單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在腫瘤微環(huán)境中的挑戰(zhàn)演講人01技術(shù)層面的挑戰(zhàn)：從樣本制備到數(shù)據(jù)獲取的瓶頸02數(shù)據(jù)分析層面的挑戰(zhàn)：從高維數(shù)據(jù)到生物學(xué)意義的轉(zhuǎn)化03生物學(xué)解釋層面的挑戰(zhàn)：從數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)到機(jī)制認(rèn)知的鴻溝04臨床轉(zhuǎn)化層面的挑戰(zhàn)：從實(shí)驗(yàn)室到病床的距離05總結(jié)與展望：在挑戰(zhàn)中探索腫瘤微空間的奧秘目錄單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在腫瘤微環(huán)境中的挑戰(zhàn)作為腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment,TME）研究的重要工具，單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（SpatialTranscriptomics,ST）技術(shù)通過整合基因表達(dá)與空間位置信息，為我們揭示了TME中細(xì)胞互作、異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)演變的復(fù)雜圖景。然而，隨著其在腫瘤研究中的深入應(yīng)用，一系列技術(shù)、分析、生物學(xué)轉(zhuǎn)化及臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)逐漸浮現(xiàn)。這些挑戰(zhàn)既源于TME本身的復(fù)雜性，也與ST技術(shù)的固有局限性密切相關(guān)。本文將結(jié)合自身在腫瘤微環(huán)境空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，系統(tǒng)剖析單空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在TME研究中面臨的核心挑戰(zhàn)，并探討可能的解決方向，以期為相關(guān)領(lǐng)域的同仁提供參考與啟示。01技術(shù)層面的挑戰(zhàn)：從樣本制備到數(shù)據(jù)獲取的瓶頸技術(shù)層面的挑戰(zhàn)：從樣本制備到數(shù)據(jù)獲取的瓶頸空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的核心優(yōu)勢(shì)在于“空間”，但這一優(yōu)勢(shì)的實(shí)現(xiàn)高度依賴于樣本制備、信號(hào)捕獲和數(shù)據(jù)獲取的技術(shù)可靠性。在腫瘤微環(huán)境研究中，技術(shù)層面的挑戰(zhàn)尤為突出，直接影響后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性和生物學(xué)意義的挖掘。1空間分辨率與細(xì)胞類型異質(zhì)性的矛盾腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類型構(gòu)成，且不同細(xì)胞類型在空間上呈現(xiàn)高度異質(zhì)分布。例如，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（Tumor-InfiltratingLymphocytes,TILs）常與腫瘤細(xì)胞形成“免疫接觸”，而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-AssociatedMacrophages,TAMs）則多聚集在缺氧區(qū)域。當(dāng)前主流ST技術(shù)（如10xGenomicsVisium、Slide-seq）的空間分辨率通常在50-100μm，而單個(gè)細(xì)胞的直徑多在10-20μm，這意味著每個(gè)spot（空間捕獲點(diǎn)）可能包含2-10個(gè)不同細(xì)胞類型，形成“混合信號(hào)”（mixedsignal）。1空間分辨率與細(xì)胞類型異質(zhì)性的矛盾以10xVisium為例，其55μm的分辨率無(wú)法區(qū)分緊密相鄰的腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞，導(dǎo)致基因表達(dá)信號(hào)被“稀釋”。例如，在腫瘤-免疫交界區(qū)域，若一個(gè)spot同時(shí)包含腫瘤細(xì)胞（高表達(dá)EGFR、KRAS）和T細(xì)胞（高表達(dá)CD3E、CD8A），其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將呈現(xiàn)兩種細(xì)胞的特征，難以準(zhǔn)確反映細(xì)胞間的真實(shí)互作狀態(tài)。