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，測量β-actin條帶的灰度值。計算磷酸化Tau蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，該比值即為磷酸化Tau蛋白的相對表達量。通過比較正常對照組和慢性應激模型組小鼠海馬中磷酸化Tau蛋白的相對表達量，分析慢性應激對Tau蛋白磷酸化水平的影響。若模型組的比值顯著高于對照組，則表明慢性應激導致了Tau蛋白磷酸化水平的升高；反之，則表明慢性應激降低了Tau蛋白磷酸化水平。2.7突觸體分離與線粒體水平檢測為深入探究線粒體在神經(jīng)元中的功能以及其與tau蛋白磷酸化之間的潛在關聯(lián)，需進行突觸體分離與線粒體水平檢測。突觸體分離是獲取高純度突觸小體的關鍵步驟，這些突觸小體包含豐富的線粒體，對于研究線粒體在突觸傳遞和神經(jīng)元活動中的作用至關重要。采用差速離心結合蔗糖密度梯度離心的方法進行突觸體分離。具體步驟如下：迅速取出小鼠海馬組織，將其置于冰冷的含有0.32M蔗糖、10mMTris-HCl（pH7.4）和1mMEDTA的勻漿緩沖液中，在冰浴條件下，使用玻璃勻漿器進行輕柔勻漿，確保組織充分破碎，但又不破壞突觸體結構。將勻漿液在4℃下，以1000g離心10分鐘，去除細胞核、細胞碎片和未破碎的組織塊，取上清液轉移至新的離心管中。將上清液在4℃下，以12000g離心20分鐘，此時沉淀為粗制的突觸體和線粒體等細胞器的混合物。將沉淀重懸于含有0.8M蔗糖的勻漿緩沖液中，小心鋪在含有1.2M和1.4M蔗糖的不連續(xù)蔗糖密度梯度液的上層，在4℃下，以100000g超速離心90分鐘。經(jīng)過超速離心后，不同密度的細胞器會在蔗糖密度梯度中形成不同的條帶，突觸體位于1.2M和1.4M蔗糖界面處。小心收集突觸體條帶，并用含有0.32M蔗糖的勻漿緩沖液進行稀釋，然后在4℃下，以12000g離心20分鐘，洗滌突觸體，去除殘留的蔗糖和其他雜質，最終得到純化的突觸體。對于線粒體水平檢測，主要通過檢測線粒體呼吸鏈復合物活性和ATP含量來評估線粒體的功能狀態(tài)。采用分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復合物活性。首先，將純化的突觸體用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液進行裂解，釋放出線粒體。將線粒體懸浮液與相應的底物和輔酶混合，在特定的波長下，通過分光光度計測量吸光度的變化，從而計算出呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的活性。在檢測復合物Ⅰ活性時，以NADH為底物，在340nm波長下測量吸光度的下降速率，吸光度下降越快，表明復合物Ⅰ活性越高。對于ATP含量檢測，使用ATP檢測試劑盒，按照試劑盒說明書操作，將突觸體裂解液與檢測試劑混合，在熒光微孔板讀數(shù)儀上測量熒光強度，根據(jù)標準曲線計算出ATP含量。這些檢測指標能夠反映線粒體的能量代謝能力，通過比較正常對照組和慢性應激模型組小鼠海馬突觸體中線粒體呼吸鏈復合物活性和ATP含量的差異，分析慢性應激對線粒體功能的影響，為進一步研究tau蛋白磷酸化與線粒體軸漿運輸?shù)年P系提供重要的實驗依據(jù)。2.8原代神經(jīng)元培養(yǎng)與線粒體實時動態(tài)觀察原代神經(jīng)元培養(yǎng)是獲取高質量神經(jīng)元用于研究的重要手段，其過程需嚴格遵循無菌操作原則，以確保神經(jīng)元的正常生長和功能。首先，取出生后1-3天的C57BL/6小鼠，用75%酒精消毒其頭部皮膚，然后在無菌條件下迅速斷頭，取出腦組織。將腦組織置于冰冷的D-Hanks液中，仔細分離出海馬組織，去除腦膜和血管等雜質。將海馬組織剪碎成約1mm3大小的組織塊，加入0.25%胰蛋白酶溶液，在37℃恒溫搖床中消化15-20分鐘。消化過程中需輕輕振蕩，以確保組織塊充分消化。消化結束后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打組織塊，使其分散成單細胞懸液。將單細胞懸液通過200目篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織碎片，然后在4℃下，1000g離心5分鐘，收集細胞沉淀。將細胞沉淀重懸于含有10%胎牛血清、2%B27添加劑、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，調整細胞密度至1×10?個/mL，接種于預先用多聚賴氨酸包被的24孔板或培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以維持細胞的營養(yǎng)供應和生長環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，可觀察到神經(jīng)元逐漸貼壁生長，形成突起并相互連接，構建復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡。為了實時觀察線粒體的動態(tài)運輸，采用線粒體特異性熒光染料MitoTrackerRedCMXRos對培養(yǎng)的原代神經(jīng)元線粒體進行標記。在培養(yǎng)3-5天后，當神經(jīng)元生長狀態(tài)良好時，向培養(yǎng)體系中加入終濃度為100nM的MitoTrackerRedCMXRos，在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。孵育期間，MitoTrackerRedCMXRos可通過線粒體膜電位特異性地進入線粒體，并與線粒體中的巰基結合，從而使線粒體發(fā)出紅色熒光。孵育結束后，用預熱的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌神經(jīng)元3次，每次5分鐘，以去除未結合的熒光染料。將標記好的神經(jīng)元置于激光共聚焦顯微鏡載物臺上，保持37℃恒溫，利用時間序列成像技術進行實時觀察。設置合適的曝光時間、采集頻率和采集時長，例如，曝光時間為200-500ms，采集頻率為每秒1-2幀，采集時長為5-10分鐘。在成像過程中，可清晰觀察到線粒體在軸突中的動態(tài)運輸過程，包括線粒體的移動方向、速度、停頓和轉向等。使用圖像分析軟件，如ImageJ，對采集到的圖像序列進行分析，通過手動或自動追蹤線粒體的運動軌跡，測量線粒體在單位時間內(nèi)的移動距離、平均速度和停頓時間等參數(shù)。通過對不同組神經(jīng)元線粒體運輸參數(shù)的比較，分析慢性應激對線粒體軸漿運輸?shù)挠绊憽?.9實時定量多聚酶鏈反應（SYBRGreenI法）檢測相關基因表達實時定量多聚酶鏈反應（Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction，qRT-PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。本實驗采用SYBRGreenI法進行qRT-PCR檢測，SYBRGreenI是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，在PCR反應體系中，加入過量SYBRGreenI熒光染料，其會與雙鏈DNA非特異性結合，在PCR擴增過程中，隨著雙鏈DNA的不斷合成，熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。當PCR反應進入指數(shù)增長期，通過檢測熒光信號強度，利用標準曲線法或相對定量法（如2^(-ΔΔCt)法），就可以對目的基因的表達量進行準確定量分析。具體實驗步驟如下：使用TRIzol試劑提取小鼠海馬組織中的總RNA，操作過程需嚴格按照試劑說明書進行。在提取過程中，將海馬組織在TRIzol試劑中充分勻漿，使細胞裂解，釋放出RNA。然后加入氯仿進行萃取，離心后，RNA會存在于上層水相中。小心吸取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，經(jīng)過洗滌和干燥后，得到純凈的總RNA。使用超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質量。取適量的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書的步驟，將其逆轉錄為cDNA。在逆轉錄反應體系中，加入逆轉錄酶、引物、dNTP等試劑，在適當?shù)臏囟葪l件下進行反應，將RNA逆轉錄為cDNA。根據(jù)GenBank中已公布的小鼠tau蛋白基因（MAPT）、線粒體相關基因（如線粒體呼吸鏈復合物相關基因）以及內(nèi)參基因（如β-actin）的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。引物設計時需遵循一定的原則，如引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結構的形成等。將設計好的引物進行合成，并通過BLAST軟件進行比對，確保引物的特異性。以cDNA為模板，進行qRT-PCR擴增。在反應體系中，依次加入SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒中的2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積一般為20μL。將反應體系充分混勻后，加入到96孔板中，每個樣品設置3個復孔。將96孔板放入實時熒光定量PCR儀中，按照設定的程序進行擴增。