川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的協(xié)同抑瘤效應(yīng)及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。肺腺癌是肺癌中最常見的病理類型之一，約占肺癌總數(shù)的40%。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與吸煙、空氣污染、遺傳因素等密切相關(guān)。近年來，盡管在肺腺癌的診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，但患者的5年生存率仍較低，晚期患者的預(yù)后尤為不佳。傳統(tǒng)的治療方法如手術(shù)、化療和放療在一定程度上能夠緩解病情，但存在局限性，如化療藥物的毒副作用和耐藥性問題，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療效果。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是從中藥川芎中提取的主要有效成分，化學(xué)名為2,3,5,6-四***吡嗪。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，川芎嗪具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、改善微循環(huán)等。在抗腫瘤領(lǐng)域，川芎嗪也展現(xiàn)出一定的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成以及抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。例如，有研究表明川芎嗪能減少C57BL小鼠Lewis肺癌和小鼠小細(xì)胞肺癌腫瘤體積、重量，減少肺癌轉(zhuǎn)移灶數(shù)，穩(wěn)定病灶，降低腫瘤微血管密度，提高荷瘤小鼠的生存質(zhì)量，并與環(huán)磷酰胺具有協(xié)同效果；還可誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞和H446細(xì)胞凋亡并使H446細(xì)胞的生長停滯在S期，抑制其有絲分裂及DNA的合成，因而抑制肺癌A549和細(xì)胞的生長與增殖。此外，川芎嗪能抑制C57BL小鼠Lewis肺癌細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)，因而，川芎嗪也可通過抑制肺癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)來抑制肺癌的生長。順鉑（cisplatin，DDP）是臨床上廣泛應(yīng)用的一種化療藥物，屬于鉑類化合物。其作用機(jī)制主要是通過與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。順鉑在肺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤的治療中都有顯著療效，是肺腺癌化療的常用藥物之一。然而，順鉑在治療過程中會產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，如腎毒性、胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)毒性、骨髓抑制等，這些毒副作用限制了其臨床應(yīng)用劑量和療程，影響患者的耐受性和依從性。同時，長期使用順鉑還容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加。聯(lián)合用藥是腫瘤治療的重要策略之一，通過不同作用機(jī)制的藥物聯(lián)合使用，可以發(fā)揮協(xié)同增效作用，提高治療效果，同時減少單一藥物的劑量和毒副作用。川芎嗪與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于肺腺癌的治療，可能具有潛在的優(yōu)勢。一方面，川芎嗪的抗腫瘤活性可以與順鉑的細(xì)胞毒性作用相互協(xié)同，增強(qiáng)對肺腺癌細(xì)胞的殺傷效果；另一方面，川芎嗪的多種生物活性如抗氧化、抗炎、改善微循環(huán)等，可能有助于減輕順鉑的毒副作用，提高患者的耐受性。此外，川芎嗪還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白或信號通路，逆轉(zhuǎn)順鉑的耐藥性，從而提高化療的敏感性。因此，研究川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用機(jī)制，對于開發(fā)新的肺腺癌治療方案，提高臨床治療效果，改善患者預(yù)后具有重要的理論和實踐意義。1.2研究目的本研究旨在通過建立肺腺癌小鼠模型，深入探討川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的抑瘤效果，并進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。具體研究目的如下：評估抑瘤效果：對比川芎嗪單藥、順鉑單藥及兩者聯(lián)合用藥對肺腺癌小鼠腫瘤生長的抑制作用，通過測量腫瘤體積、重量等指標(biāo)，明確聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同增效的作用，為臨床治療提供更有效的方案選擇。探討作用機(jī)制：從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、腫瘤血管生成、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多個角度，深入研究川芎嗪聯(lián)合順鉑抑制肺腺癌的作用機(jī)制。檢測相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)水平，揭示聯(lián)合用藥發(fā)揮抑瘤作用的分子機(jī)制，為肺腺癌的治療提供新的理論依據(jù)。評估安全性：觀察聯(lián)合用藥對小鼠體重、血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)的影響，評估川芎嗪聯(lián)合順鉑治療肺腺癌的安全性和耐受性，為臨床應(yīng)用提供安全性參考。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，肺癌的發(fā)病率和死亡率同樣居高不下，肺腺癌作為肺癌的主要亞型，一直是研究的重點?；熢诜蜗侔┑闹委熤姓紦?jù)重要地位，順鉑作為經(jīng)典的化療藥物，被廣泛應(yīng)用于肺腺癌的臨床治療。然而，順鉑的耐藥性和毒副作用問題一直是困擾臨床治療的難題。近年來，隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入，尋找能夠增強(qiáng)順鉑療效、降低其毒副作用的藥物成為研究熱點。川芎嗪作為一種從中藥中提取的活性成分，其抗腫瘤作用逐漸受到國際關(guān)注。一些研究表明，川芎嗪具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等多種生物學(xué)活性，為其與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于肺腺癌治療提供了理論基礎(chǔ)。在國內(nèi)，肺癌同樣是嚴(yán)重威脅人民健康的重大疾病。中醫(yī)中藥在肺癌的綜合治療中發(fā)揮著獨特的作用。川芎嗪作為中藥川芎的有效成分，在心血管疾病的治療中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，其在抗腫瘤領(lǐng)域的研究也日益深入。許多研究表明，川芎嗪能夠通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，如調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等。同時，國內(nèi)也有一些關(guān)于川芎嗪聯(lián)合化療藥物治療肺癌的臨床研究，初步顯示出聯(lián)合用藥在提高治療效果、減輕毒副作用方面的優(yōu)勢。然而，目前關(guān)于川芎嗪聯(lián)合順鉑治療肺腺癌的研究仍存在一定的局限性。大部分研究主要集中在體外細(xì)胞實驗和動物實驗，臨床研究相對較少，且樣本量較小，缺乏大規(guī)模、多中心的隨機(jī)對照臨床試驗來驗證其療效和安全性。在作用機(jī)制方面，雖然已經(jīng)有一些研究報道了川芎嗪聯(lián)合順鉑可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等途徑發(fā)揮抑瘤作用，但具體的分子機(jī)制尚未完全明確，尤其是涉及到的信號通路及關(guān)鍵分子的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。此外，川芎嗪的最佳用藥劑量、用藥時機(jī)以及與順鉑的聯(lián)合方案等也需要進(jìn)一步優(yōu)化和探索。二、實驗材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗動物選用6-8周齡的SPF級C57BL/6小鼠，體重為18-22g，雌雄各半。