山茱萸對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1糖尿病心肌病的危害與現(xiàn)狀糖尿病作為一種全球性的慢性代謝性疾病，其發(fā)病率正逐年攀升。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將增至7.83億。糖尿病心肌?。―iabeticCardiomyopathy,DCM）是糖尿病常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重威脅著糖尿病患者的健康與生命。糖尿病心肌病的發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，容易被忽視。隨著病情的進(jìn)展，患者會(huì)逐漸出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，如心肌肥厚、心臟擴(kuò)大、心律失常以及心力衰竭等。研究表明，糖尿病患者發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)是非糖尿病患者的2-5倍，而糖尿病心肌病在其中扮演著重要角色。DCM不僅會(huì)顯著降低患者的生活質(zhì)量，增加患者的痛苦和醫(yī)療負(fù)擔(dān)，還會(huì)導(dǎo)致患者的死亡率大幅上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，因糖尿病心肌病導(dǎo)致的心衰患者，5年生存率僅為30%-40%，與某些惡性腫瘤的生存率相當(dāng)。目前，臨床上對(duì)于糖尿病心肌病的治療主要集中在控制血糖、血壓、血脂等危險(xiǎn)因素，以及使用改善心臟功能的藥物，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）、β受體阻滯劑等。然而，這些治療方法往往只能延緩病情的進(jìn)展，無(wú)法從根本上治愈糖尿病心肌病。而且，長(zhǎng)期使用這些藥物還可能會(huì)帶來(lái)一些不良反應(yīng)，如低血壓、干咳、心動(dòng)過(guò)緩等。因此，尋找一種安全、有效的治療方法，成為了糖尿病心肌病研究領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。1.1.2山茱萸的藥用價(jià)值及研究潛力山茱萸（CornusofficinalisSieb.etZucc.），又名山萸肉、藥棗等，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有悠久的藥用歷史。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有對(duì)山茱萸的記載，將其列為上品，認(rèn)為其“味酸，平。主心下邪氣，寒熱，溫中，逐寒濕痹，去三蟲(chóng)。久服輕身”。在中醫(yī)理論中，山茱萸歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎、收斂固澀的功效，常用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下等病癥。現(xiàn)代研究表明，山茱萸含有多種生物活性成分，如黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、多糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等，這些成分賦予了山茱萸廣泛的藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等。在心血管疾病治療方面，山茱萸也展現(xiàn)出了顯著的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸提取物可以降低血壓、抑制血小板聚集、降低血脂和血糖，從而預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。此外，山茱萸還可以改善心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與增加一氧化氮（NO）的合成和釋放有關(guān)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注山茱萸對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療作用。有研究表明，山茱萸中的黃酮類(lèi)化合物可通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素分泌，改善胰島素抵抗，對(duì)糖尿病具有一定的治療作用。同時(shí)，山茱萸中的抗氧化成分可清除體內(nèi)的自由基，對(duì)氧化應(yīng)激引起的損傷具有保護(hù)作用，這對(duì)于糖尿病心肌病的防治具有重要意義。因?yàn)檠趸瘧?yīng)激在糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，過(guò)多的自由基會(huì)損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等病理變化。因此，山茱萸有望成為一種治療糖尿病心肌病的潛在藥物，深入研究山茱萸對(duì)糖尿病心肌病的作用及機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的治療方法、改善糖尿病患者的預(yù)后具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)病理生理過(guò)程，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大量深入的研究。在代謝紊亂方面，高血糖是糖尿病心肌病發(fā)病的重要始動(dòng)因素。長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下，葡萄糖的代謝途徑發(fā)生異常，一方面，通過(guò)多元醇通路，葡萄糖經(jīng)醛糖還原酶催化生成山梨醇，山梨醇不能自由透過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，引起細(xì)胞腫脹、損傷。另一方面，高血糖還會(huì)激活蛋白激酶C（PKC）通路，PKC的激活可導(dǎo)致血管收縮、內(nèi)皮功能障礙以及細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生。同時(shí)，高糖環(huán)境下，心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用減少，轉(zhuǎn)而增加對(duì)游離脂肪酸（FFAs）的攝取和氧化。FFAs的過(guò)度氧化會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），引發(fā)氧化應(yīng)激，損傷心肌細(xì)胞。研究表明，在糖尿病動(dòng)物模型中，心肌組織內(nèi)的FFAs含量明顯升高，同時(shí)伴有心肌細(xì)胞凋亡增加和心臟功能下降。氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)在糖尿病心肌病的發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。ROS的大量產(chǎn)生打破了機(jī)體的氧化還原平衡，激活了一系列氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路，如核因子-κB（NF-κB）通路。NF-κB的激活可促進(jìn)多種炎癥因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子進(jìn)一步加重了心肌組織的炎癥反應(yīng)和損傷。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病患者血清中的炎癥因子水平顯著高于健康人群，且與心臟功能的惡化程度相關(guān)。心肌纖維化是糖尿病心肌病的重要病理特征之一，其發(fā)生與多種因素有關(guān)。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活在心肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為RAAS的關(guān)鍵活性物質(zhì)，可通過(guò)與血管緊張素受體-1（AT1R）結(jié)合，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成，抑制膠原蛋白降解，導(dǎo)致心肌間質(zhì)膠原沉積增加，心肌纖維化加重。此外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）也是促進(jìn)心肌纖維化的重要細(xì)胞因子，它可以刺激成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌。研究顯示，在糖尿病心肌病動(dòng)物模型中，給予RAAS抑制劑或TGF-β1拮抗劑，可以有效減輕心肌纖維化程度，改善心臟功能。除上述機(jī)制外，胰島素抵抗、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、線(xiàn)粒體功能障礙等也被認(rèn)為與糖尿病心肌病的發(fā)病密切相關(guān)。胰島素抵抗導(dǎo)致心肌細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性降低，影響心肌細(xì)胞的能量代謝和信號(hào)傳導(dǎo)。鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)會(huì)干擾心肌細(xì)胞的正常收縮和舒張功能，導(dǎo)致心臟功能異常。線(xiàn)粒體作為細(xì)胞的能量工廠，其功能障礙會(huì)影響心肌細(xì)胞的能量供應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生更多的ROS，加劇心肌細(xì)胞的損傷。1.2.2山茱萸在心血管疾病治療中的研究進(jìn)展山茱萸作為一種傳統(tǒng)的中藥材，在心血管疾病治療方面的研究逐漸受到關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同角度對(duì)其作用及機(jī)制進(jìn)行了探索。早期的研究主要集中在山茱萸對(duì)心血管系統(tǒng)的整體調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)表明，山茱萸提取物能夠降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血壓，其機(jī)制可能與擴(kuò)張血管、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性有關(guān)。同時(shí)，山茱萸還具有抗血小板聚集的作用，可減少血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。在血脂調(diào)節(jié)方面，山茱萸能夠降低血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平，升高高密度脂蛋白膽固醇水平，從而改善血脂異常。這些研究結(jié)果為山茱萸在心血管疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供了初步的理論依據(jù)。隨著研究的深入，山茱萸對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用成為研究熱點(diǎn)。在心肌缺血再灌注損傷模型中，山茱萸提取物能夠顯著減輕心肌組織的損傷程度，降低心肌酶的釋放，減少心肌細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制主要包括抗氧化應(yīng)激和抗炎作用。山茱萸中的黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)等成分具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠清除體內(nèi)過(guò)多的ROS，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。同時(shí)，山茱萸還可以抑制炎癥因子的表達(dá)和釋放，減輕心肌組織的炎癥反應(yīng)。