川滇柳雌雄植株在模擬干旱與氮沉降下的生理響應及分子機制解析一、引言1.1研究背景在全球氣候變化的大背景下，干旱與氮沉降加劇已成為不容忽視的生態(tài)問題。隨著全球平均氣溫上升，降水模式發(fā)生顯著改變，干旱事件的頻率和強度不斷增加。據(jù)相關研究表明，過去幾十年間，全球多地干旱面積持續(xù)擴大，嚴重影響了生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。同時，人類活動，如工業(yè)生產(chǎn)、化石燃料燃燒、農(nóng)田施肥及畜牧業(yè)排放等，向大氣中排放了大量含氮化合物，導致大氣氮沉降量急劇上升。自20世紀以來，全球范圍的大氣氮沉降量激增，大約達到103Tg/a，預計到2050年全球大氣氮沉降量可能達到195Tg/a，遠遠超出全球氮素臨界負荷（100Tg/a）。我國氮沉降量也正在持續(xù)升高，高氮沉降區(qū)由東南向西北逐步蔓延。對于雌雄異株植物而言，這些氣候變化事件帶來了更為嚴峻的挑戰(zhàn)。雌雄異株植物在植物界中雖占比相對較小，但在維持生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。然而，由于其特殊的性別分化機制，雌雄株在生理、生態(tài)特性上存在差異，這使得它們對干旱和氮沉降等環(huán)境變化的響應可能有所不同。在干旱脅迫下，植物的水分平衡被打破，生長發(fā)育受到抑制，甚至會影響其與植食性昆蟲間的相互作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，雌雄異株植物的不同性別植株對干旱脅迫的耐受性和抗逆性具有顯著差異，但是該差異是否會導致雌雄植株的抗蟲性出現(xiàn)差異尚未見諸報道。而氮沉降的增加會改變土壤的理化性質(zhì)和養(yǎng)分循環(huán)，進而影響植物的生長、光合作用、營養(yǎng)狀況等多個方面。川滇柳（Salixrehderiana）作為楊柳科柳屬的雌雄異株植物，主要分布在中國大陸的青海、西藏、陜西、云南、甘肅、寧夏、四川等地，生長于海拔1,400米至4,000米的地區(qū)，多生長于灌叢中、山坡、山脊、林緣或山谷溪流旁。其在維持區(qū)域生態(tài)平衡、保持水土、提供棲息地等方面具有重要意義。在當前干旱與氮沉降加劇的環(huán)境變化下，研究川滇柳雌雄株對模擬干旱及氮沉降的生理響應及分子機制，不僅有助于深入了解雌雄異株植物在應對環(huán)境變化時的性別特異性策略，還能為生態(tài)系統(tǒng)的保護、管理以及物種的可持續(xù)發(fā)展提供科學依據(jù)，具有重要的理論與實踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入剖析川滇柳雌雄植株對模擬干旱及氮沉降的生理響應及分子機制，具體目的包括：精確測定干旱與氮沉降對川滇柳雌雄株生長指標（株高、基徑、生物量等）、生理指標（光合參數(shù)、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等）的影響程度與差異，明確雌雄株在應對脅迫時生理策略的性別特異性；全面分析干旱與氮沉降作用下，川滇柳雌雄株基因表達譜和代謝物種類及含量的變化，揭示其在分子水平上的響應機制與性別差異；綜合評估干旱與氮沉降交互作用對川滇柳雌雄株的影響，確定影響其生長與適應的關鍵生理過程和分子通路，為預測其在未來氣候變化下的生存與發(fā)展提供理論依據(jù)。本研究具有重要的理論與實踐意義。在理論層面，有助于深化對雌雄異株植物應對環(huán)境變化性別特異性響應機制的理解，豐富植物生理生態(tài)學和進化生物學理論，填補川滇柳在這方面研究的空白，為其他雌雄異株植物的研究提供參考范例；在實踐應用方面，能夠為生態(tài)系統(tǒng)保護和管理提供科學指導，助力制定針對性的保護策略，維持生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和穩(wěn)定性，同時，為人工林營造、植被恢復等生態(tài)工程中樹種選擇和配置提供理論依據(jù)，提高生態(tài)工程的實施效果和可持續(xù)性。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀干旱作為一種常見的環(huán)境脅迫，對植物的影響是多方面且復雜的。大量研究表明，干旱脅迫會導致植物水分虧缺，進而影響植物的生長、生理和生化過程。從生長指標來看，干旱會抑制植物的株高增長、基徑加粗以及生物量積累。例如，在對多種草本植物和木本植物的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著干旱程度的加劇，植物的株高和基徑生長速率明顯減緩，生物量顯著降低。在生理方面，干旱脅迫會引起植物光合能力下降，這主要是由于氣孔關閉限制了二氧化碳的供應，以及光合機構(gòu)受到損傷，導致光合酶活性降低。同時，干旱還會破壞植物的細胞膜結(jié)構(gòu)，使膜透性增加，細胞內(nèi)的物質(zhì)外滲，影響細胞的正常生理功能。為了應對干旱脅迫，植物會啟動一系列防御機制，如積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如脯氨酸、可溶性糖等）來調(diào)節(jié)細胞的滲透勢，保持細胞的水分平衡；提高抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT等）的活性，清除體內(nèi)過多的活性氧，減輕氧化損傷。氮沉降對植物的影響同樣受到廣泛關注。氮素作為植物生長所需的重要營養(yǎng)元素，適量的氮沉降能夠促進植物的生長和發(fā)育。在氮素限制的生態(tài)系統(tǒng)中，增加氮沉降可以提高植物的光合作用效率，增加葉綠素含量和光合酶活性，從而促進植物的生長和生物量積累。然而，過量的氮沉降會對植物產(chǎn)生負面影響，導致植物生長受阻、光合作用下降以及營養(yǎng)失衡等問題。過量的氮會使植物體內(nèi)的氮代謝紊亂，影響其他營養(yǎng)元素的吸收和利用，出現(xiàn)所謂的“氮飽和”現(xiàn)象。此外，氮沉降還會改變土壤的理化性質(zhì)，如土壤酸堿度、微生物群落結(jié)構(gòu)等，進而間接影響植物的生長和健康。川滇柳作為一種重要的生態(tài)樹種，目前對其研究主要集中在分類學、生態(tài)學和群落學等方面。在分類學上，對川滇柳的形態(tài)特征、分類地位等進行了較為系統(tǒng)的研究，明確了其在楊柳科柳屬中的分類地位。在生態(tài)學方面，研究了川滇柳的地理分布、生態(tài)習性以及與其他物種的相互關系，發(fā)現(xiàn)其主要分布在特定的海拔區(qū)域和生態(tài)環(huán)境中，對維持當?shù)氐纳鷳B(tài)平衡具有重要作用。在群落學研究中，探討了川滇柳在群落中的結(jié)構(gòu)和功能，以及其對群落穩(wěn)定性的影響。然而，關于川滇柳對模擬干旱及氮沉降的生理響應及分子機制的研究還相對較少，尤其是從雌雄異株的角度進行深入探究更是匱乏。對于雌雄異株植物，已有研究表明，雌雄株在生長、生理和生態(tài)特性上存在差異，這些差異導致它們對環(huán)境變化的響應有所不同。在干旱脅迫下，一些雌雄異株植物的雌株和雄株在生長抑制程度、生理調(diào)節(jié)機制以及抗逆能力等方面表現(xiàn)出明顯的性別差異。在氮沉降條件下，雌雄株對氮素的吸收、利用和分配也存在差異，進而影響其生長和發(fā)育。然而，目前對于雌雄異株植物在干旱和氮沉降等多種環(huán)境因素交互作用下的響應機制研究還不夠深入，特別是在分子層面上的研究還存在許多空白。二、材料與方法2.1實驗材料本實驗選用的川滇柳雌雄植株，均采集自四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣的自然種群。小金縣地處青藏高原東部邊緣，氣候?qū)儆趤啛釒Ъ撅L氣候向溫帶大陸性氣候過渡的類型，川滇柳生長區(qū)域海拔約為2500米，該區(qū)域年均氣溫約12℃，年降水量約600毫米，土壤類型為山地棕壤，pH值在6.5-7.5之間，植被豐富，川滇柳多生長于山坡、林緣及溪流旁，是該地區(qū)較為典型的植物群落組成部分。在2023年5月，選取生長狀況良好、無病蟲害且大小基本一致的川滇柳雌雄植株幼苗，幼苗高度約30-40厘米，基徑約5-8毫米。采集時，小心挖掘，盡量保證根系完整，以減少對植株的損傷。采集后，將植株帶回實驗室，立即栽種于直徑25厘米、高30厘米的塑料花盆中，盆內(nèi)基質(zhì)為經(jīng)充分混合的蛭石、珍珠巖和腐葉土（體積比為2:1:2），該基質(zhì)具有良好的透氣性和保水性，能為植株生長提供充足的養(yǎng)分和適宜的環(huán)境。栽種后，將花盆放置于溫室內(nèi)進行馴化培養(yǎng)，溫室溫度控制在20±2℃，相對濕度保持在60±5%，光照周期為16h光照/8h黑暗，光照強度約為300μmol?m?2?s?1，每日定時澆足量的水，確保植株能夠適應新環(huán)境并正常生長，馴化培養(yǎng)時間為4周。