盡管基于scRNA-seq的去卷積算法（如SPOTlight、RDeconv）可嘗試分離混合信號(hào)，但該過程依賴于參考細(xì)胞圖譜的準(zhǔn)確性，且無(wú)法解決空間鄰近性導(dǎo)致的信號(hào)模糊問題。2樣本制備的復(fù)雜性與RNA降解風(fēng)險(xiǎn)腫瘤組織具有高度異質(zhì)性，部分區(qū)域（如壞死區(qū)、纖維化區(qū)）的RNA質(zhì)量較差，而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)樣本完整性要求極高。理想的ST樣本需滿足：①組織切片厚度均勻（通常為10μm）；②RNA保持完整且無(wú)降解；③組織形態(tài)與空間位置高度匹配。然而，臨床腫瘤樣本（如穿刺活檢、手術(shù)切除標(biāo)本）往往面臨以下問題：-樣本量限制：穿刺活檢樣本量?。ㄖ睆?lt;1mm），難以獲得足夠數(shù)量的組織切片用于ST實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致數(shù)據(jù)捕獲效率低下。-RNA降解：腫瘤組織常因缺血、缺氧導(dǎo)致RNA酶活性升高，尤其在室溫保存或反復(fù)凍融過程中，RNA易降解，影響基因表達(dá)的準(zhǔn)確性。筆者曾在一例肝癌穿刺樣本的ST實(shí)驗(yàn)中，因樣本離體后未及時(shí)冷凍，導(dǎo)致30%的spot檢測(cè)到的RNA分子數(shù)低于100個(gè)，數(shù)據(jù)質(zhì)量嚴(yán)重受損。2樣本制備的復(fù)雜性與RNA降解風(fēng)險(xiǎn)-形態(tài)與空間錯(cuò)配：石蠟包埋組織雖便于長(zhǎng)期保存，但甲醛固定會(huì)導(dǎo)致RNA片段化（平均長(zhǎng)度<200bp），而ST技術(shù)的捕獲探針通常針對(duì)全長(zhǎng)RNA設(shè)計(jì)，降低了檢測(cè)效率；冷凍切片雖能較好保留RNA完整性，但易產(chǎn)生冰晶，破壞組織形態(tài)，影響空間定位的準(zhǔn)確性。3空間信息保真度的技術(shù)偏差ST技術(shù)的原理是通過在載玻片上固定oligo-dT探針捕獲組織切片中釋放的poly-A尾RNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄和測(cè)序獲得基因表達(dá)信息。然而，這一過程可能引入空間定位偏差：01-非特異性結(jié)合：探針可能非特異性結(jié)合非poly-ARNA（如miRNA、rRNA），或捕獲組織切片中游離的RNA（如壞死細(xì)胞釋放的RNA），導(dǎo)致“假陽(yáng)性”空間信號(hào)。02-捕獲效率不均：組織切片厚度不均或探針分布密度差異，會(huì)導(dǎo)致不同區(qū)域的RNA捕獲效率不同。例如，切片較厚的區(qū)域可能因RNA擴(kuò)散而擴(kuò)大捕獲范圍，模糊真實(shí)的空間邊界。033空間信息保真度的技術(shù)偏差-組織皺縮與位移：切片過程中的機(jī)械力可能導(dǎo)致組織皺縮或位移，使最終的空間坐標(biāo)與原始解剖位置存在偏差。筆者在處理食管癌組織切片時(shí)曾觀察到，部分區(qū)域因皺縮導(dǎo)致spot間距從55μm壓縮至40μm，嚴(yán)重影響空間鄰域分析的可靠性。02數(shù)據(jù)分析層面的挑戰(zhàn)：從高維數(shù)據(jù)到生物學(xué)意義的轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)分析層面的挑戰(zhàn)：從高維數(shù)據(jù)到生物學(xué)意義的轉(zhuǎn)化空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是高維（基因維度）、稀疏（大部分spot基因表達(dá)為0）且具有空間結(jié)構(gòu)的，其數(shù)據(jù)分析面臨“維度災(zāi)難”“稀疏性”“異質(zhì)性”等多重挑戰(zhàn)。如何從海量數(shù)據(jù)中提取有意義的生物學(xué)信息，是當(dāng)前TME研究的核心難題。1數(shù)據(jù)稀疏性與背景噪聲的干擾ST數(shù)據(jù)的稀疏性體現(xiàn)在兩個(gè)方面：①基因表達(dá)稀疏：每個(gè)spot僅能捕獲數(shù)百至數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)，而人類基因組約有2萬(wàn)個(gè)編碼基因，大部分基因在單個(gè)spot中未被檢測(cè)到；②細(xì)胞類型稀疏：稀有細(xì)胞亞群（如樹突狀細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞）在TME中占比低，其表達(dá)信號(hào)易被高豐度細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞）掩蓋。