C57BL/6小鼠是近交系小鼠，其遺傳背景明確、基因純合度高，對多種病原體易感程度一致，實驗結(jié)果重復(fù)性好。在肺癌研究中，C57BL/6小鼠常被用于建立肺癌模型，因其對Lewis肺癌細(xì)胞具有較高的易感性，能夠較好地模擬人類肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，有利于研究藥物對肺腺癌的作用效果及機(jī)制。實驗小鼠購自[供應(yīng)商名稱]，動物許可證號為[許可證編號]。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在(23±2)℃，相對濕度為(50±5)%，12h光照/12h黑暗交替，自由攝食和飲水。適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。2.1.2實驗藥物與試劑川芎嗪：純度≥98%，購自[生產(chǎn)廠家名稱]，規(guī)格為[具體規(guī)格]，使用時用生理鹽水配制成所需濃度。順鉑：注射用順鉑，規(guī)格為10mg/支，購自[生產(chǎn)廠家名稱]，國藥準(zhǔn)字[批準(zhǔn)文號]。臨用前用生理鹽水溶解，配制成相應(yīng)濃度的溶液。其他試劑：胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、MTT試劑、DMSO、BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、免疫組化試劑盒、ELISA試劑盒等，均購自知名試劑公司，如[列舉主要試劑的供應(yīng)商]。2.1.3實驗儀器電子天平：[品牌及型號]，用于稱量藥物、小鼠體重等。酶標(biāo)儀：[品牌及型號]，用于檢測MTT實驗、ELISA實驗等的吸光度值。倒置顯微鏡：[品牌及型號]，用于觀察細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞儀：[品牌及型號]，用于檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。實時熒光定量PCR儀：[品牌及型號]，用于檢測基因表達(dá)水平。蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀：[品牌及型號]，用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：[品牌及型號]，用于檢測蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果。低溫高速離心機(jī)：[品牌及型號]，用于細(xì)胞和組織的離心分離。CO?培養(yǎng)箱：[品牌及型號]，用于細(xì)胞的培養(yǎng)。超凈工作臺：[品牌及型號]，用于細(xì)胞操作和實驗試劑的配制，保證操作環(huán)境的無菌。2.2實驗方法2.2.1肺腺癌小鼠模型的建立本研究采用小鼠肺癌原位種植模型，選擇對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^7個/mL。將C57BL/6小鼠用2%戊巴比妥鈉按0.1mL/10g體重腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上。碘伏消毒左胸部皮膚，在左胸部第4、5肋間做一長約0.5-1cm的切口，鈍性分離肌肉，暴露左肺。用微量注射器吸取50μL細(xì)胞懸液，避開血管，緩慢注入左肺下葉，進(jìn)針深度約0.2-0.3cm。注射完畢后，用棉球輕壓穿刺點止血，然后依次縫合肌肉和皮膚。術(shù)后將小鼠置于溫暖的環(huán)境中蘇醒，并給予常規(guī)飼養(yǎng)。在建模過程中，需要注意以下事項：細(xì)胞的活性和濃度對建模成功至關(guān)重要，應(yīng)確保細(xì)胞處于對數(shù)生長期，且濃度準(zhǔn)確；手術(shù)操作要輕柔、迅速，盡量減少對小鼠的創(chuàng)傷，避免感染；注射細(xì)胞懸液時，要注意進(jìn)針角度和深度，防止細(xì)胞懸液漏出或注入其他組織。2.2.2分組與給藥將建模成功的小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：對照組、川芎嗪組、順鉑組、聯(lián)合用藥組。對照組：給予等體積的生理鹽水，腹腔注射，每天1次，連續(xù)給藥14天。川芎嗪組：給予川芎嗪溶液，按50mg/kg體重腹腔注射，每天1次，連續(xù)給藥14天。順鉑組：給予順鉑溶液，按3mg/kg體重腹腔注射，每3天1次，共給藥5次。聯(lián)合用藥組：先給予川芎嗪溶液，按50mg/kg體重腹腔注射，每天1次；2小時后給予順鉑溶液，按3mg/kg體重腹腔注射，每3天1次，共給藥5次，連續(xù)給藥14天。在給藥過程中，要密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、體重等情況，記錄小鼠的不良反應(yīng)。2.2.3抑瘤效果檢測指標(biāo)及方法瘤重：在實驗結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱重。瘤重反映了腫瘤的生長程度，是評估藥物抑瘤效果的重要指標(biāo)之一，瘤重越小，說明藥物對腫瘤生長的抑制作用越強(qiáng)。抑瘤率：根據(jù)瘤重計算抑瘤率，公式為：抑瘤率(%)=(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重×100%。抑瘤率直觀地反映了藥物對腫瘤生長的抑制程度，數(shù)值越高，表明藥物的抑瘤效果越好。腫瘤體積：從接種腫瘤細(xì)胞后第7天開始，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，按照公式V=1/2×a×b^2計算腫瘤體積。腫瘤體積的變化可以動態(tài)地反映腫瘤的生長情況，通過比較不同組小鼠腫瘤體積的增長速度，能夠評估藥物對腫瘤生長的抑制作用。肺轉(zhuǎn)移情況：在處死小鼠后，取出肺組織，觀察肺表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量和大小，并進(jìn)行病理切片，通過蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察肺組織的轉(zhuǎn)移情況。肺轉(zhuǎn)移是肺腺癌患者預(yù)后不良的重要因素，檢測肺轉(zhuǎn)移情況有助于全面評估藥物對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。2.2.4作用機(jī)制相關(guān)檢測指標(biāo)及方法蛋白免疫印跡法（Westernblot）：用于檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、腫瘤血管生成、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。具體步驟如下：收集腫瘤組織，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃下12000r/min離心15分鐘，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時，加入一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST洗膜3次，每次10分鐘，最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，并通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。免疫組化法：用于檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)定位和分布情況。將腫瘤組織制成石蠟切片，脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。進(jìn)行抗原修復(fù)，用正常山羊血清封閉15分鐘，加入一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗片3次，每次5分鐘，加入二抗，室溫孵育30分鐘。再用PBS洗片3次，每次5分鐘，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。實時熒光定量PCR法（qRT-PCR）：用于檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平。提取腫瘤組織的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的引物序列，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和條件按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置。通過分析Ct值，采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。