生物制品方法開發(fā)中色譜柱的選擇----蛋白分析Theworldleaderinservingscience內(nèi)容概要?生物制品的概念?生物制品的分類?生物制品與小分子藥物的區(qū)別?Thermo在蛋白藥物中的解決方案2生物制品的概念?生物制品是以微生物,細(xì)胞、動物或人源組織和體液等為原料，應(yīng)用傳統(tǒng)技術(shù)（如萃取，沉淀等傳統(tǒng)方法）或現(xiàn)代生物技術(shù)制成，用于人類疾病的預(yù)防、治療和診斷的產(chǎn)品。?生物制品主要有：各類菌苗、各類疫苗、類毒素、抗毒素、各類干擾素、酶制品、免疫調(diào)節(jié)劑、血液制品、轉(zhuǎn)移因子、淋巴因子，單克隆抗體以及單克隆抗體與毒素相結(jié)合的各種“生物導(dǎo)彈”ADC藥物，融合蛋白，雙抗等。3生物制品的分類?按照生理功能和用途可分為治療藥物（治療腫瘤，心腦血管疾病等），診斷藥物（靈敏度高，特異性強的用于免疫診斷，酶診斷，放射性診斷和基因診斷的藥物和預(yù)防藥物（菌苗，疫苗和類毒素）。?按來源可分為天然生物材料（如人體，動植物，各種微生物和海洋生物等）基因工程技術(shù)得到的微生物或細(xì)胞。?按結(jié)構(gòu)可分為氨基酸及其衍生物，多肽和蛋白類藥物，酶和輔酶類藥物，核酸及其降解物和衍生物類藥物，糖類藥物，脂類藥物，細(xì)胞生長因子等。4生物制品與小分子藥物的區(qū)別小分子藥物生物制品?一般分子量小一般分子量大?通常是有機合成或者化學(xué)合成是從活體細(xì)胞或者組織中獲得的（存在內(nèi)在污染的風(fēng)險）?比較少的關(guān)鍵質(zhì)量工藝步驟?研究得很透徹很多關(guān)鍵質(zhì)量工藝步驟不太容易研究透徹?結(jié)構(gòu)已知不能或者不能完全定義結(jié)構(gòu)不均一性混合物（可能包括變異體）常常有免疫原性?均一性藥物?通常沒有免疫原性5ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案蛋白的尺寸和復(fù)雜性6ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案蛋白的不均一性?氨基酸取代?氨基甲?；?N或者C段修飾?二硫鍵的錯配，?折疊方式，?截短?聚體?多聚體降解?變性?羧基化?甲?；?γ谷氨酸羧化?O末端糖基化?N末端糖基化?甲基化?磷酸化?硫化?乙?；?脂肪酸?；?脫酰胺作用?氧化?PEG化7ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案蛋白結(jié)構(gòu)評價工具?氨基酸序列和修飾：質(zhì)譜，肽圖，色譜分離?折疊：二硫鍵，熱力學(xué)，氫氘交換質(zhì)譜和離子遷移質(zhì)譜，核磁共振技術(shù)，圓二色譜，傅立葉變換紅外光譜，熒光光譜?亞基相互作用：色譜法，離子遷移質(zhì)譜?尺寸不均一性：聚體和電荷異構(gòu)體?疏水性：色譜法，毛細(xì)管電泳，光散射，離子遷移質(zhì)譜，超速離心，尺寸排阻色譜，場流分級分流，光散射，顯微鏡?糖基化：陰離子交換，酶解，肽圖，毛細(xì)管電泳，質(zhì)譜8ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案ColumnsOrbitrapFusionQExactiveHFExactivePlusEMRTSQtriplequadseriesPepFinder1.0ProteinDeconvolution3.0ProSightPCSimGlycanIntactProteinNativeMSTop-down/middle-downBottom-upHDXGlycanMSIASamplePreparationKitsReagentsenzymesPinPointStandardsBioanalysis9ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案ThermoFisher液相色譜產(chǎn)品線BioColumnsMAbPacICColumnsIonPacASIonPacCSCarboPacAminoPacIonSwiftLCColumnsAccucoreAcclaimProPacHypersilGOLDSyncronisDNAPacGlycanPacProSwiftHyperCarbHypersilDNASwift10ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案蛋白藥物色譜方法一級結(jié)構(gòu)的確認(rèn)電荷異構(gòu)體疏水性特異性位點聚體和片段SEC/RP/HICRPHILICIEC/RPHIC/RPAFC11ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案蛋白藥物分析中可以使用的色譜柱GlycanPacFamilyMAbPacFamily?AXH-1?ProteinA?AXR-1?SEC-1Acclaim?SCX-10/pHgradient?AccliaimPepMapFamilyNanocolumns?HIC-10,HIC-20,HIC-Butyl?MAbPacRPProPacFamily?WCX-10EASY-Spray?AcclaimSEC-300?AcclaimSEC-1000?WAX-10BiobasicFamily?SAX-10?BiobasicSEC-60/120/300/1000?BiobasicC4/C8/C18?BiobasicSCX?SCX-10?HIC-10ProSwiftFamily?RP-1S?RP-4H12ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案MAbPacFamily?ProteinA(親和色譜分離模式）?SEC-1（尺寸排阻分離模式）?SCX-10/pHgradient（離子交換分離模式）?HIC-10,HIC-20,HIC-Butyl（疏水相互作用模式）?MAbPacRP（反相分離模式）13ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilyProteinA(親和色譜分離模式）?分離原理：中性pH條件下抗體結(jié)合在柱子上，其他雜蛋白流穿，酸性條下抗體洗脫出來。?柱子特色：1.2分鐘內(nèi)有效分離目標(biāo)抗體與雜質(zhì)，最快可以在1分鐘內(nèi)完成一個分析。2.有著極高的靈敏度可以檢測到0.025mg/mL的濃度，實際上樣量0.5ug）。3.壽命長，連續(xù)進(jìn)樣2000針，峰形良好?柱子特性參數(shù)：IgG動態(tài)載量/柱子ParticleFlowrate(ml/min)PressureTemperatur(μg)*(atColumnMAbPacProteinASize(μm)Limit(psi)e(C)pHRange1.9-7.52mL/min)122.510003010014ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案MAbPacFamilyProteinA(親和色譜分離模式）分析細(xì)胞發(fā)酵液譜圖UnboundColumn:Flowrate:EluentA:EluentB:Gradient:MAbPacProteinA,4×35mm5,2002mL/min50mMSodiumPhosphate,150mMNaCl,5%acetonitrile,pH7.550mMSodiumPhosphate,150mMNaCl,5%acetonitrile,pH2.50%Bfor0.2mins,100%Bfor0.60mins,0%Bfor1.20mins4,0003,0002,0001,000Temperature:25oCDetection:280nmInj.volume:10μLSample:Harvestcellculture(HCC)mAu0.025mg/mL-5mg/mLIgG-2000.