(19)世界知識產(chǎn)權(quán)組織(43)國際公布日2025年7月3日(03.07.2025)C12N5/04(2006.01)A61P17/00(2006.01)A61K36/815(2006.01)A61Q19/00(2006.01)A61K36/232(2006.01)A61Q19/02(2006.01)A61K36/258(2006.01)A61Q19/08(2006.01)(21)國際申請?zhí)枺篜CT/CN2024/1(22)國際申請日：2024年12月25日(25.12.2024)(25)申請語言：中文(26)公布語言：中文(30)優(yōu)先權(quán)：1層南區(qū)201210(CN)。GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,IDIR,IS,IT,JM,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KLA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,MGMU,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SASE,SG,SK,SL,ST,SV,SY,TH,TJUA,UG,US,UZ,VC,VN,WS,ZA,ZM(84)指定國(除另有指明，要求每一種可提供的地區(qū)NA,RW,SC,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),歐亞(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),歐洲(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GBHU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,ME,MK,MTPL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OAPI(BFCG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML本國際公布：一包括國際檢索報告(條約第21條(3))。(72)發(fā)明人：李萍(LI,Ping);中國上海市浦東新區(qū)中1層南區(qū)201210(CN)。張葉(ZHANG,Ye);中國區(qū)蔡倫路159號1幢1層南區(qū)201210(CN)。王靜(WANG,Jing);中國上海市浦東新區(qū)中國(上海)自由貿(mào)易試驗區(qū)蔡倫路159號1幢1層南區(qū)201210(CN)。陸天倫(LU,Tianlun);中國上海倫路159號1幢1層南區(qū)201210(CN)。(74)代理人：北京市中咨律師事務(wù)所(ZHONGZILAWOFFICE);中國北京市西城區(qū)平安里西大街26號新時代大廈7層100034(CN)。(81)指定國(除另有指明，要求每一種可提供的國家BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CCV,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,E(54)發(fā)明名稱：包含枸杞外泌體的組合物及其制備方法與應(yīng)用(57)摘要：本公開涉及制備枸杞外泌體的方法，以及通過該方法所制備得到的枸杞外泌體及其應(yīng)用。具體地，本公開的枸杞植物外泌體的制備方法包括逐層過濾步驟，所述逐層過濾步驟依次包括深層過濾和任選的膜過濾。1WO2025/140310PCT/說明書技術(shù)領(lǐng)域[0001]本公開涉及從植物如從枸杞中提取外泌體的方法、該方法提取的植物外泌體，含有其的組合物，及其在皮膚領(lǐng)域中的應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]外泌體是由細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層的一種納米顆粒，直徑通常在30-200nm,含有豐富的蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)等。外泌體能在細(xì)胞間傳遞蛋白、mRNA、microRNA等活性物質(zhì)，參與許多重要的生理、病理過程，其獨特作用已經(jīng)受到越來越多的業(yè)內(nèi)關(guān)注。[0003]目前，外泌體主要從乳源樣品、各種細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腫瘤組織的滲出液等材料中獲取。但是，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液等來源中獲取外泌體的材料來源有限、成本較高，所獲得的外泌體含量低，提純后的成本更高，這就制約了外泌體的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。[0004]各種植物也是外泌體的重要來源，且植物來源的外泌體樣納米顆粒(Plantderivedexosome-likenanoparticles,PEN)的提取率遠(yuǎn)高于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物的提取率，表明其作為納米工廠的經(jīng)濟效力。最重要的是，最近的研究表明植物外泌體可以被腸道巨噬細(xì)胞吸收，發(fā)揮細(xì)胞間通訊和免疫調(diào)節(jié)的作用I2-3。[0005]正確的提取和純化方法對于外泌體的分析至關(guān)重要，因為它們通常存在于過于復(fù)雜的基質(zhì)中。外泌體提取方法的研究不僅要考察提取物的特異性和純度，還需要考慮操作的簡單性和規(guī)模效率。目前，分離外泌體較多使用的方法包括超速離心法、聚合物沉淀法、凝膠排阻法、抗體親和沉淀法、密度梯度離心法、膜過濾等。但是每種方法都有其缺陷，比如超速離心法操作繁雜、技術(shù)難度高、耗時，分離的外泌體可能因高速離心而受損，且含有大量雜蛋白；聚合物沉淀法提取的外泌體缺乏特異性和選擇性，純度低；凝膠排阻法的技術(shù)難度較高，但難以保證分離的外泌體無菌，耗時且難以規(guī)模化；免疫親和層析通常會2WO2025/140310提高樣品的純度但會降低效率和回收率；而膜過濾其樣品特異性和純度4?；夹g(shù)主要包括微流體技術(shù)，超速離心方法、基于淀技術(shù)、和免疫親和捕獲技術(shù)，而用于分離和法主要基于用于哺乳動物來源的外泌體的既定技術(shù)如，對于差速離心，由于植物和動物之間的物來源的外泌體經(jīng)?；旌嫌械鞍踪|(zhì)、核酸聚集體和其使用密度梯度超速離心進(jìn)行進(jìn)一步純化以分離污染中存在高分子量成分，例如纖維素和淀粉，其通常會導(dǎo)致離心困難，因而，需的外泌體，但是對于植物來源的外泌體的分離并不理想。例如，雖然基于形成針對細(xì)胞外囊泡表面抗原的免疫復(fù)合物的免疫親和捕泌體的理想方法，但是，對于植物來源的外泌記蛋白和特征抗體的不足限制了該技術(shù)的應(yīng)用。因此，組合多種手段如萃取、膜過濾除雜、微濾除菌應(yīng)來獲得植物外泌體7。如上文所述，盡管超速離心法通常被認(rèn)為是外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)，可以分離出相對純的外泌體5,但超速離心方法具有諸多缺陷，且依賴于超高速離心力和持續(xù)時間、通過將顆粒沉降到底部和角質(zhì)形成細(xì)胞組成，其主要功能是保護體內(nèi)組織和液體不受外界環(huán)境影響8。3WO2025/140310使皮膚屏障功能受損9。同時皮膚也是紫外線誘導(dǎo)氧化損傷的靶器官，UVB所攜屏障破壞是抵擋皮膚光老化及皮膚病變的關(guān)鍵要素之一。