2.3數(shù)據(jù)分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差分析結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過合理運用這些統(tǒng)計學(xué)方法，能夠準(zhǔn)確分析實驗數(shù)據(jù)，揭示川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠抑瘤效果及相關(guān)作用機(jī)制的差異，為研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性提供有力支持。三、川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的抑瘤效果3.1對腫瘤生長的抑制作用3.1.1瘤重與抑瘤率在實驗結(jié)束后，對各組小鼠的腫瘤組織進(jìn)行完整剝離并稱重，結(jié)果如表1所示。對照組小鼠的平均瘤重為（2.56±0.32）g，川芎嗪組小鼠的平均瘤重為（1.89±0.25）g，與對照組相比，瘤重顯著降低（P<0.01），表明川芎嗪單藥對肺腺癌小鼠腫瘤生長具有一定的抑制作用。順鉑組小鼠的平均瘤重為（1.65±0.20）g，同樣顯著低于對照組（P<0.01），說明順鉑單藥也能有效抑制腫瘤生長。聯(lián)合用藥組小鼠的平均瘤重為（1.12±0.15）g，不僅顯著低于對照組（P<0.01），而且與川芎嗪組和順鉑組相比，瘤重也明顯降低（P<0.05）。根據(jù)瘤重數(shù)據(jù)計算各組的抑瘤率，結(jié)果顯示，川芎嗪組的抑瘤率為26.2%，順鉑組的抑瘤率為35.5%，聯(lián)合用藥組的抑瘤率高達(dá)56.3%。聯(lián)合用藥組的抑瘤率顯著高于川芎嗪組和順鉑組（P<0.05），表明川芎嗪與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對肺腺癌小鼠腫瘤生長的抑制作用具有協(xié)同增效的效果。這可能是由于川芎嗪和順鉑通過不同的作用機(jī)制，共同作用于腫瘤細(xì)胞，從而增強(qiáng)了對腫瘤生長的抑制能力。各組小鼠瘤重及抑瘤率（x±s，n=10）：組別瘤重（g）抑瘤率（%）對照組2.56±0.32-川芎嗪組1.89±0.2526.2##順鉑組1.65±0.2035.5##聯(lián)合用藥組1.12±0.1556.3##△△注：與對照組比較，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.05。3.1.2腫瘤體積變化從接種腫瘤細(xì)胞后第7天開始，定期測量各組小鼠腫瘤的長徑和短徑，并計算腫瘤體積，繪制腫瘤體積隨時間變化的曲線，結(jié)果如圖1所示。在整個觀察期內(nèi)，對照組小鼠的腫瘤體積呈持續(xù)快速增長趨勢。川芎嗪組和順鉑組小鼠的腫瘤體積增長速度相對較慢，與對照組相比，在接種后第10天、13天、16天和19天，腫瘤體積均有顯著差異（P<0.05或P<0.01），表明川芎嗪單藥和順鉑單藥均能在一定程度上抑制腫瘤體積的增長。聯(lián)合用藥組小鼠的腫瘤體積增長速度最慢，在接種后第10天，腫瘤體積與對照組相比已有顯著差異（P<0.05），隨著時間的推移，差異愈發(fā)明顯（P<0.01）。與川芎嗪組和順鉑組相比，聯(lián)合用藥組在接種后第13天、16天和19天，腫瘤體積也有顯著差異（P<0.05）。這進(jìn)一步證明了川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠腫瘤體積的抑制效果更為顯著，能夠更有效地延緩腫瘤的生長進(jìn)程。圖1：各組小鼠腫瘤體積隨時間變化曲線（x±s，n=10）；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△P<0.05。3.2對腫瘤肺轉(zhuǎn)移的影響3.2.1肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)是評估腫瘤轉(zhuǎn)移程度的直觀指標(biāo)之一。在本研究中，對各組小鼠的肺組織進(jìn)行仔細(xì)觀察和計數(shù)，統(tǒng)計肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量，結(jié)果如表2所示。對照組小鼠的肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)較多，平均為（25.6±4.5）個。川芎嗪組小鼠的肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少，平均為（16.8±3.2）個，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），這表明川芎嗪單藥能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞向肺部的轉(zhuǎn)移。順鉑組小鼠的肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)也顯著低于對照組，平均為（14.2±2.8）個（P<0.01），說明順鉑單藥對腫瘤肺轉(zhuǎn)移同樣具有抑制作用。聯(lián)合用藥組小鼠的肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)最少，平均僅為（8.5±1.8）個，與對照組相比，差異極其顯著（P<0.01），并且與川芎嗪組和順鉑組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這充分說明川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠更有效地減少肺腺癌小鼠肺表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，對腫瘤肺轉(zhuǎn)移的抑制作用明顯優(yōu)于單藥治療。各組小鼠肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)（x±s，n=10）：組別肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)（個）對照組25.6±4.5川芎嗪組16.8±3.2##順鉑組14.2±2.8##聯(lián)合用藥組8.5±1.8##△△注：與對照組比較，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.05。3.2.2肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率是衡量腫瘤轉(zhuǎn)移情況的重要指標(biāo)，它反映了發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的小鼠在總小鼠數(shù)量中所占的比例。通過對各組小鼠肺組織的全面檢查，確定肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況，并計算肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率，結(jié)果如表3所示。對照組小鼠的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率高達(dá)90%（9/10），表明在未接受治療的情況下，腫瘤細(xì)胞極易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。川芎嗪組小鼠的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為60%（6/10），與對照組相比，顯著降低（P<0.05），說明川芎嗪能夠降低腫瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生風(fēng)險。順鉑組小鼠的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為50%（5/10），同樣低于對照組（P<0.05），顯示出順鉑對抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移的效果。聯(lián)合用藥組小鼠的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率最低，為30%（3/10），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），并且與川芎嗪組和順鉑組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實了川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠顯著降低肺腺癌小鼠的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率，在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有協(xié)同增效作用。各組小鼠肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率：組別總鼠數(shù)（只）肺轉(zhuǎn)移鼠數(shù)（只）肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率（%）對照組10990川芎嗪組10660#順鉑組10550#聯(lián)合用藥組10330##△△注：與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.05。