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0Minutes15ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案MAbPacFamilyProteinA(親和色譜分離模式）?進(jìn)樣2000針以上的對比譜圖Column:MAbPacProteinA,4×35mmFlowrate:2mL/minEluentA:7.550mMSodiumPhosphate,150mMNaCl,5%acetonitrile,pH1,4001,2001,000800EluentB:2.550mMSodiumPhosphate,150mMNaCl,5%acetonitrile,pHGradient:Temperature:Detection:Inj.volume:Sample:0%Bfor0.2mins,100%Bfor0.60mins,0%Bfor1.20mins25oC280nm20μLRabbitIgG,1mg/mL#2011#1811mAu600400200#1611#1411#1211#1011#811#611#411#211#30-500.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.50Minutes16ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案MAbPacFamilyProteinA(親和色譜分離模式）?常見問題1.這根柱子的目標(biāo)應(yīng)用？?抗體滴度分析?捕集后的2D分析2.該親和柱的最大流速是多少??最高2.5mL/min.3.該親和柱能耐受最高乙腈比例是多少??最高是20%.為了延長柱子的壽命，乙腈的濃度請保持恒定。4.我能使用這款柱子進(jìn)行IgG的純化??可以的，最大可以到100μgIgG.如果純化的IgG，第二維用于IEC分析，流動相中應(yīng)該降低鹽的濃度，否則純化好的IgG可能不能結(jié)合在IEC色譜柱上。17ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案MAbPacFamilyProteinA(親和色譜分離模式）?清洗方法1.溶劑清洗方法準(zhǔn)備pH在3或者以下的緩沖液以1mL/min的流速沖洗柱子這根柱子30分鐘，然后使用上樣緩沖液平衡30分鐘2.鹽清洗調(diào)整B相鹽的濃度為1mol/L,以1mL/min的流速沖洗40-60分鐘，然后使用上樣緩沖液平衡30分鐘3.有機溶劑清洗添加10%乙腈到流動相A中，以1mL/min的流速沖洗40-60分鐘，然后使用上樣緩沖液平衡30分鐘18ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySEC-1(尺寸排阻色譜分離模式）?分離原理：樣品空間尺寸大小差異進(jìn)行分離。?柱子特色：1鍵和了親水性專利表面，能最大程度的減少了色譜柱與樣品之間的非尺寸排阻作用.2.穩(wěn)定的表面鍵合技術(shù)，低的柱流失效應(yīng)可以跟MS,ELSD以及CAD檢測器兼容。3.穩(wěn)定可靠的高端裝填技術(shù)4.分析單克隆抗體，聚體和片段有著超優(yōu)的性能?柱子特性參數(shù)：鍵合官能團硅膠基質(zhì)粒徑二醇基球形，高純，多孔硅膠5μm孔徑300?色譜柱材質(zhì)PEEK（4.0mm內(nèi)徑柱子）SST（7.8mm和2.1mm內(nèi)徑柱子）球蛋白分離范圍球蛋白排阻極限10,000-1,000,000>1,000,00019ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySEC-1(尺寸排阻色譜分離模式）?色譜柱規(guī)格規(guī)格目標(biāo)應(yīng)用應(yīng)用目的7.8×300mm單抗與聚體實現(xiàn)最高分辨率的分析精確定量單抗聚體的含量，用于QC的批次放行。4.0×300mm4.0×150mm單抗與聚體實現(xiàn)分辨率的分析用于SEC-MS分析4.0×300mm柱子跟7.8×300mm柱子對比，只需要1/4的樣品量能夠?qū)崿F(xiàn)單抗單體與聚體基線分離。2.1×300mm2.1×150mm低流速和低樣品量可以完美的跟MS聯(lián)用。20ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySEC-1(尺寸排阻色譜分離模式）分離單抗的例子mAbmonomer(a)Column:MAbPacSEC-1,5μm,a.7.8×300mmb.4.0×300mma.2.1×300mm50.040.030.020.010.00.0Dimension:AggregatesMobilephase:50mMSodiumPhosphatepH6.8,in300mMNaCl30oC0.02.55.07.510.012.515.018.0Temp.lowrate:a.760μL/minb.200μL/minc.50μL/min(b)Inj.volume:a.10μLb.5μL5025a.1μL0Detection:280nm0.02.55.07.510.012.515.018.0Sample:mAb(1mg/mL)70.060.0(c)50.040.030.020.010.00.00.02.55.07.510.012.515.018.0RetentionTime(min)21ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamily離子強度的影響:MAbPacSEC-1eColumn:Format:Mobilephase:MAbPacSEC-1,5μm7.8×300mm50mMsodiumphosphate,pH6.8and1.300mMNaCl2.200mMNaCl3.100mMNaCl4.50mMNaCl5.25mMNaCl6.0mMNaClIsocratic30oC0.76mL/min20μLUV(280nm)SECstandard25022520017515012510075dcab6.Rs=1.645.Rs=1.724.Rs=1.803.Rs=1.902.Rs=2.031.Rs*=2.02Gradient:Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:a.Thyroglobulin(bovine):0.1mg/mLb.γ-globulin(bovine):0.1mg/mLc.Ovalbumin(chicken):0.1mg/mLd.Myoglobin(horse):0.05mg/mLe.VitaminB12:0.01mg/mL50250MAbPacSEC-1column上，樣品與柱子之間存在非常低的離子性吸附，流動相鹽濃度對分離不敏感。-25-502.04.06.08.010.012.014.016.018.0RetentionTime(min)*Rs是γ-球蛋白和卵清蛋白的分離度。22ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamily非變性條件下SEC-MS分析SEC-1非變性條件下分析單抗單體與聚體Column:MAbPacSEC-1,5μm,2.1×150mm(a)Dimension:單體Mobilephase:20mMammoniumformateTemp.:30oCFlowrate:50μL/min聚體Inj.volume:1μLDetection:Samples:ExactivePlusEMRmAb(1mg/mL)+38+39(b)+40+37+26+25(c)+27+24+2823ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySEC-1快速聚體分析mAbmonomerColumn:MAbPacSEC-1,5μm,a.4.0×300mm140Dimension:(a)4.0×300mmb.4.0×150mmMobilephase:50mMSodiumPhosphatepH6.8,in300mMNaCl10075Temp.:30oCFlowrate:200μL/min50AggregatesInj.volume:2μLDetection:Sample:280nmmAb(5mg/mL)25(b)4.0×150mm300200100150mmMAbPacSEC-1柱子縮短了分析時間。-500.02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.022.025.0RetentionTime(min)24ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamily單抗片段結(jié)構(gòu)(a)(b)(c)25ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySEC-1分析單抗以及片段1mAb70.0Column:MAbPacSEC-1,5μm7.8×300mmFormat:Mobilephase:50mMsodiumphosphate,300mMNaCl,pH6.8-10.070.0F(ab)2234Gradient:IsocraticTemperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:30oCscFcFab0.76mL/min10μLUV(280nm)1.Rituximab(5mg/mL),inject2μL2.Rituximab+IdeS(2mg/mL)3.Rituximab+Papain(2mg/mL)4.Rituximab+DTT(2mg/mL)Fc-10.0140DTTmAb的片斷F(ab)2和scFc,Fc，F(xiàn)ab,HCandLC都得到了分離。HC+LCHCLC-200.05.010.015.020.0RetentionTime(min)26ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamily變性條件下SEC-MS分析SEC-1變性條件下分析單抗重鏈與輕鏈(a)FullMSoflightchain(LC)FullMSofheavychain(HC)(d)+9(b)+20+10+8+18+16+11+12+13+14+7(c)(e)G0G0+LysG1G1+LysG227ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySEC-1色譜條件ColumnID(mm)Flowrate(μL/min)UVflowcell2.150-754.07.8200-300760-1,000Micro(180nL)Semi-microAnalytical(11μL)(2.5μL)TubingID(μm)50-7511005150-25020SampleLoopSize(PullLoopWPS(μL))28ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySEC-1常見問題如果分離度比較差，請確認(rèn)以下事宜?系統(tǒng)設(shè)置:連接管路，流速，檢測池體積和進(jìn)樣方法?使用混合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品控制系統(tǒng)。Bio-radGelFiltrationStandard#151-1901?如果壓力比較高，請確認(rèn)系統(tǒng)沒有堵。29ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySEC-1(尺寸排阻色譜分離模式）清洗方法1.100%純水以200μL/min流速沖洗30分鐘。2.80%甲醇水以200μL/min流速沖洗30分鐘。.3.0.1M乙酸銨（pH5.0）緩沖液以200μL/min流速沖洗30分鐘。4.使用流動相以200μL/min流速沖洗至少30分鐘。5.如果上述操作沒有效果，可以在流動相中添加0.05%SDS沖洗柱子，使用此步驟操作后，該柱子要專柱專用6.如果色譜柱壓力很高，可以以200ul/min的流速采用反沖的方法進(jìn)行清洗。清洗時，請設(shè)置限壓保護(hù)。30ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySCX-10(強陽離子交換色譜）?分離原理：樣品電荷差異進(jìn)行分離。?柱子特色：1鍵和了親水性專利表面，能最大程度的減少了色譜柱與樣品之間的疏水相互作用.2.特定的鍵和了磺酸基官能團，保證了鍵和密度和鍵和鏈的長度。3.穩(wěn)定可靠的高端裝填技術(shù)4.配合CX-1pHbuffer緩沖液，分析蛋白樣品有著超優(yōu)的性能?柱子特性參數(shù)：鍵合官能團基質(zhì)磺酸基聚苯乙烯-二乙烯基苯3um,5μm,10um無孔粒徑孔徑色譜柱材質(zhì)PEEK（3um5um10um）SST（5umRS色譜柱）31ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySCX-10(強陽離子交換色譜）分離原理：根據(jù)樣品電荷差異進(jìn)行分離柱子規(guī)格參數(shù)：色譜柱規(guī)格推薦流速最大壓降10μm,4x250mm10μm,4x150mm10μm,2x250mm0.5to1.0mL/min0.5to1.0mL/min0.1to0.3mL/min3,000psi3000Psi3,000psi1.0to1.3mL/min(UHPLCRS,5μm,4.6x250mmRS,5μm,4.6x150mm7,000psi7,000psiinstrumentationrequired)1.0to2.0mL/min(UHPLCinstrumentationrequired)Upto2.0mL/minRS,5μm,4.6x50mmRS,5μm,2.1x250mm7,000psi7,000psiUpto0.32mL/min(UHPLCinstrumentationrequired)Upto0.42mL/min(UHPLCRS,5μm,2.1x150mmRS,5μm,2.1x50mm7,000psi7,000psiinstrumentationrequired)Upto0.42mL/min5μm,4x250mm(PEEK)5μm,4x150mm(PEEK)5μm,4x50mm(PEEK)3μm,4x50mm(PEEK)0.5-0.7mL/min0.5-1.0mL/minUpto2mL/min0.5to0.8mL/min5,000psi5,000psi5,000psi5,000psi32ThermoScientificCX-1pHGradientBuffersBufferABufferBpH值形態(tài)5.6液態(tài)10X10.2液態(tài)10X濃縮倍數(shù)?10倍純水稀釋就可以了?100%緩沖液A到100%緩沖液B可以得到一個從5.6到10.2線性的pH范圍.