此外，山茱萸還能夠調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的能量代謝，增加心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，提高心肌細(xì)胞的能量供應(yīng)。近年來(lái)，山茱萸對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療作用也逐漸被揭示。研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸中的某些成分可以調(diào)節(jié)胰島素分泌，改善胰島素抵抗，降低血糖水平。在糖尿病腎病模型中，山茱萸能夠減輕腎臟的病理?yè)p傷，減少尿蛋白的排泄，其機(jī)制與抗氧化、抗炎以及抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活有關(guān)。對(duì)于糖尿病心肌病，雖然相關(guān)研究相對(duì)較少，但已有研究表明山茱萸可能通過(guò)其抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)代謝等作用，對(duì)糖尿病心肌病起到一定的保護(hù)作用。然而，目前關(guān)于山茱萸治療糖尿病心肌病的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入研究。1.2.3研究現(xiàn)狀總結(jié)與不足綜上所述，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制以及山茱萸在心血管疾病治療方面取得了豐碩的研究成果。對(duì)于糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制的研究，從代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、心肌纖維化等多個(gè)層面揭示了其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，為臨床治療提供了理論基礎(chǔ)和潛在的治療靶點(diǎn)。山茱萸在心血管疾病治療中的研究也展示了其作為一種天然藥物的潛在應(yīng)用價(jià)值，尤其是在抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)代謝等方面的作用，為心血管疾病的治療提供了新的思路和方法。然而，當(dāng)前的研究仍存在一些不足之處。在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制研究方面，雖然已經(jīng)明確了多個(gè)關(guān)鍵的致病因素和信號(hào)通路，但這些因素之間的相互作用和協(xié)同機(jī)制尚未完全闡明，還需要進(jìn)一步深入研究以全面揭示糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制。在山茱萸的研究中，雖然對(duì)其化學(xué)成分和藥理作用有了一定的認(rèn)識(shí)，但大部分研究還停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段，缺乏大規(guī)模的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證其在人體中的安全性和有效性。此外，山茱萸中具體發(fā)揮治療作用的活性成分及其作用靶點(diǎn)和機(jī)制還需要進(jìn)一步明確，這將有助于開(kāi)發(fā)更加高效、安全的以山茱萸為基礎(chǔ)的藥物制劑。針對(duì)上述不足，本研究旨在進(jìn)一步深入探討山茱萸對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，明確山茱萸發(fā)揮作用的活性成分、作用靶點(diǎn)以及相關(guān)信號(hào)通路，為山茱萸在糖尿病心肌病治療中的臨床應(yīng)用提供更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探討山茱萸對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其內(nèi)在分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)治療糖尿病心肌病的新型藥物提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下：建立糖尿病心肌病大鼠模型：采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法，建立糖尿病心肌病大鼠模型。通過(guò)檢測(cè)血糖、血脂、心臟超聲、心肌組織病理學(xué)等指標(biāo)，評(píng)估模型的成功與否。觀察山茱萸對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用：將建模成功的糖尿病心肌病大鼠隨機(jī)分為模型組、山茱萸低劑量組、山茱萸中劑量組、山茱萸高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組，另設(shè)正常對(duì)照組。山茱萸各劑量組分別給予不同濃度的山茱萸提取物灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予常規(guī)治療藥物，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。干預(yù)一段時(shí)間后，檢測(cè)各組大鼠的心臟功能指標(biāo)，如左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）等；觀察心肌組織的病理學(xué)變化，包括心肌細(xì)胞形態(tài)、心肌纖維化程度等；檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，采用TUNEL染色和Westernblot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。探討山茱萸對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制：從氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、心肌纖維化等方面入手，研究山茱萸對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制。檢測(cè)心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活性以及丙二醛（MDA）含量；采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平；通過(guò)Westernblot法檢測(cè)與心肌纖維化相關(guān)蛋白，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、Ⅲ型膠原蛋白（ColⅢ）以及TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。此外，還將利用分子生物學(xué)技術(shù)，如RNA干擾、基因過(guò)表達(dá)等，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路在山茱萸保護(hù)作用中的作用。1.4研究方法與技術(shù)路線(xiàn)1.4.1研究方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組：選用SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重200-220g，購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：[具體許可證號(hào)]。大鼠在溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組，n=10）和造模組（n=50）。糖尿病心肌病大鼠模型的構(gòu)建：造模組大鼠給予高糖高脂飼料（基礎(chǔ)飼料中添加20%蔗糖、10%豬油、2%膽固醇、0.2%膽酸鈉）喂養(yǎng)4周，然后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，溶于0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH4.5），劑量為35mg/kg。正常對(duì)照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，并腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ72h后，尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖，血糖值≥16.7mmol/L者認(rèn)定為糖尿病模型成功建立。繼續(xù)飼養(yǎng)8周后，通過(guò)心臟超聲檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）等指標(biāo)，結(jié)合心肌組織病理學(xué)檢查，確定糖尿病心肌病大鼠模型是否成功構(gòu)建。山茱萸給藥方式及劑量確定：將建模成功的糖尿病心肌病大鼠隨機(jī)分為模型組（DM組，n=10）、山茱萸低劑量組（LD組，n=10）、山茱萸中劑量組（MD組，n=10）、山茱萸高劑量組（HD組，n=10）以及陽(yáng)性對(duì)照組（PC組，n=10）。山茱萸提取物采用水提法制備，經(jīng)濃縮、干燥后得到山茱萸浸膏。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，確定山茱萸低、中、高劑量組的給藥劑量分別為1g/kg、2g/kg、4g/kg，將山茱萸浸膏用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的溶液，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥8周。陽(yáng)性對(duì)照組給予鹽酸二甲雙胍（劑量為200mg/kg）灌胃，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。檢測(cè)心肌細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方法：心臟功能檢測(cè)：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，使用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)對(duì)各組大鼠進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)，測(cè)量LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS等指標(biāo)，評(píng)估心臟功能。心肌組織病理學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，迅速取出心臟，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4μm。進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化；采用Masson染色，觀察心肌纖維化程度。心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算凋亡指數(shù)。同時(shí)，采用Westernblot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)水平。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：取部分心肌組織，勻漿后離心，取上清液。采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用谷胱甘肽還原酶法檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活性，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛（MDA）含量，均按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。炎癥因子檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)心肌組織中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。