素A、鈣和鐵。通常，外泌體主要負(fù)責(zé)細(xì)胞間的物質(zhì)傳遞，從而進(jìn)一步調(diào)控多種泌體的方法，以實現(xiàn)外泌體生產(chǎn)成本降低和產(chǎn)膚的有益效果。發(fā)明內(nèi)容用逐層過濾來分離提取植物外泌體的方法，該方規(guī)模(如圖1所示),且分離提純的外泌體具有較高的純度。泌體。通過分析分離所得植物外泌體的物理特分析，比較兩種方法提取的植物外泌體的區(qū)別植物外泌體含有更多的活性代謝物。當(dāng)植物原料放大10分離提取的植物外泌體的方法優(yōu)勢更加明顯。此外泌體具有典型的外泌體樣茶托形狀，蛋白含量豐富，并且在體外具有抗炎和的外泌體產(chǎn)量或粒子濃度，能防止因雜質(zhì)過多導(dǎo)致的濾膜堵塞，且能保證產(chǎn)物4WO2025/140310無菌。使用本公開的逐層過濾方法提取的植物外泌體具有典型的外泌體樣的茶托形狀，粒徑在30-200nm范圍內(nèi)，并顯示出優(yōu)異的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性。[0015]本公開的植物外泌體提取方法提適于大規(guī)模生產(chǎn)；優(yōu)選地，所述方法可以通過增加過濾的膜面積從而處理大規(guī)模生產(chǎn)所對應(yīng)的植物材料的量，例如質(zhì)量為至至100000g的植物材料。[0016]因此，一方面，本公開提供一種分離提取植物外泌體的方法，具體地通過深層過濾分離提取植物外泌體的方法，所述方法包括以下步驟：[0018]b)對獲得的植物材料進(jìn)行預(yù)處理，獲得植物粗提取液；和[0019](c)對獲得的植物粗提取液進(jìn)行逐層過濾處理，其中，在步驟(c)中，所述逐層過濾處理包括深層過濾步驟，以及任選地膜過濾步驟。[0020]在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，在步驟(c)中，所述逐層過濾步驟包括使用深層過濾，優(yōu)選地，所述深層過濾采用約1-50μm孔徑的深層過濾，更優(yōu)選為約2-30μm孔徑的深層過濾。在具體的實施方案中，在步驟(c)中，所述逐層過濾步驟包括深層過濾步驟，所述深層過濾步驟使用深層囊式過濾(優(yōu)選具有約1-50μm孔徑),更優(yōu)選所述深層囊式過濾為具有約2-30μm孔徑的深層囊式過濾。[0021]在具體的實施方案中，在步驟(c)中，所述深層過濾步驟包括使用深層過濾器，優(yōu)選地，所述深層過濾器為具有約1-50μm孔徑的深層過濾器，更優(yōu)選為具有2-30μm孔徑的深層過濾器。在具體的實施方案中，所述深層過濾器為具有1-50μm孔徑的深層囊式過濾器，更優(yōu)選為具有約2-30μm孔徑的深層囊式過濾器，例如，適用的深層囊式過濾器包括頗爾公司(PallCorporation,NY)生產(chǎn)的深層過濾器，例如為SupracapTMDepthFilter[0022]在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，所述逐層過濾還包括在深層過濾步驟之后進(jìn)行的至少一個膜過濾步驟，優(yōu)選地，所述膜過濾包括防堵塞膜過濾，或者還進(jìn)一步包括除菌膜過濾，例如進(jìn)行孔徑在約0.4-0.8μm的防5WO2025/140310堵塞膜過濾和/或孔徑在約0.1-0.3μm的除菌膜過濾，更優(yōu)選地，膜過濾包括約0.45-0.8μm的膜過濾和約0.1-0.22μm的膜過濾，最優(yōu)選地，膜過濾由依次進(jìn)行的約0.45μm的防堵塞膜過濾和約0.22μm的除菌膜過濾組成。[0023]在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，所述深層過濾、0.45μm的膜過濾和0.22μm的膜過濾的流速為約20-1000mL/min,例如約20-500mL/min、約20-200mL/min、約30-100mL/min。[0024]在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，所述步驟(c)的逐層過濾由本公開一般或具體或優(yōu)選定義的深層過濾和本公開一般或具體或優(yōu)選定義的膜過濾組成。[0025]在一種本公開的分離提取植物外泌體的方法實施方案中，在步驟(b)中，所述預(yù)處理包括混合、粉碎、研磨、攪拌、過濾、離心中的一種或多種，以獲得植物粗提取物。在具體的實施方案中，所述預(yù)處理包括混合、粉碎、過濾和離心。[0026]在具體的實施方案中，所述步驟(b)中的混合使用水性溶液，例如水溶液；優(yōu)選地，所述水溶液為等滲水溶液；更優(yōu)選地，所述等滲水溶液為等滲氯化鈉水溶液，例如氯化鈉注射液。[0027]在具體的實施方案中，所述步驟(b)可以在任何合適的溫度進(jìn)行。例如，所述步驟(b)可以在以下溫度進(jìn)行：約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、820℃、25℃、30℃、35℃或40℃,或者約0℃至約40℃內(nèi)的任意子范圍(例如，任意兩個上述溫度之間的任意范圍),優(yōu)選約2-30℃、較優(yōu)選2-20℃,更優(yōu)選2-8℃,最優(yōu)選4℃。在一些實施方案中，可以在環(huán)境溫度(例如25℃)下進(jìn)行本公開的所述步驟(b)。[0028]在本公開的方法實施方案中，所述植物材料可以是陸生或水生的。優(yōu)選地，所述植物材料選自枸杞、人參、石斛、和/或當(dāng)歸。[0029]另一方面，本公開提供一種植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體),其通過前述一般或優(yōu)選定義的方法實施方案所制備，或源自枸杞、人參、石斛、和/或當(dāng)歸；優(yōu)選地，所述外泌體具有約30-450nm的直徑，優(yōu)選約30-250nm的直徑，更優(yōu)選具有約30-200nm的直徑；和/或所述外泌體具有茶托形狀；和/或所述外泌體與超速6WO2025/140310離心方法所制備的植物外泌體相比在以下一個或多個方面具有更多的代謝物：脂質(zhì)和脂質(zhì)樣分子、有機氧化合物、苯丙烷和聚酮、有機雜環(huán)化合物、有機酸及其衍生物和/或苯類化合物。[0030]另一方面，本公開提供一種植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)組合物，例如外泌體溶液，包含通過本公開一般或優(yōu)選定義的方法制備的植物外泌體，以及任選的適合的賦形劑或載體，所述賦形劑或載體就營養(yǎng)保健、藥學(xué)、食品、皮膚病學(xué)和/或化妝品而言是可接受的。[0031]在一種具體的實施方案中，所述外泌體組合物是藥物組合物。在具體的實施方案中，所述外泌體組合物包含本公開方法制備的枸杞外泌體、人參外泌體、石斛外泌體和當(dāng)歸外泌體中的至少一種；和任選的藥學(xué)上可接受的載體。[0032]另一方面，本公開提供一種組合物，其包含枸杞外泌體；可選地所述組合物還包含人參外泌體，和/或當(dāng)歸外泌體；優(yōu)選地所述組合物不含有石斛外泌體。[0033]另一方面，本公開提供一種組合物，其包含枸杞外泌體、人參外泌體、石斛外泌體和當(dāng)歸外泌體中的任意一種、任意兩種、任意三種、或者四種。[0034]在一種具體的實施方案中，所述組合物包含枸杞外泌體和人參外泌體。[0035]在一種具體的實施方案中，所述組合物包含枸杞外泌體和當(dāng)歸外泌體。[0036]在一種具體的實施方案中，所述組合物包含枸杞外泌體、當(dāng)歸外泌體和人參外泌體。[0037]在一種具體的實施方案中，所述枸杞外泌體、人參外泌體、石斛外泌體和當(dāng)歸外泌體中的至少一種是通過本公開的方法制備得到，或分別源自枸杞、人參、石斛、當(dāng)歸。