巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白免疫保護效果及機制探究一、引言1.1研究背景與意義雞球蟲病是由艾美耳球蟲屬的多種球蟲寄生于雞腸道內所引起的一種寄生蟲病，是對養(yǎng)雞業(yè)危害最為嚴重的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計，全球家禽業(yè)每年因球蟲病造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)十億美元，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了沉重的打擊。球蟲的種類繁多，能感染雞的艾美耳球蟲主要有7種，分別是柔嫩艾美耳球蟲（Eimeriatenella）、堆型艾美耳球蟲（Eimeriaacervulina）、毒害艾美耳球蟲（Eimerianecatrix）、巨型艾美耳球蟲（Eimeriamaxima）、和緩艾美耳球蟲（Eimeriamitis）、布氏艾美耳球蟲（Eimeriabrunetti）和早熟艾美耳球蟲（Eimeriapraecox），它們在雞的腸道內寄生部位各異，致病力也有所不同。巨型艾美耳球蟲是雞球蟲中較為常見且危害較大的一種。它主要寄生于雞的小腸中段，感染后會導致小腸黏膜出現(xiàn)嚴重的病變，腸壁增厚、出血，腸道消化和吸收功能受到嚴重影響。病雞表現(xiàn)為精神萎靡、食欲不振、腹瀉、便血等癥狀，生長發(fā)育受阻，飼料轉化率降低，嚴重時可導致雞只死亡，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前，雞球蟲病的防控主要依賴于藥物防治和疫苗免疫。然而，長期大量使用抗球蟲藥物，使得球蟲對多種藥物產(chǎn)生了耐藥性，導致藥物防治效果逐漸下降。同時，藥物殘留問題也日益凸顯，嚴重影響了雞肉和雞蛋的品質安全，威脅著人類健康。傳統(tǒng)的活疫苗雖然具有一定的免疫效果，但存在制作過程復雜、需要低溫保存、保存期短以及使用不當易導致免疫失敗等缺點，限制了其在養(yǎng)雞業(yè)中的廣泛應用。隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發(fā)展，基因工程疫苗成為了雞球蟲病防控研究的熱點。重組配子體蛋白疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，具有安全性高、免疫原性強、易于制備和保存等優(yōu)點，為雞球蟲病的防治提供了新的思路和方法。研究巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白的免疫保護效果，對于開發(fā)高效、安全的雞球蟲病新型疫苗具有重要的理論意義和實際應用價值。一方面，深入了解重組配子體蛋白激發(fā)機體免疫應答的機制，能夠為疫苗的設計和優(yōu)化提供堅實的理論基礎，有助于提升疫苗的免疫效果；另一方面，研發(fā)出有效的重組配子體蛋白疫苗，能夠在養(yǎng)雞生產(chǎn)中廣泛應用，顯著降低雞球蟲病的發(fā)生率和危害程度，提高養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟效益和社會效益，保障雞肉和雞蛋的質量安全，促進養(yǎng)雞業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。1.2國內外研究現(xiàn)狀在國外，雞球蟲病的研究起步較早，對巨型艾美耳球蟲的生物學特性、致病機制等方面已經(jīng)有了較為深入的了解。學者們發(fā)現(xiàn)巨型艾美耳球蟲的生活史包括無性生殖和有性生殖兩個階段，在雞體內的發(fā)育過程會對腸道組織造成嚴重的損傷，影響腸道的正常功能。關于球蟲病的防控，早期主要依賴化學藥物，如磺胺類、呋喃類等藥物被廣泛應用。但隨著時間的推移，球蟲對這些藥物的耐藥性問題逐漸凸顯。于是，疫苗的研究成為了重點方向，活疫苗在一定程度上解決了藥物耐藥性的問題，但存在的缺陷也限制了其廣泛應用。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，國外對重組配子體蛋白疫苗的研究取得了不少成果。有研究通過基因工程技術表達了巨型艾美耳球蟲的配子體蛋白，并對其免疫原性進行了評估，發(fā)現(xiàn)該重組蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生一定的免疫應答，為重組配子體蛋白疫苗的開發(fā)奠定了基礎。國內對于雞球蟲病的研究也在不斷深入。在巨型艾美耳球蟲的研究方面，國內學者對其在國內的流行情況、感染特點等進行了大量的調查和分析，明確了其在不同地區(qū)養(yǎng)雞場的感染率和分布情況。在防治手段上，早期同樣以藥物防治為主，隨著對食品安全和藥物殘留問題的重視，國內也加大了對疫苗的研究力度。對于重組配子體蛋白疫苗，國內眾多科研團隊開展了相關研究，通過優(yōu)化基因表達系統(tǒng)、改進蛋白純化方法等手段，提高重組配子體蛋白的表達量和純度，并對其免疫保護效果進行了多方面的評價。例如，有研究將重組配子體蛋白與不同的佐劑聯(lián)合使用，觀察其對免疫效果的影響，發(fā)現(xiàn)合適的佐劑能夠顯著增強重組蛋白的免疫原性，提高免疫保護效果。盡管國內外在巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白的研究上取得了一定的進展，但仍存在一些不足之處。一方面，目前對于重組配子體蛋白激發(fā)機體免疫應答的詳細機制尚未完全明確，這限制了疫苗的進一步優(yōu)化和改進。不同的免疫途徑、免疫劑量以及佐劑的選擇等因素對免疫效果的影響還需要深入研究，以確定最佳的免疫方案。