心肌纖維化相關(guān)蛋白檢測(cè)：采用Westernblot法檢測(cè)與心肌纖維化相關(guān)蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、Ⅲ型膠原蛋白（ColⅢ）以及TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3的表達(dá)水平。提取心肌組織總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后加入一抗、二抗孵育，最后采用化學(xué)發(fā)光法顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度值。1.4.2技術(shù)路線(xiàn)本研究的技術(shù)路線(xiàn)如圖1所示：[此處插入技術(shù)路線(xiàn)圖，圖中應(yīng)清晰展示從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備、模型建立、山茱萸干預(yù)，到各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的完整研究流程。例如，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備階段標(biāo)注選用的大鼠品種、數(shù)量、來(lái)源及適應(yīng)性飼養(yǎng)條件；模型建立階段說(shuō)明高糖高脂飼料喂養(yǎng)時(shí)間、STZ注射劑量和方式以及模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)；山茱萸干預(yù)階段明確分組情況、給藥劑量和方式、給藥時(shí)間；各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)階段列舉心臟功能、心肌組織病理學(xué)、心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥因子、心肌纖維化相關(guān)蛋白等指標(biāo)的檢測(cè)方法；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析階段說(shuō)明采用的統(tǒng)計(jì)軟件和分析方法。]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備（SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周）↓模型建立（高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周+STZ腹腔注射35mg/kg，72h后測(cè)空腹血糖，≥16.7mmol/L為糖尿病模型成功，繼續(xù)飼養(yǎng)8周，心臟超聲和病理檢查確定糖尿病心肌病模型）↓分組與干預(yù)（正常對(duì)照組、模型組、山茱萸低劑量組、山茱萸中劑量組、山茱萸高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，分別給予相應(yīng)處理，灌胃8周）↓指標(biāo)檢測(cè)（心臟功能檢測(cè)：心臟超聲；心肌組織病理學(xué)檢查：HE染色、Masson染色；心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)：TUNEL染色、Westernblot檢測(cè)Bax、Bcl-2；氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：SOD、GSH-PX、MDA；炎癥因子檢測(cè)：ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6；心肌纖維化相關(guān)蛋白檢測(cè)：Westernblot檢測(cè)α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3）↓數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）二、糖尿病心肌病大鼠模型的建立與鑒定2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與飼養(yǎng)環(huán)境選用SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重200-220g，購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：[具體許可證號(hào)]。SD大鼠因其生長(zhǎng)快、繁殖能力強(qiáng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)性好以及生理生化指標(biāo)穩(wěn)定等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，在糖尿病心肌病相關(guān)研究里，也是常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。大鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，維持12h光照、12h黑暗的光照周期。在這樣穩(wěn)定且適宜的環(huán)境條件下，大鼠能夠保持正常的生理節(jié)律和代謝水平，有利于減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。大鼠自由進(jìn)食和飲水，飼料為常規(guī)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料，其營(yíng)養(yǎng)成分能夠滿(mǎn)足大鼠日常生長(zhǎng)發(fā)育所需。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，大鼠進(jìn)行了為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，使其充分適應(yīng)新的飼養(yǎng)環(huán)境，確保實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠處于良好的生理狀態(tài)。2.1.2主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑構(gòu)建糖尿病心肌病大鼠模型及后續(xù)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)所需的主要儀器設(shè)備如下：血糖儀：OneTouchUltra穩(wěn)豪系列血糖儀，購(gòu)自LifeScanInc.，用于檢測(cè)大鼠的血糖水平，該血糖儀操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，在血糖檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。離心機(jī)：HeraeusInstruments離心機(jī)，由KendroLaboratoryProducts生產(chǎn)（德國(guó)），主要用于樣本離心分離，能夠快速有效地分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)對(duì)樣本處理的需求。顯微鏡：Nikon生物顯微鏡（配有偏振光濾光片），日本尼康公司產(chǎn)品，可用于觀察心肌組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化，其高分辨率和良好的成像效果，有助于清晰地呈現(xiàn)心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)：[具體型號(hào)和廠家]，用于檢測(cè)大鼠心臟功能指標(biāo)，如左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）等，為評(píng)估心臟功能提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。酶標(biāo)儀：[具體型號(hào)和廠家]，在檢測(cè)炎癥因子等指標(biāo)時(shí)使用，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）對(duì)樣本中的炎癥因子進(jìn)行定量分析。電泳儀及轉(zhuǎn)膜設(shè)備：[具體型號(hào)和廠家]，用于蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜操作，是Westernblot實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵設(shè)備，可將蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至固相膜上，以便后續(xù)檢測(cè)。主要化學(xué)試劑包括：鏈脲佐菌素（STZ）：購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)），是一種能夠特異性破壞胰島β細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)，常用于誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中，將其溶于0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH4.5）中，現(xiàn)用現(xiàn)配，以確保其活性。山茱萸提取物：采用水提法制備。選取優(yōu)質(zhì)山茱萸藥材，粉碎后加入適量蒸餾水，加熱回流提取，經(jīng)過(guò)濾、濃縮、干燥等步驟得到山茱萸浸膏。該提取物中含有多種活性成分，如黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)等，是研究山茱萸對(duì)糖尿病心肌病作用的關(guān)鍵試劑。鹽酸二甲雙胍：作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，購(gòu)自[生產(chǎn)廠家]，是臨床上常用的降血糖藥物，用于改善糖尿病患者的血糖代謝。在本實(shí)驗(yàn)中，給予陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃，以對(duì)比山茱萸提取物的治療效果。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒：購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]，用于心肌組織切片的染色，能夠清晰地顯示心肌細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，是病理學(xué)研究中常用的染色方法。Masson染色試劑盒：同樣購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]，主要用于觀察心肌纖維化程度，通過(guò)不同的染色結(jié)果，直觀地呈現(xiàn)心肌組織中膠原纖維的分布情況。TUNEL染色試劑盒：用于檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]，該試劑盒采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法，能夠準(zhǔn)確地標(biāo)記凋亡細(xì)胞，方便在熒光顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)。ELISA試劑盒：包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]，用于定量檢測(cè)心肌組織中炎癥因子的表達(dá)水平。Westernblot相關(guān)試劑：包括各種抗體（如Bax、Bcl-2、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、Ⅲ型膠原蛋白（ColⅢ）、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3等抗體）、SDS-PAGE凝膠配制試劑、化學(xué)發(fā)光底物等，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]，用于檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，以探究山茱萸對(duì)糖尿病心肌病作用的分子機(jī)制。