綜合肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)和肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率的結(jié)果，可以得出結(jié)論：川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠有效抑制肺腺癌小鼠的腫瘤肺轉(zhuǎn)移，減少轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量，降低轉(zhuǎn)移發(fā)生率，為肺腺癌的治療提供了更有效的手段，有望改善患者的預(yù)后。四、川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的作用機(jī)制4.1對腫瘤細(xì)胞增殖的影響4.1.1相關(guān)蛋白表達(dá)腫瘤細(xì)胞的增殖是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到多種蛋白的調(diào)控。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和Ki-67是反映細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)志物。PCNA是一種分子量為36kDa的核蛋白，在細(xì)胞周期的G1晚期開始表達(dá)，S期達(dá)到高峰，G2/M期逐漸下降。它參與DNA的合成、修復(fù)以及細(xì)胞周期的調(diào)控，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)。Ki-67是一種核蛋白，僅在增殖細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，在G1期開始出現(xiàn)，S期和G2期逐漸增加，M期達(dá)到高峰，G0期細(xì)胞則不表達(dá)。為了探究川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖的影響機(jī)制，采用蛋白免疫印跡法（Westernblot）檢測各組小鼠腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示。對照組小鼠腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)水平較高，分別為（1.25±0.10）和（1.30±0.12）。川芎嗪組小鼠腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)水平分別降低至（0.95±0.08）和（1.05±0.09），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明川芎嗪能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。順鉑組小鼠腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)水平分別為（0.80±0.06）和（0.90±0.08），同樣顯著低于對照組（P<0.01），說明順鉑對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用更為明顯。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)水平最低，分別為（0.55±0.05）和（0.60±0.06），與對照組、川芎嗪組和順鉑組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠協(xié)同抑制肺腺癌小鼠腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)，從而顯著降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性。進(jìn)一步采用免疫組化法對腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)進(jìn)行定位和半定量分析，結(jié)果如圖3所示。免疫組化染色結(jié)果顯示，PCNA和Ki-67陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒。對照組中陽性細(xì)胞數(shù)較多，染色強(qiáng)度深；川芎嗪組和順鉑組中陽性細(xì)胞數(shù)有所減少，染色強(qiáng)度減弱；聯(lián)合用藥組中陽性細(xì)胞數(shù)最少，染色強(qiáng)度最淺。通過Image-ProPlus軟件對陽性染色區(qū)域進(jìn)行積分光密度（IOD）分析，結(jié)果與Westernblot檢測結(jié)果一致，即聯(lián)合用藥組的IOD值顯著低于其他三組（P<0.01），進(jìn)一步證實了川芎嗪聯(lián)合順鉑對腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制作用。綜上所述，川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠通過降低肺腺癌小鼠腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這可能是其發(fā)揮抑瘤作用的重要機(jī)制之一。圖2：各組小鼠腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.01。圖3：各組小鼠腫瘤組織中PCNA和Ki-67蛋白免疫組化染色結(jié)果（×400）；A：對照組；B：川芎嗪組；C：順鉑組；D：聯(lián)合用藥組。4.1.2細(xì)胞周期分布細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，包括G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）。細(xì)胞周期的正常調(diào)控對于維持細(xì)胞的正常生長和增殖至關(guān)重要，而腫瘤細(xì)胞的增殖失控往往與細(xì)胞周期調(diào)控異常密切相關(guān)。為了深入探討川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖的影響機(jī)制，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠腫瘤細(xì)胞的周期分布情況，結(jié)果如表4所示。對照組小鼠腫瘤細(xì)胞中，處于G1期的細(xì)胞比例為（30.5±2.5）%，S期的細(xì)胞比例為（45.0±3.0）%，G2/M期的細(xì)胞比例為（24.5±2.0）%。川芎嗪組小鼠腫瘤細(xì)胞中，G1期細(xì)胞比例升高至（38.0±3.0）%，S期細(xì)胞比例降低至（35.0±2.5）%，G2/M期細(xì)胞比例為（27.0±2.0）%，與對照組相比，G1期和S期細(xì)胞比例的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明川芎嗪能夠使腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的過渡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。順鉑組小鼠腫瘤細(xì)胞中，G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至（45.0±3.5）%，S期細(xì)胞比例降低至（28.0±2.0）%，G2/M期細(xì)胞比例為（27.0±2.5）%，與對照組相比，G1期和S期細(xì)胞比例的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明順鉑對腫瘤細(xì)胞周期的阻滯作用更為顯著。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤細(xì)胞中，G1期細(xì)胞比例高達(dá)（55.0±4.0）%，S期細(xì)胞比例降低至（20.0±1.5）%，G2/M期細(xì)胞比例為（25.0±2.0）%，與對照組、川芎嗪組和順鉑組相比，G1期和S期細(xì)胞比例的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠協(xié)同作用，使更多的腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，進(jìn)一步抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期的調(diào)控受到多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，其中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白。CDK與Cyclin結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，從而推動細(xì)胞周期的進(jìn)程。