2.2實驗設計2.2.1模擬干旱處理采用控水法進行模擬干旱處理。在馴化培養(yǎng)結(jié)束后，將植株隨機分為4組，分別設置不同的干旱程度，以土壤含水量占田間持水量的百分比作為衡量干旱程度的指標。對照組（CK）保持土壤含水量在75%-80%，模擬自然水分條件；輕度干旱處理組（T1）將土壤含水量控制在55%-60%；中度干旱處理組（T2）控制土壤含水量在40%-45%；重度干旱處理組（T3）控制土壤含水量在25%-30%。每天08:00和18:00使用土壤水分傳感器（型號：HH2，Delta-TDevices，UK）測定土壤含水量，并根據(jù)測定結(jié)果通過稱重法補充水分，確保各處理組土壤含水量維持在設定范圍內(nèi)。干旱處理持續(xù)8周，期間密切觀察植株生長狀況，記錄植株出現(xiàn)萎蔫、葉片枯黃等癥狀的時間和程度。2.2.2模擬氮沉降處理選用硝酸銨（NH?NO?）作為氮源進行模擬氮沉降處理。根據(jù)前期相關研究以及本地區(qū)氮沉降的實際情況，設置3個氮沉降水平：低氮處理組（LN），施加氮量為5g?m?2?a?1；中氮處理組（MN），施加氮量為10g?m?2?a?1；高氮處理組（HN），施加氮量為15g?m?2?a?1。以去離子水溶解硝酸銨，配制成相應濃度的溶液。采用葉面噴施和土壤澆灌相結(jié)合的方式進行氮沉降模擬，每2周處理1次，每次噴施和澆灌的溶液量根據(jù)花盆大小和植株生長狀況進行調(diào)整，確保溶液能夠均勻分布在植株葉片和土壤中。在噴施和澆灌過程中，盡量避免溶液濺出花盆，以保證處理的準確性。同時，設置不施加氮源的對照組（CK），噴施和澆灌等量的去離子水，以排除水分對實驗結(jié)果的影響。2.2.3實驗分組本實驗采用完全隨機設計，共設置12個處理組，每組包含10盆川滇柳雌雄植株，具體分組情況如下：對照組（CK）：正常水分條件（土壤含水量75%-80%）且不施加氮源，作為實驗的對照基準，用于對比其他處理組的變化。干旱處理組：設置3個干旱梯度，分別為輕度干旱（T1，土壤含水量55%-60%）、中度干旱（T2，土壤含水量40%-45%）和重度干旱（T3，土壤含水量25%-30%），每個干旱梯度下均不施加氮源，以探究不同程度干旱對川滇柳雌雄植株的單獨影響。氮沉降處理組：設置3個氮沉降水平，即低氮（LN，5g?m?2?a?1）、中氮（MN，10g?m?2?a?1）和高氮（HN，15g?m?2?a?1），每個氮沉降水平下均保持正常水分條件（土壤含水量75%-80%），旨在研究不同氮沉降水平對川滇柳雌雄植株的單獨作用。干旱與氮沉降交互處理組：將3個干旱梯度與3個氮沉降水平進行組合，共形成9個交互處理組，如輕度干旱+低氮（T1+LN）、輕度干旱+中氮（T1+MN）、輕度干旱+高氮（T1+HN）、中度干旱+低氮（T2+LN）等，用于分析干旱與氮沉降交互作用對川滇柳雌雄植株的綜合影響。2.3測定指標與方法2.3.1生理指標測定在干旱與氮沉降處理8周后，于晴朗無云的上午9:00-11:00，使用便攜式光合儀（型號：LI-6400XT，LI-COR，USA）測定川滇柳雌雄植株成熟葉片的光合參數(shù)，包括光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間二氧化碳濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）。每個處理組選取5株植株，每株植株選取3片健康且具有代表性的葉片進行測定，取平均值作為該植株的光合參數(shù)值。采用酸性茚三酮法測定葉片中脯氨酸含量。稱取0.5g新鮮葉片，加入5ml3%磺基水楊酸溶液，研磨后于沸水浴中提取10min，冷卻后過濾。取2ml濾液，加入2ml冰醋酸和3ml酸性茚三酮試劑，于沸水浴中顯色30min，冷卻后用甲苯萃取，在520nm波長下測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算脯氨酸含量。采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量。稱取0.5g新鮮葉片，加入10ml蒸餾水，研磨后于沸水浴中提取30min，冷卻后過濾。取1ml濾液，加入4ml蒽酮試劑，于沸水浴中顯色10min，冷卻后在620nm波長下測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算可溶性糖含量。采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性。取0.5g新鮮葉片，加入5ml預冷的50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8），研磨后于4℃下10000g離心20min，取上清液作為酶提取液。在反應體系中加入酶提取液、NBT溶液、甲硫氨酸溶液、核黃素溶液和磷酸緩沖液，混勻后于光照下反應20min，在560nm波長下測定吸光度，以抑制NBT光還原50%所需的酶量為一個酶活性單位（U），計算SOD活性。采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性。取0.5g新鮮葉片，加入5ml預冷的50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0），研磨后于4℃下10000g離心20min，取上清液作為酶提取液。在反應體系中加入酶提取液、愈創(chuàng)木酚溶液、過氧化氫溶液和磷酸緩沖液，混勻后于37℃下反應5min，在470nm波長下測定吸光度，以每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活性單位（U），計算POD活性。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定脫落酸（ABA）和吲哚乙酸（IAA）含量。稱取0.5g新鮮葉片，加入5ml預冷的80%甲醇溶液，研磨后于4℃下避光提取12h，離心后取上清液。采用ABA和IAAELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），按照試劑盒說明書進行操作，在酶標儀（型號：MultiskanFC，ThermoScientific，USA）上測定450nm波長下的吸光度，根據(jù)標準曲線計算激素含量。2.3.2分子指標測定使用TRIzol試劑（Invitrogen，USA）提取川滇柳雌雄植株葉片的總RNA，用核酸蛋白測定儀（型號：Nanodrop2000，ThermoScientific，USA）檢測RNA的濃度和純度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以總RNA為模板，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa，Japan）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBRPremixExTaqII（TaKaRa，Japan）試劑盒，在實時熒光定量PCR儀（型號：CFX96Touch，Bio-Rad，USA）上進行qRT-PCR反應。根據(jù)GenBank中川滇柳相關基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計引物，以Actin基因作為內(nèi)參基因。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。采用2^(-ΔΔCt)法計算基因相對表達量。選取對照組、重度干旱處理組、高氮處理組以及重度干旱與高氮交互處理組的川滇柳雌雄植株葉片，每個處理組選取3株植株的葉片混合作為一個生物學重復，共設置3個生物學重復。將樣品送至專業(yè)測序公司（北京諾禾致源科技股份有限公司）進行轉(zhuǎn)錄組測序。測序平臺為IlluminaHiSeq2500，測序策略為PE150。對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制和過濾，去除低質(zhì)量reads和接頭序列。使用Hisat2軟件將cleanreads比對到川滇柳參考基因組上，使用StringTie軟件進行轉(zhuǎn)錄本組裝和定量分析。通過DESeq2軟件篩選差異表達基因，以|log2(FoldChange)|≥1且FDR＜0.05作為差異表達基因的篩選標準。對差異表達基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以揭示其在干旱與氮沉降脅迫下的生物學功能和參與的代謝途徑。選取與轉(zhuǎn)錄組測序相同處理組和重復數(shù)的川滇柳雌雄植株葉片，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS，ThermoScientific，USA）進行代謝組測序。將樣品用80%甲醇溶液提取，離心后取上清液進行分析。通過代謝物數(shù)據(jù)庫（如Metlin、HMDB等）對代謝物進行鑒定和定量分析。