[0038]在一種具體的實施方案中，所述組合物包含枸杞外泌體、人參外泌體、石斛外泌體和當(dāng)歸外泌體，其中任意兩種外泌體之間的粒子數(shù)比例范圍為約1:101?-101:[0039]在一種具體的實施方案中，所述組合物包含枸杞外泌體和當(dāng)歸外泌體，其中枸7WO2025/140310[0040]在一種具體的實施方案中，枸杞外泌體的粒子數(shù)與當(dāng)歸外泌體的粒子數(shù)的比例范圍為約至少1:1,優(yōu)選枸杞外泌體的粒子數(shù)與當(dāng)歸外泌體的粒子數(shù)的比例為約[0041]在一種具體的實施方案中，所述組合物包含枸杞外泌體和人參外泌體，其中枸杞外泌體的粒子數(shù)與人參外泌體的粒子數(shù)的比例為約101?:1、10?:1、10?:1、10?:[0042]在一種具體的實施方案中，枸杞外泌體的粒子數(shù)與人參外泌體的粒子數(shù)的比例范圍為約至少1:1。[0043]在一種具體的實施方案中，枸杞外泌體的粒子數(shù)與人參外泌體的粒子數(shù)的比例[0044]在一種具體的實施方案中，所述組合物包含枸杞外泌體和人參外泌體，其中該組合物相比每種組分的外泌體具有提高的皮膚修護作用或?qū)寡趸饔茫瑑?yōu)選地枸杞外泌體與人參外泌體的粒子數(shù)比例為約3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4,例[0045]在一種具體的實施方案中，所述組合物包含枸杞外泌體和當(dāng)歸外泌體，其中該組合物相比每種組分的外泌體具有提高的皮膚修護作用或?qū)寡趸饔?，?yōu)選地枸杞外泌體與當(dāng)歸外泌體的粒子數(shù)比例為約3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4,例[0046]在一種具體的實施方案中，所述組合物包含枸杞外泌體、當(dāng)歸外泌體和人參外泌體，且枸杞外泌體、當(dāng)歸外泌體和人參外泌體之間的粒子數(shù)比例為約1:1:1。[0047]另一方面，本公開提供一種植物外泌體組合物，包含根據(jù)本公開的方法制備的植物外泌體或組合物，以及任選地適合的賦形劑或載體。8WO2025/140310[0048]在一種具體的實施方案中，所述植物外泌體組合物為藥物組合物、食品組合物、美容或化妝品組合物或營養(yǎng)保健組合物。[0049]在一種具體的實施方案中，所述外泌體組合物是食品組合物，其包含通過本公開一般或優(yōu)選定義的方法所制備的植物外泌體，以及任選的其他食物成分和/或可食用賦形劑和/或載體。在具體的實施方案中，所述食品組合物包含由本公開方法所制備的枸杞外泌體、人參外泌體、石斛外泌體和當(dāng)歸外泌體中的至少一種，以及任選的其他食物成分和/或可食用賦形劑和/或載體。在一種具體的實施方案中，所述外泌體組合物是美容(或化妝品)組合物，其包含通過本公開一般或優(yōu)選定義的方法所制備的植物外泌體，以及任選地美容/化妝品可接受的賦形劑或載體。在具體的實施方案中，所述美容性組合物包含由本公開方法所制備的枸杞外泌體、人參外泌體、石斛外泌體和當(dāng)歸外泌體中的至少一種，以及至少一種美容/化妝品可接受的賦形劑或載體。[0050]在一種具體的實施方案中，所述外泌體組合物是營養(yǎng)保健組合物，其包含通過本公開一般或優(yōu)選定義的方法所制備的植物外泌體，以及任選地營養(yǎng)保健可接受的賦形劑或載體。在具體的實施方案中，所述營養(yǎng)保健組合物包含由本公開方法所制備的枸杞外泌體、人參外泌體、石斛外泌體和當(dāng)歸外泌體中的至少一種，以及至少一種營養(yǎng)保健可接受的賦形劑或載體。另一方面，本公開還提供由本公開方法所制備的植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)或包含其的組合物(包括但不限于藥物組合物/食品組合物/美容或化妝品組合物/營養(yǎng)保健組合物)的用途，其用于治療或預(yù)防一或有助于(或輔助用于)改善、緩解或控制—炎癥、優(yōu)選皮膚炎癥，或在皮膚學(xué)領(lǐng)域用于—或輔助用于一修護、抗炎、抗氧化、抗衰老、美白或保濕。[0051]另一方面，本公開還提供由本公開方法所制備的植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)或包含其的組合物(包括但不限于藥物組合物/食品組合物/美容組合物/營養(yǎng)保健組合物)在制備產(chǎn)品(藥物、食品、營養(yǎng)保健品、美容/化妝品等)中的用途，所述產(chǎn)品用于治療或預(yù)防—或有助于(或輔助用于)改善、緩解或控制—炎癥、優(yōu)選皮膚炎癥，或在皮膚學(xué)領(lǐng)域用于或輔助用于修護、抗炎、抗氧化、抗衰老、美白或保濕。9WO2025/140310PCT/[0052]另一方面，本公開提供一種治療或預(yù)防炎癥、優(yōu)選皮膚炎癥、或治療或預(yù)防皮膚學(xué)癥狀、或輔助用于改善、緩解或控制皮膚學(xué)癥狀的方法，其包括向有需要的對象施用通過前述一般或優(yōu)選定義的方法所制備的植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)或包含其的組合物(藥物組合物/食品組合物/美容或化妝品組合物/營養(yǎng)保健[0053]另一方面，本公開提供上述植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)或植物外泌體組合物在生物醫(yī)藥或藥物遞送系統(tǒng)中的用途。[0054]另一方面，本公開還提供制備藥物、食品、營養(yǎng)保健品、美容/化妝品組合物的方法，包括根據(jù)本公開一般或優(yōu)選定義的方法制備得到植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體),并將所述植物外泌體摻入所述藥物、食品、營養(yǎng)保健品、美容/化妝品組合物中。附圖說明[0055]以下附圖示例了本公開的優(yōu)選實施方案。出于說明本公開的目的，圖中顯示了目前優(yōu)選的實施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本公開不限于圖中所示具體實施方案。[0056]圖1顯示本公開植物外泌體分離提取方法的示例性步驟流程。[0057]圖2A-F顯示本公開逐層過濾方法提取的六種植物外泌體的化合物分類；A:GQV01;B:RSV01;C:SHV01;D:HJV01;E:D[0058]圖3A-F顯示采用超速離心方法提取的六種植物外泌體的化合物分類；A:LyE0[0059]圖4顯示使用逐層過濾和超速離心提取的六種植物外泌體差異代謝物火山圖；A:GQV01vsLyE01;B:RSV01vsGsE01;C:SHV01vsDeE01;D:HJV01vsPoE01;E:DGV01vsAnE01;F:DHV01vsReE01。橫坐標(biāo)為代謝物在兩組間表達(dá)差異的倍數(shù)變化值，即log2FC;縱坐標(biāo)為代謝物表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計學(xué)檢驗值，即-log10(p值)值，橫縱坐標(biāo)的數(shù)值都做了對數(shù)化處理。[0060]圖5A-F顯示使用逐層過濾和超速離心提取的六種植物外泌體KEGG通路富集分析圖；A:GQV01vsLyE01;B:RSV01vsGsE01;C:SHV01vsDeE01;DJV01vsPoE01;E:DGV01vsAnE01;F:DHV01vsReE01。橫坐標(biāo)表示通路名WO2025/140310rm越顯著富集，其中P值<0.001的標(biāo)記為***、P值<0.01的標(biāo)記為**.P值<0.0C:SHV01;D:HJV01;E:D對GQV01的分析圖的體外PKH67染色流式檢測。白濃度。