運輸條件儲存條件室溫室溫?通用，快速和高分辨率分析。4~8C4~8CpH梯度緩沖液是電荷變異體的分析平臺33蛋白和單抗在IEC色譜柱上的分離鹽梯度pH梯度?最廣泛使用的方法?能根據(jù)pI值進(jìn)行樣品的洗脫?配制緩沖液相對比較簡單?收集到的組分中低的鹽濃度?很多情況下可以提高分辨率?形成線性pH梯度比較困難?花費更長的時間進(jìn)行條件優(yōu)化（如pH,鹽濃度）34ZwitterionicBufferCocktail的線性pH梯度35蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在線性CX-1pH梯度緩沖液下洗脫圖MAbPacSCX-10Column,4×250mmPeaklabel:proteinname–elutionpH9011109Lectin-1-6.11pHtrace6040208CytochromeC-10.15Lectin-2-6.28RibonucleaseA-8.727Lectin-3-6.45Trypsinogen-7.7560-105400510152025303536蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在Phosphate-basedpH梯度下洗脫圖MAbPacSCX-10Column,4×250mmpH7010.09.59.08.58.07.57.06.56.05.5605040pHtrace30.20100-10051015202530354037為什么要使用pH梯度緩沖液??鹽梯度洗脫用于離子交換色譜15.010.05.0因為電荷的差異需要改變鹽的濃度30.0Saltgradient?pH梯度緩沖液特性0.0%B:10.00.0min5.010.015.020.025.030.0?快速，穩(wěn)定和重現(xiàn)性好15.010.05.0?和現(xiàn)有的陽離子交換柱和液相系統(tǒng)搭配使用50.0?操作簡單，容易實現(xiàn)自動化?可以應(yīng)用在大部分抗體上pHgradient25.00.0%B:25.00.0min5.010.015.020.025.030.038線性pH梯度緩沖液兼容性：WCX和SCX?pH梯度緩沖液可以同時用于弱陽離子交換柱(ProPacWCX-10)和強陽離子交換柱(MAbPacSCX-10)?在弱陽離子交換柱上，pH梯度緩沖液會有一些延遲。39ProPacWCX-10和MAbPacSCX-10分析標(biāo)準(zhǔn)蛋白對比譜圖25010.508.00ProPacWCX-10,4×250mm100-505.0040.00.05.010.015.020.025.030.035.035010.50MAbPacSCX-10,4×250mm2508.00125-505.0040.00.05.010.015.020.025.030.035.0RetentionTime(min)40線性pH梯度緩沖液的優(yōu)勢:通用方法?pH值從5.6-10.2是一種通用的電荷變異體分析方法?該pH梯度緩沖液可以應(yīng)用于大多數(shù)等電點在6-10之間的蛋白。?從線性曲線圖上可以得到未知蛋白的等電點。41pH洗脫值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白pI的線性曲線關(guān)系圖42pH梯度條件下標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜圖60.050.040.030.020.010.0-5.00510152025303540RetentionTime[min]43線性pH梯度條件下不同等電點的標(biāo)準(zhǔn)單抗的對比譜圖20018010.5010.009.509.008.508.007.507.006.506.005.505.00pHtrace160140120100806040200-200.05.010.015.020.025.030.035.040.0RetentionTime(min)44單抗洗脫pH值與等電點的線性曲線45pH梯度條件下分析熱賣的單抗譜圖PlatformmethodformAbchargevariantanalysis46線性pH梯度優(yōu)勢:優(yōu)化方法簡單?方法優(yōu)化簡單?通過一個緩的pＨ梯度可以得到更高的分辨率。(如.50-100%,而不是0-100%B)470–100%B梯度條件下分析單抗電荷變異體0%B100%B40.010.50(a)pHtrace30.020.010.09.008.007.006.005.00-5.00510152025303540RetentionTime[min]*ThepHtraceatelutionwasobtainedwiththeThermoScientific?Dionex?UltiMate?3000pHandConductivityMonitoringModule(PCM-3000)4825–50%B梯度條件下分析單抗電荷變異體25%B50%B16.08.007.757.507.257.00(c)pHtrace10.05.0-2.06.604005101520253035RetentionTime[min]49線性pH梯度的優(yōu)勢:快速分析?通過以下措施可以實現(xiàn)快速分析?更小的粒徑(5μm而不是10μm)?更短的陽離子交換柱(4×50mm)20分鐘內(nèi)可以實現(xiàn)單抗電荷變異體的快速分析。50快速pH梯度條件下單抗電荷變異體的分析0%B100%B25010.50pHtrace200150100509.008.007.006.005.000-500.02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.0RetentionTime(min)5110分鐘內(nèi)的超快速pH梯度洗脫0%B100%B14011.0010.009.008.007.006.0012010080pHtrace60402010-205.0010.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0RetentionTime(min)52快速分析方法開發(fā)5mingradient10mingradient3步進(jìn)行方法優(yōu)化0.8mingradient1.0100%B10分鐘線性梯度2.2040%B5分鐘線性梯度3.1827%B0.8分鐘線性梯度0.8分鐘pH梯度條件下電荷變異體的數(shù)目和分辨率53鹽梯度與pH梯度分離單抗對比譜圖15.010.05.030.0Saltgradient0.0%B:10.0min0.05.010.015.020.025.030.015.010.05.050.025.0pHgradient0.0%B:25.00.0min5.010.015.020.025.030.030mingradient,ThermoScientific?MabPac?SCX-10,10μm,4×250mmcolumn54分析核糖核酸酶A的300次進(jìn)樣重現(xiàn)性6010.50pHtrace259.008.007.006.005.00Run#3000-25Run#200-50Run#100-75Run#5-1000.02.55.07.510.012.515.017.520.0RetentionTime[min]保留時間重現(xiàn)性<0.8%RSD55CX-1pHGradientBufferKit(10X):使用簡單110Lot1(130523/130528)Lot2(130524/130529)Lot3(130531/130530)80604020-100.05.010.015.020.025.030.035.040.0RetentionTime(min)56離子交換色譜分析的一些建議?