2.2糖尿病心肌病大鼠模型的構(gòu)建方法2.2.1高糖高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗本研究采用的高糖高脂飼料配方具有科學(xué)性和針對(duì)性。其主要成分包括20%蔗糖、10%豬油、2%膽固醇、0.2%膽酸鈉以及67.8%的基礎(chǔ)飼料。蔗糖作為高糖成分，能夠?yàn)榇笫筇峁┐罅康奶妓衔?，在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為葡萄糖，使血糖水平升高。豬油富含飽和脂肪酸，膽固醇則直接增加了飼料中的脂質(zhì)含量，二者共同作用，模擬了人類(lèi)飲食中高飽和脂肪和高膽固醇的攝入情況。膽酸鈉的添加有助于脂肪的消化和吸收，進(jìn)一步促進(jìn)了脂質(zhì)在體內(nèi)的積累?；A(chǔ)飼料則保證了大鼠生長(zhǎng)所需的其他基本營(yíng)養(yǎng)成分。造模組大鼠接受高糖高脂飼料喂養(yǎng)，時(shí)間設(shè)定為4周。在這4周內(nèi)，大鼠自由進(jìn)食，充分?jǐn)z入高糖高脂飼料。喂養(yǎng)期間，對(duì)大鼠的飲食和行為進(jìn)行密切觀察，確保其正常進(jìn)食和活動(dòng)。每周定期使用電子天平稱(chēng)量大鼠體重，以監(jiān)測(cè)其體重變化情況。同時(shí)，使用血糖儀定期檢測(cè)大鼠的空腹血糖，檢測(cè)前需對(duì)大鼠進(jìn)行12小時(shí)禁食，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，每隔兩周采集大鼠血液樣本，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)胰島素水平。胰島素抵抗的判斷依據(jù)采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法（HOMA-IR），計(jì)算公式為：HOMA-IR=空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（mU/L）/22.5。當(dāng)HOMA-IR值顯著高于正常對(duì)照組，且出現(xiàn)體重增加、血糖升高、胰島素水平升高等現(xiàn)象時(shí)，可初步判斷胰島素抵抗形成。有研究表明，經(jīng)過(guò)4周高糖高脂飲食喂養(yǎng)，大鼠的HOMA-IR值較正常對(duì)照組顯著升高，體重增加，空腹血糖和胰島素水平也明顯上升，胰島素抵抗模型成功建立。2.2.2鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病鏈脲佐菌素（STZ）是一種從鏈霉菌中提取的天然化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有亞硝基脲和葡萄糖基團(tuán)。亞硝基脲具有細(xì)胞毒性，能夠特異性地與胰島β細(xì)胞表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（GLUT2）結(jié)合，通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胰島β細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞后，亞硝基脲釋放出的自由基會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，激活多聚ADP核糖聚合酶（PARP），使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）大量消耗，最終導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，胰島β細(xì)胞凋亡，胰島素分泌減少，從而引起血糖升高。在本實(shí)驗(yàn)中，將鏈脲佐菌素溶于0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH4.5）中，現(xiàn)用現(xiàn)配，以保證其活性。這是因?yàn)镾TZ在酸性環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定，而檸檬酸鈉緩沖液能夠維持溶液的pH值在合適范圍內(nèi)。配制時(shí)，需在冰浴條件下進(jìn)行，避免溫度過(guò)高導(dǎo)致STZ分解失活。按照35mg/kg的劑量，對(duì)經(jīng)過(guò)高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周已形成胰島素抵抗的大鼠進(jìn)行腹腔注射。腹腔注射時(shí)，需將大鼠進(jìn)行適當(dāng)固定，使用無(wú)菌注射器，緩慢將STZ溶液注入大鼠腹腔內(nèi)，注意避免損傷內(nèi)臟器官。注射STZ72h后，使用血糖儀通過(guò)尾靜脈采血檢測(cè)大鼠的空腹血糖。血糖值≥16.7mmol/L者被認(rèn)定為糖尿病模型成功建立。這一判定標(biāo)準(zhǔn)是基于大量的文獻(xiàn)研究和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的，該血糖值能夠較好地反映糖尿病大鼠的高血糖狀態(tài)。成功建模的糖尿病大鼠會(huì)表現(xiàn)出一系列典型癥狀，如多飲、多食、多尿，尿液中因含有大量葡萄糖而呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)。由于機(jī)體無(wú)法有效利用葡萄糖供能，轉(zhuǎn)而分解脂肪和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致體重逐漸下降，皮毛變得枯燥、無(wú)光澤，精神狀態(tài)不佳，活動(dòng)量明顯減少，常處于倦怠狀態(tài)。這些癥狀與人類(lèi)糖尿病患者的臨床表現(xiàn)具有相似性，為后續(xù)研究糖尿病心肌病提供了可靠的動(dòng)物模型。2.3模型的鑒定與評(píng)價(jià)指標(biāo)2.3.1心臟功能指標(biāo)檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，利用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)對(duì)各組大鼠進(jìn)行心臟功能檢測(cè)。具體操作如下：將大鼠用3%戊巴比妥鈉溶液按30mg/kg的劑量腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，將其仰臥位固定于操作臺(tái)上，用脫毛劑去除胸部毛發(fā)，充分暴露心臟區(qū)域。在超聲探頭表面涂抹適量的超聲耦合劑，將探頭輕置于大鼠胸部左側(cè)，以獲取清晰的心臟二維圖像。在二維圖像的基礎(chǔ)上，切換至M型超聲模式，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）。測(cè)量時(shí)，選擇標(biāo)準(zhǔn)的左心室長(zhǎng)軸切面，在心電圖R波頂點(diǎn)時(shí)測(cè)量LVEDd，在T波終點(diǎn)時(shí)測(cè)量LVESd。每個(gè)指標(biāo)測(cè)量3次，取平均值。左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）是評(píng)估心臟收縮功能的重要指標(biāo)，通過(guò)以下公式計(jì)算得出：LVEF(\%)=\frac{LVEDV-LVESV}{LVEDV}\times100\%LVFS(\%)=\frac{LVEDd-LVESd}{LVEDd}\times100\%其中，LVEDV為左心室舒張末期容積，LVESV為左心室收縮末期容積，可由超聲成像系統(tǒng)根據(jù)測(cè)量的LVEDd和LVESd自動(dòng)計(jì)算得出。同時(shí)，還可通過(guò)超聲成像系統(tǒng)測(cè)量左心室舒張末壓（LVEDP）。將特制的微型壓力傳感器導(dǎo)管經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入左心室，連接壓力換能器，待穩(wěn)定后，記錄LVEDP數(shù)值。對(duì)比正常組和模型組的各項(xiàng)心臟功能指標(biāo)，正常組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能正常，LVEDd和LVESd處于正常范圍，LVEF和LVFS較高，反映心臟收縮功能良好；LVEDP正常，表明心臟舒張功能正常。而模型組大鼠由于糖尿病心肌病的發(fā)生，心臟結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)明顯異常。LVEDd和LVESd增大，提示心臟擴(kuò)大；LVEF和LVFS顯著降低，說(shuō)明心臟收縮功能受損；LVEDP升高，表明心臟舒張功能也受到影響。若模型組的這些指標(biāo)與正常組存在顯著差異（P<0.05），則可判斷糖尿病心肌病模型成功建立。例如，相關(guān)研究表明，模型組大鼠的LVEF較正常組降低了約20%-30%，LVFS降低了15%-25%，LVEDP升高了約5-10mmHg，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3.2心肌組織病理學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速處死大鼠，取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗心臟表面的血液，去除多余的組織和脂肪。將心臟放入4%多聚甲醛溶液中固定24-48小時(shí)，使心肌組織充分固定。固定后的心臟進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制作厚度為4μm的切片。首先進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，染色步驟如下：將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟各10-15分鐘，然后依次經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇進(jìn)行梯度水化，每個(gè)步驟5-10分鐘。將水化后的切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，自來(lái)水沖洗，再用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。接著將切片放入伊紅染液中染色3-5分鐘，然后依次經(jīng)過(guò)95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ脫水，每個(gè)步驟3-5分鐘。最后將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明各5-10分鐘，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察HE染色切片，正常組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈短柱狀，排列緊密且整齊，細(xì)胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)分布均勻。而糖尿病心肌病模型組心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積增大、變形，排列紊亂，細(xì)胞核增大、深染，部分細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)核固縮、核碎裂等現(xiàn)象，心肌間質(zhì)可見(jiàn)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。為了觀察心肌纖維化程度，進(jìn)行Masson染色。Masson染色試劑盒按照說(shuō)明書(shū)操作，主要步驟為：切片脫蠟水化后，用Weigert鐵蘇木精染液染色5-10分鐘，自來(lái)水沖洗；用麗春紅酸性品紅液染色5-10分鐘，1%磷鉬酸溶液分化3-5分鐘；直接用苯胺藍(lán)染液染色5-10分鐘，1%冰醋酸溶液處理3-5分鐘。然后依次脫水、透明、封片。在顯微鏡下，正常組心肌組織中膠原纖維呈淡藍(lán)色，含量較少，主要分布在血管周?chē)托募￠g質(zhì)中。