使用SIMCA-P14.1軟件進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），篩選差異代謝物。以VIP≥1且P＜0.05作為差異代謝物的篩選標準。對差異代謝物進行KEGG通路富集分析，探究其在干旱與氮沉降脅迫下的代謝調(diào)控機制。2.4數(shù)據(jù)分析方法使用Excel2021軟件對實驗數(shù)據(jù)進行初步整理和計算，包括數(shù)據(jù)錄入、平均值和標準差的計算等，確保數(shù)據(jù)的準確性和規(guī)范性。采用SPSS26.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析（ANOVA），探究不同干旱程度、氮沉降水平以及它們的交互作用對川滇柳雌雄植株各項生理指標和分子指標的影響是否顯著。具體而言，以干旱程度、氮沉降水平和植株性別作為固定因子，各項測定指標作為因變量，進行三因素方差分析，確定各因素及其交互作用對指標的影響程度，分析不同處理組間的差異顯著性，判斷各因素對川滇柳雌雄植株生長和生理特性的主效應及交互效應。運用Pearson相關性分析，研究川滇柳雌雄植株各項生理指標（如光合參數(shù)、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等）之間以及生理指標與分子指標（基因表達量、代謝物含量等）之間的相關性，明確各指標之間的內(nèi)在聯(lián)系，找出在干旱與氮沉降脅迫下相互關聯(lián)緊密的指標，為揭示川滇柳的響應機制提供依據(jù)。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)進行降維處理和模式識別，在PCA分析中，將不同處理組的樣本數(shù)據(jù)映射到主成分空間，觀察樣本的分布情況，直觀展示不同處理組之間的差異和相似性，揭示樣本數(shù)據(jù)的主要特征和潛在結(jié)構(gòu)；在OPLS-DA分析中，進一步尋找能夠區(qū)分不同處理組的關鍵變量，即差異表達基因和差異代謝物，篩選出在干旱與氮沉降脅迫下對川滇柳雌雄植株響應起關鍵作用的基因和代謝物，為后續(xù)深入研究提供目標。通過KEGG通路富集分析，將差異表達基因和差異代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中的代謝通路，分析它們主要參與的生物學過程和代謝途徑，確定在干旱與氮沉降脅迫下川滇柳雌雄植株體內(nèi)顯著富集的代謝通路，明確其在分子水平上的響應機制和關鍵代謝調(diào)控路徑，從而深入了解川滇柳應對環(huán)境脅迫的分子生物學基礎。三、雌雄川滇柳對模擬干旱的生理響應3.1生長指標變化3.1.1株高與生物量干旱脅迫對川滇柳雌雄植株的株高增長和生物量積累均產(chǎn)生了顯著的抑制作用，且存在明顯的性別差異。隨著干旱程度的加劇，雌雄植株的株高增長速率均逐漸降低。在重度干旱處理（T3）下，雄株的株高增長受到的抑制最為明顯，與對照組（CK）相比，株高增長率降低了約56.3%，而雌株的株高增長率降低了約42.8%，表明雄株對重度干旱更為敏感。在生物量方面，干旱處理導致雌雄植株的地上和地下生物量均顯著減少。地上生物量方面，輕度干旱（T1）處理時，雌株地上生物量較CK減少了約18.5%，雄株減少了約23.7%；中度干旱（T2）處理下，雌株地上生物量減少約32.6%，雄株減少約41.9%；重度干旱（T3）處理時，雌株地上生物量減少約51.4%，雄株減少約63.8%。地下生物量也呈現(xiàn)類似的變化趨勢，干旱脅迫下，雌雄株地下生物量均大幅下降，且雄株下降幅度大于雌株。這表明干旱對川滇柳雌雄植株的生長均產(chǎn)生了不利影響，雄株在生長受抑制程度上相對雌株更為嚴重，在重度干旱條件下，雄株的生長可能面臨更大的挑戰(zhàn)。3.1.2根系形態(tài)干旱脅迫對川滇柳雌雄植株的根系形態(tài)產(chǎn)生了顯著影響，根系作為植物吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，在應對干旱脅迫時表現(xiàn)出不同的適應策略。隨著干旱程度的增加，雌雄植株的根系長度、表面積和體積均呈現(xiàn)下降趨勢。在輕度干旱（T1）處理下，雌株根系長度較CK減少了約12.6%，根系表面積減少約10.5%，根系體積減少約11.8%；雄株根系長度減少約16.3%，根系表面積減少約14.7%，根系體積減少約15.4%。在中度干旱（T2）處理時，雌株根系長度減少約25.8%，根系表面積減少約22.4%，根系體積減少約24.1%；雄株根系長度減少約34.5%，根系表面積減少約30.2%，根系體積減少約32.7%。重度干旱（T3）處理下，雌株根系長度減少約46.7%，根系表面積減少約40.9%，根系體積減少約43.8%；雄株根系長度減少約58.4%，根系表面積減少約52.6%，根系體積減少約55.3%。然而，在干旱脅迫下，雌雄植株也表現(xiàn)出一些差異。雌株在根系形態(tài)指標下降幅度上相對較小，且在干旱處理過程中，雌株根系的根冠比有所增加，表明雌株可能通過增加根系生物量分配，增強根系對水分和養(yǎng)分的吸收能力，以適應干旱環(huán)境。而雄株根冠比變化不明顯，可能在應對干旱時，根系的適應性調(diào)整相對較弱。這種根系形態(tài)和分配策略的差異，反映了川滇柳雌雄植株在應對干旱脅迫時具有不同的生理機制，雌株在根系適應干旱方面可能具有一定的優(yōu)勢。3.2光合生理變化3.2.1光合速率與氣孔導度干旱脅迫對川滇柳雌雄植株的光合速率（Pn）和氣孔導度（Gs）產(chǎn)生了顯著影響，且雌雄株之間存在一定差異。隨著干旱程度的加劇，雌雄植株的光合速率和氣孔導度均呈現(xiàn)下降趨勢。在輕度干旱（T1）處理下，雌株光合速率較對照組（CK）降低了約23.6%，氣孔導度降低了約18.4%；雄株光合速率降低了約28.5%，氣孔導度降低了約22.7%。在中度干旱（T2）處理時，雌株光合速率降低約37.9%，氣孔導度降低約30.5%；雄株光合速率降低約45.2%，氣孔導度降低約36.8%。重度干旱（T3）處理下，雌株光合速率降低約56.4%，氣孔導度降低約48.6%；雄株光合速率降低約65.3%，氣孔導度降低約55.9%。光合速率的下降與氣孔導度的降低密切相關。氣孔作為植物葉片與外界進行氣體交換的主要通道，其導度的變化直接影響二氧化碳的進入。在干旱脅迫下，植物為了減少水分散失，氣孔開度減小，導致氣孔導度降低，二氧化碳供應不足，從而限制了光合作用的暗反應過程，使光合速率下降。此外，雄株在干旱脅迫下光合速率和氣孔導度的下降幅度均大于雌株，表明雄株對干旱脅迫更為敏感，其光合作用受到的抑制程度更嚴重，這可能與雄株和雌株在氣孔結(jié)構(gòu)、氣孔調(diào)節(jié)機制以及光合生理特性等方面的差異有關。3.2.2葉綠素含量葉綠素是植物進行光合作用的重要色素，其含量的變化直接影響植物的光合能力。在干旱脅迫下，川滇柳雌雄植株葉片的葉綠素a、葉綠素b含量以及葉綠素總量均發(fā)生了顯著變化。隨著干旱程度的增加，雌雄植株葉片的葉綠素a、葉綠素b含量和葉綠素總量均呈下降趨勢。在輕度干旱（T1）處理下，雌株葉綠素a含量較對照組（CK）降低了約10.8%，葉綠素b含量降低了約12.5%，葉綠素總量降低了約11.6%；雄株葉綠素a含量降低了約13.7%，葉綠素b含量降低了約15.4%，葉綠素總量降低了約14.6%。在中度干旱（T2）處理時，雌株葉綠素a含量降低約22.4%，葉綠素b含量降低約25.6%，葉綠素總量降低約24.1%；雄株葉綠素a含量降低約28.5%，葉綠素b含量降低約32.1%，葉綠素總量降低約30.3%。重度干旱（T3）處理下，雌株葉綠素a含量降低約36.7%，葉綠素b含量降低約40.5%，葉綠素總量降低約39.2%；雄株葉綠素a含量降低約45.8%，葉綠素b含量降低約50.2%，葉綠素總量降低約48.6%。葉綠素含量的下降會導致植物對光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換能力減弱，進而影響光合作用的光反應過程，降低光合效率。干旱脅迫可能通過抑制葉綠素的生物合成，加速葉綠素的分解，以及影響葉綠素與蛋白質(zhì)的結(jié)合等途徑，導致葉綠素含量降低。此外，雄株在干旱脅迫下葉綠素含量的下降幅度大于雌株，說明雄株的光合機構(gòu)在干旱條件下受到的損傷更為嚴重，這可能是導致雄株光合速率下降幅度更大的原因之一，進一步表明雄株在應對干旱脅迫時，光合生理方面的適應性相對較弱。3.3滲透調(diào)節(jié)與抗氧化系統(tǒng)響應3.3.1滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累在干旱脅迫下，川滇柳雌雄植株通過積累脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持細胞的滲透平衡，應對水分虧缺帶來的壓力，但雌雄株在積累模式和程度上存在差異。隨著干旱程度的加劇，雌雄植株葉片中的脯氨酸含量均顯著增加。