第1章緒論1.1引言隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、人們生活水平的提高，食品安全已然成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)議題。食用油作為膳食中的重要成分，它的質(zhì)量安全直接影響到消費(fèi)者的健康。在運(yùn)輸、貯存及使用環(huán)節(jié)中，油脂易受氧化、水解等化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)發(fā)生劣變，生成醛類、酮類、酸類等對(duì)人體有害的氧化產(chǎn)物。在這個(gè)過程中脂肪酸的含量可能會(huì)發(fā)生變化。通過考察食用油樣品中脂肪酸含量的差異，有望更準(zhǔn)確地鑒別食品的質(zhì)量，規(guī)范食品標(biāo)準(zhǔn)。本文研究的脂肪酸主要有月桂酸、肉豆蔻是、棕櫚酸、硬脂酸和二十二酸。1.2食用油概述食用油ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1-3]是人體生命活動(dòng)重要的組成成分和能源物質(zhì)之一，為人們提供必需脂肪酸、促進(jìn)脂溶性維生素吸收。食用油主要是由甘油三酯（TAG）組成，并含有少量游離脂肪酸、磷脂、甾醇及脂溶性維生素等成分。根據(jù)原料來源，食用油可分為植物油、動(dòng)物油及調(diào)和油等，不同油的脂肪酸組成差異顯著，如椰子油中富含中鏈脂肪酸（如月桂酸、肉豆蔻酸等），而橄欖油中富含單不飽和脂肪酸。在加工、儲(chǔ)存及烹飪過程中，油脂在光照、氧氣、微生物作用下容易發(fā)生氧化、水解、縮合等反應(yīng)，導(dǎo)致游離脂肪酸含量升高、過氧化值超標(biāo)，并生成醛類、酮類等有害物。食用油變質(zhì)不僅會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)價(jià)值降低，還會(huì)增加人們患心血管疾病、癌癥等慢性病的風(fēng)險(xiǎn)，所以要建立一種高效、精準(zhǔn)的油脂檢測(cè)方法。脂肪酸甲酯化結(jié)合GC-MS分析是當(dāng)前主流方法，但傳統(tǒng)衍生化試劑存在毒性高、副反應(yīng)多等問題。本研究采用的三甲基硅重氮甲烷（TMSD)由于其溫和的反應(yīng)條件和可控的衍生化進(jìn)程，展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。研究證實(shí)，GC-MS與HPLC技術(shù)可精準(zhǔn)分析脂肪酸動(dòng)態(tài)變化，通過FFA含量監(jiān)測(cè)能有效鑒別油脂氧化程度及摻假行為。Wei團(tuán)隊(duì)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wei</Author><Year>2012</Year><RecNum>35</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>35</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743689501">35</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wei,Fang</author><author>Zhao,Qin</author><author>Lv,Xin</author><author>Dong,Xu-Yan</author><author>Feng,Yu-Qi</author><author>Chen,Hong</author></authors></contributors><titles><title>RapidMagneticSolid-PhaseExtractionBasedonMonodisperseMagneticSingle-CrystalFerriteNanoparticlesfortheDeterminationofFreeFattyAcidContentinEdibleOils</title><secondary-title>JournalofAgriculturalandFoodChemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofAgriculturalandFoodChemistry</full-title></periodical><dates><year>2012</year><pub-dates><date>2012/12/20</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1021/jf303840q</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/jf303840q</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[4]采用硫酸-甲醇衍生化結(jié)合GC-MS技術(shù)，建立了一種高效靈敏的分析方法，成功實(shí)現(xiàn)4種食用油加速貯藏過程中游離脂肪酸（FFA）的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，該方法靈敏度高，線性響應(yīng)好，并發(fā)現(xiàn)新鮮油的特征在于低含量的游離脂肪酸，而在氧化過程中，儲(chǔ)存時(shí)間越長，產(chǎn)生的游離脂肪酸含量越高。Cao課題組ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[5]建立了6種單甘酯的GC-MS定量分析方法，具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性。發(fā)現(xiàn)地溝油樣品中的單甘酯標(biāo)記物含量也異常高，可用于食用油降解狀態(tài)的研究、食用油中摻入地溝油的商品油的鑒別、食用油中單甘酯標(biāo)記物的檢測(cè)以及篩選地溝油。1.3脂肪酸概述脂肪酸（FattyAcids，F(xiàn)As）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[6-8]是一類具有脂族鏈的天然羧酸化合物，廣泛存在于生物體中，是脂質(zhì)家族的核心成員。