例如，在一例乳腺癌ST數(shù)據(jù)中，CD1C（樹突狀細(xì)胞標(biāo)志物）僅在3%的spot中檢測(cè)到表達(dá)，且表達(dá)量顯著低于腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物EPCAM。如何區(qū)分“低豐度基因的真實(shí)表達(dá)”與“背景噪聲”（如測(cè)序錯(cuò)誤、捕獲效率波動(dòng)）是數(shù)據(jù)預(yù)處理的關(guān)鍵。現(xiàn)有方法多基于閾值過濾（如表達(dá)量>1TPM）或統(tǒng)計(jì)模型（如MAGIC算法進(jìn)行數(shù)據(jù)插補(bǔ)），但過度插補(bǔ)可能引入“假陽(yáng)性”，而嚴(yán)格過濾則可能導(dǎo)致稀有信號(hào)丟失。2空間異質(zhì)性建模的復(fù)雜性腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性不僅體現(xiàn)在細(xì)胞類型組成上，更體現(xiàn)在細(xì)胞狀態(tài)的空間梯度變化。例如，腫瘤中心區(qū)域常呈缺氧狀態(tài)（表達(dá)HIF1A、VEGF），而浸潤(rùn)前沿則高表達(dá)免疫激活相關(guān)基因（如IFNG、GZMB）。如何準(zhǔn)確刻畫這種空間異質(zhì)性，需要發(fā)展能同時(shí)整合表達(dá)數(shù)據(jù)和空間坐標(biāo)的分析方法。-空間聚類算法的選擇：傳統(tǒng)聚類算法（如Seurat的Louvain算法）僅基于基因表達(dá)相似性，忽略了空間鄰近性，可能導(dǎo)致聚類結(jié)果與實(shí)際解剖結(jié)構(gòu)不符。例如，在腫瘤邊緣，腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞在表達(dá)上可能差異較大，但空間上緊密相鄰，傳統(tǒng)算法可能將其分為不同聚類，而空間聚類算法（如BayesSpace、SpaGCN）則通過引入空間鄰近先驗(yàn)，能識(shí)別出具有空間連續(xù)性的細(xì)胞亞群。2空間異質(zhì)性建模的復(fù)雜性-空間軌跡推斷的局限性：細(xì)胞軌跡分析（如Monocle3、PAGA）可模擬細(xì)胞分化或狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程，但ST數(shù)據(jù)缺乏單細(xì)胞分辨率，難以準(zhǔn)確推斷單個(gè)細(xì)胞的軌跡。例如，在腫瘤演進(jìn)過程中，腫瘤細(xì)胞從上皮狀態(tài)向間質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變（EMT），ST數(shù)據(jù)僅能觀察到區(qū)域間基因表達(dá)的空間梯度，而無(wú)法確定單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變路徑。-空間異質(zhì)性的定量評(píng)估：目前缺乏統(tǒng)一的指標(biāo)來(lái)量化TME的空間異質(zhì)性。研究多通過“基因表達(dá)變異系數(shù)”“空間自相關(guān)指數(shù)”（如Moran'sI）等參數(shù)描述局部異質(zhì)性，但難以反映全局異質(zhì)性的結(jié)構(gòu)特征。例如，腫瘤微環(huán)境可能呈現(xiàn)“免疫排斥區(qū)”“免疫浸潤(rùn)區(qū)”“免疫豁免區(qū)”等多結(jié)構(gòu)共存，如何用數(shù)學(xué)模型刻畫這種復(fù)雜結(jié)構(gòu)仍是未解難題。3多模態(tài)數(shù)據(jù)整合的技術(shù)壁壘ST技術(shù)常與其他組學(xué)技術(shù)（如scRNA-seq、空間蛋白質(zhì)組學(xué)、成像質(zhì)譜流式）聯(lián)合應(yīng)用，以全面解析TME。然而，多模態(tài)數(shù)據(jù)的整合面臨“維度不匹配”“批次效應(yīng)”“數(shù)據(jù)類型差異”等挑戰(zhàn)。-scRNA-seq與ST數(shù)據(jù)的整合：scRNA-seq可提供高精度的細(xì)胞類型注釋，但缺乏空間信息；ST具有空間信息但細(xì)胞類型分辨率低?，F(xiàn)有方法（如Seurat的Integration、SPOTlight）通過將ST數(shù)據(jù)投影到scRNA-seq的細(xì)胞類型空間中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型注釋，但該過程依賴于scRNA-seq樣本與ST樣本的細(xì)胞組成相似性。例如，若ST樣本中含有scRNA-seq未覆蓋的罕見細(xì)胞亞群，則可能導(dǎo)致注釋偏差。3多模態(tài)數(shù)據(jù)整合的技術(shù)壁壘-空間蛋白質(zhì)組學(xué)與ST數(shù)據(jù)的整合：空間蛋白質(zhì)組學(xué)（如CODEX、IMC）可檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)及定位，但其檢測(cè)通量（通常<50種蛋白質(zhì)）遠(yuǎn)低于ST（數(shù)千種基因），如何將低維蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)與高維基因數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，需要構(gòu)建“基因-蛋白質(zhì)”表達(dá)模型。