另一方面，現(xiàn)有的研究大多集中在實驗室階段，在實際生產(chǎn)中的應用還存在一定的差距。重組配子體蛋白疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)工藝、穩(wěn)定性、保存條件以及成本效益等問題都需要進一步解決，以實現(xiàn)其在養(yǎng)雞業(yè)中的廣泛應用。1.3研究目的與內容本研究旨在深入探究巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白的免疫保護效果，為開發(fā)高效、安全的雞球蟲病新型疫苗提供關鍵的理論依據(jù)和實踐指導。具體研究目標如下：首先，明確巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白單獨免疫以及不同組合聯(lián)合免疫時，對雞體產(chǎn)生的免疫保護效果，包括免疫后雞體對球蟲感染的抵抗力、臨床癥狀的改善情況等。其次，篩選出針對巨型艾美耳球蟲的最佳免疫組合，即確定哪種重組配子體蛋白或蛋白組合能夠激發(fā)雞體產(chǎn)生最為有效的免疫應答，提供最強的免疫保護。再者，研究不同佐劑與重組配子體蛋白聯(lián)合使用時對免疫效果的影響，篩選出能夠顯著增強重組配子體蛋白免疫原性的最佳佐劑，以提高疫苗的免疫效果。為實現(xiàn)上述研究目標，本研究將開展以下內容的研究：一是進行巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白的制備，利用基因工程技術，克隆、表達和純化巨型艾美耳球蟲的重組配子體蛋白，為后續(xù)的免疫試驗提供充足的蛋白材料。二是設計并實施免疫試驗，將制備好的重組配子體蛋白以不同的組合方式和免疫劑量免疫雞只，同時設置相應的對照組，包括未免疫攻蟲組和空白對照組。三是進行攻蟲試驗，在免疫雞只達到一定時間后，用巨型艾美耳球蟲對其進行攻蟲，觀察雞只的發(fā)病情況、臨床表現(xiàn)，如精神狀態(tài)、采食情況、腹瀉和便血等癥狀。四是檢測免疫指標，通過檢測雞只的存活率、排出血便數(shù)、平均增重、相對增重率、病變記分、卵囊減少率、抗球蟲指數(shù)（ACI）和血清特異性抗體水平等指標，綜合評價重組配子體蛋白的免疫保護效果。五是佐劑篩選試驗，將不同的佐劑與重組配子體蛋白聯(lián)合使用，重復上述免疫試驗和攻蟲試驗，比較不同佐劑對免疫效果的影響，篩選出最佳佐劑。1.4研究方法與技術路線本研究綜合運用多種先進的科學方法，從基因層面到動物實驗，逐步深入探究巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白的免疫保護效果。在基因克隆與蛋白表達純化方面，首先從巨型艾美耳球蟲中精準提取總RNA，通過反轉錄巧妙地獲得cDNA。接著，運用聚合酶鏈式反應（PCR）技術，以cDNA為模板，根據(jù)目的基因的特定序列設計引物，擴增出所需的重組配子體蛋白基因片段。將擴增得到的基因片段與合適的表達載體進行連接，構建出重組表達質粒。隨后，把重組表達質粒轉化至大腸桿菌等合適的表達宿主中，通過優(yōu)化誘導表達條件，如誘導劑濃度、誘導時間和溫度等，實現(xiàn)重組配子體蛋白的高效表達。表達后的蛋白經(jīng)過一系列純化步驟，如親和層析、離子交換層析等，去除雜質，獲得高純度的重組配子體蛋白，為后續(xù)實驗提供優(yōu)質的蛋白材料。動物免疫試驗是本研究的關鍵環(huán)節(jié)。選用健康、體重相近的雛雞作為實驗動物，將其隨機分為多個組，包括不同重組配子體蛋白免疫組、聯(lián)合免疫組、佐劑與重組配子體蛋白聯(lián)合免疫組、未免疫攻蟲組和空白對照組。在免疫過程中，嚴格按照既定的免疫程序進行操作，確定合適的免疫劑量和免疫途徑。例如，采用肌肉注射、皮下注射或口服等方式將重組配子體蛋白或其與佐劑的混合物接種到雛雞體內。在規(guī)定的時間間隔后，對雛雞進行加強免疫，以增強免疫效果。攻蟲試驗在免疫后的特定時間進行。用含有一定數(shù)量巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊的懸液對免疫組和未免疫攻蟲組的雛雞進行攻蟲感染。攻蟲后，密切觀察雛雞的發(fā)病情況，詳細記錄每只雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、是否出現(xiàn)腹瀉、便血等臨床癥狀，以及發(fā)病的時間和嚴重程度。檢測分析環(huán)節(jié)運用多種檢測技術，全面評估重組配子體蛋白的免疫保護效果。每天仔細記錄雛雞的存活情況，統(tǒng)計存活率。通過觀察和計數(shù)雛雞排出的血便堆數(shù)，了解腸道出血情況。定期稱量雛雞的體重，計算平均增重和相對增重率，評估生長發(fā)育受影響程度。在攻蟲后的特定時間，對雛雞進行解剖，觀察腸道病變情況，按照標準的病變記分方法對腸道病變進行評分，量化病變程度。收集雛雞的糞便，采用飽和鹽水漂浮法等方法檢測糞便中的卵囊數(shù)量，計算卵囊減少率，反映免疫對球蟲繁殖的抑制作用。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等方法檢測血清中特異性抗體水平，了解體液免疫應答情況。本研究的技術路線以基因克隆和蛋白表達純化為起點，獲得重組配子體蛋白。然后，通過動物免疫試驗和攻蟲試驗，模擬實際感染情況。最后，利用多種檢測分析方法，從不同角度綜合評價重組配子體蛋白的免疫保護效果，為雞球蟲病新型疫苗的開發(fā)提供全面、可靠的依據(jù)，具體技術路線如圖1所示。[此處插入技術路線圖，圖中詳細展示從基因克隆開始，到蛋白表達純化、動物分組免疫、攻蟲試驗以及各項指標檢測分析的整個流程，各步驟之間用箭頭清晰連接，并標注關鍵操作和參數(shù)。