此類化合物主要以酯化形式參與甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）及磷脂的分子結(jié)構(gòu)，亦可游離存在。從植物到動(dòng)物源性食品，脂肪酸普遍分布于天然產(chǎn)物中。脂肪酸作為人體必需營養(yǎng)素，在維持基礎(chǔ)生理功能和代謝調(diào)控中發(fā)揮雙重作用。研究表明，必需脂肪酸不僅參與基礎(chǔ)能量代謝，更通過調(diào)節(jié)心率、血壓、凝血功能及生殖系統(tǒng)活性等關(guān)鍵生理過程維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。月桂酸（C12:0）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[9,10]主要存在于椰子油和牛奶中，是對(duì)革蘭氏陽性菌最具抑制作用的飽和脂肪酸之一。月桂酸廣泛食品添加劑、制藥工業(yè)方面。但富含月桂酸的油樣可能導(dǎo)致血脂異常、心血管問題。肉豆蔻酸（C14:0）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Alonso-Castro</Author><Year>2021</Year><RecNum>38</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[11]</style></DisplayText><record><rec-number>38</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743689501">38</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Alonso-Castro,AngelJosabad</author><author>Serrano-Vega,Roberto</author><author>PérezGutiérrez,Salud</author><author>Isiordia-Espinoza,MarioAlberto</author><author>Solorio-Alvarado,CesarRogelio</author></authors></contributors><titles><title>Myristicacidreducesskininflammationandnociception</title><secondary-title>JournalofFoodBiochemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofFoodBiochemistry</full-title></periodical><dates><year>2021</year><pub-dates><date>2021/11/22</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1111/jfbc.14013</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1111/jfbc.14013</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[11]主要存在于椰子油和棕櫚仁油中，具有體外抗炎活性。同時(shí)，它可以作為生產(chǎn)表面活性劑的原料，也用于消泡劑、增香劑。棕櫚酸（C16:0）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Carta</Author><Year>2017</Year><RecNum>81</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[12]</style></DisplayText><record><rec-number>81</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743692835">81</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Carta,Gianfranca</author><author>Murru,Elisabetta</author><author>Banni,Sebastiano</author><author>Manca,Claudia</author></authors></contributors><titles><title>PalmiticAcid:PhysiologicalRole,MetabolismandNutritionalImplications</title><secondary-title>FrontiersinPhysiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>FrontiersinPhysiology</full-title></periodical><pages>227-230</pages><volume>267</volume><dates><year>2017</year><pub-dates><date>2017/11/24</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.3389/fphys.2017.00902</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.3389/fphys.2017.00902</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[12]可以由棕櫚油或棕櫚仁油中提取得到，在肉類、乳制品和可可脂中也含有大量的棕櫚酸。它可以作為香料配料，也用于消泡劑、乳化劑。硬脂酸（C18:0）在自然界中廣泛存在于動(dòng)植物油脂中，可以發(fā)生脫氫反應(yīng)，在進(jìn)入人體后，轉(zhuǎn)化成為油酸從而降低血液中膽固醇含量，有利于身體健康。它廣泛用于化妝品、食品、藥品和塑料等領(lǐng)域。