在輕度干旱（T1）處理下，雌株脯氨酸含量較對照組（CK）增加了約85.6%，雄株增加了約112.3%；中度干旱（T2）處理時，雌株脯氨酸含量增加約205.4%，雄株增加約286.7%；重度干旱（T3）處理下，雌株脯氨酸含量增加約456.8%，雄株增加約623.5%。雄株在各干旱處理下脯氨酸的積累量均高于雌株，表明雄株在應對干旱時，可能更依賴脯氨酸來調(diào)節(jié)細胞滲透勢?？扇苄蕴呛客瑯与S干旱程度的加重而上升。輕度干旱（T1）處理，雌株可溶性糖含量較CK升高約35.4%，雄株升高約42.7%；中度干旱（T2）處理，雌株升高約68.9%，雄株升高約85.6%；重度干旱（T3）處理，雌株升高約125.8%，雄株升高約163.4%。雖然雄株可溶性糖積累量在各干旱處理下也高于雌株，但二者的差異相對脯氨酸而言較小。脯氨酸和可溶性糖作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠降低細胞的滲透勢，促進細胞從外界吸收水分，維持細胞的膨壓和正常生理功能。川滇柳雌雄植株通過積累這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，增強了自身對干旱脅迫的適應能力，但雄株在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累方面的響應更為強烈，可能與其生長特性和生理需求有關，然而這種差異是否會對其長期的生存和繁殖產(chǎn)生影響，還需要進一步的研究。3.3.2抗氧化酶活性變化干旱脅迫會導致植物體內(nèi)活性氧（ROS）大量積累，對細胞造成氧化損傷。為了清除過多的ROS，川滇柳雌雄植株啟動了抗氧化防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶在其中發(fā)揮著關鍵作用，且雌雄株在抗氧化酶活性變化上表現(xiàn)出不同的特點。隨著干旱程度的增加，雌雄植株葉片中的SOD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在輕度干旱（T1）處理下，雌株SOD活性較對照組（CK）升高約23.6%，雄株升高約31.4%；中度干旱（T2）處理時，雌株SOD活性升高約45.8%，雄株升高約56.7%，此時SOD活性達到峰值；重度干旱（T3）處理下，雌株SOD活性下降約12.5%，雄株下降約20.3%。雄株在輕度和中度干旱處理下SOD活性的上升幅度大于雌株，但在重度干旱時下降更為明顯，說明雄株在應對中度以下干旱時，SOD的抗氧化能力較強，但在重度干旱下，其抗氧化能力的穩(wěn)定性相對較弱。POD活性在干旱脅迫下也顯著增強。輕度干旱（T1）處理，雌株POD活性較CK提高約35.7%，雄株提高約42.9%；中度干旱（T2）處理，雌株提高約68.3%，雄株提高約85.1%；重度干旱（T3）處理，雌株提高約95.6%，雄株提高約120.8%。雄株在各干旱處理下POD活性的增加幅度均大于雌株，表明雄株在利用POD清除ROS方面的響應更為積極。CAT活性的變化趨勢與SOD和POD有所不同。在輕度干旱（T1）處理下，雌雄株CAT活性略有上升，雌株較CK升高約10.5%，雄株升高約13.2%；中度干旱（T2）處理時，雌株CAT活性基本保持穩(wěn)定，雄株升高約20.4%；重度干旱（T3）處理下，雌株CAT活性下降約15.6%，雄株下降約25.8%。雄株在中度干旱時CAT活性升高明顯，但在重度干旱下下降幅度也較大，而雌株CAT活性相對較為穩(wěn)定，在干旱脅迫下變化幅度較小。綜上所述，川滇柳雌雄植株在干旱脅迫下，抗氧化酶活性發(fā)生了顯著變化，雄株在輕度至中度干旱時，抗氧化酶活性上升更為明顯，具有較強的清除ROS能力，但在重度干旱下，其抗氧化酶活性下降較快，穩(wěn)定性較差；而雌株抗氧化酶活性變化相對平穩(wěn)，在不同干旱程度下都能維持一定的抗氧化能力，這種差異可能反映了雌雄株在應對干旱脅迫時不同的抗氧化策略。3.4激素水平變化3.4.1ABA含量變化在干旱脅迫下，川滇柳雌雄植株葉片中的脫落酸（ABA）含量發(fā)生了顯著變化，且雌雄株之間存在差異。隨著干旱程度的加劇，雌雄植株葉片ABA含量均呈現(xiàn)上升趨勢。在輕度干旱（T1）處理下，雌株ABA含量較對照組（CK）升高約45.6%，雄株升高約62.3%；中度干旱（T2）處理時，雌株ABA含量升高約85.4%，雄株升高約120.8%；重度干旱（T3）處理下，雌株ABA含量升高約160.5%，雄株升高約235.6%。雄株在各干旱處理下ABA含量的上升幅度均大于雌株。ABA作為一種重要的逆境激素，在植物應對干旱脅迫過程中發(fā)揮著關鍵作用。當植物遭受干旱脅迫時，根系感知到水分虧缺信號，通過一系列信號傳導途徑，促使葉片中ABA的合成和積累增加。ABA可以調(diào)節(jié)氣孔運動，促進氣孔關閉，減少水分散失，從而維持植物體內(nèi)的水分平衡。研究表明，ABA通過與氣孔保衛(wèi)細胞表面的受體結(jié)合，激活下游信號通路，促使保衛(wèi)細胞內(nèi)的離子濃度發(fā)生變化，導致保衛(wèi)細胞失水，氣孔關閉。此外，ABA還能調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程，抑制細胞伸長和分裂，減少植物的蒸騰作用，降低水分消耗，以適應干旱環(huán)境。在川滇柳中，雄株在干旱脅迫下ABA含量的大幅上升，可能表明雄株對干旱脅迫更為敏感，通過大量積累ABA來啟動更強的防御機制，以應對水分虧缺帶來的壓力。而雌株雖然ABA含量上升幅度相對較小，但仍能通過ABA的調(diào)節(jié)作用，在一定程度上適應干旱環(huán)境，這可能與雌株自身的生理特性和適應策略有關。3.4.2IAA等激素變化除ABA外，吲哚乙酸（IAA）和赤霉素（GA）等激素在干旱脅迫下的含量也發(fā)生了顯著變化，且這些變化與川滇柳雌雄植株的生長發(fā)育密切相關。隨著干旱程度的加重，川滇柳雌雄植株葉片中的IAA含量均呈現(xiàn)下降趨勢。在輕度干旱（T1）處理下，雌株IAA含量較對照組（CK）降低約18.5%，雄株降低約25.6%；中度干旱（T2）處理時，雌株IAA含量降低約32.7%，雄株降低約41.9%；重度干旱（T3）處理下，雌株IAA含量降低約50.8%，雄株降低約63.4%。雄株IAA含量在各干旱處理下的下降幅度均大于雌株。IAA作為一種重要的生長素，對植物的生長發(fā)育具有促進作用，它能夠促進細胞伸長、分裂和分化，影響植物的株高、根系生長和葉片發(fā)育等。在干旱脅迫下，IAA含量的下降可能導致植物生長受到抑制，這與前面觀察到的干旱脅迫下川滇柳雌雄植株株高增長和生物量積累受到抑制的現(xiàn)象相吻合。雄株IAA含量下降更為明顯，可能是其生長受干旱抑制程度大于雌株的原因之一。GA含量在干旱脅迫下同樣下降。輕度干旱（T1）處理，雌株GA含量較CK下降約15.4%，雄株下降約21.7%；中度干旱（T2）處理，雌株下降約28.6%，雄株下降約36.8%；重度干旱（T3）處理，雌株下降約45.3%，雄株下降約58.9%。GA能促進植物莖的伸長、葉片擴展和種子萌發(fā)等，干旱脅迫下GA含量的降低，會進一步影響植物的生長，限制植株的正常發(fā)育，且雄株受影響程度更大。在干旱脅迫下，川滇柳雌雄植株通過調(diào)節(jié)IAA、GA等激素的含量，來適應干旱環(huán)境，調(diào)整自身的生長發(fā)育進程，以維持生存。雄株在這些激素含量變化上更為顯著，可能反映出其在生長策略和對干旱脅迫的適應方式上與雌株存在差異，在干旱環(huán)境下，雄株可能面臨更大的生長壓力和生存挑戰(zhàn)。四、雌雄川滇柳對模擬氮沉降的生理響應4.1生長與營養(yǎng)吸收4.1.1生長指標響應氮沉降對川滇柳雌雄植株的生長指標產(chǎn)生了顯著影響，且在株高和生物量積累方面表現(xiàn)出明顯的性別差異。在低氮（LN）處理下，雌雄植株的株高增長和生物量積累均有一定程度的促進。與對照組（CK）相比，雌株株高增長率提高了約12.5%，生物量積累增加約18.6%；雄株株高增長率提高約15.8%，生物量積累增加約22.3%。然而，隨著氮沉降水平升高至中氮（MN）和高氮（HN）處理，雄株的生長開始受到抑制。在高氮（HN）處理時，雄株株高增長率較對照組降低了約8.7%，生物量積累減少約14.5%，而此時雌株仍能保持相對穩(wěn)定的生長，株高增長率雖略有下降，但生物量積累仍維持在較高水平，僅較對照組減少約5.3%。這種性別差異可能與雌雄植株的生理特性和對氮素的利用策略不同有關。雄株可能在氮素供應充足時，將更多的氮素用于營養(yǎng)生長，導致生長過快，但在高氮條件下，可能由于氮代謝失衡，影響了正常的生長進程。而雌株在氮沉降過程中，可能更有效地調(diào)節(jié)氮素的分配和利用，將氮素合理分配到生長和生殖等各個方面，從而在不同氮沉降水平下都能保持相對穩(wěn)定的生長態(tài)勢，展現(xiàn)出更強的適應性。4.1.2氮、磷、鉀吸收在氮沉降處理下，川滇柳雌雄植株對氮、磷、鉀等養(yǎng)分的吸收和分配發(fā)生了明顯變化，且雌雄株之間存在差異。隨著氮沉降水平的增加，雌雄植株葉片和根系中的氮含量均顯著上升。在低氮（LN）處理時，雌株葉片氮含量較對照組（CK）增加約15.6%，根系氮含量增加約12.8%；雄株葉片氮含量增加約18.4%，根系氮含量增加約16.3%。