用于MAbPacSCX-10色譜柱的緩沖液要含有少量的電解質(zhì)，禁止使用純水清洗柱子。?盡量避免在流動相中使用有機溶劑，如果要使用，請保持有機溶劑含量穩(wěn)定。?HPLC系統(tǒng)避免金屬污染。?如果您想嘗試pH梯度條件，請先使用MAbPacSCX-10,10μm,4×250mm?進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(LentilLectin,RiboA,Trypsinogen,andCytC)來確認(rèn)系統(tǒng)是正常的。如果可以同時檢測pH值和電導(dǎo)率，那將會更好。?如果要快速分析，可以選擇更短的柱子(如MAbPacSCX-10,10μm,4×150mm)或者更小粒徑的柱子(如5μm).?如果您的樣品掛不到柱子上或者不能洗脫出來，請確認(rèn)蛋白的等電點和緩沖液的ｐＨ值。57ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilySCX-10(強陽離子交換色譜）?色譜柱的清洗1.對于輕度污染，使用1-2M高鹽溶液在分析完成后進(jìn)行清洗就可以了2.對于比較嚴(yán)重的污染，進(jìn)樣100-500uL或者更多進(jìn)樣體積的0.1-1MNaOH進(jìn)行清洗（在進(jìn)行此步操作時，請在緩沖液A體系下進(jìn)行，完成進(jìn)樣NaOH后，進(jìn)樣緩沖液A500ul)3.如有必要，可以使用1M的鹽酸以1ml/min的流速清洗5-30分鐘，然后使用0.1MNaOH清洗柱子，不要超過20個柱體積，然后立即使用分析流動相A相平衡柱子。4.如果有保護(hù)柱，請將保護(hù)柱和分析柱分開獨立清洗5.如果上述清洗方法無效，且有柱壓上升的現(xiàn)象，可以將柱子反接在系統(tǒng)上清洗，但是不要超過該柱子能耐受的最大壓力值。58ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilyHIC色譜柱?分離原理：樣品的疏水性差異，采用高鹽上樣，低鹽洗脫的溫和方式進(jìn)行分離。?柱子特色：1鍵和了三種不同的官能團，為蛋白的分離提供了不同的選擇性.2.高分辨率和高柱效3.穩(wěn)定可靠的高端裝填技術(shù)4.與有機溶劑和水相兼容?柱子特性參數(shù)：MAbPacHIC-10MAbPacHIC-20MAbPacHIC-ButylChemistryProprietarypolyamideProprietaryalkylamideButylSubstrateParticleSizePoresize*CapacitySpherical,highpuritysilicaparticlesSpherical,highpuritysilicaparticlesHydrophilicpolymer5μm5μm5μm1,000?28mg/mL1,000?24mg/mLNon-porous9mg/mLpHRange2.0-8.0602.0-9.02.0-12.060TemperatureLimit(°C)60OrganicCompatibilityFlowRate0-100%0-100%0.5-1.0mL/min(recommended)1.5mL/min(max)0-50%MaximumPressure6,000psi(4.6×100mm)8,000psi(4.6×250mm)6,000psi(4.6×100mm)4,000psi(4.6×100mm)8,000psi(4.6×250mm)59ThermoScientific?HICColumnSelectionGuideResindataResinTypeSilicaParticleSize5μmPoreSize1000?MAbPacHIC-10MAbPacHIC-20MAbPacHIC-ButylProPacHIC-10Silica5μm1000?PolymerSilica5μmNonporous300?5μmApplicationguideGeneralProteinsIntactmAbsmAbAggregatesmAbFragmentsOxidizedVariantsADCCys&LysMAbPacHIC-10MAbPacHIC-20ExcellentExcellentExcellentGoodGoodGoodExcellentOKGoodGoodGoodGoodOKGoodGoodOKExcellentGoodMAbPacHIC-ButylPoorExcellentPoorProPacHIC-10PoorGoodGood60SeparationofProteins80Column:Format:MAbPacHIC-10,5μm4.6×100mm4MobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.0603Gradient:Time(min)-5.00.01.015.0%A1001001000%B000100100214020.00Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:30oC1.0mL/min10μLUV(280nm)Proteinmixture1)Myoglobin20Peaks:2)RibonucleaseA3)Lysozyme4)α-ChymotrypsinogenA0048121620RetentionTime(min)61SeparationofAggregatesonMAbPacHIC-10220MonomerColumn:MAbPacHIC-10,5μm200150100504.6×100mmFormat:MobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.0Gradient:Time(min)%A%B404040100100-5.00.01.029.034.060606000mAbvariantsTemperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:30oC0.5mL/min10μL(4mg/mL)UV(280nm)MonoclonalantibodyAggregate0051015202530RetentionTime(min)62SeparationofmAbFragmentsonMAbPacHIC-2040aIntactmAbColumn:Format:MAbPacHIC-20,5μm4.6×100mmMobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.0Gradient:Time(min)-5.00.01.015.0%A6060600%B404040100100020.0060FabbPapaindigestTemperature:Flowrate:Inj.volume:30oC1.0mL/minIntactmAb:Fc5μLPapaindigest:12μLUV(280nm)a)IntactmAb(2.5mg/mL)b)Papaindigest(1mg/mL)Detection:Sample:0048121620RetentionTime(min)63Comparison–