二十二酸（C22:0）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Liu</Author><Year>2024</Year><RecNum>80</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[13]</style></DisplayText><record><rec-number>80</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743692835">80</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Liu,Kerong</author><author>Gu,Ying</author><author>Pan,Xingnan</author><author>Chen,Sha</author><author>Cheng,Jie</author><author>Zhang,Le</author><author>Cao,Minkai</author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"size="100%">BehenicacidalleviatesinflammationandinsulinresistanceingestationaldiabetesmellitusbyregulatingTLR4/NF-</style><styleface="normal"font="default"charset="161"size="100%">κBsignalingpathway</style></title><secondary-title>iScience</secondary-title></titles><periodical><full-title>iScience</full-title></periodical><pages>1-16</pages><volume>27</volume><dates><year>2024</year><pub-dates><date>2024/09/24</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1016/j.isci.2024.111019</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.isci.2024.111019</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[13]可以在各種植物中找到。它具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗腫瘤特性，已被證明是胰脂肪酶的天然抑制劑，可有效抑制肥胖的發(fā)展，廣泛用于油漆、涂料和塑料等工業(yè)領(lǐng)域。1.5脂肪酸的分析研究進(jìn)展脂肪酸因其具有低揮發(fā)性和高極性，在高溫條件下易發(fā)生聚合、脫羧或裂解反應(yīng)，制約其分析效能。食品中游離脂肪酸（FFA）含量通常處于痕量水平，其弱電離特性導(dǎo)致質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度不足，難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。通過將脂肪酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性強(qiáng)、極性低的甲酯衍生物（FAME），可顯著提升分離效率與檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜食品體系中痕量脂肪酸的準(zhǔn)確定性與定量分析。1.5.1氣相色譜/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）是脂肪酸分析的主要方法。。由于脂肪酸分子中含有羧基等極性基團(tuán)，需通過甲酯化或硅烷化等衍生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性衍生物后方可進(jìn)行GC分析。在氣相色譜分析中，脂肪酸甲酯化主要通過硫酸（鹽酸）-甲醇法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wei</Author><Year>2012</Year><RecNum>35</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>35</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743689501">35</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wei,Fang</author><author>Zhao,Qin</author><author>Lv,Xin</author><author>Dong,Xu-Yan</author><author>Feng,Yu-Qi</author><author>Chen,Hong</author></authors></contributors><titles><title>RapidMagneticSolid-PhaseExtractionBasedonMonodisperseMagneticSingle-CrystalFerriteNanoparticlesfortheDeterminationofFreeFattyAcidContentinEdibleOils</title><secondary-title>JournalofAgriculturalandFoodChemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofAgriculturalandFoodChemistry</full-title></periodical><dates><year>2012</year><pub-dates><date>2012/12/20</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1021/jf303840q</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/jf303840q</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