B:六種植物外泌體抑制LPS誘導(dǎo)的RA外泌體TNF-α釋放抑制率?？v坐標(biāo)為Elisa試劑盒檢測到的TNF-α中P值<0.001的標(biāo)記為***,P值<0.01的標(biāo)記為**。[0065]圖10顯示了枸杞對經(jīng)UV照射3D皮膚模型的修護作用。A.3D皮膚模型組織形態(tài)定量分析；D.TEWL檢測結(jié)果。用t-test方法進(jìn)行統(tǒng)計分析時，與BC組相比，顯著性以#表示，#:P-value<0.05,##:P-value<0.01;與NC組相比，顯著性以表示，*:P-value<0.05,**:P-value<0.01。其中Con為正常未經(jīng)UV照射B.FLG、LOR、CLDN1相對積分光密度(IOD)值定量分析。用t-test方法進(jìn)行統(tǒng)計分析時，與BC組相比，顯著性以#表示，#:P-value<0.05,##:P-value<WO2025/1403100.01;與NC組相比，顯著性以*表示，*:P-value<0.05,**:P-value<0.01。其中正常組(con),UV建模組(UV),陽性對照組(WY14643),藥物處理組(GQ)。[0067]圖12顯示枸杞對經(jīng)UV照射的3D皮膚模型保濕作用的影響。A.水通道蛋性以#表示，#:P-value<0.05,##:P-value<0.01;與NC組相比，顯著性以*表示，*:P-value<0.05,**:P-value<0.01。其中正常組(con),UV建模組(U法進(jìn)行統(tǒng)計分析時，與BC組相比，顯著性以#表示，#:P-value<0.05,##:P-value<0.01;與NC組相比，顯著性以*表示，*:P-value<0.05,*:P-value<0.01。其中正常組(con),UV建模組(UV),陽性對照組(WY14643),藥物處理GQ:枸杞；DG:當(dāng)歸；RS:人參；SH:石斛；mix1:GQ:DG:RS:SH=1:1:x中各組分濃度根據(jù)顯示比例換算);B.A圖WB結(jié)果的半定量分析。合植物已于圖中標(biāo)記(con:空白對照組；UV:紫外照射GQ:枸杞；DG:當(dāng)歸；RS:人參；SH:石斛；mix1:GQ:Dix2:GQ:DG:SH=1:1:1;mix3:GQ:RS:SH=1:1:1;mix4:其中GQ、DG、RS、SH、mix1、mix2、mix3和mix4組中外泌體的總濃度均為1xWO2025/140310GQ:枸杞；DG:當(dāng)歸；RS:人參；mix1:GQ:DG=1:1;mix2:GQ:RS=1:總濃度均為1x10?個/ml,每個mix中各組分濃度根據(jù)顯示比例換算);B.A圖WB結(jié)[0072]圖17枸杞、當(dāng)歸外泌體及其混合物，以及枸杞、人參外泌體及其混合物G=1:1;1:3:GQ:DG=1:3;3:1:GQ:DG=3:1,其中GQ、DG、各混合物中外泌體的總濃度均為1x108個/ml,每個組合中各組分濃度根據(jù)顯示比例換算);B.AS=1:3;3:1:GQ:RS=3:1,其中GQ、RS、各混合物中08個/ml,每個組合中各組分濃度根據(jù)顯示比例換算);D.C圖WB結(jié)果的半定量分熒光成像結(jié)果的定量分析，差異性分析使用雙尾Student'sT檢驗，#表示數(shù)據(jù)組的差異，***:P-value<0.001;****:P-value<0.0001,其中GQ、RS、各組合物中外泌體的總濃度均為1×10?個/mL,每個各組合物中各組分濃度根據(jù)顯示比WO2025/140310熒光成像結(jié)果的定量分析，差異性分析使用雙尾Student'sT檢驗，#表示的差異，***:P-value<0.0001,其中GQ、DG、各組合物中外泌體的總濃度[0076]I定義和術(shù)語[0078]本公開上下文所用的“囊泡”,也稱為細(xì)胞外囊泡，是膜包圍的結(jié)構(gòu)，其被細(xì)胞釋放到體外和體內(nèi)。細(xì)胞外囊泡可以含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，并且可以在m,有時候也可以為30-150nm或30-100nm,具有雙層膜結(jié)構(gòu)和茶托狀形態(tài)。[0081]如本文上下文所使用的“深層過濾(depthfiltration,DF)”意指使用深層過濾介質(zhì)和哺乳動物細(xì)胞懸液的初步澄清，可單獨使用或與離心結(jié)合使用。深層過濾介WO2025/140310如聚合樹脂)。在一些實施方案中，中等大小的顆粒被深層過濾去除較少；非常小的顆粒通過布朗擴散(加上吸附)被有效地去除(例如小于介質(zhì)空隙的顆?？蛇M(jìn)入到介質(zhì)內(nèi)部),而非常大的顆粒則通過物理篩分或攔截被捕獲(例如被截留并附著[0082]本文所使用的術(shù)語“深層過濾器”或“深層囊式過濾器”是在過濾器材料的深層內(nèi)實現(xiàn)過濾。這樣的過濾器是那些包含結(jié)合以形成復(fù)雜的曲折的流動通道迷宮的隨機纖維基質(zhì)的過濾器。這些過濾器中的顆粒分離是由被纖維基質(zhì)誘捕或吸附到纖維基質(zhì)上造成的。最頻繁使用的用于細(xì)胞培養(yǎng)肉湯和其他進(jìn)料的生物工藝的深層過濾器介質(zhì)包括纖維素纖維、助濾器諸如DE和帶正電荷的樹脂粘合劑。不同于絕對過濾器，深層過濾器介質(zhì)使顆粒保留在整個多孔介質(zhì)中，從而允許滯留大于孔徑的顆粒。目前行業(yè)內(nèi)擁有深層過濾介質(zhì)產(chǎn)品的公司包括賽多利斯、默克密理博、頗爾(PALL)、3M等公司。可商購的深層過濾器包括但不限于Millistak+Pod深層過濾器系統(tǒng)、XOHC介質(zhì)(Millipore公司)濾器(3MPurification公司)等。在本公開中，深層過濾可使用平行排列的兩個或更多個深層過濾器進(jìn)行。在這種情況下，可商購的深層過濾器可包括例如Millistak+miniDOHC(Millipore公司)和XOHC過濾器(Millipore公司)或頗爾公司過濾器(PallcorporationNY),如Supra[0083]在本文上下文中，術(shù)語“化妝品”、“化妝品組合物”、“美容產(chǎn)品”或“美容組合物”是指以涂抹、噴灑或者其他類似方法，散布于人體表面的任何部位如皮膚、毛發(fā)、指趾甲、唇齒等，以達(dá)到清潔、保養(yǎng)、美容、修飾和改變外觀、或者修正人體氣味、保持良好狀態(tài)為目的的化學(xué)工業(yè)品或精細(xì)化工產(chǎn)品。在一些實施方案中，本公開的化妝品、化妝品組合物、美容產(chǎn)品或美容組合物為非治療目的。[0084]在本文上下文中，術(shù)語“營養(yǎng)保健組合物”是指用于補充人體營養(yǎng)素需求、提高身體健康狀況和身體機能的產(chǎn)品，可通過胃腸道或胃腸外施用，通常通過胃腸道施用。[0085]在本文上下文中，“皮膚”應(yīng)理解為是包括其、從最上層或角質(zhì)層到最下層或皮下層(包含最上層或角質(zhì)層以及最下層或皮下層兩者)的層。這些層由不同類型WO2025/140310的細(xì)胞構(gòu)成，如角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑素細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)元和/或脂肪細(xì)胞等。術(shù)語“皮膚”也包括頭皮。術(shù)語“皮膚”包含哺乳動物的皮膚并且包含人體皮膚。同樣，術(shù)語“毛發(fā)、指甲和粘膜”包含哺乳動物(例如人類)的毛發(fā)、指甲和粘膜。[0086]在本文的上下文中，術(shù)語“治療”涵蓋治療方法，包含涉及施用根據(jù)本公開的提取物以減輕或消除疾病或病癥或減少或消除與所述疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的方法。