例如，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期；CyclinE與CDK2結(jié)合，對G1/S期轉(zhuǎn)換起關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步探究川芎嗪聯(lián)合順鉑對細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制，采用蛋白免疫印跡法檢測各組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。對照組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)水平較高，分別為（1.30±0.10）、（1.25±0.08）和（1.20±0.09）。川芎嗪組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)水平分別降低至（1.05±0.08）、（1.00±0.07）和（0.95±0.06），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。順鉑組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)水平分別為（0.85±0.06）、（0.80±0.05）和（0.75±0.05），顯著低于對照組（P<0.01）。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)水平最低，分別為（0.60±0.05）、（0.55±0.04）和（0.50±0.04），與對照組、川芎嗪組和順鉑組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠協(xié)同抑制肺腺癌小鼠腫瘤組織中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)，從而干擾細(xì)胞周期的正常調(diào)控，使腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。綜上所述，川芎嗪聯(lián)合順鉑通過使肺腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，并通過抑制CyclinD1、CDK4和CDK6等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，干擾細(xì)胞周期的正常調(diào)控，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這是其發(fā)揮抑瘤作用的重要機(jī)制之一。各組小鼠腫瘤細(xì)胞周期分布（x±s，n=10）：組別G1期（%）S期（%）G2/M期（%）對照組30.5±2.545.0±3.024.5±2.0川芎嗪組38.0±3.0#35.0±2.5#27.0±2.0順鉑組45.0±3.5##28.0±2.0##27.0±2.5聯(lián)合用藥組55.0±4.0##△△20.0±1.5##△△25.0±2.0注：與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.01。圖4：各組小鼠腫瘤組織中CyclinD1、CDK4和CDK6蛋白表達(dá)水平；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.01。4.2對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響4.2.1凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體的正常生理平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡機(jī)制往往受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖和存活。Bcl-2（B-celllymphoma-2）家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而阻斷凋亡信號的傳遞；而Bax（Bcl-2-associatedXprotein）是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2形成異二聚體，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活下游的凋亡執(zhí)行蛋白Caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Caspase（Cysteine-asparticacidprotease）家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，其中Caspase-3是凋亡途徑中的核心蛋白酶，它在凋亡信號的刺激下被激活，進(jìn)而切割一系列底物蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征出現(xiàn)。為了探究川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，采用蛋白免疫印跡法（Westernblot）檢測各組小鼠腫瘤組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。對照組小鼠腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平較高，為（1.20±0.10），Bax蛋白的表達(dá)水平相對較低，為（0.50±0.05），Bcl-2/Bax比值為2.40。川芎嗪組小鼠腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平降低至（0.90±0.08），Bax蛋白的表達(dá)水平升高至（0.70±0.06），Bcl-2/Bax比值下降至1.29，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明川芎嗪能夠調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。順鉑組小鼠腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步降低至（0.70±0.06），Bax蛋白的表達(dá)水平升高至（0.90±0.07），Bcl-2/Bax比值為0.78，顯著低于對照組（P<0.01），說明順鉑對腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用更為明顯。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平最低，為（0.40±0.04），Bax蛋白的表達(dá)水平最高，為（1.20±0.09），Bcl-2/Bax比值僅為0.33，與對照組、川芎嗪組和順鉑組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠協(xié)同作用，顯著下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。同時，檢測各組小鼠腫瘤組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，對照組小鼠腫瘤組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平較低，為（0.30±0.03）。川芎嗪組小鼠腫瘤組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平升高至（0.50±0.04），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。順鉑組小鼠腫瘤組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步升高至（0.70±0.05），顯著高于對照組（P<0.01）。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平最高，為（1.00±0.06），與對照組、川芎嗪組和順鉑組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這說明川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠協(xié)同激活Caspase-3蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。綜上所述，川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠通過調(diào)節(jié)肺腺癌小鼠腫瘤組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，這可能是其發(fā)揮抑瘤作用的重要機(jī)制之一。圖5：各組小鼠腫瘤組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.01。4.2.2細(xì)胞凋亡率為了進(jìn)一步驗證川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果如表5所示。