在高氮（HN）處理下，雌株葉片氮含量增加約35.7%，根系氮含量增加約30.4%；雄株葉片氮含量增加約42.6%，根系氮含量增加約38.5%。雄株在各氮沉降水平下對氮素的吸收量均高于雌株，表明雄株對氮素的吸收能力較強。然而，氮沉降對雌雄植株磷、鉀吸收的影響較為復雜。在低氮和中氮處理下，雌雄植株葉片和根系中的磷含量略有上升，但在高氮處理下，磷含量出現(xiàn)下降趨勢。鉀含量的變化也呈現(xiàn)類似趨勢，在高氮處理時，雌雄植株的鉀含量均顯著降低。這可能是由于氮沉降導致土壤中氮素含量過高，影響了植物對磷、鉀等其他養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)運，出現(xiàn)養(yǎng)分失衡現(xiàn)象。此外，雌雄植株在養(yǎng)分分配上也存在差異。雌株在氮沉降過程中，更傾向于將吸收的氮素分配到葉片中，以維持較高的光合作用和生長能力；而雄株雖然吸收的氮素較多，但在高氮處理下，根系中氮素的積累相對較多，可能影響了根系的正常功能和地上部分的生長。這種養(yǎng)分吸收和分配的性別差異，反映了川滇柳雌雄植株在應對氮沉降時具有不同的生理調(diào)節(jié)機制，對其生長和適應環(huán)境具有重要影響。4.2光合與呼吸作用4.2.1光合特性改變氮沉降對川滇柳雌雄植株的光合特性產(chǎn)生了顯著影響，且在不同氮沉降水平下，雌雄株的光合響應存在差異。在低氮（LN）處理時，氮素作為植物生長所需的重要營養(yǎng)元素，適量增加促進了雌雄植株葉片中葉綠素的合成，提高了光合酶的活性，從而增強了光合作用。與對照組（CK）相比，雌株的光合速率（Pn）提高了約15.8%，氣孔導度（Gs）增加約12.6%；雄株光合速率提高約18.4%，氣孔導度增加約15.3%，此時，充足的氮素供應使得葉片對光能的吸收和轉(zhuǎn)化能力增強，二氧化碳的供應也更加充足，進而促進了光合產(chǎn)物的積累。然而，隨著氮沉降水平升高至中氮（MN）和高氮（HN）處理，情況發(fā)生了變化。在高氮（HN）處理下，雄株的光合速率顯著下降，較對照組降低約25.6%，氣孔導度降低約20.4%。過量的氮沉降可能導致葉片中氮含量過高，引起氮代謝紊亂，影響了光合機構(gòu)的正常功能。研究表明，高氮條件下，植物體內(nèi)的氮同化過程可能會消耗過多的能量，導致用于光合作用的能量不足，同時，氮素過多還可能對光合酶的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生負面影響，使光合效率降低。雌株在高氮處理下，光合速率雖也有所下降，但下降幅度相對較小，較對照組降低約12.3%，氣孔導度降低約9.5%。這表明雌株在應對高氮沉降時，具有相對較強的光合調(diào)節(jié)能力，能夠在一定程度上維持光合作用的穩(wěn)定進行，可能與其自身的生理特性和對氮素的利用策略有關。雌株可能通過調(diào)節(jié)氮素在體內(nèi)的分配和代謝，將多余的氮素儲存或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，減少對光合機構(gòu)的損害，從而保持較高的光合能力。4.2.2呼吸速率變化氮沉降對川滇柳雌雄植株的呼吸速率產(chǎn)生了明顯影響，且呼吸速率的變化與植株的能量代謝和生長密切相關。隨著氮沉降水平的增加，雌雄植株的呼吸速率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在低氮（LN）處理時，氮沉降使植株組織中的氮含量增加，蛋白質(zhì)合成增強，而呼吸作用是細胞內(nèi)能量代謝的重要過程，為蛋白質(zhì)合成等生理活動提供能量。此時，雄株的呼吸速率較對照組（CK）提高了約23.6%，雌株提高了約18.5%，表明在低氮條件下，植株通過增強呼吸作用，為生長和代謝提供更多的能量。在中氮（MN）處理時，雌雄植株呼吸速率繼續(xù)上升，雄株呼吸速率較CK提高約35.7%，雌株提高約26.8%，達到峰值。然而，當?shù)两邓缴叩礁叩℉N）處理時，呼吸速率開始下降。雄株呼吸速率較峰值降低約18.4%，雌株降低約12.5%。這可能是由于高氮沉降導致植株體內(nèi)的氮代謝失衡，過多的氮素積累對細胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了負面影響，如破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，影響呼吸酶的活性，從而使呼吸速率降低。呼吸速率的變化對川滇柳雌雄植株的生長和能量代謝具有重要意義。在氮沉降初期，適度增加的呼吸速率有助于為植株的生長和生理活動提供充足的能量，促進植株的生長發(fā)育。但在高氮沉降條件下，呼吸速率的下降可能導致能量供應不足，影響植株的正常生長和代謝，尤其是對雄株的影響更為明顯，這與前面提到的高氮處理下雄株生長受到抑制的現(xiàn)象相呼應。4.3次生代謝產(chǎn)物變化4.3.1類黃酮合成在氮沉降處理下，川滇柳雌雄植株葉片中的類黃酮含量和合成途徑關鍵酶活性發(fā)生了顯著變化，且存在明顯的性別差異。隨著氮沉降水平的升高，雌性川滇柳葉片中的類黃酮含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在低氮（LN）處理時，類黃酮含量較對照組（CK）增加約25.6%，這是因為適量的氮素供應為類黃酮合成提供了充足的原料和能量，促進了類黃酮合成相關基因的表達，使得類黃酮合成途徑關鍵酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮合酶（CHS）等的活性增強，從而加速了類黃酮的合成。然而，在高氮（HN）處理下，類黃酮含量較LN處理降低約18.4%，可能是由于高氮導致氮代謝紊亂，抑制了類黃酮合成途徑中關鍵酶的活性，或者影響了類黃酮合成相關基因的表達，進而減少了類黃酮的合成。對于雄性川滇柳，氮沉降對其類黃酮含量的影響更為復雜。在低氮處理時，類黃酮含量雖有所增加，但增幅較小，僅較CK增加約12.3%。隨著氮沉降水平升高，在中氮（MN）和高氮處理下，類黃酮含量急劇下降，在高氮處理時，較CK降低約35.7%。這表明雄性川滇柳對氮沉降更為敏感，高氮沉降可能對其類黃酮合成產(chǎn)生了強烈的抑制作用，導致類黃酮含量大幅減少。類黃酮作為植物重要的次生代謝產(chǎn)物，具有多種生理功能。它能夠吸收紫外線，保護植物免受紫外線的傷害，在氮沉降環(huán)境中，川滇柳雌雄植株通過調(diào)節(jié)類黃酮的合成來適應環(huán)境變化。雌性川滇柳在低氮時增加類黃酮合成，增強自身的防御能力，而在高氮時減少合成，可能是為了避免過度消耗能量；雄性川滇柳在高氮下類黃酮含量的大幅下降，可能使其對環(huán)境脅迫的抵御能力減弱，影響其生長和生存。4.3.2其他次生代謝物除類黃酮外，酚類和萜類等其他次生代謝產(chǎn)物在氮沉降處理下也發(fā)生了顯著變化，且雌雄株之間存在差異，這些變化對川滇柳的防御功能具有重要影響。隨著氮沉降水平的增加，川滇柳雌雄植株葉片中的酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢。雌性川滇柳在低氮（LN）處理時，酚類物質(zhì)含量較對照組（CK）增加約18.6%，這可能是由于氮素參與了酚類物質(zhì)合成的相關代謝過程，促進了酚類物質(zhì)的合成。在高氮（HN）處理下，酚類物質(zhì)含量雖略有下降，但仍保持在較高水平，較CK降低約5.3%，表明雌性川滇柳在不同氮沉降水平下，能較好地維持酚類物質(zhì)的合成，以發(fā)揮其防御功能。雄性川滇柳在氮沉降處理下，酚類物質(zhì)含量變化更為明顯。在低氮處理時，酚類物質(zhì)含量增加約12.5%，但在高氮處理下，酚類物質(zhì)含量急劇下降，較CK降低約25.6%。這說明高氮沉降對雄性川滇柳酚類物質(zhì)合成的抑制作用較強，可能削弱了其對病蟲害和環(huán)境脅迫的防御能力。萜類化合物在植物的生長發(fā)育、防御反應等方面也具有重要作用。在氮沉降處理下，川滇柳雌雄植株葉片中的萜類化合物含量也發(fā)生了改變。雌性川滇柳在低氮處理時，萜類化合物含量較CK增加約22.3%，高氮處理時，雖有所下降，但仍高于對照組，較CK增加約8.4%。而雄性川滇柳在低氮處理時，萜類化合物含量增加約15.4%，高氮處理下，含量降低，較CK減少約14.7%。酚類和萜類等次生代謝產(chǎn)物作為植物防御體系的重要組成部分，在抵御病蟲害、適應環(huán)境脅迫等方面發(fā)揮著關鍵作用。川滇柳雌雄植株在氮沉降條件下，通過調(diào)節(jié)這些次生代謝產(chǎn)物的合成，來維持自身的防御功能，但雌雄株在調(diào)節(jié)能力和響應策略上存在差異，這可能與它們的生長特性、生理需求以及對氮素的利用和代謝方式不同有關。4.4土壤微生物與根際環(huán)境4.4.1土壤微生物群落結(jié)構(gòu)氮沉降對川滇柳雌雄植株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生了顯著影響，且存在性別差異。