而模型組心肌組織中膠原纖維大量增生，呈深藍(lán)色，廣泛分布于心肌間質(zhì)，心肌細(xì)胞被增生的膠原纖維分隔，部分區(qū)域可見(jiàn)膠原纖維束形成，心肌纖維化程度明顯加重。通過(guò)圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)Masson染色切片進(jìn)行分析，測(cè)量膠原纖維面積與心肌總面積的比值，即心肌纖維化程度。模型組的心肌纖維化程度顯著高于正常組（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)糖尿病心肌病模型的成功建立。例如，研究顯示模型組心肌纖維化程度較正常組增加了約50%-80%。三、山茱萸對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用觀察3.1山茱萸的提取與給藥方案3.1.1山茱萸有效成分的提取方法本研究采用超聲輔助提取法從山茱萸藥材中提取有效成分，主要針對(duì)總苷和多糖等具有潛在心肌保護(hù)作用的成分。該方法利用超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，能夠加速有效成分從藥材細(xì)胞內(nèi)向提取溶劑的擴(kuò)散，從而提高提取效率。首先，選取優(yōu)質(zhì)的山茱萸藥材，經(jīng)干燥、粉碎后過(guò)40目篩備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的山茱萸粉末，置于圓底燒瓶中，按照一定的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液作為提取溶劑。將圓底燒瓶放入超聲清洗器中，設(shè)置超聲功率為200W，超聲溫度為50℃，超聲時(shí)間為30min，進(jìn)行超聲提取。在超聲過(guò)程中，超聲波的高頻振動(dòng)使山茱萸細(xì)胞內(nèi)的有效成分迅速溶出到乙醇溶液中。提取結(jié)束后，將提取液進(jìn)行抽濾，以去除未溶解的雜質(zhì)。得到的濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在50℃、減壓條件下進(jìn)行濃縮，直至大部分乙醇被蒸出，得到濃縮液。為了進(jìn)一步分離和純化總苷和多糖，將濃縮液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入等體積的石油醚，振搖萃取3次，每次10min。石油醚主要用于去除濃縮液中的脂溶性雜質(zhì)，使總苷和多糖等成分留在下層水相中。棄去上層石油醚相，將下層水相轉(zhuǎn)移至另一分液漏斗中，加入等體積的乙酸乙酯，振搖萃取3次，每次10min。乙酸乙酯能夠萃取部分極性較小的苷類(lèi)成分，進(jìn)一步提高總苷的純度。收集下層水相，即為富含總苷和多糖的水溶液。為了優(yōu)化提取條件，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)相結(jié)合的方法。單因素試驗(yàn)分別考察料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、超聲功率（100W、150W、200W、250W、300W）和超聲時(shí)間（15min、20min、25min、30min、35min）對(duì)總苷和多糖提取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)提取率影響顯著的因素，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型，分析各因素之間的交互作用，確定最佳提取條件為：料液比1:20，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲功率200W，超聲時(shí)間30min。在此條件下，總苷提取率可達(dá)[X1]%，多糖提取率可達(dá)[X2]%。3.1.2給藥劑量與方式根據(jù)前期研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將建模成功的糖尿病心肌病大鼠隨機(jī)分為模型組（DM組，n=10）、山茱萸低劑量組（LD組，n=10）、山茱萸中劑量組（MD組，n=10）、山茱萸高劑量組（HD組，n=10）以及陽(yáng)性對(duì)照組（PC組，n=10）。山茱萸提取物的給藥劑量參考相關(guān)文獻(xiàn)以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。山茱萸低劑量組給予1g/kg的山茱萸提取物，中劑量組給予2g/kg，高劑量組給予4g/kg。將山茱萸提取物用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的溶液，采用灌胃方式對(duì)大鼠進(jìn)行給藥，每天灌胃1次，連續(xù)給藥8周。灌胃時(shí)，使用灌胃針將適量的藥物溶液緩慢注入大鼠胃內(nèi)，操作過(guò)程中需注意避免損傷大鼠食管和胃部。陽(yáng)性對(duì)照組給予鹽酸二甲雙胍（劑量為200mg/kg）灌胃，鹽酸二甲雙胍是臨床上常用的降血糖藥物，能夠改善糖尿病患者的血糖代謝，同時(shí)對(duì)糖尿病心肌病也具有一定的治療作用，作為陽(yáng)性對(duì)照用于對(duì)比山茱萸提取物的治療效果。正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，以排除灌胃操作和生理鹽水對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在給藥期間，密切觀察大鼠的飲食、體重、精神狀態(tài)等一般情況，若發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)異常情況，及時(shí)進(jìn)行相應(yīng)處理。3.2心肌細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)3.2.1TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率采用TUNEL染色試劑盒（購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]）對(duì)心肌組織切片進(jìn)行染色，以檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。具體操作步驟如下：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出大鼠心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除血液和雜質(zhì)。將心臟組織切成約2mm厚的薄片，放入4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)，使組織充分固定。固定后的組織經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟等處理，制成石蠟切片，切片厚度為4μm。將石蠟切片置于60℃烘箱中烘烤1小時(shí)，使切片與載玻片緊密貼合。然后將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟各10分鐘，再依次經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇進(jìn)行梯度水化，每個(gè)步驟5分鐘。水化后的切片用PBS沖洗3次，每次5分鐘。用蛋白酶K工作液（20μg/ml）在37℃孵育15分鐘，以消化組織蛋白，增加細(xì)胞通透性。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。將切片浸入含2%過(guò)氧化氫的PBS溶液中，室溫孵育10分鐘，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。之后再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。在切片上滴加50μlTdT酶反應(yīng)液（按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制，陰性對(duì)照切片滴加不含TdT酶的反應(yīng)液），放入濕盒中，37℃避光孵育60分鐘。孵育完成后，將切片放入已預(yù)熱至37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液中，37℃保溫30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)切片，使液體充分接觸組織。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。在切片上滴加50μl過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，放入濕盒中，室溫孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗4次，每次5分鐘。在切片上滴加新鮮配制的0.05%二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液，室溫顯色3-6分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。用蒸餾水沖洗切片4次，前3次每次1分鐘，最后1次5分鐘。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1-2分鐘，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。然后依次經(jīng)過(guò)70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ脫水，每個(gè)步驟3分鐘。最后將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明各5分鐘，中性樹(shù)膠封片。在熒光顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）進(jìn)行觀察，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)視野中的凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡率，公式如下：????o????(\%)=\frac{????o????è????°}{??????è????°}\times100\%對(duì)比不同組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡率較低，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，表明糖尿病心肌病導(dǎo)致了心肌細(xì)胞凋亡增加。而山茱萸各劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較模型組均有不同程度降低，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，其中山茱萸高劑量組凋亡率降低最為明顯，說(shuō)明山茱萸能夠抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。3.2.2凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測(cè)運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞中caspase-3、Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，分析山茱萸對(duì)這些蛋白表達(dá)的影響。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：取適量心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上充分研磨，使組織裂解。將裂解后的組織勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。制備12%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為30μg。同時(shí)加入蛋白Marker，用于指示蛋白分子量大小。在恒壓100V條件下進(jìn)行電泳，使蛋白在凝膠中分離。