術(shù)語“治療”還涵蓋涉及減輕或消除疾病或病癥的生理后果的治療方法。[0087]在本文的上下文中，術(shù)語“護理”是指維持皮膚、毛發(fā)、指甲和/或粘膜的特性。通過在健康受試者以及在具有敏感性皮膚的受試者以及表現(xiàn)出皮膚、毛發(fā)、指甲和/或粘膜癥狀(例如但不限于潰瘍和皮膚損傷、牛皮癬、皮炎、痤瘡或酒渣鼻等)的受試者中進(jìn)行美容性處理和/或護理來改善或維持所述特性。[0088]在本文的上下文中，當(dāng)術(shù)語“治療”和“護理”帶有修飾語“美容性”和/或“非治療性”時，意味著所述治療或護理的目的是有助于或輔助用于改善、緩解或控制所涉及的病狀，例如有助于或輔助用于改善或維持皮膚、毛發(fā)、指甲和/或粘膜的美容特性，該特性會影響皮膚、毛發(fā)、指甲和/或粘膜的美學(xué)外觀，具體地例如有助于或輔助用于修護、抗炎、抗氧化、抗衰老、美白或保濕等，以改善皮膚、毛發(fā)、指甲和/或粘膜的水合作用、彈性、緊致度、光澤、色調(diào)或質(zhì)地。[0089]在本文的上下文中，術(shù)語“預(yù)防”是指本公開的提取物預(yù)防、延緩或阻礙疾病或病癥的出現(xiàn)或發(fā)展、或預(yù)防、延緩或阻礙皮膚、粘膜和/或毛發(fā)的美容特性變化的能力。如本公開中所使用的，術(shù)語“預(yù)防”可與術(shù)語“抑制發(fā)生”互換使用，也就是說，其是指本公開的提取物抑制疾病或病癥的出現(xiàn)或發(fā)展、或抑制皮膚、毛發(fā)、指甲和/或粘膜的美容特性變化的能力。[0090]在本文的上下文中，當(dāng)對于特定數(shù)值或值范圍使用時，術(shù)語“約”意味著與其聯(lián)用的數(shù)值浮動±10%,例如浮動±5%、±2%或±1%。舉例而言，如本文所使用的表述“約100”包括90和110和其間的所有值(例如90.5、95、101、105、109.95……等)。對于比例而言，術(shù)語“約”用于限定所給出的比例的每個數(shù)字，WO2025/140310例如，比例“約1:1”是指比例為(0.9-1.1):(0.9-1.1),再例如“約n-m”或“約n-約m”的范圍是指90%n-110%n至90%m-110%m。[0091]類似或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于本公開的實踐或測試中，以下描述的方法和材料僅為示例性的。T00921本說明書中所提及的所有專利、申請和非專利出版物均以全文引用的方式并入本文中。[0095]本公開的方法所涉及的原料為植物材料。優(yōu)選地，植物材料可以是陸生的(例如枸杞、人參、石斛、和/或當(dāng)歸)。更優(yōu)選地，所述植物材料為枸杞。[0096]所述植物材料可以是植物的部分或者全部，例如可以選自木材、根、根莖、樹皮、樹干、花、花瓣、萼片、種子、果實、莖、葉和/或胚芽及其中一種以上的混合物。在一些實施方案中，植物材料包括枸杞、人參、石斛、黃精、當(dāng)歸、地黃或其中一種以上的混合物。[0097]在一些實施方案中，植物材料包括枸杞(LyciumchinenseMiller),為茄科枸杞屬多年生木本植物?？捎糜诒竟_方法的枸杞的形式包括干枸杞、枸杞粉、枸杞提取物、其生理上可接受的鹽及其衍生物?？捎糜诒竟_方法的枸杞包括但不限于寧夏枸杞、中國枸杞、黑果枸杞、新疆枸杞、截萼枸杞、柱筒枸杞、云南枸杞、昌吉枸杞。此外，枸杞還包括枸杞變種，例如黃果枸杞、北方枸杞或紅枝枸杞。本公開方法可以使用一種以上枸杞的混合物作為植物材料進(jìn)行外泌體的提取。[0098]在一些實施方案中，植物材料為或包括人參(PanaxginsengC.A.Mey.),是五加科、人參屬(genusPanax)多年生草本植物?？捎糜诒竟_方法的人參可以是人參屬植物的種子、根、莖、葉、和果實中的一種或多種，優(yōu)選根，優(yōu)選干的人參根，或者各種炮制后的中藥飲片人參。具體地，人參屬中的植物可以是高麗參(P南參(Panaxvietnamensis)等。具體地，可用于本公開方法的人參可以是園參(栽培WO2025/140310參)或山參(野生參),具體地包括生曬參、糖參、生曬山參、紅參、白參等。本公開方法可以使用一種以上人參或一種以上人參部位的混合物作為植物材料進(jìn)行外泌體的提取。[0099]在一些實施方案中，植物材料為或包括枸杞(LyciumchinenseMiller),為茄科枸杞屬多年生木本植物?？捎糜诒竟_方法的枸杞的形式包括干枸杞、枸杞粉、枸杞提取物、其生理上可接受的鹽及其衍生物?？捎糜诒竟_方法的枸杞包括但不限于寧夏枸杞、中國枸杞、黑果枸杞、新疆枸杞、截萼枸杞、柱筒枸杞、云南枸杞、昌吉枸杞。此外，枸杞還包括枸杞變種，例如黃果枸杞、北方枸杞或紅枝枸杞。本公開方法可以使用一種以上枸杞的混合物作為植物材料進(jìn)行外泌體的提取。[0100]在一些實施方案中，植物材料為或包括當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv.)Diels),是傘形科當(dāng)歸屬多年生草本植物?？捎糜诒竟_方法的當(dāng)歸特別地是其當(dāng)歸根，例如干燥的根，其形式包括但不限于粉狀、片狀或塊狀?？捎糜诒竟_方法的當(dāng)歸的種類包括但不限于秦當(dāng)歸、川當(dāng)歸、西當(dāng)歸、云當(dāng)歸、東當(dāng)歸、臺灣當(dāng)歸、川當(dāng)歸、岷縣當(dāng)歸、北海當(dāng)歸、大和當(dāng)歸、韓國當(dāng)歸等。本公開方法可以使用一種以上當(dāng)歸的混合物作為植物材料進(jìn)行外泌體的提取。[0102]在一些實施方案中，所述提取方法包括對植物材料(優(yōu)選枸杞)進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，包括物理、化學(xué)、和生物的預(yù)處理，或它們的任意組合。[0103]在一些實施方案中，所述預(yù)處理包括但不限于清洗、與等滲溶液進(jìn)行混合、粉碎、研磨、攪拌、過濾、離心中的一種或多種。優(yōu)選地，預(yù)處理在無菌環(huán)境中進(jìn)行。[0104]在一些實施方案中，所述預(yù)處理的清洗可以用水性載體或其他可食用或可藥用溶劑(包括有機溶劑或無機溶劑)進(jìn)行。優(yōu)選地，清洗劑為水性載體。水性載體是本領(lǐng)域已知的，其包括但不限于無菌水、注射用水或等滲溶液?？蛇x地，清洗處理還包含一定量的表面活性劑在清洗溶劑中。更優(yōu)選地，清洗劑為水或注射用水。WO2025/140310[0105]在一些實施方案中，所述預(yù)處理中用到的等滲溶液包括等滲劑的溶液。等滲溶液包括但不限于氯化鈉溶液、磷酸鹽緩沖液、林格注射液、等滲的葡萄糖注射液、葡萄糖和乳酸鹽的林格注射液。等滲劑包括選自氯化鈉、甘露醇、乳糖、葡萄糖(含水或無水)、蔗糖、甘油和山梨糖醇或上述的任何一種的溶液的等滲劑。在某些實施方案中，氯化鈉以等滲的量存在。優(yōu)選地，等滲溶液為含有9mg/ml(或0.9%)氯化鈉的無菌溶液或氯化鈉注射液。[0106]在一些實施方案中，將植物材料(優(yōu)選枸杞)與等滲溶液以一定比例進(jìn)行混合。例如，按照以下質(zhì)量體積比(w/v,g/mL,植物質(zhì)量：等滲溶液體積)將植物材料與0、約1:100、約1:200或約1:500。優(yōu)選地，植物材料與等滲溶液的質(zhì)量體積比的[0107]在一些實施方案中，所述預(yù)處理中的粉碎包括本領(lǐng)域已知的任何合適的方式，包括但不限于干磨、濕磨和振動球磨。例如，粉碎包括采用粉末化技術(shù)或破壁化技術(shù)對植物或部分進(jìn)行粉碎處理。所述破壁化技術(shù)采用破壁機。[0108]在一些實施方案中，可以在任何合適的溫度進(jìn)行所述預(yù)處理。