例如，基因克隆部分標注提取RNA、反轉錄、PCR擴增的主要試劑和條件；蛋白表達純化部分標注表達宿主、誘導劑及純化方法；動物分組免疫部分列出各組別及免疫方式、劑量；攻蟲試驗標注攻蟲時間、卵囊劑量；檢測分析部分標注各項指標的檢測時間和方法。][此處插入技術路線圖，圖中詳細展示從基因克隆開始，到蛋白表達純化、動物分組免疫、攻蟲試驗以及各項指標檢測分析的整個流程，各步驟之間用箭頭清晰連接，并標注關鍵操作和參數(shù)。例如，基因克隆部分標注提取RNA、反轉錄、PCR擴增的主要試劑和條件；蛋白表達純化部分標注表達宿主、誘導劑及純化方法；動物分組免疫部分列出各組別及免疫方式、劑量；攻蟲試驗標注攻蟲時間、卵囊劑量；檢測分析部分標注各項指標的檢測時間和方法。]二、巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白的制備2.1相關基因的獲取與分析本研究選用實驗室保存的具有代表性的巨型艾美耳球蟲蟲株作為研究對象。從感染巨型艾美耳球蟲的雞腸道組織中，小心地收集球蟲，確保收集過程中盡量減少雜質的混入。采用Trizol試劑法提取球蟲的總RNA，該方法利用Trizol試劑能夠迅速裂解細胞并抑制RNA酶活性的特性，有效地從復雜的生物樣品中提取高質量的RNA。在提取過程中，嚴格按照試劑說明書的操作步驟進行，從勻漿處理到多次離心分離，每一步都確保操作的準確性和規(guī)范性，以保證獲得純度高、完整性好的總RNA。隨后，利用反轉錄試劑盒將提取的總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄過程中選用的試劑盒具有高效的反轉錄酶，能夠以RNA為模板準確地合成互補的cDNA鏈。通過優(yōu)化反轉錄反應條件，如反應溫度、時間以及引物的選擇等，確保反轉錄反應的高效進行，獲得足量的cDNA用于后續(xù)的基因擴增。根據(jù)GenBank中已公布的巨型艾美耳球蟲配子體蛋白基因序列，運用專業(yè)的引物設計軟件，如PrimerPremier5.0，精心設計特異性引物。在設計引物時，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值以及引物之間是否存在二聚體等因素，以確保引物能夠特異性地擴增目的基因。引物設計完成后，通過NCBI的BLAST工具進行比對分析，進一步驗證引物的特異性，避免引物與其他非目的基因序列發(fā)生非特異性結合。以反轉錄得到的cDNA為模板，使用高保真的DNA聚合酶進行PCR擴增。PCR反應體系經(jīng)過多次優(yōu)化，確定了各成分的最佳濃度，包括模板cDNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶以及緩沖液等。反應條件也經(jīng)過反復摸索，確定了合適的變性溫度、退火溫度和延伸時間，以保證擴增反應的特異性和高效性。例如，變性溫度設置為95℃，使DNA雙鏈充分解鏈；退火溫度根據(jù)引物的Tm值進行調整，一般在55-60℃之間，確保引物能夠與模板特異性結合；延伸時間則根據(jù)目的基因的長度進行設定，保證DNA聚合酶能夠沿著模板準確地合成新的DNA鏈。PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將擴增產(chǎn)物與DNAMarker一起上樣到含有核酸染料的瓊脂糖凝膠中，在合適的電壓下進行電泳分離。在電泳過程中，DNA分子在電場的作用下向正極移動，根據(jù)其分子量的大小在凝膠中形成不同的條帶。通過觀察凝膠上條帶的位置和亮度，與DNAMarker進行對比，判斷擴增產(chǎn)物的大小和純度。如果擴增產(chǎn)物條帶清晰、單一，且大小與預期相符，則說明擴增成功；若出現(xiàn)多條非特異性條帶，則需要進一步優(yōu)化PCR反應條件，如調整引物濃度、改變退火溫度等，或者重新設計引物。將擴增得到的目的基因片段連接到pMD18-T載體上，構建重組克隆質粒。連接反應使用高效的DNA連接酶，在合適的溫度和時間條件下，將目的基因片段與載體進行連接。連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，通過熱激法使感受態(tài)細胞吸收重組質粒。將轉化后的細胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，使轉化成功的細胞形成單菌落。利用藍白斑篩選法初步篩選陽性克隆，白色菌落表示含有重組質粒，而藍色菌落則表示載體自身環(huán)化。對篩選出的白色菌落進行PCR鑒定和酶切鑒定，進一步驗證重組質粒的正確性。PCR鑒定使用與擴增目的基因相同的引物，對菌落進行擴增，若能擴增出與目的基因大小一致的條帶，則說明該菌落含有重組質粒；酶切鑒定則使用特定的限制性內切酶對重組質粒進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物的條帶大小，與預期的酶切圖譜進行對比，進一步確認重組質粒的構建是否正確。將鑒定正確的重組克隆質粒送往專業(yè)的測序公司進行測序。測序結果通過DNAStar、DNAMAN等生物信息學軟件與GenBank中已有的巨型艾美耳球蟲配子體蛋白基因序列進行比對分析，以確定所克隆的基因序列的準確性和同源性。同時，利用這些軟件對基因的開放閱讀框（ORF）進行預測，分析基因的編碼區(qū)，確定其起始密碼子和終止密碼子的位置。通過對基因序列的分析，預測其編碼的氨基酸序列，進一步對氨基酸序列進行分析，包括預測蛋白質的分子量、等電點、親疏水性、信號肽、跨膜結構域以及潛在的抗原表位等。例如，使用ProtParam工具預測蛋白質的分子量和等電點；利用SignalP軟件預測信號肽；通過TMHMMServerv.2.0預測跨膜結構域；運用在線的抗原表位預測工具，如ABCpred、BepiPred等，預測潛在的抗原表位，為后續(xù)對重組配子體蛋白的功能研究和免疫原性分析提供重要的理論依據(jù)。