例如，通過整合ST的CD8A基因表達(dá)與IMC的CD8蛋白質(zhì)表達(dá)，可驗(yàn)證T細(xì)胞的空間分布，但兩者在檢測(cè)靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍上的差異可能導(dǎo)致關(guān)聯(lián)不一致。-多批次數(shù)據(jù)的批次效應(yīng)校正：不同實(shí)驗(yàn)室、不同平臺(tái)的ST數(shù)據(jù)存在批次效應(yīng)（如10xVisium與Slide-seq的捕獲效率差異），直接聯(lián)合分析會(huì)導(dǎo)致空間定位偏差。現(xiàn)有批次校正方法（如Harmony、BBKNN）多基于基因表達(dá)相似性，但可能破壞空間結(jié)構(gòu)的真實(shí)性。例如，校正后的數(shù)據(jù)可能將不同樣本的“腫瘤核心區(qū)”聚類在一起，而忽略了樣本間的空間異質(zhì)性。03生物學(xué)解釋層面的挑戰(zhàn)：從數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)到機(jī)制認(rèn)知的鴻溝生物學(xué)解釋層面的挑戰(zhàn)：從數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)到機(jī)制認(rèn)知的鴻溝空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠提供“哪里表達(dá)了什么基因”的答案，但要回答“為什么在這里表達(dá)”“基因表達(dá)如何驅(qū)動(dòng)生物學(xué)功能”等機(jī)制性問題，仍面臨巨大挑戰(zhàn)。生物學(xué)解釋的局限性，使得ST數(shù)據(jù)在TME機(jī)制研究中的應(yīng)用尚未完全釋放潛力。1細(xì)胞類型注釋的不確定性細(xì)胞類型注釋是ST數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)，但TME中細(xì)胞類型的復(fù)雜性（如免疫細(xì)胞亞群的高度可塑性、腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性）導(dǎo)致注釋準(zhǔn)確性受限。-免疫細(xì)胞亞群的區(qū)分：TAMs可分為M1型（抗腫瘤）和M2型（促腫瘤），其標(biāo)志物（如CD68、CD163）存在重疊，僅靠基因表達(dá)難以精確區(qū)分。例如，在一例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤ST數(shù)據(jù)中，CD163+的TAMs同時(shí)表達(dá)M1標(biāo)志物（iNOS）和M2標(biāo)志物（ARG1），提示其處于“混合極化狀態(tài)”，而傳統(tǒng)注釋方法可能將其簡(jiǎn)單歸為M2型，掩蓋了功能的復(fù)雜性。-腫瘤細(xì)胞亞異質(zhì)性：腫瘤細(xì)胞存在克隆異質(zhì)性，不同亞克隆的空間分布可能影響治療響應(yīng)。例如，EGFR突變亞克隆可能聚集在腫瘤中心，而PD-L1高表達(dá)亞克隆則位于浸潤(rùn)前沿，但ST技術(shù)無(wú)法檢測(cè)單核苷酸變異（SNV），需結(jié)合空間DNA測(cè)序（如VisiumHD）才能實(shí)現(xiàn)克隆空間定位，目前此類技術(shù)仍處于早期階段。1細(xì)胞類型注釋的不確定性-基質(zhì)細(xì)胞的表型可塑性：癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）可分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，但其亞型（如myCAFs、apCAFs）的標(biāo)志物（如α-SMA、FAP）表達(dá)具有動(dòng)態(tài)性，ST數(shù)據(jù)僅能提供“時(shí)間快照”，無(wú)法反映CAF的表型轉(zhuǎn)變過程。2細(xì)胞間互作解析的間接性腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間互作是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，包括“接觸依賴性互作”（如T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的PD-1/PD-L1結(jié)合）和“非接觸依賴性互作”（如巨噬細(xì)胞分泌的IL-10抑制T細(xì)胞活性）。