例如，所述預(yù)處理可以在以下溫度進(jìn)行：約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、925℃、30℃、35℃或40℃,或者約0℃至約40℃內(nèi)的任意子范圍(例如，任意兩個上述溫度之間的任意范圍),優(yōu)選約2-30℃、較優(yōu)選約2-20℃,更優(yōu)選約2-8℃,最優(yōu)選約4℃。在一些實施方案中，可以在環(huán)境溫度(例如約25℃)下進(jìn)行本公開的所述步驟(b)。[0109]在一些實施方案中，所述預(yù)處理中的攪拌、過濾或離心操作可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體需要進(jìn)行選擇并調(diào)整。[0110]逐層過濾[0111]本公開的植物外泌體提取方法，包括逐層過濾的步驟。[0112]本公開方法的逐層過濾包括至少一個過濾步驟，優(yōu)選多個過濾步驟，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10甚至更多個過濾步驟。在一些實施方案中，例如，WO2025/140310逐層過濾可以包括3個過濾步驟。在一些實施方案中立進(jìn)行或者連續(xù)進(jìn)行。在一些實施方案中，逐層過濾更優(yōu)選地逐層過濾步驟包括深層過濾步驟、防生產(chǎn)批次，本公開的方法處理植物的速率范圍為約30g/小時、50g/小時、60g/小時、70g/小時、80g/小時、90g/小時、100g/小時、200g/小時、300g/小時、400g/小時、500g/小時、600g/小時、700g/小時、800g/小時、900g/小時、1,000g/小同過濾步驟之間的過濾孔徑不同。在一些實施方案中，逐層過濾包括1個過濾步驟，其中該過濾步驟使用兩種不同孔徑的過濾單元，m。在一些實施方案中，逐層過濾包括2個過濾步驟，其中第一過濾步驟中的孔徑與第二過濾步驟中的孔徑不同，例如，沿過濾液流第一過濾步驟中的孔徑、第二過濾步驟中的孔徑和第全相同或至少部分不同，優(yōu)選，沿過濾液流體方向該WO2025/140310PCT/μm、約0.03μm、約0.02μm和約0.01μm;過濾步驟中的孔徑的范圍可以是上述任何兩個孔徑組成的范圍，例如但不限于約0.05-2μm、0.05-1μm、0.05-0.m、9-10μm,優(yōu)選逐層過濾的孔徑可分別選自約1-50μm、2-30μm、2-20μ8μm。在一些實施方案中，更優(yōu)選地，過濾步驟中的孔徑可選自約1-50μm、0.4-0.8μm和0.1-0.3μm,或其組合，例如約0.22μm,例如約6-30μm、約0.[0116]在本公開方法中，逐層過濾中的過濾步驟可以在一個設(shè)備中進(jìn)行，其中所述設(shè)備包括多個具有過濾功能的單獨單元。在一些實施方案中，逐層過濾可以在兩個或以上的設(shè)備中進(jìn)行，其中每個設(shè)備包括一個或多個具有過濾功能的單獨單元。在一些實施方案中，逐層過濾可以在一個設(shè)備中進(jìn)行，其中所述設(shè)備包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400和500個具有過濾功能的單獨單元。WO2025/140310溶劑，例如水、氯化鈉等滲水溶液、乙醇、丙例如，所述溶劑可以具有范圍為約例如1mL/分鐘、2mL/分鐘、3mL/分鐘L/分鐘、5mL/分鐘、6mL/分鐘、7mL/分鐘、8mL/分鐘、9mL/分鐘、10mL/分鐘、15mL/分鐘、20mL/分鐘、25mL/分鐘、30mL/分鐘、35mL/分鐘、40mL/分鐘、45mL/分鐘、50mL/分鐘、60mL/分鐘、70mL/分鐘、80mL/分鐘、90mL/分鐘、100mL/分鐘、200mL/分鐘、300mL/分鐘、400mL/分鐘、500mL/分鐘、600mL/分鐘、700mL/分鐘、800mL/分鐘、900mL/分鐘或1,000mL/分鐘，或者約1m約1mL/分鐘至約500mL/分鐘、約1mL/分鐘至約200mL/分鐘、約10mL/分鐘至約1,000mL/分鐘、約10mL/分鐘至約800mL/分鐘、約10mL/分鐘至約500鐘、約10mL/分鐘至約200mL/分鐘、約20mL/分鐘至約1000mL/分鐘、約20mL/分鐘至約800mL/分鐘、約20mL/分鐘至約500mL/分鐘、約20mL/分鐘至約200mL/分鐘、約50mL/分鐘至約1000mL/分鐘、約50mL/分鐘至約500mL/分鐘、約50mL/分鐘至約200mL/分鐘。在大規(guī)模生產(chǎn)的實施方案中，溶劑的流速可以高至約速為約20mL/分鐘至約1000mL/分鐘，例如約20mL/分鐘至約500mL/分鐘，約20行本公開的逐層過濾，例如，約0℃、1℃、2℃、320℃、25℃、30℃、35℃或40℃,或者約0℃至約40℃內(nèi)的任意子范圍(例如，任意兩個上述溫度之間的任意范圍),例如約0℃至約35℃、約0℃至約30℃優(yōu)、約0層過濾。在另一些實施方案中，可以在約4℃進(jìn)行本公開的逐層過濾，例如在約WO2025/140310可以是聚合物。在一些實施方案中，所述聚合物丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸、陶瓷、硅藻土、物：尼龍、丙烯酸的共聚物、聚砜、聚偏氟乙烯、纖在一些實施方案中，所述聚合物可以是親水水化膜。例如，逐層過濾中所使用的膜可以是在使用前滅菌(例如高壓滅菌),以確保其無菌。WO2025/140310[0123]深層過濾[0124]本公開提供一種制備植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)的方法，其含有逐層過濾步驟，所述逐層過濾步驟具有防止或避免堵塞的功能或效果。本公開的方法可以使用任何具有防止或避免堵塞的功能或效果的過濾，例如深層過濾(DF)、微濾(MF)、超濾(UF)、無菌過濾、膜色譜(MC)和離心。[0125]在一些實施方案中，本公開提供一種制備植物外泌體(優(yōu)選枸杞外泌體)的方法，其含有逐層過濾步驟，所述逐層過濾步驟包括深層過濾。優(yōu)選地，在一些實施方案中，所述深層過濾是通過深層過濾器實現(xiàn)的，例如深層囊式過濾器。[0126]在一些實施方案中，深層過濾器是商業(yè)可購買的深層過濾器，例如頗爾公司(PallCorporation,NY)生產(chǎn)的深層過濾器，例如SupracapTM深層過濾器；還可以是由Millipore(Billerica,MA)生產(chǎn)的諸如MilliStakTM系列的活性炭過濾器；也可以是filestar3μm深層過濾器(PALL,目錄號BYA030P6)。在一些實施方案中，本公開[0127]可用于本公開方法的深層過濾的載量范圍為約50-200L/m2,例如50-150L/m2[0128]對本公開而言，深層過濾器可以是任何具有深層過濾功能的過濾器。在一些實施方案中，深層過濾器可以是具有任何孔徑的過濾器。在一些實施方案中，本公開所用的深層過濾器包括具有約以下孔徑范圍的深層過濾器：0.5-100μm、18-30μm、8-20μm、9-50μm、9-40μm、9-30μm、9-20μm,優(yōu)選深層過濾的孔徑可分別選自約1-50μm、約2-30μm、約2-20μm、約6-30μm,更優(yōu)WO2025/140310選為具有約2-30μm孔徑的深層過濾器，例如具有約2-30μm孔徑的深層囊式過在一些實施方案中，本公開的深層過濾由深層囊式過濾器進(jìn)行。深層囊式過濾器通常應(yīng)用在發(fā)酵液和細(xì)胞培養(yǎng)液的澄清過濾、血清劑的過濾、化藥除雜、脫碳過濾、或膠體或粘性物料的過濾。本公開的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，深層囊式過濾器也適合于植物材料的提取，尤其適合于本公組成，其中上層濾板孔徑大，攔截大尺寸顆粒，保護下層濾板；下層濾板孔徑小，進(jìn)一步攔截小顆粒，保證濾出料液澄清度，例如可以選擇第一層膜孔徑為約11-30μm,第二層膜孔徑為約6-15μm;或者第一層膜孔徑為約8-20μm,公開方法的深層過濾的過濾流速的范圍可為100-1000LMH(每小時通過1m2膜包的液體體積),例如約100LMH、約200L00LMH、約500-1000LMH,或100-1000LMH之間任何兩點組成的范圍?