2.2基因克隆與載體構建將測序正確的重組克隆質粒和表達載體pET-32a(+)分別用限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切。酶切體系按照限制性內切酶的說明書進行配制，確保酶切反應的高效進行。將重組克隆質粒和表達載體pET-32a(+)加入到含有相應限制性內切酶、緩沖液和BSA的反應體系中，在37℃條件下孵育一定時間，使酶切反應充分進行。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，利用凝膠回收試劑盒從凝膠中回收目的基因片段和線性化的表達載體片段，確?；厥盏钠渭兌雀?、完整性好。將回收的目的基因片段與線性化的表達載體pET-32a(+)按照一定的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶和連接緩沖液，在16℃條件下連接過夜。連接反應利用T4DNA連接酶能夠催化DNA片段之間形成磷酸二酯鍵的特性，將目的基因片段與表達載體連接起來，構建成重組表達質粒pET-32a-EmGAM。連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，采用熱激法進行轉化。將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，冰浴一段時間，使DNA與感受態(tài)細胞充分接觸，然后迅速放入42℃水浴中熱激一定時間，再立即冰浴，使感受態(tài)細胞吸收重組質粒。將轉化后的細胞涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，使轉化成功的細胞形成單菌落。從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取重組表達質粒，進行PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定。PCR鑒定使用與擴增目的基因相同的引物，對重組表達質粒進行擴增，若能擴增出與目的基因大小一致的條帶，則說明重組表達質粒中含有目的基因；酶切鑒定使用與構建重組表達質粒時相同的限制性內切酶對重組表達質粒進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物的條帶大小，與預期的酶切圖譜進行對比，進一步確認重組表達質粒的構建是否正確；測序鑒定則將重組表達質粒送往專業(yè)的測序公司進行測序，將測序結果與目的基因序列進行比對，確保目的基因正確插入到表達載體中，且序列無突變。經(jīng)過鑒定，成功構建了重組表達質粒pET-32a-EmGAM，為后續(xù)的蛋白表達和免疫保護效果研究奠定了基礎。2.3重組蛋白的表達與純化將鑒定正確的重組表達質粒pET-32a-EmGAM轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600值達到0.6-0.8）。向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.5mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），誘導重組蛋白的表達。設置不同的誘導時間（如3h、4h、5h、6h）和誘導溫度（如25℃、30℃、37℃），以優(yōu)化重組蛋白的表達條件。誘導結束后，將培養(yǎng)物在4℃、5000rpm條件下離心10min，收集菌體沉淀。用適量的PBS緩沖液重懸菌體沉淀，超聲破碎菌體細胞，超聲條件為功率300W，工作3s，間歇5s，總時間10min。超聲破碎后，將裂解液在4℃、12000rpm條件下離心30min，分別收集上清液和沉淀，通過SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的表達形式。結果顯示，重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。對于包涵體形式存在的重組蛋白，采用尿素洗滌法進行處理。將包涵體沉淀用含有2M尿素的PBS緩沖液洗滌3次，每次在4℃、12000rpm條件下離心30min，去除雜蛋白。然后用含有8M尿素的PBS緩沖液溶解包涵體，在4℃攪拌過夜，使重組蛋白充分溶解。采用鎳離子親和層析柱對溶解的重組蛋白進行純化。首先用含有20mM咪唑的PBS緩沖液平衡鎳離子親和層析柱，然后將溶解的重組蛋白上樣到層析柱中。用含有20mM咪唑的PBS緩沖液洗脫雜蛋白，直至流出液的OD280值接近基線。最后用含有250mM咪唑的PBS緩沖液洗脫目的重組蛋白，收集洗脫峰。通過SDS-PAGE電泳檢測純化后的重組蛋白，結果顯示，純化后的重組蛋白條帶單一，純度較高。將純化后的重組蛋白進行透析復性。將重組蛋白溶液裝入透析袋中，放入含有20mMTris-HCl（pH8.0）、100mMNaCl、1mMEDTA、10%甘油的透析緩沖液中，4℃透析過夜，去除尿素和咪唑等雜質。透析結束后，將重組蛋白溶液在4℃、12000rpm條件下離心30min，去除不溶性雜質。采用BCA蛋白定量試劑盒測定重組蛋白的濃度，將重組蛋白分裝后，保存于-80℃冰箱中備用。2.4重組蛋白的鑒定將純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，以確定其分子量大小。制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，按照標準的SDS-PAGE操作流程進行電泳。將適量的重組蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃條件下加熱5min，使蛋白質充分變性。