[4]、氫氧化鈉（四甲基氫氧化鈉銨）-甲醇法ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[14-18]、三氟化硼-甲醇法ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[19-21]及重氮甲烷法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Antolín</Author><Year>2008</Year><RecNum>70</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[22]</style></DisplayText><record><rec-number>70</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743692835">70</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Antolín,ErnestoMéndez</author><author>Delange,DavidMarrero</author><author>Canavaciolo,VíctorGonzález</author></authors></contributors><titles><title>EvaluationoffivemethodsforderivatizationandGCdeterminationofamixtureofverylongchainfattyacids(C24:0-C36:0)</title><secondary-title>JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis</full-title></periodical><pages>194-199</pages><volume>46</volume><number>1</number><dates><year>2008</year><pub-dates><date>2008/01/07</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1016/j.jpba.2007.09.015</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.jpba.2007.09.015</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[22]等實(shí)現(xiàn)。然而，上述方法均存在反應(yīng)副產(chǎn)物多、試劑毒性高或操作條件苛刻等缺陷。本研究采用三甲基硅重氮甲烷（TMSD）作為衍生化試劑，其作為重氮甲烷的安全替代品，兼具反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)可控及環(huán)境友好性等優(yōu)勢(shì)，在有機(jī)合成與脂質(zhì)分析領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊應(yīng)用前景。Simionato課題組ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Simionato</Author><Year>2010</Year><RecNum>11</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[16]</style></DisplayText><record><rec-number>11</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743688566">11</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Simionato,JullianaIsabelle</author><author>Garcia,JulianaCarla</author><author>Santos,GeraldoTadeudos</author><author>Oliveira,CláudioCelestino</author><author>Visentainer,JesuiVergilio</author><author>Souza,NilsonEveláziode</author></authors></contributors><titles><title>Validationofthedeterminationoffattyacidsinmilkbygaschromatography</title><secondary-title>JournaloftheBrazilianChemicalSociety</secondary-title></titles><periodical><full-title>JournaloftheBrazilianChemicalSociety</full-title></periodical><dates><year>2010</year><pub-dates><date>2010/01/01</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1590/s0103-50532010000300018</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1590/s0103-50532010000300018</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[16]使用氯仿、甲醇和水（2：1：1）作為衍生化試劑結(jié)合GC-MS分析，該方法對(duì)牛奶樣品的加標(biāo)回收率良好，驗(yàn)證了方法的可靠性。因此，亞油酸等脂肪酸可以安全地用GC-FID進(jìn)行分離和定量。溫愷嘉課題組ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[23]建立了適用于蛋黃卵磷脂（供注射用）中棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸含量測(cè)定的分析方法，使用氣相色譜外標(biāo)法分析甲酯衍生物。