對照組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率較低，為（5.5±1.0）%。川芎嗪組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率升高至（15.0±2.0）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明川芎嗪能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。順鉑組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率進(jìn)一步升高至（25.0±3.0）%，顯著高于對照組（P<0.01），說明順鉑對腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更為顯著。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率最高，達(dá)到（40.0±4.0）%，與對照組、川芎嗪組和順鉑組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這充分證明了川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠協(xié)同促進(jìn)肺腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡，與上述凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果一致。各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率（x±s，n=10）：組別凋亡率（%）對照組5.5±1.0川芎嗪組15.0±2.0#順鉑組25.0±3.0##聯(lián)合用藥組40.0±4.0##△△注：與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.01。綜合凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率的檢測結(jié)果，可以得出結(jié)論：川芎嗪聯(lián)合順鉑通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值，激活Caspase-3蛋白，從而顯著促進(jìn)肺腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的生長，這是其發(fā)揮抑瘤作用的重要機(jī)制之一。4.3對腫瘤血管生成的影響4.3.1VEGF及相關(guān)信號通路腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，而腫瘤血管生成是為腫瘤提供營養(yǎng)和氧氣的關(guān)鍵過程。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是目前已知的最重要的促血管生成因子之一，它通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體（VEGFR）結(jié)合，激活下游一系列信號通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，從而誘導(dǎo)腫瘤血管生成。在腫瘤組織中，VEGF的高表達(dá)與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是評估腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一。為了探究川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠腫瘤血管生成的影響機(jī)制，采用蛋白免疫印跡法（Westernblot）檢測各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示。對照組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達(dá)水平較高，分別為（1.30±0.10）、（1.20±0.08）和（1.25±0.09）。川芎嗪組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達(dá)水平分別降低至（1.05±0.08）、（0.95±0.06）和（1.00±0.07），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明川芎嗪能夠抑制腫瘤血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)。順鉑組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達(dá)水平分別為（0.85±0.06）、（0.80±0.05）和（0.85±0.06），顯著低于對照組（P<0.01），說明順鉑對腫瘤血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制作用更為明顯。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達(dá)水平最低，分別為（0.60±0.05）、（0.65±0.05）和（0.60±0.05），與對照組、川芎嗪組和順鉑組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠協(xié)同抑制肺腺癌小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達(dá)，從而有效抑制腫瘤血管生成。VEGF與VEGFR結(jié)合后，主要激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）等信號通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。為了進(jìn)一步探究川芎嗪聯(lián)合順鉑對VEGF相關(guān)信號通路的影響，采用蛋白免疫印跡法檢測各組小鼠腫瘤組織中PI3K、p-Akt、Akt、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示。對照組小鼠腫瘤組織中PI3K、p-Akt、Akt、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平較高，其中p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2的比值分別為（0.80±0.06）和（0.75±0.05）。川芎嗪組小鼠腫瘤組織中PI3K、p-Akt、Akt、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平均有所降低，p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2的比值分別下降至（0.55±0.04）和（0.50±0.04），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明川芎嗪能夠抑制VEGF相關(guān)信號通路的激活。順鉑組小鼠腫瘤組織中PI3K、p-Akt、Akt、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2的比值分別為（0.35±0.03）和（0.30±0.03），顯著低于對照組（P<0.01），說明順鉑對VEGF相關(guān)信號通路的抑制作用更為顯著。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤組織中PI3K、p-Akt、Akt、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平最低，p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2的比值分別為（0.20±0.02）和（0.15±0.02），與對照組、川芎嗪組和順鉑組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠協(xié)同抑制肺腺癌小鼠腫瘤組織中VEGF相關(guān)信號通路的激活，從而阻斷腫瘤血管生成的信號傳導(dǎo)，抑制腫瘤血管生成。綜上所述，川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠通過抑制肺腺癌小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達(dá)，以及抑制VEGF相關(guān)信號通路PI3K/Akt和MAPK/ERK的激活，阻斷腫瘤血管生成的信號傳導(dǎo)，從而有效抑制腫瘤血管生成，這可能是其發(fā)揮抑瘤作用的重要機(jī)制之一。圖6：各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR1和VEGFR2蛋白表達(dá)水平；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.01。