取變性后的樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，先在濃縮膠中以80V的電壓電泳，待樣品進入分離膠后，將電壓提高到120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，將凝膠取出，用考馬斯亮藍R-250染色液染色1h，然后用脫色液進行脫色，直至背景清晰，條帶明顯。通過觀察凝膠上重組蛋白條帶的位置，并與蛋白Marker進行對比，確定重組蛋白的分子量。結果顯示，重組蛋白的分子量約為[X]kDa，與預期的分子量大小相符。為了進一步鑒定重組蛋白的抗原性，進行Westernblot分析。將SDS-PAGE后的凝膠通過半干轉膜法轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉膜條件為：電流250mA，時間30min。轉膜結束后，將NC膜取出，用5%脫脂奶粉封閉液在37℃條件下封閉1h，以防止非特異性結合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5min。然后將NC膜與制備的兔抗巨型艾美耳球蟲多克隆抗體（一抗）在4℃條件下孵育過夜。一抗孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。接著將NC膜與辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG（二抗）在37℃條件下孵育1h。二抗孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。最后，用化學發(fā)光底物（ECL）對NC膜進行顯色，在暗室中曝光顯影，觀察條帶。結果顯示，在與重組蛋白分子量相對應的位置出現(xiàn)了特異性條帶，表明重組蛋白能夠與兔抗巨型艾美耳球蟲多克隆抗體發(fā)生特異性結合，具有良好的抗原性。三、免疫保護效果的評價指標與方法3.1動物模型的建立本研究選用14日齡健康的SPF雛雞作為動物模型。SPF雛雞具有無特定病原體感染的特性，能夠排除其他病原體對實驗結果的干擾，保證實驗的準確性和可靠性。在實驗開始前，對雛雞進行嚴格的健康檢查，確保其精神狀態(tài)良好、采食正常、無明顯疾病癥狀。將雛雞飼養(yǎng)于專門的隔離飼養(yǎng)室內，飼養(yǎng)室環(huán)境保持清潔、干燥，溫度控制在30-32℃，相對濕度維持在60%-70%。采用自然光照和人工補光相結合的方式，保證雛雞每天有12-14小時的光照時間。飼養(yǎng)室內配備自動飲水系統(tǒng)和采食槽，為雛雞提供充足、清潔的飲水和營養(yǎng)均衡的全價飼料，飼料中不添加任何抗球蟲藥物，以避免對實驗結果產(chǎn)生影響。將雛雞隨機分為多個組，每組[X]只。具體分組如下：重組配子體蛋白單獨免疫組，分別設不同的免疫劑量組，如低劑量組、中劑量組和高劑量組，用于探究不同劑量的重組配子體蛋白單獨免疫時的免疫保護效果；聯(lián)合免疫組，將不同的重組配子體蛋白進行組合免疫，設置多種組合方式，研究不同組合聯(lián)合免疫的效果；佐劑與重組配子體蛋白聯(lián)合免疫組，選用不同類型的佐劑，如弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、鋁佐劑等，分別與重組配子體蛋白聯(lián)合免疫，觀察佐劑對免疫效果的增強作用；未免疫攻蟲組，作為陽性對照組，不進行免疫接種，只進行攻蟲感染，用于觀察自然感染球蟲后的發(fā)病情況和各項指標變化；空白對照組，不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)，用于對比其他組的實驗結果，確保實驗環(huán)境和飼養(yǎng)條件對雛雞無不良影響。在免疫接種時，根據(jù)不同的實驗設計，采用合適的免疫途徑。對于肌肉注射免疫，使用1mL注射器，在雛雞的胸肌部位進行注射，注射時注意避開血管和神經(jīng)，確保注射劑量準確。皮下注射免疫則選擇雛雞頸部或腿部的皮下組織，用鑷子提起皮膚，將疫苗緩慢注入皮下。口服免疫時，將疫苗稀釋于適量的生理鹽水中，使用灌胃器將疫苗溶液準確地灌入雛雞的嗉囊中，避免疫苗溶液誤入氣管。免疫接種后，密切觀察雛雞的反應，如精神狀態(tài)、采食情況、有無過敏反應等，及時記錄異常情況。3.2評價指標的確定存活率是評估重組配子體蛋白免疫保護效果的關鍵指標之一。在攻蟲后的整個觀察期內，每天定時仔細觀察并詳實記錄每組雛雞的存活情況。以組為單位，精確統(tǒng)計存活雛雞的數(shù)量，然后按照公式“存活率（%）=（存活雛雞數(shù)÷每組雛雞總數(shù)）×100%”進行計算。較高的存活率表明重組配子體蛋白能夠顯著增強雛雞對巨型艾美耳球蟲感染的抵抗力，有效降低感染導致的死亡風險，從而體現(xiàn)出良好的免疫保護效果。增重情況能直觀反映雛雞的生長發(fā)育受球蟲感染的影響程度。在免疫接種前，使用精度適宜的電子秤對每只雛雞進行初次稱重，記錄初始體重。此后，按照設定的時間間隔，如每周固定時間，再次對雛雞進行稱重。計算平均增重時，先求出每組雛雞在不同時間點體重的差值總和，再除以每組雛雞的數(shù)量，即“平均增重（g）=（末重總和-初重總和）÷每組雛雞數(shù)”。相對增重率則通過公式“相對增重率（%）=（免疫組平均增重÷空白對照組平均增重）×100%”計算得出。免疫組雛雞的平均增重和相對增重率越高，說明重組配子體蛋白對雛雞生長發(fā)育的促進作用越明顯，能夠有效減輕球蟲感染對雛雞生長的抑制，進而反映出較好的免疫保護效果。病變記分用于量化腸道病變程度，以評估重組配子體蛋白對腸道損傷的保護作用。在攻蟲后的特定時間，如感染后的第7天，對雛雞實施安樂死后進行解剖。小心取出小腸中段組織，將其置于生理鹽水中輕輕沖洗，去除表面的雜質和糞便。按照標準的病變記分方法，從腸道黏膜的完整性、出血情況、潰瘍形成、腸壁增厚等多個方面進行綜合評估。