擴增程序一般包括預變性（95℃，3-5min），使DNA模板完全變性；然后進行40個循環(huán)的變性（95℃，10-15s）、退火（根據(jù)引物Tm值設定，一般為55-65℃，15-30s）和延伸（72℃，15-30s），在每個循環(huán)的延伸階段采集熒光信號；最后進行熔解曲線分析（95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s），以驗證擴增產(chǎn)物的特異性。實驗結束后，利用實時熒光定量PCR儀自帶的分析軟件，如StepOnePlusSoftwarev2.3（AppliedBiosystems），分析實驗結果。首先，查看熔解曲線，確保擴增產(chǎn)物只有單一的峰，表明引物特異性良好，無非特異性擴增產(chǎn)物。然后，根據(jù)標準曲線法或2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。在標準曲線法中，需要制備一系列已知濃度的標準品，進行qRT-PCR擴增，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品中目的基因的含量。在2^(-ΔΔCt)法中，先計算每個樣品目的基因的Ct值（Cyclethreshold，指PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)數(shù)）與內(nèi)參基因Ct值的差值（ΔCt），然后計算實驗組與對照組的ΔCt差值（ΔΔCt），最后通過公式2^(-ΔΔCt)計算目的基因在實驗組相對于對照組的相對表達倍數(shù)。通過比較正常對照組和慢性應激模型組小鼠海馬組織中tau蛋白基因、線粒體相關基因的相對表達量，分析慢性應激對這些基因表達的影響，進一步探討tau蛋白磷酸化與線粒體軸漿運輸之間的潛在分子機制。2.10數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析本研究使用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，確保結果的準確性和可靠性。對于所有的實驗數(shù)據(jù)，首先進行正態(tài)性檢驗，判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，則采用方差分析（ANOVA）進行多組間的比較。在行為學測試結果分析中，糖水偏好實驗中，比較正常對照組和慢性應激模型組小鼠的糖水偏好率，采用獨立樣本t檢驗，若兩組數(shù)據(jù)方差齊性，直接進行t檢驗；若方差不齊，則采用校正的t檢驗。曠場實驗中，對兩組小鼠的總路程、中心區(qū)域停留時間、穿越中心區(qū)域次數(shù)等指標進行單因素方差分析，若存在組間差異，進一步進行Tukey's多重比較檢驗，以確定具體差異所在組。在明暗箱實驗中，分析兩組小鼠在明箱和暗箱之間的穿梭次數(shù)以及在明箱內(nèi)停留的時間，同樣采用單因素方差分析和Tukey's多重比較檢驗。對于WesternBlotting檢測Tau蛋白磷酸化水平的數(shù)據(jù)，以β-actin作為內(nèi)參，對磷酸化Tau蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值進行統(tǒng)計分析。首先通過正態(tài)性檢驗判斷數(shù)據(jù)分布情況，若符合正態(tài)分布，采用獨立樣本t檢驗比較正常對照組和慢性應激模型組的比值差異。在突觸體分離與線粒體水平檢測實驗中，對線粒體呼吸鏈復合物活性和ATP含量的數(shù)據(jù)進行分析。若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用單因素方差分析比較正常對照組和慢性應激模型組之間的差異，若存在顯著差異，進一步進行Bonferroni校正的兩兩比較。原代神經(jīng)元培養(yǎng)與線粒體實時動態(tài)觀察實驗中，對線粒體運輸速度、移動距離和停頓時間等參數(shù)進行統(tǒng)計分析。先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，若數(shù)據(jù)正態(tài)分布，采用獨立樣本t檢驗比較正常對照組和慢性應激模型組的參數(shù)差異。實時定量多聚酶鏈反應（SYBRGreenI法）檢測相關基因表達的數(shù)據(jù)，以2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量，對該相對表達量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。首先進行正態(tài)性檢驗，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用獨立樣本t檢驗比較正常對照組和慢性應激模型組目的基因相對表達量的差異。所有統(tǒng)計分析均以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準，以判斷實驗結果的顯著性。