樣品通過三氟化硼-甲醇甲酯化,證實(shí)該方法適用于蛋黃卵磷脂中7種脂肪酸含量的測(cè)定。Hung等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Hung</Author><Year>2023</Year><RecNum>47</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[24]</style></DisplayText><record><rec-number>47</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743690667">47</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Hung,NguyenKhanh</author><author>Trang,NguyenPhuong</author><author>Du,NguyenHuy</author></authors></contributors><titles><title>Determinationofsaturatedfat,unsaturatedfat,andtransfatincommercialinstantnoodlesbasedontheanalysisoffattyacidcompositionbygaschromatography</title><secondary-title>VietnamJournalofChemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>VietnamJournalofChemistry</full-title></periodical><dates><year>2023</year><pub-dates><date>2023/11/30</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1002/vjch.202300099</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1002/vjch.202300099</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[24]通過氫氧化鈉-甲醇法甲酯化與GC-MS聯(lián)用，系統(tǒng)分析了方便面中37種脂肪酸甲酯，發(fā)現(xiàn)樣本中棕櫚酸（飽和脂肪酸）占比最高，順式單不飽和脂肪酸以油酸、亞油酸為主，反式脂肪酸及多不飽和脂肪酸含量極低。1.5.2液相色譜/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)通過反相/正相分離模式與衍生化反應(yīng)聯(lián)用，有效改善了檢測(cè)靈敏度不足的問題。由于多數(shù)脂肪酸缺乏紫外吸收基團(tuán)，常需進(jìn)行衍生化反應(yīng)，在脂肪酸分子中引入強(qiáng)紫外吸收基團(tuán)或熒光標(biāo)記試劑以增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。相較于GC，HPLC具有分離效率高、分析周期短及適用性廣等優(yōu)勢(shì)。Ding團(tuán)隊(duì)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Ding</Author><Year>2007</Year><RecNum>46</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[25]</style></DisplayText><record><rec-number>46</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="prs9r2vzyxevvwe9x5t59r2tp09adrz2a9aa"timestamp="1743690667">46</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Ding,Yang-Jun</author><author>Zhao,Xian-En</author><author>Zhu,Fang</author><author>Suo,You-Rui</author><author>Li,Yu-Lin</author><author>Chen,Gui-Chen</author><author>You,Jin-Mao</author></authors></contributors><titles><title>IdentificationofLong-ChainUnsaturatedFattyAcidsinDeep-SeaFishOilbyLiquidChromatography/MassSpectrometry/AtmosphericPressureChemicalIonization</title><secondary-title>ChineseJournalofAnalyticalChemistry</secondary-title></titles><periodical><full-title>ChineseJournalofAnalyticalChemistry</full-title></periodical><dates><year>2007</year><pub-dates><date>2007/03/01</date></pub-dates></dates><urls><related-urls><url>/10.1016/s1872-2040(07)60041-3</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/s1872-2040(07)60041-3</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[25]采用HPLC/APCI-MS結(jié)合BDEBS衍生化技術(shù)，成功鑒定了深海魚油中23種中長鏈不飽和脂肪酸，并實(shí)現(xiàn)了雙鍵位置的精準(zhǔn)定位，為多不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)解析提供了創(chuàng)新性技術(shù)方案。1.6課題研究目的與意義探索并優(yōu)化脂肪酸的甲酯化反應(yīng)條件，確保反應(yīng)高效且穩(wěn)定，提高定量準(zhǔn)確性和重復(fù)性，減少樣品和試劑用量，降低成本。建立一套基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)的脂肪酸甲酯定量分析方法，并將該方法應(yīng)用于變質(zhì)食用油的檢測(cè)，確定脂肪酸變化與食用油變質(zhì)程度的關(guān)系，應(yīng)用該方法對(duì)市售食用油進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，鑒別是否存在變質(zhì)現(xiàn)象。