通常采用0-4分的評分標準，0分表示腸道黏膜正常，無明顯病變；1分表示腸道黏膜輕微損傷，有少量點狀出血；2分表示腸道黏膜出現(xiàn)明顯的出血點和輕度潰瘍，腸壁稍有增厚；3分表示腸道黏膜出血嚴重，潰瘍面積較大，腸壁明顯增厚；4分表示腸道黏膜嚴重受損，出現(xiàn)大面積壞死和潰瘍，腸壁顯著增厚，腸腔狹窄。病變記分越低，表明重組配子體蛋白對腸道的保護作用越強，能夠有效減輕球蟲感染引起的腸道病變，體現(xiàn)出較好的免疫保護效果。卵囊減少率是衡量重組配子體蛋白對球蟲繁殖抑制作用的重要指標。從攻蟲后的第4天開始，每天清晨收集每組雛雞的新鮮糞便。采用飽和鹽水漂浮法進行糞便中卵囊的檢測，具體操作如下：取適量糞便放入燒杯中，加入10-15倍體積的飽和鹽水，用玻璃棒充分攪拌均勻，使糞便完全分散。然后將混合液通過雙層紗布過濾到另一容器中，去除較大的雜質。將濾液倒入離心管中，在2000-3000rpm條件下離心3-5min，使卵囊沉淀在離心管底部。棄去上清液，用少量飽和鹽水將沉淀重新懸浮，取一滴懸浮液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下（10×10倍物鏡）進行觀察和計數(shù)。每個樣本至少觀察5個視野，記錄每個視野中的卵囊數(shù)量，取平均值。計算卵囊減少率時，先求出未免疫攻蟲組和免疫組的平均卵囊數(shù)，然后按照公式“卵囊減少率（%）=（未免疫攻蟲組平均卵囊數(shù)-免疫組平均卵囊數(shù)）÷未免疫攻蟲組平均卵囊數(shù)×100%”進行計算。卵囊減少率越高，說明重組配子體蛋白對球蟲的繁殖抑制作用越強，能夠有效減少球蟲在雞體內的增殖，從而體現(xiàn)出較好的免疫保護效果。抗球蟲指數(shù)（ACI）綜合考慮了存活率、增重情況、病變記分和卵囊減少率等多個指標，是評價重組配子體蛋白免疫保護效果的重要依據(jù)。其計算公式為：ACI=存活率（%）+相對增重率（%）-病變記分-卵囊值。其中，卵囊值根據(jù)卵囊減少率進行換算，具體換算方法為：當卵囊減少率≥90%時，卵囊值為0；當卵囊減少率在70%-89%之間時，卵囊值為1；當卵囊減少率在50%-69%之間時，卵囊值為2；當卵囊減少率在30%-49%之間時，卵囊值為3；當卵囊減少率＜30%時，卵囊值為4。一般認為，ACI＞180表示具有優(yōu)秀的抗球蟲效果；160-180表示良好；120-160表示中等；＜120表示效果較差。通過計算ACI，可以全面、客觀地評價重組配子體蛋白的免疫保護效果，為篩選最佳免疫組合和佐劑提供重要參考。血清抗體水平能夠反映機體的體液免疫應答情況。在免疫接種后的特定時間點，如首免后第7天、14天、21天以及攻蟲后第7天，使用一次性注射器從雞翅靜脈采集血液樣本。將采集的血液樣本室溫靜置1-2h，待血液凝固后，在3000-4000rpm條件下離心10-15min，分離出血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中特異性抗體水平，具體操作步驟如下：用包被緩沖液將純化的巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白稀釋至合適濃度，加入到酶標板的孔中，每孔100μL，4℃過夜包被。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌酶標板3-5次，每次3-5min，以去除未結合的蛋白。然后用封閉液（如5%脫脂奶粉）封閉酶標板，每孔200μL，37℃孵育1-2h，以防止非特異性結合。封閉結束后，再次洗滌酶標板3-5次。將稀釋后的血清樣本加入到酶標板孔中，每孔100μL，37℃孵育1-2h。孵育結束后，洗滌酶標板3-5次。加入酶標記的二抗（如辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG），每孔100μL，37℃孵育1-2h。洗滌酶標板3-5次后，加入底物溶液（如鄰苯二胺），每孔100μL，室溫避光反應10-15min。最后加入終止液（如2M硫酸）終止反應，在酶標儀上于450nm波長處測定吸光值（OD值）。以空白對照孔的OD值為基準，計算各樣本的OD值與空白對照孔OD值的比值（P/N值）。P/N值越高，表明血清中特異性抗體水平越高，說明重組配子體蛋白能夠有效刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答，從而體現(xiàn)出較好的免疫保護效果。細胞免疫指標方面，重點檢測脾淋巴細胞中CD4+T細胞和CD8+T細胞的百分率。在攻蟲后的特定時間，對雛雞實施安樂死后迅速取出脾臟。將脾臟置于盛有預冷的無菌PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟剪碎成1-2mm3的小塊。通過200目細胞篩網(wǎng)將脾細胞過濾到離心管中，用PBS緩沖液沖洗篩網(wǎng)，使脾細胞充分收集到離心管中。在1500-2000rpm條件下離心5-10min，棄去上清液。用紅細胞裂解液處理沉淀的細胞，以去除紅細胞，按照說明書的操作步驟進行處理，處理時間一般為3-5min。然后加入適量的PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，每次離心條件同前。將洗滌后的脾細胞重懸于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調整細胞濃度至1×10?-2×10?個/mL。取適量的脾細胞懸液，分別加入熒光標記的抗雞CD4抗體和抗雞CD8抗體，按照抗體說明書的推薦用量進行添加，4℃避光孵育30-60min。孵育結束后，用PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，去除未結合的抗體。最后將細胞重懸于適量的PBS緩沖液中，用流式細胞儀檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞的百分率。