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時(shí)，停止電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1.5小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后的PVDF膜加入一抗，caspase-3、Bax、Bcl-2抗體均按照1:1000的比例用5%脫脂奶粉稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。然后加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物中孵育1-2分鐘，然后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、顯影，采集圖像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，即為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織中caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低。caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行酶，其激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生；Bax是促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素c，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bcl-2是抗凋亡蛋白，能夠抑制線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素c，阻止細(xì)胞凋亡。模型組中這些蛋白表達(dá)的變化表明糖尿病心肌病誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而山茱萸各劑量組大鼠心肌組織中caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平較模型組均有不同程度降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平較模型組有不同程度升高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。這說(shuō)明山茱萸可能通過(guò)調(diào)節(jié)caspase-3、Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡，從而對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。3.3心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平檢測(cè)3.3.1活性氧（ROS）含量測(cè)定采用熒光探針2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量。DCFH-DA本身無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成DCFH，DCFH可被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化為具有強(qiáng)熒光的2,7-二氯熒光素（DCF），通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。具體操作步驟如下：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出大鼠心臟，剪取適量心肌組織，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，去除血液和雜質(zhì)。將心肌組織剪成約1mm3的小塊，放入含有0.25%胰蛋白酶的消化液中，37℃消化15-20分鐘，期間輕輕搖晃，使組織充分消化。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含10μMDCFH-DA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，37℃孵育20-30分鐘，使DCFH-DA充分進(jìn)入細(xì)胞。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。對(duì)比模型組和山茱萸干預(yù)組ROS水平變化，模型組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著高于正常對(duì)照組，表明糖尿病心肌病導(dǎo)致了心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。而山茱萸各劑量組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量較模型組均有不同程度降低，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，其中山茱萸高劑量組ROS含量降低最為明顯。這說(shuō)明山茱萸能夠有效降低糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。3.3.2抗氧化酶活性檢測(cè)采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用谷胱甘肽還原酶法檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活性。SOD能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫和氧氣。在黃嘌呤氧化酶法中，通過(guò)黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可與氮藍(lán)四唑（NBT）反應(yīng)生成藍(lán)色的甲臜，而SOD可以抑制該反應(yīng)。通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中藍(lán)色甲臜的生成量，即可間接反映SOD的活性。具體操作按照SOD檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。GSH-PX能夠催化還原型谷胱甘肽（GSH）與過(guò)氧化氫反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和水。在谷胱甘肽還原酶法中，谷胱甘肽還原酶可將GSSG還原為GSH，同時(shí)使輔酶Ⅱ（NADP?）還原為還原型輔酶Ⅱ（NADPH）。通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中NADPH的生成量，即可間接反映GSH-PX的活性。具體操作按照GSH-PX檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取適量心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑的預(yù)冷勻漿緩沖液，在冰上充分研磨，制成10%的心肌組織勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液用于檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別加入相應(yīng)的試劑，在特定條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算SOD和GSH-PX的活性。分析山茱萸對(duì)心肌細(xì)胞抗氧化能力的調(diào)節(jié)作用，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD和GSH-PX活性顯著降低。這是因?yàn)樘悄虿⌒募〔?dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，大量的ROS消耗了抗氧化酶，使其活性下降。而山茱萸各劑量組大鼠心肌組織中SOD和GSH-PX活性較模型組均有不同程度升高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。這表明山茱萸能夠提高糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗氧化能力，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。3.4心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)檢測(cè)3.4.1炎癥因子的測(cè)定采用ELISA試劑盒（購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]）檢測(cè)心肌組織勻漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的含量。實(shí)驗(yàn)前，將心肌組織從-80℃冰箱取出，置于冰上解凍。取適量心肌組織，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，在冰浴條件下用組織勻漿器充分勻漿，制成10%的心肌組織勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液用于檢測(cè)。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先在酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。然后加入相應(yīng)的檢測(cè)抗體，37℃孵育1-2小時(shí)，使抗體與抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。接著加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30-60分鐘。再次洗滌酶標(biāo)板5次后，加入底物溶液，37℃避光反應(yīng)15-30分鐘，使底物在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。最后加入終止液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出待測(cè)樣本中炎癥因子的含量。對(duì)比不同組炎癥因子水平差異，正常對(duì)照組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6等炎癥因子含量處于較低水平。模型組大鼠心肌組織中炎癥因子含量顯著高于正常對(duì)照組，這是因?yàn)樘悄虿⌒募〔?huì)引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子大量釋放。而山茱萸各劑量組大鼠心肌組織中炎癥因子含量較模型組均有不同程度降低，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。其中，山茱萸高劑量組炎癥因子含量降低最為明顯，說(shuō)明山茱萸能夠抑制糖尿病心肌病大鼠心肌組織的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。3.4.2炎癥相關(guān)信號(hào)通路的研究運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)NF-κB等炎癥相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。取適量心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上充分研磨，使組織裂解。將裂解后的組織勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。制備10%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為30μg。同時(shí)加入蛋白Marker，用于指示蛋白分子量大小。在恒壓100V條件下進(jìn)行電泳，使蛋白在凝膠中分離。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時(shí)，停止電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1.5小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后的PVDF膜加入一抗，NF-κBp65、IκB、p-IκB等抗體均按照1:1000的比例用5%脫脂奶粉稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。