醫(yī)療機(jī)構(gòu)核酸檢測(cè)操作規(guī)范匯編核酸檢測(cè)作為病原體篩查與診斷的核心技術(shù)，其操作規(guī)范性直接影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性與醫(yī)療安全。為指導(dǎo)醫(yī)療機(jī)構(gòu)規(guī)范開(kāi)展核酸檢測(cè)工作，結(jié)合臨床實(shí)踐與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，特編制本操作規(guī)范匯編。一、檢測(cè)前準(zhǔn)備規(guī)范（一）物資與試劑準(zhǔn)備開(kāi)展核酸檢測(cè)前，需全面核查物資與試劑的有效性、完整性：采樣物資：一次性采樣拭子（獨(dú)立包裝、無(wú)破損）、病毒采樣管（含保存液，確認(rèn)無(wú)滲漏、保存液量達(dá)標(biāo)）、采樣管架、記號(hào)筆等；檢測(cè)試劑：核酸提取試劑（檢查有效期、批號(hào)一致性）、擴(kuò)增試劑（引物、探針、酶等組分無(wú)降解、無(wú)沉淀）；防護(hù)用品：醫(yī)用防護(hù)口罩（N95及以上）、醫(yī)用防護(hù)服、護(hù)目鏡/面屏、一次性醫(yī)用手套（雙層）、鞋套等，確保防護(hù)用品在有效期內(nèi)且無(wú)破損。（二）環(huán)境與設(shè)備準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室分區(qū)：嚴(yán)格劃分清潔區(qū)（試劑準(zhǔn)備）、半污染區(qū)（樣本處理）、污染區(qū)（擴(kuò)增與產(chǎn)物分析），各區(qū)設(shè)置物理隔離，避免交叉污染；設(shè)備校準(zhǔn)：核酸提取儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀需定期校準(zhǔn)（至少每季度1次），校準(zhǔn)記錄存檔；檢測(cè)前檢查設(shè)備運(yùn)行狀態(tài)（如溫度準(zhǔn)確性、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速），確認(rèn)無(wú)故障報(bào)警；環(huán)境消毒：檢測(cè)前30分鐘，用含氯消毒劑（500mg/L）或紫外線（照射≥30分鐘）對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣、工作臺(tái)面消毒；檢測(cè)后再次消毒，確保無(wú)核酸殘留（可采用核酸酶處理或高溫滅活）。二、樣本采集操作規(guī)范（一）咽拭子采集1.被采集者準(zhǔn)備：取坐位或仰臥位，頭部后仰，張口發(fā)“啊”音，充分暴露咽喉部；避免采集前30分鐘飲水、進(jìn)食、吸煙或嚼口香糖。2.采集者操作：手持采樣拭子，快速擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁（每側(cè)至少3次），動(dòng)作輕柔避免嘔吐反射；采樣后立即將拭子頭浸入病毒保存液，折斷拭子桿（或旋緊管蓋），確保拭子頭完全浸沒(méi)，管蓋旋緊無(wú)滲漏。（二）鼻拭子采集1.體位與消毒：被采集者頭部保持中立位，采集者用棉簽蘸取75%乙醇消毒鼻孔（可選步驟，視場(chǎng)景而定）；2.采樣操作：將采樣拭子沿鼻腔下鼻道緩緩插入（成人約2-3cm，兒童酌減），貼鼻腔壁旋轉(zhuǎn)3圈（約10秒），然后以同樣方式采集另一側(cè)鼻腔；采樣后立即將拭子浸入保存液，旋緊管蓋。（三）采集過(guò)程感染控制每采集1人，更換外層手套（或用速干手消毒劑消毒手套），避免交叉污染；采樣臺(tái)配備消毒濕巾，采集后立即擦拭臺(tái)面；疑似/確診病例采樣時(shí)，采集者需加強(qiáng)防護(hù)（如加穿防水圍裙、戴雙層手套），采樣后對(duì)采樣區(qū)域進(jìn)行終末消毒。三、樣本轉(zhuǎn)運(yùn)與接收規(guī)范（一）轉(zhuǎn)運(yùn)包裝要求內(nèi)層包裝：將樣本管放入密封袋（生物安全袋），袋內(nèi)放置吸水紙（防止泄漏），填寫(xiě)樣本信息單（含樣本編號(hào)、采集時(shí)間、受檢者信息、采集者姓名）；中層包裝：密封袋放入帶蓋轉(zhuǎn)運(yùn)箱（或保溫箱），箱內(nèi)放置冰排（維持2-8℃，若需長(zhǎng)期轉(zhuǎn)運(yùn)可采用-20℃冰排）；外層包裝：轉(zhuǎn)運(yùn)箱外貼“生物樣本”標(biāo)識(shí)，注明“感染性物質(zhì)”，并填寫(xiě)轉(zhuǎn)運(yùn)單（含接收單位、聯(lián)系人、電話）。（二）轉(zhuǎn)運(yùn)與接收流程轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)限：常溫下（25℃以下）樣本應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；若無(wú)法及時(shí)送達(dá)，需置于2-8℃保存，保存時(shí)間不超過(guò)24小時(shí)；接收核查：實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)，核對(duì)樣本數(shù)量、信息完整性、包裝密封性；若發(fā)現(xiàn)樣本管泄漏、保存液渾濁或樣本管破裂，立即將污染物品放入生物安全柜，用含氯消毒劑（2000mg/L）消毒，按感染性廢物處理；異常處理：對(duì)信息不全、包裝破損的樣本，聯(lián)系采集點(diǎn)重新采集；對(duì)超過(guò)保存時(shí)限的樣本，評(píng)估后決定是否重新采集。