ST技術(shù)可通過“空間鄰近性”推斷細(xì)胞間互作，但這種方法存在“相關(guān)性不等于因果性”的局限。-空間鄰近性的誤導(dǎo)：兩個(gè)細(xì)胞類型在空間上鄰近，不一定存在直接互作。例如，腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞鄰近，可能是血管生成的結(jié)果，而非直接互作；而T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的互作可能通過“遠(yuǎn)距離分泌因子”實(shí)現(xiàn)，無(wú)需空間鄰近。現(xiàn)有細(xì)胞間互作預(yù)測(cè)工具（如CellPhoneDB、NicheNet）多基于基因共表達(dá)和空間鄰近性，但缺乏對(duì)互作機(jī)制（如受體-配體結(jié)合的直接證據(jù)）的驗(yàn)證。2細(xì)胞間互作解析的間接性-動(dòng)態(tài)互作的靜態(tài)捕捉：ST數(shù)據(jù)通常是時(shí)間點(diǎn)切片，無(wú)法捕捉細(xì)胞間互作的動(dòng)態(tài)過程。例如，T細(xì)胞從血液遷移至腫瘤區(qū)域的過程涉及趨化因子（如CXCL9/10）的梯度引導(dǎo)，而ST僅能反映“遷移后”的空間分布，無(wú)法解析遷移過程中的動(dòng)態(tài)互作網(wǎng)絡(luò)。-微環(huán)境信號(hào)的復(fù)雜性：細(xì)胞間互作不僅涉及細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸，還受細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、代謝產(chǎn)物（如乳酸）的影響。例如，腫瘤細(xì)胞分泌的乳酸可抑制T細(xì)胞功能，但ST技術(shù)無(wú)法直接檢測(cè)ECM成分或代謝產(chǎn)物的空間分布，需結(jié)合空間代謝組學(xué)（如MALDI-MSI）才能全面解析微環(huán)境信號(hào)。3空間轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的解析困境基因表達(dá)的空間差異源于轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的時(shí)空特異性，而ST技術(shù)難以直接解析調(diào)控因子（如轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳修飾）與靶基因的空間關(guān)聯(lián)。-轉(zhuǎn)錄因體的空間活性推斷：轉(zhuǎn)錄因子（TF）的活性通常通過其靶基因表達(dá)推斷，但TF本身可能不表達(dá)（如通過蛋白磷酸化激活），或靶基因在其他細(xì)胞類型中表達(dá)，導(dǎo)致推斷偏差。例如，在腫瘤缺氧區(qū)域，HIF1A的靶基因（如VEGFA）可能在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而非腫瘤細(xì)胞中，單純基于VEGFA的空間分布無(wú)法準(zhǔn)確推斷HIF1A在腫瘤細(xì)胞中的活性。-表觀遺傳修飾的空間缺失：基因表達(dá)受染色質(zhì)可及性、DNA甲基化等表觀遺傳調(diào)控，但ST技術(shù)僅檢測(cè)RNA表達(dá)，無(wú)法直接獲取表觀遺傳信息。整合ATAC-seq（染色質(zhì)可及性）與ST數(shù)據(jù)可間接推斷調(diào)控關(guān)系，但ATAC-seq通常需要大量細(xì)胞（>5000個(gè)），而ST樣本的細(xì)胞量有限，難以匹配空間分辨率。3空間轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的解析困境-非編碼RNA的空間功能：長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）和miRNA可通過調(diào)控基因表達(dá)參與TME重塑，但其在空間上的表達(dá)模式及功能尚不明確。例如，lncRNAMALAT1高表達(dá)于腫瘤轉(zhuǎn)移前沿，可通過調(diào)控E-cadherin促進(jìn)EMT，但ST技術(shù)難以檢測(cè)低豐度非編碼RNA，限制了對(duì)其空間功能的解析。04臨床轉(zhuǎn)化層面的挑戰(zhàn)：從實(shí)驗(yàn)室到病床的距離臨床轉(zhuǎn)化層面的挑戰(zhàn)：從實(shí)驗(yàn)室到病床的距離空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在腫瘤微環(huán)境研究中展現(xiàn)出巨大潛力，但其臨床轉(zhuǎn)化仍面臨樣本標(biāo)準(zhǔn)化、生物標(biāo)志物驗(yàn)證、成本效益等現(xiàn)實(shí)挑戰(zhàn)，限制了其在精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用。