第2章游離脂肪酸的綠色甲酯化研究2.1材料與方法2.1.1樣品和試劑月桂酸（C12，化學(xué)純）、甲酸（HPLC），國藥化學(xué)試劑有限公司；肉豆蔻酸（C14:0，>99%）、棕櫚酸（C16:0，>97%）、硬脂酸（C18:0，>98%）、二十二酸（C22:0，>99%），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；三甲基硅重氮甲烷（正己烷溶液2mol/L）、三甲基氯硅烷（95%），上海安耐吉化學(xué)試劑有限公司；乙酸甲酯（AR,98%），阿拉丁試劑（上海）有限公司。圖2-1化合物的結(jié)構(gòu)式（A：月桂酸；B：肉豆蔻酸；C：棕櫚酸；D：硬脂酸；E：二十二酸；F：三甲基硅重氮甲烷；G：三甲基氯硅烷）2.1.2樣品制備與衍生化準(zhǔn)確稱取月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十二酸5種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品10mg，用乙酸甲酯溶劑稀釋至10.0mL，制成質(zhì)量濃度為1000μg/mL的混合貯備液，將配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；將混合貯備液稀釋至質(zhì)量濃度為100μg/mL的溶液（溶劑為乙酸甲酯），進(jìn)行甲酯化反應(yīng)。取2mol/L的衍生化試劑三甲基硅重氮甲烷50μL和催化劑三甲基氯硅烷20μL，加入1mL混合標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸溶液，在室溫下磁力攪拌30min，加入20μL終止試劑甲酸，進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)分析。圖2-2游離脂肪酸與三甲基硅重氮甲烷的甲酯化反應(yīng)2.1.3儀器條件使用Agilent7890A氣相色譜系統(tǒng)與Agilent5975C單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(Agilent，PaloAlto，CA，USA)聯(lián)用進(jìn)行儀器分析。使用HP-5毛細(xì)管柱(15mx0.25mm，0.25um膜厚，AgilentTechnologies)分離目標(biāo)分析物。將樣品等分試樣(1μL)注入進(jìn)樣口，氣相色譜入口溫度設(shè)置為260℃，分流比為20:1。氦氣(99.999%)作為載氣，流速設(shè)置為1.0mL/min。柱溫箱溫度最初設(shè)置為60℃，以30℃/min的速率升至160℃，保持2min，以25℃/min的速率升至200℃，以5℃/min的速率升至220℃，最后以30℃/min的速率升至280℃。采用了全掃描模式質(zhì)量掃描（掃描范圍m/z：50-400）模式，質(zhì)譜條件設(shè)置如下:電子電離(EI)能量為70eV，離子源溫度為230℃，進(jìn)樣口溫度為260℃。使用高純度氦氣(99.998%)為碰撞激活解離氣體，流速設(shè)置為1mL/min。采集時(shí)間范圍為3.5-14.9min。2.2結(jié)果與討論2.2.1氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析如圖2-3所示，為5種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)三甲基硅重氮甲烷甲酯衍生化后的氣質(zhì)聯(lián)用分析總離子流圖；通過觀察總離子流圖中色譜峰的EI質(zhì)譜響應(yīng)，確定圖2-3中tR5.520min為月桂酸甲酯，tR6.890min為肉豆蔻酸甲酯，tR8.153min為棕櫚酸甲酯，tR9.586min為硬脂酸甲酯，tR13.433min為二十二酸甲酯。圖2-35種脂肪酸甲酯化氣質(zhì)聯(lián)用分析總離子流圖圖2-4脂肪酸甲酯（A：月桂酸甲酯；B：肉豆蔻酸甲酯；C：棕櫚酸甲酯；D：硬脂酸甲酯；E：二十二酸酸甲酯）EI質(zhì)譜圖2.2.2衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化在探究三甲基硅重氮甲烷作為衍生化試劑進(jìn)行脂肪酸的甲酯化中，本節(jié)考察了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、衍生化試劑用量及催化劑用量對(duì)月桂酸、肉豆蔻酸及棕櫚酸酯化率的影響。反應(yīng)溫度為探究最佳的反應(yīng)溫度，取2mol/L的衍生化試劑三甲基硅重氮甲烷100μL和催化劑三甲基氯硅烷20μL，加入1mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃溫度下磁力攪拌10min，加入20μL終止試劑甲酸，進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)分析。比較不同溫度的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用出峰的峰面積。由圖可知，在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，甲酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率并未隨溫度變化呈現(xiàn)顯著差異，這表明溫度對(duì)甲酯化反應(yīng)效率影響有限。因此，選擇室溫作為該反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)溫度（如圖2-5）。