四、核酸提取操作規(guī)范（一）試劑與樣本處理試劑平衡：提取試劑從冰箱取出后，室溫平衡15-30分鐘，避免反復(fù)凍融（提取酶等組分需避光保存）；樣本預(yù)處理：樣本管室溫靜置10分鐘（或4000rpm離心2分鐘），去除氣泡；用移液器吸取樣本時(shí)，避免觸碰管壁（防止污染移液器）。（二）提取過(guò)程操作加樣操作：在生物安全柜內(nèi)操作，移液器槍頭一次性使用，加樣后更換槍頭；將樣本加入提取板（或反應(yīng)管）時(shí)，避免產(chǎn)生氣溶膠（可采用“慢吸慢打”手法）；儀器操作：按提取試劑說(shuō)明書(shū)設(shè)置提取儀參數(shù)（如溫度、時(shí)間、轉(zhuǎn)速），運(yùn)行過(guò)程中不得開(kāi)蓋；提取完成后，立即將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)（或4℃暫存，不超過(guò)2小時(shí)）。五、核酸擴(kuò)增與結(jié)果判讀（一）擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備試劑解凍：擴(kuò)增試劑（含酶、引物、探針）從-20℃取出后，室溫解凍10分鐘，輕輕混勻（避免劇烈振蕩產(chǎn)生氣泡）；反應(yīng)體系配制：在冰上操作，按比例加入酶、引物、探針、水等組分，配制完成后短暫離心（3000rpm，1分鐘），確保試劑集中于管底。（二）擴(kuò)增與結(jié)果分析加樣與擴(kuò)增：將提取的核酸產(chǎn)物加入反應(yīng)體系，每加完1份樣本更換槍頭；PCR儀設(shè)置參數(shù)（如逆轉(zhuǎn)錄溫度、預(yù)變性溫度、循環(huán)數(shù)），擴(kuò)增過(guò)程中嚴(yán)禁開(kāi)蓋；結(jié)果判讀：陽(yáng)性：靶基因Ct值≤35（或按試劑說(shuō)明書(shū)閾值），且擴(kuò)增曲線呈典型S型；陰性：無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct值＞40；無(wú)效：內(nèi)參基因無(wú)擴(kuò)增或曲線異常，需重新檢測(cè)（檢查樣本、試劑或儀器，必要時(shí)重新采樣）。六、質(zhì)量控制管理（一）室內(nèi)質(zhì)量控制質(zhì)控品設(shè)置：每次檢測(cè)需同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性質(zhì)控（濃度接近臨床樣本）、陰性質(zhì)控（無(wú)模板水或陰性樣本），與臨床樣本同批處理；質(zhì)控分析：繪制質(zhì)控圖（如Levey-Jennings圖），監(jiān)控Ct值波動(dòng)；若陽(yáng)性質(zhì)控Ct值偏離均值±3SD或陰性質(zhì)控出現(xiàn)擴(kuò)增，立即停止檢測(cè)，分析原因（如試劑污染、操作失誤），采取糾正措施（更換試劑、重新清潔實(shí)驗(yàn)室）后重新檢測(cè)。（二）室間質(zhì)量評(píng)價(jià)每半年參加省級(jí)及以上衛(wèi)生健康部門(mén)組織的核酸檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)，提交檢測(cè)結(jié)果；對(duì)質(zhì)評(píng)不合格項(xiàng)目，分析原因（如試劑批號(hào)差異、操作不規(guī)范），制定整改方案（如加強(qiáng)人員培訓(xùn)、更換試劑品牌），并驗(yàn)證整改效果。七、廢棄物處理規(guī)范（一）廢棄物分類(lèi)感染性廢物：采樣拭子、含保存液的樣本管、污染的防護(hù)用品、擴(kuò)增后的反應(yīng)管等，放入雙層黃色醫(yī)療垃圾袋，標(biāo)注“核酸檢測(cè)廢物”；其他廢物：未污染的試劑包裝（如外盒）、一次性手套（未接觸樣本）按生活垃圾處理（或醫(yī)療廢物，視機(jī)構(gòu)規(guī)定）。（二）處理流程感染性廢物需經(jīng)高壓滅菌（121℃，30分鐘）或化學(xué)消毒（2000mg/L含氯消毒劑浸泡30分鐘）后，由醫(yī)療廢物集中處置單位轉(zhuǎn)運(yùn)；暫存時(shí)間不超過(guò)48小時(shí)，暫存點(diǎn)需通風(fēng)、防滲漏，遠(yuǎn)離醫(yī)療區(qū)和居民區(qū)。八、人員防護(hù)與培訓(xùn)（一）防護(hù)用品使用采樣人員：穿醫(yī)用防護(hù)服、戴N95口罩、護(hù)目鏡、雙層手套、鞋套，防護(hù)服破損或污染時(shí)立即更換；穿脫流程：穿防護(hù)服前執(zhí)行七步洗手法，脫防護(hù)服時(shí)按“外污染、內(nèi)清潔”原則，依次脫鞋套、外層手套、防護(hù)服、護(hù)目鏡、口罩，每步后消毒手；職業(yè)暴露處理：若樣本濺入眼內(nèi)，立即用生理鹽水沖洗15分鐘；若發(fā)生針刺傷，擠出傷口血液，用碘伏消毒，報(bào)告院感科并就醫(yī)。（二）培訓(xùn)與考核新入職人員需接受核酸檢測(cè)理論培訓(xùn)（含生物安全、操作規(guī)范）和實(shí)操培訓(xùn)（樣本采集、提取、擴(kuò)增），考核合格后方可獨(dú)立上崗；