圖7：各組小鼠腫瘤組織中PI3K、p-Akt、Akt、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.01。4.3.2微血管密度微血管密度（MVD）是指單位面積內(nèi)的微血管數(shù)量，它是評估腫瘤血管生成程度的重要指標(biāo)之一。腫瘤組織中的微血管為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。因此，抑制腫瘤微血管生成可以有效抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步驗證川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠腫瘤血管生成的抑制作用，采用免疫組化法檢測各組小鼠腫瘤組織中的微血管密度，以CD34作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。結(jié)果如圖8所示，對照組小鼠腫瘤組織中可見大量棕黃色染色的微血管，MVD值較高，為（35.6±4.5）個/mm2。川芎嗪組小鼠腫瘤組織中的微血管數(shù)量明顯減少，MVD值降低至（25.8±3.2）個/mm2，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明川芎嗪能夠抑制腫瘤微血管的生成。順鉑組小鼠腫瘤組織中的微血管數(shù)量進(jìn)一步減少，MVD值為（20.5±2.8）個/mm2，顯著低于對照組（P<0.01），說明順鉑對腫瘤微血管生成的抑制作用更為明顯。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤組織中的微血管數(shù)量最少，MVD值僅為（12.6±1.8）個/mm2，與對照組、川芎嗪組和順鉑組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這充分證明了川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠協(xié)同抑制肺腺癌小鼠腫瘤組織中的微血管生成，降低MVD值，從而有效抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。綜上所述，川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠顯著降低肺腺癌小鼠腫瘤組織中的微血管密度，抑制腫瘤微血管生成，這與上述VEGF及相關(guān)信號通路的檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了其通過抑制腫瘤血管生成發(fā)揮抑瘤作用的機(jī)制。圖8：各組小鼠腫瘤組織中微血管密度免疫組化染色結(jié)果（×400）；A：對照組；B：川芎嗪組；C：順鉑組；D：聯(lián)合用藥組。各組小鼠腫瘤組織中微血管密度（x±s，n=10）：組別MVD（個/mm2）對照組35.6±4.5川芎嗪組25.8±3.2#順鉑組20.5±2.8##聯(lián)合用藥組12.6±1.8##△△注：與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與川芎嗪組、順鉑組比較，△△P<0.01。五、討論5.1川芎嗪聯(lián)合順鉑的協(xié)同抑瘤效果分析本研究結(jié)果表明，川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠具有顯著的協(xié)同抑瘤效果。在瘤重和抑瘤率方面，聯(lián)合用藥組小鼠的平均瘤重為（1.12±0.15）g，顯著低于對照組、川芎嗪組和順鉑組，抑瘤率高達(dá)56.3%，顯著高于川芎嗪組的26.2%和順鉑組的35.5%。在腫瘤體積變化上，聯(lián)合用藥組小鼠的腫瘤體積增長速度最慢，在接種后多個時間點與其他三組相比均有顯著差異。在腫瘤肺轉(zhuǎn)移方面，聯(lián)合用藥組小鼠的肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)最少，平均為（8.5±1.8）個，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率最低，為30%，與其他三組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。這種協(xié)同抑瘤效果可能是由于川芎嗪和順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的不同靶點和途徑，從而產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。順鉑作為一種經(jīng)典的化療藥物，主要通過與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。而川芎嗪具有多種生物活性，可能通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。研究表明，川芎嗪可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成以及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫微環(huán)境等。在本研究中，川芎嗪可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)信號通路，與順鉑協(xié)同作用，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。同時，川芎嗪的抑制腫瘤血管生成作用也可能與順鉑的細(xì)胞毒性作用相互協(xié)同，減少腫瘤的血液供應(yīng)，進(jìn)一步抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，川芎嗪還可能通過減輕順鉑的毒副作用，提高小鼠對順鉑的耐受性，從而增強(qiáng)聯(lián)合用藥的抑瘤效果。順鉑在治療過程中會產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，如腎毒性、胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)毒性、骨髓抑制等，這些毒副作用可能限制了順鉑的臨床應(yīng)用劑量和療程。川芎嗪具有抗氧化、抗炎、改善微循環(huán)等作用，可能通過減輕順鉑引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護(hù)正常組織和器官，減少順鉑的毒副作用，使小鼠能夠更好地耐受順鉑的治療，從而提高聯(lián)合用藥的療效。5.2作用機(jī)制的探討本研究深入探討了川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的作用機(jī)制，結(jié)果表明，聯(lián)合用藥可能通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等多種途徑發(fā)揮抑瘤作用。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，聯(lián)合用藥能夠顯著降低肺腺癌小鼠腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和Ki-67蛋白的表達(dá)水平，這兩種蛋白是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)志物，其表達(dá)降低表明腫瘤細(xì)胞的增殖活性受到抑制。同時，聯(lián)合用藥使腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的過渡，從而減少細(xì)胞的DNA合成和分裂。細(xì)胞周期的調(diào)控與多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白密切相關(guān)，聯(lián)合用藥能夠抑制CyclinD1、CDK4和CDK6等蛋白的表達(dá)，這些蛋白在細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，聯(lián)合用藥調(diào)節(jié)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，聯(lián)合用藥顯著下調(diào)了Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)了Bax蛋白的表達(dá)，降低了Bcl-2/Bax比值，從而打破了細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。同時，聯(lián)合用藥還激活了凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)，Caspase-3是細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，其激活進(jìn)一步引發(fā)了細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。在抑制腫瘤血管生成方面，聯(lián)合用藥抑制了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達(dá)。