然后加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物中孵育1-2分鐘，然后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、顯影，采集圖像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，即為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。分析山茱萸對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織中p-IκB和NF-κBp65蛋白的表達(dá)水平顯著升高，IκB蛋白的表達(dá)水平顯著降低。這表明糖尿病心肌病激活了NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而山茱萸各劑量組大鼠心肌組織中p-IκB和NF-κBp65蛋白的表達(dá)水平較模型組均有不同程度降低，IκB蛋白的表達(dá)水平較模型組有不同程度升高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。這說(shuō)明山茱萸可能通過(guò)抑制IKK的活性，減少I(mǎi)κB的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB的活化，阻斷NF-κB信號(hào)通路，減輕糖尿病心肌病大鼠心肌組織的炎癥反應(yīng)，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。四、山茱萸保護(hù)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞的機(jī)制探討4.1對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響4.1.1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化通過(guò)Westernblot技術(shù)，深入探究山茱萸對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PI3K、Akt、p-Akt表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取大鼠心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上充分研磨，使組織裂解。將裂解后的組織勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。制備10%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為30μg。同時(shí)加入蛋白Marker，用于指示蛋白分子量大小。在恒壓100V條件下進(jìn)行電泳，使蛋白在凝膠中分離。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時(shí)，停止電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1.5小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后的PVDF膜加入一抗，PI3K、Akt、p-Akt抗體均按照1:1000的比例用5%脫脂奶粉稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。然后加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1:5000稀釋?zhuān)覝胤跤?小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物中孵育1-2分鐘，然后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、顯影，采集圖像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，即為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)比正常組、模型組和山茱萸干預(yù)組的差異，正常組大鼠心肌組織中PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平較高，Akt蛋白表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。模型組大鼠由于糖尿病心肌病的發(fā)生，PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明PI3K/Akt信號(hào)通路受到抑制。而山茱萸干預(yù)組中，隨著山茱萸劑量的增加，PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平逐漸升高，Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。其中，山茱萸高劑量組PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平與模型組相比有顯著差異，接近正常組水平。這表明山茱萸能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)PI3K的表達(dá)和Akt的磷酸化，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。4.1.2信號(hào)通路抑制劑的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/Akt信號(hào)通路在山茱萸保護(hù)機(jī)制中的作用，使用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002處理大鼠。將建模成功的糖尿病心肌病大鼠隨機(jī)分為模型組、山茱萸組、抑制劑組以及山茱萸聯(lián)合抑制劑組，每組10只。山茱萸組給予山茱萸高劑量提取物（4g/kg）灌胃，抑制劑組給予LY294002（10mg/kg）腹腔注射，山茱萸聯(lián)合抑制劑組先給予LY294002腹腔注射，1小時(shí)后再給予山茱萸高劑量提取物灌胃，模型組給予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)處理8周后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，采用TUNEL染色法檢測(cè)凋亡率，Westernblot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果顯示，模型組凋亡率顯著高于正常組，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低。山茱萸組凋亡率較模型組顯著降低，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高。抑制劑組凋亡率進(jìn)一步升高，Bax蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低。山茱萸聯(lián)合抑制劑組凋亡率介于山茱萸組和抑制劑組之間，雖低于抑制劑組，但高于山茱萸組，Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)變化也介于兩組之間。檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)，采用DCFH-DA法檢測(cè)ROS含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性，谷胱甘肽還原酶法檢測(cè)GSH-PX活性。結(jié)果表明，模型組ROS含量顯著升高，SOD和GSH-PX活性顯著降低。山茱萸組ROS含量降低，SOD和GSH-PX活性升高。抑制劑組ROS含量進(jìn)一步升高，SOD和GSH-PX活性進(jìn)一步降低。山茱萸聯(lián)合抑制劑組ROS含量、SOD和GSH-PX活性變化介于山茱萸組和抑制劑組之間。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，使用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑后，山茱萸對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用受到明顯抑制，心肌細(xì)胞凋亡增加，氧化應(yīng)激水平升高。這進(jìn)一步證實(shí)了PI3K/Akt信號(hào)通路在山茱萸保護(hù)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞的機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，山茱萸可能通過(guò)激活該信號(hào)通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。4.2對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用4.2.1心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出大鼠心臟，剪取適量心肌組織，將其置于含有0.25%胰蛋白酶的消化液中，37℃消化15-20分鐘，期間輕輕搖晃，使組織充分消化。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含5μM熒光探針Fluo-3/AM的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，37℃孵育30分鐘，使Fluo-3/AM充分進(jìn)入細(xì)胞。Fluo-3/AM本身無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成Fluo-3，F(xiàn)luo-3可與細(xì)胞內(nèi)的鈣離子結(jié)合，形成具有強(qiáng)熒光的復(fù)合物。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的Fluo-3/AM。將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度，即可反映心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。對(duì)比模型組和山茱萸干預(yù)組的結(jié)果，模型組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著高于正常對(duì)照組，這是由于糖尿病心肌病導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，鈣離子大量?jī)?nèi)流，使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。而山茱萸各劑量組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度較模型組均有不同程度降低，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，其中山茱萸高劑量組鈣離子濃度降低最為明顯。這表明山茱萸能夠調(diào)節(jié)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，使其趨于正常水平，從而維持心肌細(xì)胞的正常功能。4.2.2鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)分析運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜上的鈣通道蛋白（如L型鈣通道蛋白CaV1.2）、肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA2a）等鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取大鼠心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上充分研磨，使組織裂解。將裂解后的組織勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。制備10%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為30μg。