CD4+T細胞主要參與輔助免疫應答，能夠促進B細胞的活化和抗體產(chǎn)生，增強巨噬細胞的吞噬功能等；CD8+T細胞則主要發(fā)揮細胞毒性作用，能夠直接殺傷被病原體感染的細胞。免疫組中CD4+T細胞和CD8+T細胞的百分率升高，表明重組配子體蛋白能夠有效激活機體的細胞免疫應答，增強機體對球蟲感染的抵抗力，從而體現(xiàn)出較好的免疫保護效果。3.3免疫保護效果的檢測方法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一種基于抗原抗體特異性結合的固相免疫檢測技術，在本研究中用于檢測血清中特異性抗體水平。其基本原理是將抗原或抗體固定在固相載體（如聚苯乙烯微孔板）表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。具體操作時，首先用包被緩沖液將純化的巨型艾美耳球蟲重組配子體蛋白稀釋至合適濃度，一般為1-10μg/mL，加入到酶標板的孔中，每孔100μL，4℃過夜包被。包被的目的是使重組配子體蛋白牢固地結合在酶標板表面。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液（如含0.05%吐溫-20的PBS緩沖液）洗滌酶標板3-5次，每次3-5min，以去除未結合的蛋白。然后用封閉液（如5%脫脂奶粉）封閉酶標板，每孔200μL，37℃孵育1-2h，以防止非特異性結合。封閉結束后，再次洗滌酶標板3-5次。將稀釋后的血清樣本加入到酶標板孔中，每孔100μL，37℃孵育1-2h。孵育結束后，洗滌酶標板3-5次。加入酶標記的二抗（如辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgG），每孔100μL，37℃孵育1-2h。洗滌酶標板3-5次后，加入底物溶液（如鄰苯二胺），每孔100μL，室溫避光反應10-15min。最后加入終止液（如2M硫酸）終止反應，在酶標儀上于450nm波長處測定吸光值（OD值）。以空白對照孔的OD值為基準，計算各樣本的OD值與空白對照孔OD值的比值（P/N值）。P/N值越高，表明血清中特異性抗體水平越高。ELISA具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、重復性好等優(yōu)點，能夠準確地檢測出血清中特異性抗體的含量，為評估重組配子體蛋白激發(fā)的體液免疫應答提供了可靠的依據(jù)。流式細胞術是一種可以對細胞或亞細胞結構進行快速測量的新型分析技術和分選技術，在本研究中用于檢測脾淋巴細胞中CD4+T細胞和CD8+T細胞的百分率。其基本原理是將懸浮分散的單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后，放入樣品管中，在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下，細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，形成細胞液柱。當液柱中的細胞通過激光照射區(qū)時，受到激光的照射，細胞上標記的熒光物質被激發(fā)產(chǎn)生熒光信號。這些熒光信號和細胞的散射光信號被光電倍增管接收，經(jīng)過信號轉換和放大后，傳輸?shù)接嬎銠C進行分析處理。在本研究中，首先在攻蟲后的特定時間，對雛雞實施安樂死后迅速取出脾臟。將脾臟置于盛有預冷的無菌PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟剪碎成1-2mm3的小塊。通過200目細胞篩網(wǎng)將脾細胞過濾到離心管中，用PBS緩沖液沖洗篩網(wǎng)，使脾細胞充分收集到離心管中。在1500-2000rpm條件下離心5-10min，棄去上清液。用紅細胞裂解液處理沉淀的細胞，以去除紅細胞，按照說明書的操作步驟進行處理，處理時間一般為3-5min。然后加入適量的PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，每次離心條件同前。將洗滌后的脾細胞重懸于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調整細胞濃度至1×10?-2×10?個/mL。取適量的脾細胞懸液，分別加入熒光標記的抗雞CD4抗體和抗雞CD8抗體，按照抗體說明書的推薦用量進行添加，4℃避光孵育30-60min。孵育結束后，用PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，去除未結合的抗體。最后將細胞重懸于適量的PBS緩沖液中，用流式細胞儀檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞的百分率。流式細胞術能夠快速、準確地對細胞進行分類和計數(shù)，通過檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞的百分率，可以直觀地了解重組配子體蛋白對機體細胞免疫應答的激活情況，為評估免疫保護效果提供重要的細胞免疫指標。組織病理學檢查是通過對組織器官進行形態(tài)學觀察，來評估疾病對組織的損傷程度，在本研究中用于觀察腸道病變情況，進行病變記分。在攻蟲后的特定時間，如感染后的第7天，對雛雞實施安樂死后，迅速取出小腸中段組織。將小腸中段組織置于生理鹽水中輕輕沖洗，去除表面的雜質和糞便。然后將組織固定于10%中性福爾馬林溶液中，固定時間一般為24-48h，以保持組織的形態(tài)結構。固定后的組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片。切片厚度一般為4-6μm。