SeparationofmAbFragments40MAbPacHIC-10Format:4.6×100mmMobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.00Gradient:Time(min)-5.00.01.015.0%A6060600%B40404010010055MAbPacHIC-2020.00Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:30oC1.0mL/min12μLUV(280nm)Papaindigest(1mg/mL)040MAbPacHIC-Butyl0048121620RetentionTime(min)64FastAnalysisofmAbFragments140aIntactmAbColumn:Format:MAbPacHIC-20,5μm4.6×100mm100MobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.080Gradient:Time(min)-5.00.02.02.1%A4545450%B5555801001000%B:55%5.0050bTemperature:Flowrate:Inj.volume:30oC1.0mL/minIntactmAb:Papaindigest10012μLPapaindigest:12μLUV(280nm)a)IntactmAb(1mg/mL)Detection:Sample:80b)Papaindigest(1mg/mL)0%B:55%012345RetentionTime(min)65OxidizedmAbsMethionineandTryptophansareusuallyoxidized.66SeparationofOxidizedmAbonMAbPacHIC-2060NativemAbColumn:Format:MAbPacHIC-20,5μm4.6×250mmMobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.0Gradient:50403020Time(min)-6.00.02.030.0%A5050500%B505050100100Oxidizedvariants35.00Temperature:Flowrate:30oC0.5mL/minInj.volume:UntreatedmAb:20μL(1.25mg/mL)OxidizedmAb:20μL(1.25mg/mL)UV(280nm)Detection:Sample:UntreatedmAb100H2O2oxidizedmAb101418222630RetentionTime(min)67Antibody-DrugConjugates(ADCs)68HeterogeneityofCys-LinkedADC69Antibody-DrugConjugates(ADCs)Conjugationofdrugmimicviainterchaincysteineresidues70SeparationofCys-LinkedADConMAbPacHIC-Butyl40DAR4Column:Format:MAbPacHIC-Butyl,5μm4.6×100mmMobilephaseA:1.5Mammoniumsulfate,50mMsodiumphosphate,pH7.0/isopropanol(95:5v/v)MobilephaseB:50mMsodiumphosphate,pH7.0/isopropanol(80:20v/v)3020100Gradient:Time(min)-5.00.01.015.0%A1001001000%B000100100DAR220.00Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:25oC1.0mL/min5μL(5mg/mL)UV(280nm)Cys-conjugatedADCmimicDAR0DAR804812RetentionTime(min)162071SeparationofLys-LinkedADConMAbPacHIC-Butyl12DAR0Column:Format:MAbPacHIC-Butyl,5μm4.6×100mmMobilephaseA:1.5Mammoniumsulfate,50mMsodiumphosphate,pH7.0/isopropanol(95:5v/v)MobilephaseB:50mMsodiumphosphate,pH7.0/isopropanol(80:20v/v)Gradient:840Time(min)-5.00.01.029.0%A1001001000%B00010010029=512212=4,09634.00Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:35oC0.5mL/min5μL(5mg/mL)UV(280nm)Lys-conjugatedADCmimic05101520253034RetentionTime(min)72mAbanalysisusingMAbPacHICcolumnsADConMAbPacHIC-ButylOxidizedmAbonMAbPacHIC-20AggregatesonMAbPacHIC-10mAbFragmentsonMAbPacHIC-205min73ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilyHIC色譜柱?色譜柱的清洗HIC-10和HIC-201.以0.2mL/min的流速使用0.05%乙酸溶液清洗30個柱體積。2.以0.2mL/min的流速使用異丙醇清洗30個柱體積。3.再以0.2mL/min的流速使用0.05%乙酸清洗10個柱體積4.如果沒有解決問題，請將色譜柱反接在系統(tǒng)上重復(fù)上述操作HIC-Butyl1.以0.2mL/min的流速使用0.05%乙酸溶液清洗30個柱體積。2.以0.2mL/min的流速使用異丙醇清洗30個柱體積。3.再以0.2mL/min的流速使用0.05%乙酸清洗10個柱體積4.以0.2mL/min的流速使用純水清洗30個柱體積。5.進(jìn)200uL的0.1MNaOH3次。6.進(jìn)200uL的20%乙酸水溶液3次。7.再以0.2mL/min的流速使用純水清洗30個柱體積74ThermoFisher在蛋白藥物中的解決方案-MAbPacFamilyRP色譜柱?分離原理：樣品的疏水性差異，采用提供有機溶劑比例，洗脫樣品從而進(jìn)行分離。?柱子特色：1.是一款專用于高分辨率分析單抗和片斷(包括LC,HC,Fc,Fab,scFc,andF(ab)2)的反相色譜柱.2.可以滿足高分辨率質(zhì)譜檢測單抗變異體,單抗偶聯(lián)藥物和蛋白3.寬的pH范圍0-144.色譜柱最高使用溫度可以達(dá)到110度5.色譜柱可以使用100mmol/LNaOH：ACN=1:9清洗?柱子特性參數(shù)：官能團基質(zhì)粒徑孔徑規(guī)格苯基球形聚合物基質(zhì)，寬孔徑范圍(1,500?)4μm1,500?100mm:3.0+2.1mmID50mm:3.0+2.1mmID10mmGuardCartridges:3.0+2.1mmID75RP色譜柱分析單抗是很重要的?由于降解作用,單抗存在高度不均一性?糖基化?末端修飾?氧化?脫酰胺化?異構(gòu)化?二硫鍵的還原?