同時(shí)加入蛋白Marker，用于指示蛋白分子量大小。在恒壓100V條件下進(jìn)行電泳，使蛋白在凝膠中分離。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時(shí)，停止電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1.5小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后的PVDF膜加入一抗，CaV1.2、SERCA2a等抗體均按照1:1000的比例用5%脫脂奶粉稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。然后加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1:5000稀釋?zhuān)?，室溫孵?小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物中孵育1-2分鐘，然后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、顯影，采集圖像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，即為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織中CaV1.2蛋白表達(dá)水平顯著升高，SERCA2a蛋白表達(dá)水平顯著降低。CaV1.2是心肌細(xì)胞膜上主要的L型鈣通道蛋白，其表達(dá)升高會(huì)導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加；SERCA2a是肌漿網(wǎng)鈣泵，負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的鈣離子泵回肌漿網(wǎng)，其表達(dá)降低會(huì)使肌漿網(wǎng)對(duì)鈣離子的攝取能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞的正常收縮和舒張功能。而山茱萸各劑量組大鼠心肌組織中CaV1.2蛋白表達(dá)水平較模型組均有不同程度降低，SERCA2a蛋白表達(dá)水平較模型組有不同程度升高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。這說(shuō)明山茱萸可能通過(guò)調(diào)節(jié)鈣通道蛋白和肌漿網(wǎng)鈣泵的表達(dá)，減少鈣離子內(nèi)流，增強(qiáng)肌漿網(wǎng)對(duì)鈣離子的攝取和儲(chǔ)存能力，從而維持心肌細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)，對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。4.3對(duì)線(xiàn)粒體功能的保護(hù)作用4.3.1線(xiàn)粒體膜電位的檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位（ΔΨm）是反映線(xiàn)粒體功能的重要指標(biāo)，其穩(wěn)定對(duì)于維持心肌細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，線(xiàn)粒體通過(guò)呼吸鏈的電子傳遞過(guò)程產(chǎn)生質(zhì)子電化學(xué)梯度，形成穩(wěn)定的線(xiàn)粒體膜電位。當(dāng)線(xiàn)粒體功能受損時(shí)，膜電位會(huì)發(fā)生去極化，導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡等一系列病理變化。本研究利用JC-1熒光探針檢測(cè)心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位。JC-1是一種廣泛應(yīng)用于檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的陽(yáng)離子熒光染料，具有膜電位依賴(lài)性的熒光特性。在正常高膜電位的線(xiàn)粒體中，JC-1可以聚集在線(xiàn)粒體內(nèi)，形成J-聚集體，發(fā)射紅色熒光（Ex/Em=585/590nm）；而在低膜電位的線(xiàn)粒體中，JC-1則以單體形式存在，發(fā)射綠色熒光（Ex/Em=514/529nm）。通過(guò)檢測(cè)紅色熒光與綠色熒光的強(qiáng)度比值（R/G），可以定量反映線(xiàn)粒體膜電位的變化。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出大鼠心臟，剪取適量心肌組織，將其置于含有0.25%胰蛋白酶的消化液中，37℃消化15-20分鐘，期間輕輕搖晃，使組織充分消化。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含10μMJC-1的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，37℃孵育20-30分鐘，使JC-1充分進(jìn)入細(xì)胞。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的JC-1。將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的紅色熒光強(qiáng)度和綠色熒光強(qiáng)度，計(jì)算R/G值。對(duì)比正常組、模型組和山茱萸干預(yù)組的線(xiàn)粒體膜電位變化，正常組大鼠心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位較高，R/G值較大。模型組大鼠由于糖尿病心肌病的發(fā)生，線(xiàn)粒體功能受損，膜電位明顯下降，R/G值顯著降低。而山茱萸各劑量組大鼠心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位較模型組均有不同程度升高，R/G值增大，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性，其中山茱萸高劑量組R/G值升高最為明顯，接近正常組水平。這表明山茱萸能夠維持糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的穩(wěn)定，對(duì)線(xiàn)粒體功能具有保護(hù)作用。4.3.2線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物活性檢測(cè)線(xiàn)粒體呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞能量代謝的關(guān)鍵部位，由復(fù)合物Ⅰ-Ⅴ組成，這些復(fù)合物協(xié)同作用，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化產(chǎn)生的電子傳遞給氧氣，同時(shí)偶聯(lián)質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，形成質(zhì)子電化學(xué)梯度，驅(qū)動(dòng)ATP的合成。線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的改變會(huì)直接影響線(xiàn)粒體的能量代謝功能，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。本研究采用分光光度法測(cè)定線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ-Ⅴ的活性。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出大鼠心臟，剪取適量心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的線(xiàn)粒體裂解緩沖液，在冰上充分研磨，使組織裂解。將裂解后的組織勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為線(xiàn)粒體粗提物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定線(xiàn)粒體粗提物的蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，將線(xiàn)粒體粗提物調(diào)整至相同濃度。按照線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ-Ⅴ活性檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自[試劑供應(yīng)商]）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別加入相應(yīng)的底物和試劑，在特定條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ-Ⅴ的活性。分析山茱萸對(duì)線(xiàn)粒體能量代謝的調(diào)節(jié)作用，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌組織中線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ-Ⅴ的活性均顯著降低。這是因?yàn)樘悄虿⌒募〔?dǎo)致線(xiàn)粒體功能受損，呼吸鏈復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，使其活性下降，進(jìn)而影響了線(xiàn)粒體的能量代謝，導(dǎo)致ATP合成減少，心肌細(xì)胞能量供應(yīng)不足。而山茱萸各劑量組大鼠心肌組織中線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ-Ⅴ的活性較模型組均有不同程度升高，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。這表明山茱萸能夠提高糖尿病心肌病大鼠心肌組織中線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性，增強(qiáng)線(xiàn)粒體的能量代謝功能，促進(jìn)ATP的合成，為心肌細(xì)胞提供充足的能量，從而對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。五、研究結(jié)果與討論5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)5.1.1山茱萸對(duì)糖尿病心肌病大鼠心臟功能和結(jié)構(gòu)的改善通過(guò)心臟超聲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，糖尿病心肌病模型組大鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）顯著降低，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）明顯增大，表明模型組大鼠心臟收縮和舒張功能受損，心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。給予山茱萸干預(yù)后，山茱萸各劑量組大鼠的LVEF和LVFS較模型組均有不同程度升高，LVEDd和LVESd有所減小，且呈劑量依賴(lài)性。其中，山茱萸高劑量組的改善效果最為顯著，LVEF和LVFS接近正常對(duì)照組水平，說(shuō)明山茱萸能夠有效改善糖尿病心肌病大鼠的心臟功能。在心肌組織病理學(xué)觀察方面，HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列緊密整齊。模型組心肌細(xì)胞體積增大、變形，排列紊亂，細(xì)胞核增大、深染，部分細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)核固縮、核碎裂等現(xiàn)象，心肌間質(zhì)可見(jiàn)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。山茱萸各劑量組心肌細(xì)胞形態(tài)和排列情況較模型組有明顯改善，細(xì)胞水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，其中山茱萸高劑量組心肌細(xì)胞形態(tài)和排列