；蛘撸?0mL/分鐘、約1mL/分鐘至約500mL/分鐘、約1mL/分鐘至約200mL/分鐘、約10mL/分鐘至約1,000mL/分鐘、約10mL/分鐘至約800mL/分鐘、約10mL/分鐘至約500mL/分鐘、約10mL/分鐘至約200mL/分鐘、約20mL/分鐘至約1000mL/分鐘、約20mL/分鐘至約800mL/分鐘、約20mL/分鐘至約500mL/分鐘、約20mL/分鐘WO2025/140310PCT/C至約200mL/分鐘、約50mL/分鐘至約1000mL/分鐘、約50mL/分鐘至約500mL/分鐘、約50mL/分鐘至約200mL/分鐘。優(yōu)選地，本公開的進(jìn)料速率為約20mL/分鐘至約1000mL/分鐘，例如約20mL/分鐘至約500mL/分鐘、約20-200mL/分鐘。[0133]對本公開而言，可以使用任何合適的壓力進(jìn)行所述深層過濾。例如，可以使用范圍為約0.1psi至約100psi的壓力進(jìn)行所述深層過濾，例如約0.1psi、0.5psi、1psi、(例如任意兩個上述壓力之間的任意范圍)。[0134]對本公開而言，所述逐層過濾(例如深層過濾和任選的其他過濾步驟)可以進(jìn)行任何合適的時間期限。例如，對于一個生產(chǎn)批次，可以在約10分鐘至約10小時的時間范圍內(nèi)進(jìn)行所述逐層過濾，例如約10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時，或者約10分鐘至約10小時內(nèi)的任意子范圍(例如任意兩個上述時間點之間的任意范圍)。優(yōu)選地，例如對于預(yù)處理獲得的500ml植物粗提液，當(dāng)使用包括本公開定義的深層過濾和膜過濾(例如0.45μm膜過濾和0.22μm膜過濾)的逐層過濾時，處理時間為約0.5小時一約2小時，優(yōu)選約1小時，而相同的植物粗提液在12000g70min離心兩次的超速離心法，大約耗時3小時。[0135]本公開的方法可用于以合適的速率處理所述植物(優(yōu)選枸杞)。例如，對于一個生產(chǎn)批次，本公開的方法處理植物例如植物粗提液的速率范圍為約10g/小時、30g/小時、50g/小時、60g/小時、70g/小時、80g/小時、90g/小時、100g/小時、20Og/小時、300g/小時、400g/小時、500g/小時、600g/小時、700g/小時、800g/小時、900g/小時、1,000g/小時，或者約10g/小時至約1,000g/小時內(nèi)的任意子范圍(例如任意兩個上述生產(chǎn)速率之間的任意范圍)。[0136]本公開的逐層過濾(例如深層過濾和任選的其他過濾步驟)的制備植物外泌體的方法能夠獲得每100g植物約以下數(shù)量的植物外泌體：1×101個、5×101?個、10101?個、17×101?個、18×101?個、101?個、26、×101個、28×101?個、30×101個、32×101?個、WO2025/140310PCT/101個、38×101?個、40×101個、42×1個、66×101?個甚至更多。在一些實施方案中，本公開的逐層過濾能夠獲得每100g枸杞約20×101?-50×101?個，優(yōu)選約30×101?-40×101?個，例如約3植物外泌體。在一些實施方案中，本公開的逐層過濾能夠獲得每100g人參約20×101-60×101個，優(yōu)選約30×101?-50×101個，例如約39×101?個植物外泌體。在一些實施方案中，本公開的逐層過濾能夠獲得每100g石斛約10×101?-30×101個，優(yōu)選約10×101-20×101個，例如約12×101個植物外泌體。在一些實施方案中，本公開的逐層過濾能夠獲得每100g當(dāng)歸約30×101?-70×101?個，優(yōu)選約40×101?-60×101?個，例如約50[0137]本公開所述的深層過濾器包含深層過濾介質(zhì)。在一些實施方案中，所述深層過濾介質(zhì)可以是低蛋白吸附的親水性材質(zhì)，諸如聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)等(優(yōu)選其具有1-50μm的孔徑范圍)。在一些實施方案中，深層過濾介質(zhì)可以是濾板形式。在一些實施方案中，所述深層過濾介質(zhì)層任選選自SupradurP濾板、K300濾板、BECOPADP270濾板中的一種或多種。通常本領(lǐng)域常見濾板一般分為兩種：一種是由合成纖維和植物纖維材料制造的濾板；另一種是由石棉和紙漿制成的濾板。具體地，本公開所使用的濾板可以是由美國3M、PALL、EATON等公司生產(chǎn)，其常用的型號有3M公司的SP系列濾板、PALL公司的P系列濾板，以及EATON公司的BECO系列濾板。[0138]在一些實施方案中，所述深層過濾介質(zhì)可以是梯度式分布或混合式分布。在一些實施方案中，所述深層過濾介質(zhì)可以是梯度式分布。在一些實施方案中，深層囊式過濾設(shè)備為梯度式分布的雙層膜結(jié)構(gòu)，所述兩層膜結(jié)構(gòu)的孔徑沿過濾液流方向依次變小，例如可以選擇第一層膜孔徑為約11-30μm,第二層膜孔徑為約6-15μm;或者第一層膜孔徑為約8-20μm,第二層膜孔徑為約2-4μm。[0139]在一些實施方案中，所述深層過濾介質(zhì)還可以包括膜過濾層，例如所述膜過濾層的過濾孔徑優(yōu)選約0.1～10μm。在一些實施方案中，本公開的深層過濾介質(zhì)可與膜過濾介質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用。在一些實施方案中，所述膜過濾層設(shè)置在深層過濾介質(zhì)的出液端。在一些實施方案中，所述膜過濾層設(shè)置在深層過濾介質(zhì)的進(jìn)液WO2025/140310端。在一些實施方案中，深層囊式過濾后的膜過濾案中，助濾劑可以包含硅藻土、珍珠巖、滑石粉篩、粘土等。在一些實施方案中，助濾劑可以是濾劑比如珍珠巖、硅藻土或沙子，或可選源自天泵可以包括蠕動泵、隔膜泵、齒輪泵和離心驅(qū)動泵[0142]在一些實施方案中，深層過濾所使用的泵的流速可以是約以下范圍：1-1000m00mL/min或50-100mL/min。優(yōu)選地，本公開的深層過濾所使用的泵為蠕動泵，流速例如為約20-1000mL/min,例如約20-500mL/min、約20-200mL/min、約30優(yōu)選地用等滲溶液、更優(yōu)選用氯化鈉等滲溶液、最優(yōu)選囊式濾器。例如，本公開所述的深層過濾中，優(yōu)選在射液以例如約20-1000mL/min,例如約20-500mL/min、約20-200mL/min、約30例如，本公開所述的在深層過濾中，優(yōu)選在深層過濾液以例如約20-1000mL/min,例如約約20-500mL/min、約20-200mL/min、約30WO2025/140310[0146]在一些實施方案中，逐層過濾還包括膜過濾。例如，本公開的逐層過濾包括深層過濾和膜過濾。例如，在所述的逐層過濾中，膜過濾可以包括防堵塞膜過濾和除菌膜過濾。在一些實施方案中，可以先進(jìn)行防堵塞膜過濾，然后可選地進(jìn)行除菌膜過濾。在一些實施方案中，可以在除菌膜過濾之前，進(jìn)行防堵塞膜過濾。在一些實施方案中，可以進(jìn)行一次或多次防堵塞膜過濾，然后進(jìn)行一次或多次除菌膜過濾。[0147]本公開的膜過濾的孔徑可以為約2μm、約1μm、0.9μm、約0.8μm、約0.03μm、約0.02μm和約0.01μm;孔徑范圍可以是上述組成的范圍，例如但不限于約以下范圍：0.05-2μm、0.05-1μm、0.05-0.8μ-0.8μm。