圖2-5反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酸甲酯化反應(yīng)的影響反應(yīng)時(shí)間為探究最佳的反應(yīng)時(shí)間，取2mol/L的衍生化試劑三甲基硅重氮甲烷100μL和催化劑三甲基氯硅烷20μL，加入1mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在室溫下磁力攪拌1min、2min、5min、8min、10min、15min、20min、30min、40min、50min，加入20μL終止試劑甲酸，進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)分析。比較不同時(shí)間的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用出峰的峰面積。從圖中可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于30min時(shí)，甲酯化效率與反應(yīng)時(shí)間呈正相關(guān)，說明反應(yīng)體系還沒有達(dá)到完全轉(zhuǎn)化狀態(tài)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長到30min時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物的峰面積不再增加，說明反應(yīng)已經(jīng)基本完成，因此，選擇30min作為該體系的最佳反應(yīng)時(shí)間（如圖2-6所示）。圖2-6反應(yīng)時(shí)間對(duì)脂肪酸甲酯化反應(yīng)的影響衍生化試劑用量為探究最佳的衍生化試劑用量，分別取2mol/L的衍生化試劑三甲基硅重氮甲烷10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL，催化劑三甲基氯硅烷20μL，加入1mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在室溫下磁力攪拌30min，加入20μL終止試劑甲酸，進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)分析。比較不同時(shí)間的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用出峰的峰面積。從圖中可以看出，當(dāng)衍生試劑用量小于50μL時(shí)，衍生化效率與衍生化試劑用量呈正相關(guān)，說明衍生化反應(yīng)不完全；當(dāng)衍生試劑用量大于50μL時(shí)，衍生效率與衍生試劑用量達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，選擇該體系的最佳衍生化試劑用量為50μL（如圖2-7）。圖2-7衍生化試劑用量對(duì)脂肪酸甲酯化反應(yīng)的影響催化劑用量為探究最佳的催化劑用量，取2mol/L的衍生化試劑三甲基硅重氮甲烷50μL，分別取催化劑三甲基氯硅烷0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，加入1mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在室溫下磁力攪拌30min，加入20μL終止試劑甲酸，進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)分析。比較不同時(shí)間的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用出峰的峰面積。由圖可知，催化劑的引入，使甲酯化反應(yīng)效率顯著提高，當(dāng)催化劑用量小于20μL時(shí)，甲酯化衍生化效率與衍生化試劑用量呈正相關(guān)，說明衍生化反應(yīng)并未完全；當(dāng)催化劑用量大于20μL時(shí)，衍生化效率與衍生化試劑用量達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，選擇該體系的最佳催化劑用量為20μL（如圖2-8）。圖2-8催化劑用量對(duì)脂肪酸甲酯化反應(yīng)的影響結(jié)果表明，以三甲基硅重氮甲烷為衍生化試劑進(jìn)行脂肪酸甲酯的衍生化反應(yīng)，最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為30min，衍生化試劑用量為50μL，催化劑用量為20μL。2.3本章小結(jié)本章采用衍生化結(jié)合GC-MS技術(shù)，研究脂肪酸與三甲基重氮甲烷的甲酯化反應(yīng)，通過系統(tǒng)優(yōu)化反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、衍生化試劑用量以及催化劑用量，成功提高了衍生化效率，最終實(shí)現(xiàn)了脂肪酸的高效甲酯化。該方法反應(yīng)迅速，具有優(yōu)異的分析重現(xiàn)性。上述工作為食用油中脂肪酸的精準(zhǔn)定量打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。第3章食用油中5種脂肪酸的同時(shí)定量分析3.1引言作為三大營養(yǎng)素之一，食用油是日常膳食的重要組成部分，其品質(zhì)安全直接關(guān)系到人類健康安全。在熱加工和貯藏過程中，油脂在氧氣、光照和催化劑作用下，容易發(fā)生氧化水解反應(yīng)，導(dǎo)致游離脂肪酸（FFA）含量顯著提升。游離脂肪酸含量是評(píng)價(jià)油脂氧化程度與新鮮度的關(guān)鍵指標(biāo)（我國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)以酸值表征）。優(yōu)質(zhì)初榨油脂通常具有低FFA特征，而隨著貯藏時(shí)間延長，脂質(zhì)水解加劇導(dǎo)致FFA累積。FFA超標(biāo)不僅反映油脂精煉程度不足，更可能引發(fā)胃腸道功能紊亂、肝損傷等健康風(fēng)險(xiǎn)，這凸顯了酸值監(jiān)控對(duì)食用油質(zhì)量管控的重要性。