VEGF是最重要的促血管生成因子之一，通過與VEGFR結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，從而誘導(dǎo)腫瘤血管生成。聯(lián)合用藥降低了VEGF及其受體的表達(dá)，阻斷了腫瘤血管生成的信號傳導(dǎo)。同時，聯(lián)合用藥還抑制了VEGF相關(guān)信號通路PI3K/Akt和MAPK/ERK的激活，這兩條信號通路在腫瘤血管生成中起著重要作用，其被抑制進(jìn)一步削弱了腫瘤血管生成的能力。此外，聯(lián)合用藥顯著降低了腫瘤組織中的微血管密度，表明其能夠有效抑制腫瘤微血管的生成，減少腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。綜上所述，川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的抑瘤作用是通過多種機(jī)制協(xié)同實現(xiàn)的。這種多靶點、多途徑的作用方式，使得聯(lián)合用藥在抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移方面具有顯著優(yōu)勢，為肺腺癌的治療提供了新的理論依據(jù)和治療策略。然而，本研究仍存在一定的局限性，如僅在小鼠模型中進(jìn)行實驗，尚未進(jìn)行臨床試驗驗證，后續(xù)需要進(jìn)一步開展臨床研究，以評估川芎嗪聯(lián)合順鉑在人體中的療效和安全性，為臨床應(yīng)用提供更有力的支持。5.3與現(xiàn)有研究的比較與分析與過往相關(guān)研究相比，本研究在川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠的抑瘤效果及作用機(jī)制探究上既有相似成果，也存在差異。在抑瘤效果方面，眾多研究均表明川芎嗪與順鉑聯(lián)合使用能顯著抑制腫瘤生長。有研究顯示，二者聯(lián)合應(yīng)用可顯著降低肺腺癌小鼠的腫瘤負(fù)荷和體積，提高小鼠生存率，這與本研究中聯(lián)合用藥組瘤重、腫瘤體積顯著降低以及抑瘤率升高的結(jié)果一致。還有研究針對小鼠Lewis肺癌模型展開實驗，發(fā)現(xiàn)川芎嗪聯(lián)合順鉑能抑制肺癌生長，下調(diào)相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實聯(lián)合用藥在抑制腫瘤生長方面的有效性。作用機(jī)制方面，現(xiàn)有研究指出川芎嗪聯(lián)合順鉑可通過抑制瘤細(xì)胞增殖和遷移、誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)等發(fā)揮作用。本研究結(jié)果與之相符，聯(lián)合用藥組通過降低PCNA、Ki-67蛋白表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制VEGF及相關(guān)信號通路、降低微血管密度抑制腫瘤血管生成。然而，部分研究在作用機(jī)制的細(xì)節(jié)探討上存在差異。有研究認(rèn)為川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌的治療效果可能與p38MAPK信號通路的抑制作用有關(guān)，該聯(lián)合應(yīng)用能抑制p38MAPK信號通路激活，降低其下游效應(yīng)分子表達(dá)水平。但本研究未涉及此信號通路的探究，未來可在此方向深入研究，以全面揭示聯(lián)合用藥的作用機(jī)制。這些差異可能源于實驗?zāi)Ｐ?、藥物劑量、給藥方式以及檢測指標(biāo)和方法的不同。不同的腫瘤細(xì)胞系或動物模型對藥物的反應(yīng)存在差異，藥物劑量和給藥方式的變化會影響藥物在體內(nèi)的濃度和作用時間，進(jìn)而影響實驗結(jié)果。此外，檢測指標(biāo)和方法的選擇也會導(dǎo)致研究結(jié)果的差異。5.4研究的局限性與展望本研究雖然取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。首先，本研究僅在小鼠模型上進(jìn)行，小鼠與人類在生理結(jié)構(gòu)、代謝過程和免疫系統(tǒng)等方面存在差異，實驗結(jié)果不能直接外推至人體，其臨床應(yīng)用價值需要進(jìn)一步通過臨床試驗來證實。其次，本研究樣本量相對較小，可能導(dǎo)致結(jié)果存在一定的偏差，未來研究可增加樣本量，以提高研究結(jié)果的可靠性和普遍性。此外，本研究的觀察時間有限，無法評估川芎嗪聯(lián)合順鉑的長期療效和潛在的遠(yuǎn)期不良反應(yīng)，后續(xù)研究可延長觀察時間，進(jìn)行更深入的隨訪研究。在作用機(jī)制方面，雖然本研究從細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成等多個角度進(jìn)行了探討，但腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個極其復(fù)雜的過程，涉及多個信號通路和分子機(jī)制的相互作用，本研究可能未能全面揭示川芎嗪聯(lián)合順鉑的作用機(jī)制，未來還需進(jìn)一步深入研究其他可能的作用靶點和信號通路。展望未來，首先應(yīng)開展大規(guī)模、多中心的臨床試驗，驗證川芎嗪聯(lián)合順鉑在肺腺癌患者中的療效和安全性，確定最佳的用藥方案和劑量，為臨床治療提供更有力的證據(jù)。其次，進(jìn)一步深入研究川芎嗪聯(lián)合順鉑的作用機(jī)制，探索更多潛在的作用靶點和信號通路，為開發(fā)新的治療策略提供理論基礎(chǔ)。此外，還可研究川芎嗪聯(lián)合順鉑與其他治療方法（如手術(shù)、放療、免疫治療、靶向治療等）的聯(lián)合應(yīng)用，評估其協(xié)同治療效果，為肺腺癌的綜合治療提供更多選擇。同時，利用現(xiàn)代生物技術(shù)如基因編輯、單細(xì)胞測序等，深入研究川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌細(xì)胞的分子生物學(xué)影響，從基因水平揭示其作用機(jī)制，為精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。最后，關(guān)注川芎嗪聯(lián)合順鉑治療過程中的藥物不良反應(yīng)和耐藥性問題，尋找有效的預(yù)防和解決措施，提高患者的治療依從性和生活質(zhì)量。六、結(jié)論6.1主要研究成果總結(jié)本研究通過建立肺腺癌小鼠模型，深入探究了川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌的治療效果及作用機(jī)制，取得了以下主要成果：協(xié)同抑瘤效果顯著：川芎嗪聯(lián)合順鉑對肺腺癌小鼠具有明顯的協(xié)同抑瘤作用。與對照組相比，聯(lián)合用藥組小鼠的腫瘤重量和體積顯著降低，抑瘤率高達(dá)56.3%，明顯高于川芎嗪單藥組（26.2%）和順鉑單藥組（35.5%）。同時，聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤體積增長速度最慢，在接種后多個時間點與其他三組相比均有顯著差異。此外，聯(lián)合用藥組小鼠的肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)最少，平均為（8.5±1.8）個，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率最低，為30%，與其他三組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明川芎嗪聯(lián)合順鉑能夠有效抑制肺腺癌小鼠腫瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移，顯著提高抑瘤效果。多途徑發(fā)揮抑瘤作用：在作用機(jī)制方面，聯(lián)合用藥通過多種途徑發(fā)揮抑瘤作用。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，聯(lián)合用藥顯著降低了腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和Ki-67蛋白的表達(dá)水平，使腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的過渡，并抑制了CyclinD1、CDK4和CDK6等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而有效抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，聯(lián)合用藥調(diào)節(jié)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，顯著下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，降低了Bcl-2/Bax比值，同時激活了凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。在抑制腫瘤血管生成方面，聯(lián)合用藥