1樣本標(biāo)準(zhǔn)化與可重復(fù)性問題臨床腫瘤樣本具有高度異質(zhì)性（如不同腫瘤類型、不同分期、不同治療史），而ST技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程（樣本采集、切片、捕獲、測(cè)序）和數(shù)據(jù)分析流程（預(yù)處理、聚類、注釋）缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致不同研究間的結(jié)果難以比較。-樣本采集的差異：手術(shù)切除樣本與穿刺活檢樣本的取材部位、處理時(shí)間不同，可能影響ST數(shù)據(jù)質(zhì)量。例如，手術(shù)樣本的“邊緣區(qū)域”可能因術(shù)中擠壓導(dǎo)致RNA降解，而穿刺樣本因量小，可能無(wú)法覆蓋腫瘤的異質(zhì)性區(qū)域。-實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的批次效應(yīng)：不同ST平臺(tái)（10xVisium、Slide-seq、MERFISH）的原理和技術(shù)參數(shù)不同，導(dǎo)致數(shù)據(jù)存在平臺(tái)特異性。例如，Slide-seq的分辨率（10μm）高于10xVisium（55μm），能更好區(qū)分細(xì)胞類型，但檢測(cè)通量較低，難以覆蓋全基因組。1樣本標(biāo)準(zhǔn)化與可重復(fù)性問題-分析流程的主觀性：數(shù)據(jù)分析中的參數(shù)選擇（如基因表達(dá)閾值、聚類分辨率）會(huì)顯著影響結(jié)果。例如，同一ST數(shù)據(jù)，使用不同的數(shù)據(jù)插補(bǔ)方法（MAGICvsSAVER）可能導(dǎo)致識(shí)別的“免疫浸潤(rùn)熱點(diǎn)”區(qū)域存在30%的差異，這種主觀性限制了結(jié)果的可靠性。2生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證困境ST技術(shù)可發(fā)現(xiàn)與腫瘤預(yù)后、治療響應(yīng)相關(guān)的空間特征（如“免疫排斥邊界”“血管生成熱點(diǎn)”），但這些特征需經(jīng)過大規(guī)模臨床樣本驗(yàn)證才能成為生物標(biāo)志物。然而，當(dāng)前ST研究多局限于小樣本回顧性分析，存在以下問題：-樣本量不足：ST實(shí)驗(yàn)成本較高（單樣本約5000-10000美元），多數(shù)研究的樣本量<50例，難以統(tǒng)計(jì)效力。例如，在一例黑色素瘤研究中，僅20例樣本的ST數(shù)據(jù)顯示“T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的空間距離”與預(yù)后相關(guān)，但該結(jié)果需在>200例樣本中驗(yàn)證才能具有臨床意義。-缺乏前瞻性隊(duì)列驗(yàn)證：現(xiàn)有ST生物標(biāo)志物多基于回顧性樣本分析，而前瞻性隊(duì)列（如治療前后樣本的ST分析）能更準(zhǔn)確反映空間特征與治療響應(yīng)的因果關(guān)系。例如，PD-1抑制劑治療后，T細(xì)胞的空間分布可能從“浸潤(rùn)前沿”向“腫瘤核心”遷移，這種動(dòng)態(tài)變化需通過前瞻性ST隊(duì)列才能捕捉。2生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證困境-多中心數(shù)據(jù)整合的難度：不同醫(yī)療中心的樣本處理、實(shí)驗(yàn)流程存在差異，整合多中心ST數(shù)據(jù)需解決批次效應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)化問題。例如，TCGA（癌癥基因組圖譜）計(jì)劃整合多中心ST數(shù)據(jù)，但截至目前，僅少數(shù)腫瘤類型（如乳腺癌、肺癌）發(fā)布了初步結(jié)果，且數(shù)據(jù)質(zhì)量參差不齊。3技術(shù)成本與可及性的限制空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的成本較高，包括設(shè)備投入（如測(cè)序儀、顯微成像系統(tǒng)）、試劑費(fèi)用（ST試劑盒、抗體）和生物信息學(xué)分析成本，這使得其在基層醫(yī)院和資源有限的研究中心難以推廣。-設(shè)備與試劑成本：10xVisium系統(tǒng)需要配套的10xGenomicsX儀器，單次運(yùn)行成本約3000美元；Slide-seq需要定制oligo-dN珠，制備過程復(fù)雜；MERFISH需要設(shè)計(jì)數(shù)百種熒光探針，成本高達(dá)數(shù)萬(wàn)美元。這些高成本限制了ST技術(shù)的普及。-生物信息學(xué)分析門檻：ST數(shù)據(jù)分析需要專業(yè)的編程技能（如Python、R）和組學(xué)知識(shí)，而多數(shù)臨床醫(yī)生缺乏相關(guān)培訓(xùn)，導(dǎo)致“數(shù)據(jù)產(chǎn)生-分析