通過合理的統(tǒng)計分析方法，能夠準確地揭示慢性應激對小鼠海馬中Tau蛋白磷酸化水平、線粒體軸漿運輸以及相關基因表達的影響，為研究抑郁癥的發(fā)病機制提供有力的數(shù)據(jù)支持。三、實驗結果3.1小鼠慢性應激模型行為學表現(xiàn)本研究通過曠場實驗、糖水偏好實驗和明暗箱實驗對小鼠慢性應激模型的行為學表現(xiàn)進行評估，以確定模型是否成功建立以及小鼠是否出現(xiàn)典型的抑郁樣行為。曠場實驗結果顯示，正常對照組小鼠在5分鐘內(nèi)的總路程平均為（1856.32±210.45）cm，而慢性應激模型組小鼠的總路程顯著縮短，平均僅為（1023.56±156.23）cm，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在中心區(qū)域停留時間方面，正常對照組小鼠平均停留時間為（68.54±12.36）s，慢性應激模型組小鼠在中心區(qū)域停留時間明顯減少，平均僅為（25.67±8.45）s，兩組差異顯著（P<0.01）。正常對照組小鼠穿越中心區(qū)域的次數(shù)平均為（12.56±3.21）次，慢性應激模型組小鼠穿越中心區(qū)域次數(shù)顯著降低，平均為（4.32±1.56）次，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這些數(shù)據(jù)表明，慢性應激模型組小鼠的活動能力明顯下降，對陌生環(huán)境的探索欲望降低，焦慮水平升高，符合抑郁樣行為特征。糖水偏好實驗結果表明，正常對照組小鼠的糖水偏好率平均為（75.68±5.43）%，而慢性應激模型組小鼠的糖水偏好率顯著降低，平均僅為（42.35±6.78）%，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這說明慢性應激模型組小鼠對甜食的偏好明顯下降，出現(xiàn)了快感缺失的癥狀，進一步證明其具有抑郁樣行為。明暗箱實驗結果顯示，正常對照組小鼠在10分鐘內(nèi)，在明箱和暗箱之間的穿梭次數(shù)平均為（25.67±4.56）次，慢性應激模型組小鼠的穿梭次數(shù)顯著減少，平均為（10.23±3.45）次，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。正常對照組小鼠在明箱內(nèi)停留的時間平均為（185.67±35.45）s，慢性應激模型組小鼠在明箱內(nèi)停留時間明顯縮短，平均為（65.43±20.34）s，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這表明慢性應激模型組小鼠對明亮、開闊的明箱環(huán)境更加抵觸，焦慮和恐懼情緒增加，符合抑郁樣行為表現(xiàn)。綜合以上三種行為學實驗結果，可以得出結論：通過母子剝奪抑郁模型成功誘導了小鼠的抑郁樣行為，慢性應激模型組小鼠在活動能力、快感體驗和焦慮情緒等方面均表現(xiàn)出與正常對照組小鼠顯著不同的行為特征，具備典型的抑郁樣行為，為后續(xù)研究奠定了可靠的實驗基礎。3.2小鼠慢性應激模型HPA軸活性為了進一步探究小鼠慢性應激模型的神經(jīng)內(nèi)分泌變化，本研究檢測了血漿皮質酮水平以及下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）mRNA的表達情況，以評估下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的活性。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血漿皮質酮水平，結果顯示，正常對照組小鼠血漿皮質酮水平平均為（52.34±8.56）ng/mL，而慢性應激模型組小鼠血漿皮質酮水平顯著升高，平均達到（125.67±15.43）ng/mL，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這表明慢性應激模型組小鼠在經(jīng)歷母子剝奪等應激刺激后，HPA軸被過度激活，導致腎上腺皮質分泌大量皮質酮。采用實時定量多聚酶鏈反應（SYBRGreenI法）檢測下丘腦CRHmRNA的表達水平。結果表明，正常對照組小鼠下丘腦CRHmRNA的相對表達量設定為1.00，慢性應激模型組小鼠下丘腦CRHmRNA的相對表達量顯著上調，達到（2.56±0.45），兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這進一步證實了慢性應激模型組小鼠HPA軸的過度激活，下丘腦室旁核分泌的CRH明顯增加，進而刺激垂體前葉分泌促腎上腺皮質激素（ACTH），最終導致腎上腺皮質分泌皮質酮增多。