在一些優(yōu)選實施方案中，膜過濾的孔徑范圍可選自約0.4-0.8μm和約[0148]在一些實施方案中，本公開的逐層過濾包括深層過濾后的膜過濾。例如，膜過的膜過濾，然后可選地進(jìn)行約0.1-0.3μm(例如約0.22μm)的膜過濾。在一些實施方案中，可以在約0.1-0.3μm(例如約0.22μm)的膜過濾之前，進(jìn)行約0.4-0.8μm(例如約0.45μm)的膜過濾。在一些實施方案中，可以進(jìn)行一次或多次約0.4-0.8μm(例如約0.45μm)的膜過濾2μm)的膜過濾。優(yōu)選地，可以在約0.1-0.3μm(例如約0.22μm)膜過濾之前進(jìn)行一次或多次的膜過濾，優(yōu)選1次約0.4-0.8μm(例如約0.45μm)的膜過濾，以減少[0149]在一些實施方案中，所述膜過濾包括通過一個或多個串聯(lián)膜過濾器。在一些實施方案中，串聯(lián)膜過濾器的數(shù)量范圍為1-10個，諸如1、2、3、4、5、6、7、WO2025/1403108、9或10個串聯(lián)過濾器，優(yōu)選1-4個，更優(yōu)選2-3個。所有串聯(lián)膜過濾器的截止尺寸可以各自相同或不同。在一些實施方案中，串聯(lián)膜過濾器的至少2個具有不同的截止尺寸。在一些實施方案中，尺寸排阻沿著串聯(lián)膜過濾器從大到小減小。例如，在串聯(lián)的3個膜過濾器中，第一個過濾器可以是約0.45μm過濾器，第二個過濾器可以是0.3μm過濾器，并且最后一個過濾器可以是約0.22過濾器。[0150]用于本公開方法的示例性膜過濾器包括但不限于聚醚砜膜過濾器、聚偏二氟乙烯膜過濾器、纖維素膜過濾器、混合纖維素酯膜過濾器、醋酸纖維素膜過濾器、硝酸纖維素膜過濾器、聚酰胺膜過濾器、聚碳酸酯膜過濾器、聚四氟乙烯膜過濾器、聚丙烯膜過濾器、硝化纖維素膜過濾器、玻璃纖維、樹脂粘合的玻璃纖維或珠過濾器。[0151]對本公開的方法而言，用于膜過濾的膜的材質(zhì)可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的任何過濾材料，例如上文逐層過濾部分所述的各類過濾材料和膜材料。在一些實施方案中，防堵塞膜過濾為樹脂粘合的玻璃纖維膜，優(yōu)選孔徑在約0.45-0.8μm。在一些實施方案中，除菌膜過濾為聚醚砜(PES)膜，優(yōu)選孔徑在約0.1-0.22μm。[0152]在一些實施方案中，可以使用任何合適的壓力進(jìn)行所述膜過濾。例如，可以使用范圍為約0.1psi至約100psi的進(jìn)料壓力進(jìn)行所述膜過濾，例如約0.1psi、0.5psi、1圍(例如任意兩個上述進(jìn)料壓力之間的任意范圍)?？梢允褂萌魏魏线m的透過端壓力進(jìn)行所述膜過濾。例如，可以使用范圍為約0.1psi至約100psi的透過壓力進(jìn)行所者約0.1psi至約100psi內(nèi)的任意子范圍(例如任意兩個上述壓力之間的任意范圍)。[0153]在一些實施方案中，本公開所述的膜過濾可以使用泵。在一些實施方案中，泵可以包括蠕動泵，隔膜泵，齒輪泵和離心驅(qū)動泵蠕動泵進(jìn)行。在一些實施方案中，膜過濾可以使用蠕動泵。在一些實施方案中，膜過濾所使用的泵的流速可以是以下范圍：1-1000mL/min、100-1000mL/min、200-1000mL/min、500-10WO2025/140310mL/min。優(yōu)選地，本公開的膜過濾的泵的流速為約20-1000mL/min,例如約500-1000mL/min、約20-500mL/min、約20-200mL/min、約30-100mL/min。液、更優(yōu)選氯化鈉等滲溶液潤洗和/或清洗膜過濾約20-1000mL/min流速清洗膜過濾器，例如約20--500mL/min、約20-200mL/min、約30-100mL/min。/min至約800mL/min、約20mL/min至約500mL/min、約20mL/min甚至更高。優(yōu)選地，本公開的過濾流速為約20-1000mL/min,例如約20-200mL/min、約30-100mL/min。個生產(chǎn)批次，可以在約10分鐘至約10小時的時間范圍內(nèi)進(jìn)行所述膜過濾，例如約小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時的500mL植物粗提液，進(jìn)行約1小時膜過濾，優(yōu)選地[0157]在一些實施方案中，本公開的包含深層過濾和膜過濾的WO2025/140310PCT/CN2024/142×101?個、19×101?個、20×101?個、22×101?個、24×101?個、26、×101?個、28×101?個、30×101?個、32×101?個、34×101?個、36×101?個、38×101個、40×101個、42×101?個、44×101個、46×101?個、48×101?個、50×101?個、52×101°個、54×101?個、56×101個、58×101?個、66×101?個甚至更多。在一些實施方案中，本公開的膜過濾夠獲得每100g枸杞約20×101?-50×101?個，優(yōu)選約33×1010個植物外泌體。在一些實施方案中，本公開的膜過濾夠獲得每100g人參約30×101?-50×101?個，優(yōu)選約39×101?個植物外泌體。在一些實施方案中，本公開的膜過濾夠獲得每100g石斛約10×101?-20×101個，優(yōu)選約12×101?個植物外泌體。在一些實施方案中，本公開的膜過濾夠獲得每100g當(dāng)歸約45×101?-60×101?個，優(yōu)選約50×101?個植物外泌體。[0158]優(yōu)選實施方案[0159]在一個實施方案中，本公開的制備植物外泌體的方法包括以下步驟：[0160](a)獲取植物原料；[0161]b)對獲取植物原料進(jìn)行預(yù)處理，獲得植物粗提取液；[0162](c)對植物粗提取液進(jìn)行逐層過濾處理；[0163]其中，所述逐層過濾處理包括深層過濾步驟，以及任選的膜過濾步驟。[0164]在一個實施方案中，本公開制備植物外泌體的方法包括以下步驟：[0165](a)獲取植物原料；[0166]b)對獲取的植物原料進(jìn)行預(yù)處理，優(yōu)選進(jìn)行混合、粉碎、過濾和離心，獲得植物粗提取液；[0167](c)對植物粗提取液進(jìn)行逐層過濾處理，獲得濾過液；[0168]其中，所述逐層過濾處理包括深層過濾步驟，優(yōu)選所述深層過濾步驟使用約1-50μm孔徑的深層過濾，更優(yōu)選約2-30μm孔徑的深層過濾；和[0169](d)對步驟(c)中的濾過液進(jìn)行膜過濾，優(yōu)選進(jìn)行防堵塞膜過濾和/或除菌膜過濾，例如孔徑在約0.4-0.8μm的防堵塞膜過濾和/或孔徑在約0.1-0.3μm的除菌膜過濾，更優(yōu)選地，孔徑約0.45-0.8μm的膜過濾和孔徑約0.1-0.22μm的膜過濾，最優(yōu)選地，膜過濾由依次進(jìn)行的0.45μm的防堵塞膜過濾和0.22μm的除菌膜過濾組成，獲得植物外泌體。WO2025/140310[0170]在以上實施方案中，所述步驟(b)中對獲取的植物材料進(jìn)行預(yù)處理，其中所述預(yù)處理包括將所述植物材料與等滲溶液(優(yōu)選氯化鈉注射液)進(jìn)行混合，使用破壁機粉碎植物原料以獲得植物渣液，將所述植物渣液用濾網(wǎng)進(jìn)行過濾以獲取植物汁液，以及對所述植物汁液進(jìn)行離心后收集上清以獲得植物粗提取液。[0171]在以上實施方案中，所述步驟(b)中可對植物材料進(jìn)行大規(guī)模混合和粉碎。在一些具體的實施方案中，所述步驟(b)中對質(zhì)量約1000g或甚至更多，例如約500-1000g、約50-200g、例如約100g的植物進(jìn)行混合和粉碎。在一些實施方案中，所述步驟(b)在約4℃進(jìn)行。[0172]在以上實施方案中，所述步驟(b)中對粉碎后的渣液進(jìn)行攪拌處理，優(yōu)選地攪拌轉(zhuǎn)速為約50-500rpm,