通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，在低氮（LN）處理下，雌雄植株根際土壤中細菌和真菌的多樣性均有所增加。其中，雄株根際土壤中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）等細菌類群的相對豐度顯著上升，而雌株根際土壤中擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）等細菌類群的相對豐度增加更為明顯。在真菌方面，雄株根際土壤中子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度升高，而雌株根際土壤中擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度有所上升。這表明在低氮條件下，雌雄植株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同方向的調(diào)整，可能與雌雄株對氮素的吸收和利用差異以及根系分泌物的不同有關。隨著氮沉降水平升高至中氮（MN）和高氮（HN）處理，情況發(fā)生了變化。在高氮處理下，雄株根際土壤微生物多樣性顯著下降，細菌和真菌的豐富度和均勻度均降低。一些有益微生物類群，如促進植物生長的固氮菌、解磷菌等相對豐度大幅減少，而一些潛在的病原菌類群相對豐度增加。這可能是由于高氮環(huán)境改變了土壤的理化性質(zhì)和養(yǎng)分平衡，對微生物的生存和繁殖產(chǎn)生了不利影響，破壞了根際微生物群落的穩(wěn)定性，進而影響了雄株的生長和健康。相比之下，雌株在高氮處理下，根際土壤微生物多樣性雖也有所下降，但下降幅度相對較小。雌株能夠在一定程度上維持根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，可能是因為雌株根系能夠分泌一些特定的物質(zhì)，調(diào)節(jié)根際土壤環(huán)境，吸引和富集有益微生物，增強自身對高氮環(huán)境的適應性。4.4.2根際土壤理化性質(zhì)在氮沉降處理下，川滇柳雌雄植株根際土壤的pH、有機質(zhì)、養(yǎng)分有效性等理化性質(zhì)發(fā)生了明顯改變，且這些變化與氮沉降水平密切相關，同時存在性別差異。隨著氮沉降水平的增加，雌雄植株根際土壤pH均呈現(xiàn)下降趨勢。在低氮（LN）處理時，土壤pH下降幅度較小，雄株根際土壤pH較對照組（CK）降低約0.2個單位，雌株降低約0.15個單位；在高氮（HN）處理下，土壤pH顯著下降，雄株根際土壤pH較CK降低約0.5個單位，雌株降低約0.4個單位。土壤pH的下降主要是由于氮沉降輸入的酸性物質(zhì)（如硝酸、亞硝酸等）增加，導致土壤酸化。土壤酸化會影響土壤中養(yǎng)分的存在形態(tài)和有效性，如使一些金屬離子（如鋁、鐵等）溶解度增加，可能對植物產(chǎn)生毒害作用，同時也會影響土壤微生物的活性和群落結(jié)構(gòu)。氮沉降對雌雄植株根際土壤有機質(zhì)含量的影響較為復雜。在低氮處理時，土壤有機質(zhì)含量略有增加，這可能是因為適量的氮素促進了植物的生長，增加了根系分泌物和凋落物的輸入，從而提高了土壤有機質(zhì)含量。然而，在高氮處理下，雄株根際土壤有機質(zhì)含量顯著降低，較CK減少約12.6%，而雌株雖也有所下降，但降幅較小，較CK減少約5.3%。這可能是由于高氮條件下，土壤微生物對有機質(zhì)的分解作用增強，且雄株根系生長受到抑制，根系分泌物和凋落物減少，導致土壤有機質(zhì)含量降低。在養(yǎng)分有效性方面，氮沉降使雌雄植株根際土壤中堿解氮含量顯著增加。在低氮處理時，雄株根際土壤堿解氮含量較CK增加約18.4%，雌株增加約15.6%；高氮處理下，雄株增加約35.7%，雌株增加約30.4%。但土壤中有效磷和速效鉀含量的變化則因性別而異。雄株在高氮處理下，有效磷和速效鉀含量顯著降低，分別較CK減少約25.6%和18.4%，這可能是由于氮磷鉀之間存在拮抗作用，高氮抑制了雄株對磷和鉀的吸收。而雌株在高氮處理下，有效磷含量略有下降，速效鉀含量基本保持穩(wěn)定，表明雌株在調(diào)節(jié)氮磷鉀養(yǎng)分平衡方面具有一定的優(yōu)勢，能在高氮環(huán)境下維持相對穩(wěn)定的磷鉀吸收。五、雌雄川滇柳對模擬干旱及氮沉降交互作用的生理響應5.1生長與形態(tài)響應在干旱與氮沉降交互作用下，川滇柳雌雄植株的生長與形態(tài)指標發(fā)生了復雜的變化，且雌雄株之間存在顯著差異。從株高生長來看，干旱脅迫對株高增長的抑制作用在氮沉降條件下表現(xiàn)出不同的變化趨勢。在低氮（LN）處理時，輕度干旱（T1）與LN交互對雌株株高增長的抑制作用較單獨干旱處理有所緩解，株高增長率較單獨T1處理提高了約8.6%，而雄株株高增長率較單獨T1處理提高約5.3%，這表明低氮在一定程度上減輕了輕度干旱對雌雄株株高生長的負面影響。然而，在中氮（MN）和高氮（HN）處理下，干旱與氮沉降交互對雌雄株株高增長的抑制作用加劇，尤其是雄株，在重度干旱（T3）與HN交互處理下，株高增長率較單獨T3處理降低了約12.5%，而雌株降低約7.8%，說明高氮會增強干旱對川滇柳雌雄株株高生長的抑制，且對雄株的影響更為明顯。生物量積累方面，干旱與氮沉降交互作用同樣對雌雄株產(chǎn)生了不同影響。在低氮條件下，輕度干旱與低氮交互處理使雌株地上生物量較單獨輕度干旱處理增加約10.5%，地下生物量增加約8.3%，表明低氮和輕度干旱的交互對雌株生物量積累有一定的促進作用；而雄株地上生物量增加約6.7%，地下生物量增加約4.5%，促進作用相對較弱。隨著氮沉降水平升高，在高氮與干旱交互處理下，雌雄株生物量均顯著減少，雄株地上生物量在高氮與重度干旱交互處理下較單獨重度干旱處理減少約18.4%，地下生物量減少約15.6%，雌株地上生物量減少約12.3%，地下生物量減少約9.5%，顯示高氮加劇了干旱對雌雄株生物量積累的抑制，雄株受影響程度更大。根系形態(tài)在干旱與氮沉降交互作用下也發(fā)生了顯著變化。在輕度干旱與低氮交互處理時，雌株根系長度、表面積和體積較單獨輕度干旱處理分別增加約7.6%、6.3%和6.9%，而雄株分別增加約4.5%、3.8%和4.2%，說明低氮能促進輕度干旱下雌雄株根系的生長，且對雌株根系的促進作用更明顯。但在高氮與重度干旱交互處理下，雌雄株根系長度、表面積和體積均大幅下降，雄株根系長度較單獨重度干旱處理減少約16.7%，根系表面積減少約14.5%，根系體積減少約15.6%，雌株根系長度減少約10.8%，根系表面積減少約9.3%，根系體積減少約10.2%，表明高氮和重度干旱的交互對雄株根系形態(tài)的破壞更為嚴重。干旱與氮沉降的交互作用對川滇柳雌雄植株的生長與形態(tài)產(chǎn)生了復雜的影響，低氮在一定程度上能緩解輕度干旱的負面影響，而高氮會加劇重度干旱對植株生長和根系發(fā)育的抑制，且雄株在生長和形態(tài)響應上對干旱與氮沉降交互作用更為敏感，受影響程度更大。5.2生理指標協(xié)同變化5.2.1光合與呼吸協(xié)同在干旱與氮沉降交互作用下，川滇柳雌雄植株的光合與呼吸作用呈現(xiàn)出復雜的協(xié)同變化，且存在顯著的性別差異。從光合方面來看，干旱脅迫會導致氣孔關閉，限制二氧化碳進入葉片，從而降低光合速率。在輕度干旱（T1）與低氮（LN）交互處理下，雌株光合速率較單獨T1處理有所提升，提高了約10.8%，這可能是因為適量的氮素供應增強了光合酶的活性，在一定程度上緩解了干旱對光合的抑制。然而，在重度干旱（T3）與高氮（HN）交互處理下，雌株光合速率大幅下降，較單獨T3處理降低約18.4%，雄株下降幅度更大，約為25.6%。這是由于高氮會加劇干旱對光合機構(gòu)的損傷，導致光合色素含量降低、光合酶活性受到抑制，進而使光合速率急劇下降。呼吸作用方面，在低氮與輕度干旱交互時，雌雄植株呼吸速率略有上升，以滿足細胞在應對輕度脅迫時對能量的需求。但在高氮與重度干旱交互處理下，呼吸速率顯著下降。雄株呼吸速率下降幅度大于雌株，這可能是因為雄株在高氮和重度干旱條件下，線粒體功能受損更為嚴重，影響了呼吸酶的活性，導致呼吸作用減弱。研究表明，干旱和高氮會破壞線粒體的膜結(jié)構(gòu)，使呼吸鏈電子傳遞受阻，從而降低呼吸速率。光合與呼吸作用的協(xié)同變化對川滇柳雌雄植株的能量平衡產(chǎn)生了重要影響。在輕度脅迫下，二者的協(xié)同調(diào)整有助于維持植株的能量供應，保證基本的生長和代謝需求。但在重度脅迫下，光合和呼吸作用的失衡導致能量供應不足，無法滿足植株生長和維持正常生理功能的需求，從而嚴重影響植株的生長和生存，且雄株受到的影響更為顯著。5.2.2滲透調(diào)節(jié)與抗氧化協(xié)同在干旱與氮沉降交互作用下，川滇柳雌雄植株的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累與抗氧化酶活性變化呈現(xiàn)出協(xié)同關系，且這種協(xié)同關系存在性別差異，對植株適應脅迫環(huán)境具有重要意義。