聚體?LC/MS分析單抗和單抗片斷可以不需要完全降解成肽段得到這些不均一性信息.76MAbPacRP色譜柱分析蛋白的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)312010080Column:Format:MobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1MAbPacRP,4μm2.1×50mmv/v/v/)2Gradient:4Time(min)-1%A808050508080%B2020505020200.02.52.72.83.01#11010#901#801Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80oC0.6mL/min1μL-20-40-60-80#701#651#501#401UV(280nm)1.RibonucleaseA(0.5mg/mL)2.CytochromeC(0.5mg/mL)3.Lysozyme(0.5mg/mL)4.mAb(1mg/mL)#301#201#1010.000.501.001.502.002.503.00RetentionTime(min)77上樣量:1000倍上樣量對比結(jié)果2.50Column:Format:MAbPacRP,4μm2.1×50mm(a)0.02μgMobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1v/v/v/)1.25Gradient:Time(min)-10.02.52.7%A858550508585%B151550501515-0.50(b)0.2μg18.010.02.84.0Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80oC0.6mL/min1μLUV(280nm)mAb(c)2μg-20900(d)20μg500-1001.001.502.002.503.003.504.00RetentionTime(min)78高pH條件下的穩(wěn)定性1403Column:Format:MobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MAbPacRP,4μm2.1×50mmAfter6hrsof0.8MNaOHwashat80C125MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1113v/v/v/)Gradient:100882Time(min)-1.00.02.52.7%A858550508585%B1515505015154752.84.063150Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80oC0.6mL/min1μL38UV(280nm)25BeforeNaOHwash1.RibonucleaseA(0.5mg/mL)2.CytochromeC(0.5mg/mL)3.Lysozyme(0.5mg/mL)4.mAb(1mg/mL)130-200.501.001.502.002.503.003.50RetentionTime(min)79分離單抗片斷80單抗和單抗片斷分析mAb(a)140Column:Format:MAbPacRP,4μm3×50mmMobilephaseA:H2O/FA/TFA(99.88:0.1:0.02v/v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/FA/TFA(90:9.88:0.1:0.02v/v/v/v)Gradient:-20HCTime(min)0.01.011.012.0%A808055558080%B20204545202080.0(b)(c)(d)50.0LC14.015.0FabTemperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80oC0.5mL/min5μLUV(280nm)(a)trastuzumab(5mg/mL)Fc(b)trastuzumab+DTT(4mg/mL)(c)trastuzumab+木瓜蛋白酶(2mg/mL)(d)trastuzumab+半胱氨酸蛋白酶(2mg/mL)-10F(ab)2100scFc50-101.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.014.015.0RetentionTime(min)81LC/MS分析完整單抗和糖化信息Column:Format:MobilephaseA:H2O/FA/TFA(99.88:0.1:0.02v/v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/FA/TFA(90:9.88:0.1:0.02v/v/v/v)MAbPacRP,4μm3×50mmTICGradient:Time(min)0.01.011.012.0%A808055558080%B202045452020MSspectrum14.015.0Temperature:Flowrate:Inj.volume:MSDetection:MassSpec:Sample:80oC0.5mL/min1μLpositive-ionmodeQExactive?Plustrastuzumab(5mg/mL)m/zat50+82LC/MS分析還原的單抗LCHCColumn:Format:MobilephaseA:H2O/FA/TFA(99.88:0.1:0.02v/v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/FA/TFA(90:9.88:0.1:0.02v/v/v/v)MAbPacRP,4μm3×50mmTICGradient:Time(min)0.0%A808055558080%B202045452020UV1.011.012.014.015.0Temperature:Flowrate:80oC0.5mL/min1μL280nmpositive-ionmodeQExactive?PlusLCInj.volume:UVDetection:MSDetection:MassSpec:Sample:reducedtrastuzumab(4mg/mL)HC31+83分離單抗電荷變異體84DTT還原和IdeS酶解：scFc,LC和Fd85分離含有賴氨酸變異體的單抗片斷20.0Fd?Column:Format:MobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MAbPacRP,4μm3.0×50mm18.016.0MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1v/v/v/)LCGradient:14.0Time(min)0.01.011.012.0%A707060607070%B303040403030scFc,0Lys12.010.08.0scFc,1Lys14.015.0Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80oC0.5mL/min2μLUV(280nm)Infliximab+IdeS+DTT(2mg/mL)6.04.02.00.0-2.