本研究以三甲基硅重氮甲烷為衍生試劑，將脂肪酸甲酯化，然后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)食用油樣品中的脂肪酸進(jìn)行定量分析3.2材料與方法3.2.1樣品和試劑月桂酸（C12，化學(xué)純）、甲酸（HPLC），國藥化學(xué)試劑有限公司；肉豆蔻酸（C14:0，>99%）、棕櫚酸（C16:0，>97%）、硬脂酸（C18:0，>98%）、二十二酸（C22:0，>99%），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；三甲基硅重氮甲烷（正己烷溶液2mol/L）、三甲基氯硅烷（95%），上海安耐吉化學(xué)試劑有限公司；乙酸甲酯（AR,98%），阿拉丁試劑（上海）有限公司；氫氧化鉀，安徽澤升科技有限公司；去離子水是在室內(nèi)用高純水機(jī)制備的。樣品：8種市售的食用油（Oil1-Oil8），2種地溝油樣品（Oil9-Oil10）。3.2.2樣品制備與衍生化同.2.3實(shí)際樣品的萃取與濃縮取待測(cè)食用油200μL，加入2mL的1mmol/L氫氧化鉀水溶液，渦旋3min后，離心，取下層清液，加入HCl進(jìn)行酸化，調(diào)節(jié)pH值至酸性，加入乙酸甲酯溶劑1mL，渦旋3min后，提取乙酸甲酯萃取液，加入2mol/L的衍生化試劑三甲基硅重氮甲烷50μL和催化劑三甲基氯硅烷20μL，在室溫下磁力攪拌30min，加入20μL終止試劑甲酸，將衍生化產(chǎn)物注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用體系進(jìn)行定量檢測(cè)分析。脂肪酸與三甲基硅重氮甲烷的反應(yīng)方程式如圖3-1所示。圖3-1游離脂肪酸與三甲基硅重氮甲烷的甲酯化反應(yīng)3.2.4儀器條件使用Agilent7890A氣相色譜系統(tǒng)與Agilent5975C單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(Agilent，PaloAlto，CA，USA)聯(lián)用進(jìn)行儀器分析。使用HP-5毛細(xì)管柱(15m長x0.25mm內(nèi)徑0.25um膜厚，AgilentTechnologies)分離目標(biāo)分析物。將樣品等分試樣(1μL)注入進(jìn)樣口，氣相色譜入口溫度設(shè)置為260℃，分流比為20:1。氦氣(99.999%)作為載氣，流速設(shè)置為1.0mL/min。柱溫箱溫度最初設(shè)置為60℃，以30℃/min的速率升至160℃，保持2min，以25℃/min的速率升至200℃，以5℃/min的速率升至220℃，最后以30℃/min的速率升至280℃。為了進(jìn)行監(jiān)測(cè)和確認(rèn)，采用了選擇離子監(jiān)控(SIMm/z：3.5min-6.8min，m/z=171，183；6.8min-8min，m/z=242；8min-9min，m/z=227，270；9min-11min，m/z=255；11min-14.933min，m/z=311，354。)模式，質(zhì)譜條件設(shè)置如下:電子電離(EI)能量為70eV，離子源溫度為230℃，進(jìn)樣口溫度為260℃。使用高純度氦氣(99.998%)為碰撞激活解離氣體，流速設(shè)置為1mL/min。采集時(shí)間范圍為3.5-14.9min。3.3結(jié)果與討論3.3.1方法學(xué)驗(yàn)證取2mol/L的衍生化試劑三甲基硅重氮甲烷50μL和催化劑三甲基氯硅烷20μL，加入1mL混合脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在室溫下磁力攪拌30min，加入20μL終止試劑甲酸，再將其進(jìn)一步用乙酸甲酯溶劑稀釋為5000μg/L、1000μg/L、500μg/L、100μg/L、50μg/L的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)分析，對(duì)食用油中的5種脂肪酸進(jìn)行定性定量分析，采用3.2.4儀器分析條件，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)油脂樣品中脂肪酸的準(zhǔn)確定量分析，將峰面積y與濃度x（μg/L）進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見表3-1.，5種脂肪酸甲酯在50-5000μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.9985~0.9998。表3-15種脂肪酸甲酯的線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)脂肪酸甲酯保留時(shí)間（min）標(biāo)準(zhǔn)曲線R2線性范圍（μg/L）C12:05.517y=1.6487x-39.9190.999850-5000C14:06.887y=0.5649x+15.1050.998650-5000C16:08.148y=1.8317x-78.250.998950-5000C18:09.578y=0.8515x-32.0460.998550-5000C22:013.425y=0.8673x-11.7620.999650-5000從3.2.2脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中選取50μg/L和100μg/L兩個(gè)濃度考察其重現(xiàn)性，不同質(zhì)量濃度的樣品在同一天重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為日內(nèi)重現(xiàn)性;以相同的間隔（一天），每天進(jìn)樣一次樣品，連續(xù)3天，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為日間重現(xiàn)性，結(jié)果見表3-2。日重現(xiàn)性均在10%以下，表明該方法具有良好的精密度。表3-2日內(nèi)重現(xiàn)性與日間重復(fù)性脂肪酸甲酯日內(nèi)重復(fù)性日間重復(fù)性50μg/L100μg/L50μg/L100μg/LC12:05.62%7.30%4.08%7.29%C14:06.59%2.17%1.68%7.48%C16:01.60%2.40%3.37