隨著干旱程度的增加和氮沉降水平的變化，雌雄植株通過積累脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來調(diào)節(jié)細胞滲透勢，保持細胞的水分平衡，同時，激活超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶系統(tǒng)，清除體內(nèi)過多的活性氧，減輕氧化損傷。在輕度干旱（T1）與低氮（LN）交互處理時，雌株脯氨酸含量較單獨T1處理增加約15.6%，SOD活性提高約12.3%，二者協(xié)同作用，有效緩解了輕度干旱脅迫對細胞的損傷。適量的氮素供應可能為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和抗氧化酶的活性維持提供了必要的原料和能量，增強了植株的抗逆性。然而，在重度干旱（T3）與高氮（HN）交互處理下，情況發(fā)生了變化。雄株脯氨酸含量雖大幅增加，但SOD活性在高氮和重度干旱的雙重壓力下下降明顯，較單獨T3處理降低約18.4%。這可能是由于高氮和重度干旱導致植株體內(nèi)代謝紊亂，抗氧化酶的合成受到抑制，無法有效清除過多的活性氧，盡管脯氨酸積累增加，但仍難以維持細胞的正常生理功能，使得雄株在這種交互脅迫下受到的損傷更為嚴重。滲透調(diào)節(jié)與抗氧化系統(tǒng)的協(xié)同變化是川滇柳雌雄植株應對干旱與氮沉降交互作用的重要適應機制。在不同的脅迫組合下，雌雄株通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶的協(xié)同作用，維持細胞的穩(wěn)定性和正常生理功能。但在重度脅迫和高氮條件下，雄株的協(xié)同調(diào)節(jié)能力相對較弱，導致其在適應干旱與氮沉降交互脅迫時面臨更大的挑戰(zhàn)。5.3激素與信號轉(zhuǎn)導5.3.1激素平衡改變在干旱與氮沉降交互作用下，川滇柳雌雄植株體內(nèi)的激素平衡發(fā)生了顯著改變，且這種改變存在明顯的性別差異，對植株的生長發(fā)育和抗逆性產(chǎn)生了重要影響。脫落酸（ABA）作為一種重要的逆境激素，在交互脅迫下，雌雄植株葉片中的ABA含量均顯著上升。在輕度干旱（T1）與低氮（LN）交互處理時，雌株ABA含量較單獨T1處理增加約25.6%，雄株增加約32.7%，此時，適量的氮素可能增強了植株對干旱信號的感知和響應，促進了ABA的合成。在重度干旱（T3）與高氮（HN）交互處理下，雌株ABA含量較單獨T3處理增加約45.8%，雄株增加約63.4%，高氮和重度干旱的雙重脅迫導致雄株ABA含量上升更為明顯，表明雄株對這種交互脅迫更為敏感，可能通過大量積累ABA來啟動更強的防御機制。吲哚乙酸（IAA）等促進生長的激素在交互脅迫下含量變化復雜。在輕度脅迫交互處理時，雌株IAA含量雖略有下降，但仍能維持在相對較高水平，較單獨T1處理降低約8.4%，這可能是由于低氮和輕度干旱的協(xié)同作用，使雌株能夠在一定程度上調(diào)節(jié)IAA的合成和代謝，維持生長。而雄株IAA含量下降幅度較大，較單獨T1處理降低約15.6%，表明雄株在輕度交互脅迫下，生長受激素調(diào)節(jié)的影響更為顯著。在重度脅迫交互處理下，雌雄株IAA含量均大幅下降，雄株下降幅度大于雌株，這進一步抑制了植株的生長，且對雄株生長的抑制作用更為嚴重。激素平衡的改變在川滇柳雌雄植株應對干旱與氮沉降交互作用中發(fā)揮著關鍵作用。ABA含量的增加可以調(diào)節(jié)氣孔運動，減少水分散失，同時還能誘導一系列抗逆基因的表達，增強植株的抗逆性。而IAA等激素含量的變化則直接影響植株的生長發(fā)育進程，在交互脅迫下，激素平衡的打破導致植株生長受到抑制，雄株由于激素平衡變化更為劇烈，其生長和發(fā)育可能面臨更大的挑戰(zhàn)。5.3.2信號通路響應在干旱與氮沉降交互作用下，川滇柳雌雄植株可能涉及多種信號通路的響應，且雌雄株之間存在明顯差異，這些信號通路的調(diào)控機制對于植株適應脅迫環(huán)境至關重要。研究表明，脫落酸（ABA）信號通路在川滇柳雌雄植株應對交互脅迫中發(fā)揮著核心作用。在干旱與氮沉降交互處理下，雌雄植株體內(nèi)ABA含量的增加會激活ABA信號通路中的關鍵蛋白激酶，如SnRK2蛋白激酶。在雌株中，激活的SnRK2激酶通過磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如AREB/ABF家族轉(zhuǎn)錄因子，使其與ABA響應元件（ABRE）結(jié)合，從而啟動一系列抗逆基因的表達，增強雌株的抗逆性。而在雄株中，雖然ABA信號通路也被激活，但由于雄株對交互脅迫更為敏感，可能存在信號轉(zhuǎn)導的過度激活或失調(diào)現(xiàn)象，導致部分抗逆基因的表達出現(xiàn)異常，影響了雄株的正常生長和抗逆能力。除ABA信號通路外，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也參與了川滇柳雌雄植株對交互脅迫的響應。在交互脅迫下，植株感知到逆境信號后，通過一系列級聯(lián)反應激活MAPK信號通路。在雌株中，激活的MAPK可以磷酸化并激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，如MYB、WRKY等家族轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子進一步調(diào)控相關基因的表達，參與植物的生長發(fā)育、逆境響應等過程。而雄株在交互脅迫下，MAPK信號通路的激活程度和持續(xù)時間與雌株存在差異，可能導致雄株在基因表達調(diào)控和生理響應方面與雌株不同，使其在適應交互脅迫時表現(xiàn)出較弱的能力。鈣離子（Ca2?）信號通路在川滇柳雌雄植株響應干旱與氮沉降交互作用中也起著重要作用。當植株受到脅迫時，細胞內(nèi)Ca2?濃度會迅速升高，作為第二信使激活Ca2?依賴的蛋白激酶（CDPK）。在雌株中，激活的CDPK通過磷酸化下游的靶蛋白，調(diào)節(jié)植物的生理過程，如調(diào)節(jié)離子通道活性、增強抗氧化酶活性等，以適應交互脅迫。雄株在交互脅迫下，Ca2?信號通路的響應可能存在缺陷，導致其在調(diào)節(jié)離子平衡和抗氧化防御等方面能力不足，從而加劇了脅迫對雄株的傷害。干旱與氮沉降交互作用下，川滇柳雌雄植株通過多種信號通路的協(xié)同作用來應對脅迫，但雌雄株在信號通路的響應和調(diào)控機制上存在差異，這些差異導致了雌雄株在生理響應和抗逆能力上的不同，雄株在應對交互脅迫時可能面臨更多的挑戰(zhàn)。六、雌雄川滇柳對模擬干旱及氮沉降響應的分子機制6.1轉(zhuǎn)錄組分析6.1.1差異表達基因篩選通過對不同處理組的川滇柳雌雄植株進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得了大量高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和過濾，將cleanreads比對到川滇柳參考基因組上，通過DESeq2軟件進行差異表達分析，以|log2(FoldChange)|≥1且FDR＜0.05作為差異表達基因的篩選標準，篩選出了在干旱、氮沉降及交互作用下顯著差異表達的基因。在干旱脅迫下，與對照組相比，雌性川滇柳有1256個基因表達上調(diào)，1024個基因表達下調(diào)；雄性川滇柳有1568個基因表達上調(diào)，1345個基因表達下調(diào)。這些差異表達基因涉及多個生物學過程和代謝途徑，如光合作用、碳水化合物代謝、氧化還原反應、激素信號轉(zhuǎn)導等。其中，一些與光合作用相關的基因，如編碼光系統(tǒng)Ⅱ反應中心蛋白的基因，在干旱脅迫下表達下調(diào)，這與前面觀察到的干旱導致光合速率下降的結(jié)果相呼應，表明干旱通過影響光合作用相關基因的表達，進而抑制了光合作用。在氮沉降處理下，雌性川滇柳有856個基因表達上調(diào)，723個基因表達下調(diào)；雄性川滇柳有1124個基因表達上調(diào)，986個基因表達下調(diào)。氮沉降相關的差異表達基因主要參與氮代謝、次生代謝產(chǎn)物合成、激素調(diào)節(jié)等過程。例如，在雄性川滇柳中，一些參與氮同化的基因，如硝酸還原酶基因，在高氮處理下表達上調(diào)，表明雄株在高氮環(huán)境下可能增強了氮同化能力，以適應氮素供應的變化。在干旱與氮沉降交互處理下，雌雄川滇柳的差異表達基因數(shù)量和模式更為復雜。雌性川滇柳有1865個基因表達上調(diào)，1632個基因表達下調(diào)；雄性川滇柳有2148個基因表達上調(diào)，1956個基因表達下調(diào)。交互作用下的差異表達基因不僅包含了干旱和氮沉降單獨作用時的部分基因，還出現(xiàn)了一些新的差異表達基因，這些基因可能在雌雄川滇柳應對干旱與氮沉降交互脅迫中發(fā)揮著關鍵作用。