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.0RetentionTime(min)86分析單抗氧化變異體87分析含有氧化變異體的單抗片斷12.0Column:Format:MobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MAbPacRP,4μm3×50mm(a)OxidizedHCHCLCMobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.17.55.02.5v/v/v)Gradient:Time(min)0.01.011.012.0%A707060607070%B30304040303014.015.0Fd(b)Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80oC0.5mL/min2μL6.04.02.0LCUV(280nm)(a)trastuzumab+DTT(2mg/mL)(b)trastuzumab+DTT+IdeS(1mg/mL)scFcOxidizedscFc-1.01.02.53.85.06.37.58.810.011.312.513.815.0RetentionTime(min)88LC/MS分析氧化的scFcFdLCColumn:Format:MobilephaseA:H2O/FA/TFA(99.88:0.1:0.02MAbPacRP,4μm3×50mmscFc(a)TICOxidiziedscFcv/v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/FA/TFA(90:9.88:0.1:0.02v/v/v/v)Gradient:Time(min)0.01.011.012.0%A757563637575%B2525373725252525.6014.015.0+10(b)OxidizedscFcTemperature:Flowrate:Inj.volume:MSDetection:Massspec:Sample:80oC0.5mL/min2μLpositive-ionmodeQExactive?PlusOxidizedtrastuzumab,reducedbyDTTanddigestedbyIdeS(1mg/mL)2524.08(c)scFc89分離ADC藥物的DAR90PEG化蛋白分析9.0(a)Column:Format:MAbPacRP,4μm3.0×50mmMobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1v/v/v/)Gradient:6.04.02.0Time(min)0.0%A555525255555%B4545757545451.011.012.014.015.0Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80oC0.5mL/min10μLUV(280nm)(a)PEGylatedprotein(11mg/mL)14.0(b)10.0(b)de-PEGylatedprotein(1.24mg/mL)5.0-2.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.0RetentionTime(min)91示意圖DAR1DAR2DAR3DAR492WCBP圖112.0(a)Column:Format:MAbPacRP,4μm2.1×50mmMobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1v/v/v)Gradient:5.0Time(min)0.00.54.55.0%A656545456565%B3535555535355.56.0-2.025.0(b)Flowrate:Temperature:Inj.volume:Detection:Sample:0.6mL/min80oC2μLUV(280nm)a.Trastuzumabb.Trastuzumab-MMAE10.0-5.00.501.002.003.004.004.50RetentionTime(min)93分離PEG化蛋白94RPLC/UV和LC/MS分析建議和清洗方法分析建議：?系統(tǒng)評估混標(biāo):核糖核酸酶A,細(xì)胞色素C,溶菌酶，牛血清白蛋白?大多數(shù)單抗在70C到80C進(jìn)行分析.?清100mMNaOH添加在高比例有機溶劑中（如90%乙腈）.?可以在流動相中添加0.1%TFA提高分辨率.?質(zhì)譜分析時可以在流動相中添加0.1%甲酸和0.02%TFA色譜柱的清洗?100mmol/LNH4Ac清洗10個柱體積?100mmol/L焦磷酸鈉清洗100個柱體積?100mmol/LNH4Ac清洗10個柱體積?ACN:100mmol/LNH4Ac=9:1清洗20個柱體積?ACN:H2O=1:1清洗10個柱體積95糖?糖在細(xì)胞活動中起著基本作用?糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜?支鏈?電荷?翻譯過程中的修飾?糖分析的方法?HILIC(廣泛使用),RP,IEX?糖分析的挑戰(zhàn)?帶有不同電荷的糖在分析過程中峰形重疊在一起?解決方案?GlycanPacAXH-1(HILIC/WAX)或者GlycanPacAXR-1(RP/WAX)混合模式色譜柱專用于糖的分析?獨一無二的選擇性?高分辨率?高柱效(亞-2μm粒徑)?MS兼容96什么是糖?糖包括單糖，低聚糖和多糖?糖常常結(jié)合在蛋白上形成糖蛋白，結(jié)合在脂上形成糖脂)?一般的糖指的是包括10個單糖單元的有分支的和沒有分支的糖。97我們可以在哪里找到糖和糖蛋白?蛋白表面糖像指紋標(biāo)簽一樣結(jié)合在蛋白表面，其在細(xì)胞活動中起著基本作用，因此影響細(xì)胞活性。?抗體?糖基轉(zhuǎn)移酶(在糖蛋白合成中，連接了一個寡糖的酶)?糖苷酶(打破糖苷鍵的酶)98糖的復(fù)雜性?3個己糖(所有可能的糖)=1056to27648可能的三糖?6個己糖可以產(chǎn)生<10組合!!1299糖的類型?N-糖苷鍵型?糖鏈與Asn-AAx-Ser/Thr肽鏈的天冬酰胺的氨基結(jié)合。Asparagine(Asn)C(O)NH?O-糖苷鍵型?糖鏈與絲氨酸或蘇氨酸的羥基相連?其他已知的形式(很少研究）-Asn–AAx-Ser/Thr-N-Linked?酯-糖苷鍵型?連接在蛋白的C末端?色氨酸的C末端糖?S-糖苷鍵型SerineThreonineO?與半胱氨酸和甲硫氨酸的S相連(Ser)(Thr)O-Linked-Ser/Thr-100為什么研究糖鏈?治療性蛋白的需求?糖基化是生物藥物中最常見的翻譯后修飾物.?70%的臨床前和臨床階段的蛋白藥物候選藥物都經(jīng)過了糖基化?糖基化在治療性蛋白藥物中的作用:?生物活性?藥代動力學(xué)?穩(wěn)定性?免疫原性101糖基化分析的重要參數(shù)§每個寡糖中單糖的組成§糖的定量§鏈接位點分析§每個寡糖的分析§分析連接的唾液酸的數(shù)目(電荷差異)§分離結(jié)構(gòu)異構(gòu)體§觸角的類型GalactoseFucoseGlcNAc§巖藻糖基化§高甘露糖類型NeuAc(sialicacid)§半乳糖基化重復(fù)性mannose102HILIC色譜法是最常用的糖鏈分析方法?HILIC通過氫鍵的作用(結(jié)構(gòu)不同)分離糖鏈?常見的HILIC色譜柱：?TSKgelAmide-80(HPLC)?BEHGlycan(UHPLC)?Accucore150-Amide-HILIC(在HPLC系統(tǒng)上發(fā)揮UHPLC的效果)?常用的方法是使用2-AB標(biāo)記糖鏈，但是......?帶有不同電荷的糖鏈在相同的時間洗脫出來。103ThermoFisher可以提供的糖鏈分析的柱子?AccucoreAmideHILIC–分析中性糖的理想選擇?跟WatersBEHGlycan色譜柱比有著相似的選擇性和分