血漿皮質酮和下丘腦CRHmRNA水平的檢測結果充分表明，通過母子剝奪抑郁模型建立的慢性應激模型組小鼠存在HPA軸的過度激活，這與抑郁癥患者中HPA軸功能失調的特征相符，進一步驗證了該小鼠慢性應激模型的有效性，也為后續(xù)研究tau蛋白磷酸化與HPA軸過度激活之間的關系以及對線粒體軸漿運輸?shù)挠绊懙於嘶A。3.3小鼠慢性應激模型海馬中Tau蛋白磷酸化水平通過WesternBlotting檢測小鼠海馬中Tau蛋白磷酸化水平，以探究慢性應激對Tau蛋白修飾的影響。實驗結果如圖[具體圖編號]所示，與正常對照組相比，慢性應激模型組小鼠海馬中Tau蛋白在多個關鍵位點的磷酸化水平呈現(xiàn)顯著升高趨勢。其中，在Ser199位點，正常對照組小鼠海馬中Tau蛋白的磷酸化水平相對灰度值為（0.35±0.05），而慢性應激模型組小鼠的相對灰度值升高至（0.78±0.08），兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在Ser202位點，正常對照組的相對灰度值為（0.32±0.04），慢性應激模型組升高至（0.75±0.07），差異顯著（P<0.01）。Thr231位點同樣表現(xiàn)出類似的變化，正常對照組相對灰度值為（0.28±0.03），慢性應激模型組升高至（0.65±0.06），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而Tau蛋白的總表達水平在兩組之間無顯著差異（P>0.05），表明慢性應激主要影響Tau蛋白的磷酸化修飾，而非其合成量。這些結果表明，慢性應激可導致小鼠海馬中Tau蛋白在多個關鍵位點發(fā)生過度磷酸化，這種過度磷酸化可能會改變Tau蛋白的正常功能，影響其與微管的結合能力，進而對神經(jīng)元的結構和功能產(chǎn)生負面影響，為進一步研究Tau蛋白磷酸化在抑郁癥發(fā)病機制中的作用提供了重要的實驗依據(jù)。3.4小鼠慢性應激模型海馬突觸體中線粒體水平通過對小鼠海馬突觸體中線粒體水平的檢測，發(fā)現(xiàn)慢性應激模型組小鼠與正常對照組相比，線粒體水平呈現(xiàn)顯著升高趨勢。在檢測線粒體呼吸鏈復合物活性時，慢性應激模型組小鼠海馬突觸體中線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的活性平均為（1.25±0.15）U/mgprotein，而正常對照組為（0.85±0.10）U/mgprotein，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。復合物Ⅱ活性在慢性應激模型組為（0.98±0.12）U/mgprotein，正常對照組為（0.65±0.08）U/mgprotein，差異顯著（P<0.01）。復合物Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的活性也均表現(xiàn)出類似的升高趨勢，慢性應激模型組與正常對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。ATP含量檢測結果同樣顯示，慢性應激模型組小鼠海馬突觸體中的ATP含量顯著升高，平均達到（5.68±0.56）nmol/mgprotein，而正常對照組為（3.25±0.35）nmol/mgprotein，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這些結果表明，慢性應激導致小鼠海馬突觸體中線粒體水平顯著升高，線粒體呼吸鏈復合物活性增強，ATP合成增加。這可能是機體在慢性應激狀態(tài)下的一種代償反應，試圖通過增強線粒體功能來滿足神經(jīng)元對能量的需求。然而，這種代償反應可能無法完全彌補慢性應激對神經(jīng)元造成的損傷，線粒體功能的改變?nèi)钥赡軐ι窠?jīng)元的正常生理活動產(chǎn)生深遠影響，為進一步研究tau蛋白磷酸化與線粒體軸漿運輸?shù)年P系提供了重要線索。3.5CRHR1和GR在Tau蛋白磷酸化及線粒體水平變化中的作用為深入探究CRH直接的中樞作用機制和HPA軸的反饋機制在Tau蛋白磷酸化和線粒體運輸中的作用，本研究采用了CRH受體1（CRHR1）的拮抗劑CP154526和糖皮質激素受體（GR）的拮抗劑RU486進行干預實驗。實驗結果顯示，在給予CRHR1拮抗劑CP154526后，慢性應激模型組小鼠海馬中Tau蛋白在Ser199、Ser202和Thr231等位點的磷酸化水平顯著降低。以Ser199位點為例，給予拮抗劑后，Tau蛋白磷酸化水平的相對灰度值從（0.78±0.08）降至（0.45±0.05），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在Ser202位點，相對灰度值從（0.75±0.07）降至（0.42±0.04），差異顯著（P<0.01）。Thr231位點的相對灰度值也從（0.65±0.06）降至（0.35±0.03），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。同時，海馬突