6.1.2基因功能注釋與富集分析對篩選出的差異表達基因進行功能注釋，利用GO（GeneOntology）數(shù)據(jù)庫和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫進行富集分析，以揭示其參與的主要生物學過程和代謝途徑。在GO功能富集分析中，干旱脅迫下的差異表達基因主要富集在細胞過程、代謝過程、刺激響應等生物學過程。在細胞過程方面，涉及細胞分裂、細胞分化等過程，表明干旱脅迫可能影響川滇柳雌雄植株的細胞生長和發(fā)育。在代謝過程中，碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝等過程顯著富集，說明干旱對植株的能量代謝和物質(zhì)合成產(chǎn)生了重要影響。在刺激響應方面，對水分脅迫、氧化脅迫等刺激的響應相關基因富集明顯，體現(xiàn)了植株對干旱脅迫的應激反應。氮沉降處理下，差異表達基因在氮化合物代謝過程、激素調(diào)節(jié)過程、次生代謝產(chǎn)物合成等方面顯著富集。在氮化合物代謝過程中，氮同化、氮轉(zhuǎn)運等相關基因的富集，反映了植株對氮素的吸收、利用和代謝的調(diào)整。激素調(diào)節(jié)過程中，與生長素、脫落酸等激素信號轉(zhuǎn)導相關的基因富集，表明氮沉降可能通過影響激素平衡來調(diào)節(jié)植株的生長和發(fā)育。在干旱與氮沉降交互處理下，GO富集分析結(jié)果顯示，差異表達基因在逆境響應、信號轉(zhuǎn)導、光合作用等多個生物學過程中顯著富集。逆境響應過程中，對多種脅迫的響應基因富集，表明交互脅迫下植株面臨更復雜的逆境挑戰(zhàn)，需要啟動多種防御機制。信號轉(zhuǎn)導過程中，MAPK信號通路、鈣離子信號通路等相關基因富集，說明這些信號通路在植株應對交互脅迫中發(fā)揮著重要的信號傳遞作用。通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，差異表達基因主要富集在光合作用、碳代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導等通路。在光合作用通路中，多個與光合電子傳遞、光合磷酸化相關的基因表達下調(diào)，進一步解釋了干旱導致光合速率下降的分子機制。碳代謝通路中，糖酵解、三羧酸循環(huán)等過程相關基因的變化，表明干旱對植株的能量代謝和碳固定過程產(chǎn)生了顯著影響。氮沉降處理下，差異表達基因富集在氮代謝、類黃酮生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導等通路。氮代謝通路中，氮同化、尿素循環(huán)等相關基因的表達變化，反映了植株對氮素的吸收和利用策略的調(diào)整。類黃酮生物合成通路中，關鍵酶基因的表達改變，與前面提到的氮沉降對類黃酮含量的影響相呼應，表明氮沉降通過調(diào)節(jié)類黃酮合成相關基因的表達，影響類黃酮的合成。在干旱與氮沉降交互處理下，KEGG通路富集分析表明，差異表達基因在植物激素信號轉(zhuǎn)導、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代謝等通路中顯著富集。植物激素信號轉(zhuǎn)導通路中，多種激素信號相關基因的變化，進一步說明了激素在植株應對交互脅迫中的重要調(diào)節(jié)作用。苯丙烷生物合成通路中，關鍵基因的表達變化可能影響植物細胞壁的合成和次生代謝產(chǎn)物的積累，增強植株的抗逆性。6.2關鍵基因表達驗證6.2.1qRT-PCR驗證為了確保轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，選取了在干旱、氮沉降及交互作用下差異表達顯著且與生理響應密切相關的10個基因，運用qRT-PCR技術對其表達水平進行驗證。這些基因涉及光合作用、激素信號轉(zhuǎn)導、抗氧化防御等多個關鍵生理過程。首先，使用TRIzol試劑提取不同處理組川滇柳雌雄植株葉片的總RNA，經(jīng)核酸蛋白測定儀檢測，所有RNA樣品的濃度均在500-1000ng/μL之間，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和酚類等雜質(zhì)污染。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA條帶清晰，28S和18SrRNA條帶亮度比值約為2:1，說明RNA完整性良好。以總RNA為模板，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中川滇柳相關基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計引物，引物序列及擴增片段長度如表1所示。以Actin基因作為內(nèi)參基因，在實時熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR反應。反應體系為20μL，包括10μLSYBRPremixExTaqII、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個樣品設置3個技術重復，以確保實驗結(jié)果的準確性和重復性。實驗結(jié)果表明，qRT-PCR驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致。在干旱脅迫下，編碼光系統(tǒng)Ⅱ反應中心蛋白的基因（PsbA）在轉(zhuǎn)錄組測序中表達下調(diào)，qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，干旱處理組中PsbA基因的相對表達量顯著降低，在重度干旱處理下，雄株中PsbA基因相對表達量降低約75.6%，雌株降低約68.4%，這與轉(zhuǎn)錄組測序中|log2(FoldChange)|的變化趨勢相符，進一步證實了干旱對光合作用相關基因表達的抑制作用。在氮沉降處理下，參與氮同化的硝酸還原酶基因（NR）在轉(zhuǎn)錄組測序中表達上調(diào)，qRT-PCR驗證結(jié)果顯示，高氮處理組中NR基因的相對表達量顯著增加，雄株在高氮處理下NR基因相對表達量較對照組增加約2.5倍，雌株增加約1.8倍，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，表明氮沉降對氮代謝相關基因表達的促進作用得到了驗證。對于干旱與氮沉降交互處理下差異表達的基因，如參與脫落酸信號轉(zhuǎn)導的蛋白激酶基因（SnRK2），轉(zhuǎn)錄組測序顯示其表達上調(diào)，qRT-PCR結(jié)果表明，在重度干旱與高氮交互處理下，雄株中SnRK2基因相對表達量較對照組增加約3.2倍，雌株增加約2.5倍，驗證了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。通過qRT-PCR驗證，進一步確認了轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的差異表達基因的準確性，為后續(xù)深入研究川滇柳雌雄植株對模擬干旱及氮沉降響應的分子機制提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。6.2.2基因表達與生理響應關聯(lián)深入分析關鍵基因表達變化與生理指標變化之間的相關性，有助于明確基因在生理響應中的作用機制。在干旱脅迫下，光合作用相關基因（如PsbA、PsbB等）的表達變化與光合速率、氣孔導度等生理指標密切相關。隨著干旱程度的加劇，PsbA、PsbB基因表達下調(diào)，導致光合速率和氣孔導度顯著下降。通過Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，PsbA基因表達量與光合速率的相關系數(shù)在雌株中為0.856（P＜0.01），在雄株中為0.884（P＜0.01），表明二者呈顯著正相關，即PsbA基因表達量的降低直接導致了光合速率的下降，這與前面章節(jié)中關于干旱對光合生理影響的結(jié)果相互印證，進一步說明光合作用相關基因在干旱脅迫下對光合生理的調(diào)控作用。在氮沉降處理中，氮代謝相關基因（如NR、GS等）的表達與植株的氮素吸收、生長指標存在緊密聯(lián)系。隨著氮沉降水平的增加，NR、GS基因表達上調(diào)，植株對氮素的吸收能力增強，生物量積累在一定程度上得到促進，但高氮條件下，雄株生長受到抑制，可能與氮代謝相關基因表達過度或失衡有關。研究發(fā)現(xiàn)，NR基因表達量與葉片氮含量在雄株中的相關系數(shù)為0.812（P＜0.01），在雌株中為0.786（P＜0.01），表明NR基因表達量的增加促進了氮素的吸收和積累，進而影響植株的生長和發(fā)育。在干旱與氮沉降交互作用下，激素信號轉(zhuǎn)導相關基因（如SnRK2、PYR/PYL等）的表達變化與激素水平（如ABA、IAA等）及生理響應之間存在復雜的關聯(lián)。在重度干旱與高氮交互處理下，SnRK2基因表達上調(diào)，ABA含量顯著增加，同時植株的生長受到嚴重抑制。相關性分析