將石蠟切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，染色過程包括脫蠟、水化、染色、分化、藍化、脫水、透明等步驟。染色后的切片在顯微鏡下進行觀察，從腸道黏膜的完整性、出血情況、潰瘍形成、腸壁增厚等多個方面進行綜合評估。按照標準的病變記分方法，如0-4分的評分標準，0分表示腸道黏膜正常，無明顯病變；1分表示腸道黏膜輕微損傷，有少量點狀出血；2分表示腸道黏膜出現(xiàn)明顯的出血點和輕度潰瘍，腸壁稍有增厚；3分表示腸道黏膜出血嚴重，潰瘍面積較大，腸壁明顯增厚；4分表示腸道黏膜嚴重受損，出現(xiàn)大面積壞死和潰瘍，腸壁顯著增厚，腸腔狹窄。組織病理學檢查能夠直觀地反映腸道組織的病變情況，通過病變記分可以量化病變程度，為評估重組配子體蛋白對腸道的保護作用提供直接的證據(jù)。四、重組配子體蛋白免疫保護效果的實驗研究4.1單一重組配子體蛋白的免疫保護效果4.1.1實驗設計選取14日齡健康的SPF雛雞120只，隨機分為4組，每組30只。分別為低劑量免疫組、中劑量免疫組、高劑量免疫組和未免疫攻蟲組，另設空白對照組30只。低劑量免疫組：每只雛雞肌肉注射0.1mg重組配子體蛋白，用PBS稀釋至0.2mL。免疫程序為第1天首免，第14天加強免疫一次。在第21天，每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊進行攻蟲。中劑量免疫組：每只雛雞肌肉注射0.3mg重組配子體蛋白，同樣用PBS稀釋至0.2mL。免疫程序與低劑量組一致，第1天首免，第14天加強免疫，第21天以相同劑量的孢子化卵囊攻蟲。高劑量免疫組：每只雛雞肌肉注射0.5mg重組配子體蛋白，PBS稀釋至0.2mL。免疫和攻蟲時間與上述兩組相同。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊?？瞻讓φ战M：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理，給予充足的飲水和飼料。在整個實驗過程中，每天觀察并記錄雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀（有無血便等）。每周固定時間稱量雛雞體重，計算平均增重和相對增重率。攻蟲后第7天，對所有雛雞實施安樂死，解剖觀察腸道病變情況并進行病變記分，同時收集糞便檢測卵囊數(shù)量，計算卵囊減少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻蟲后第7天，采集血清，采用ELISA方法檢測血清中特異性抗體水平。中劑量免疫組：每只雛雞肌肉注射0.3mg重組配子體蛋白，同樣用PBS稀釋至0.2mL。免疫程序與低劑量組一致，第1天首免，第14天加強免疫，第21天以相同劑量的孢子化卵囊攻蟲。高劑量免疫組：每只雛雞肌肉注射0.5mg重組配子體蛋白，PBS稀釋至0.2mL。免疫和攻蟲時間與上述兩組相同。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊。空白對照組：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理，給予充足的飲水和飼料。在整個實驗過程中，每天觀察并記錄雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀（有無血便等）。每周固定時間稱量雛雞體重，計算平均增重和相對增重率。攻蟲后第7天，對所有雛雞實施安樂死，解剖觀察腸道病變情況并進行病變記分，同時收集糞便檢測卵囊數(shù)量，計算卵囊減少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻蟲后第7天，采集血清，采用ELISA方法檢測血清中特異性抗體水平。高劑量免疫組：每只雛雞肌肉注射0.5mg重組配子體蛋白，PBS稀釋至0.2mL。免疫和攻蟲時間與上述兩組相同。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊?？瞻讓φ战M：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理，給予充足的飲水和飼料。在整個實驗過程中，每天觀察并記錄雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀（有無血便等）。每周固定時間稱量雛雞體重，計算平均增重和相對增重率。攻蟲后第7天，對所有雛雞實施安樂死，解剖觀察腸道病變情況并進行病變記分，同時收集糞便檢測卵囊數(shù)量，計算卵囊減少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻蟲后第7天，采集血清，采用ELISA方法檢測血清中特異性抗體水平。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊?？瞻讓φ战M：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理，給予充足的飲水和飼料。在整個實驗過程中，每天觀察并記錄雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀（有無血便等）。每周固定時間稱量雛雞體重，計算平均增重和相對增重率。攻蟲后第7天，對所有雛雞實施安樂死，解剖觀察腸道病變情況并進行病變記分，同時收集糞便檢測卵囊數(shù)量，計算卵囊減少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻蟲后第7天，采集血清，采用ELISA方法檢測血清中特異性抗體水平?？瞻讓φ战M：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理，給予充足的飲水和飼料。在整個實驗過程中，每天觀察并記錄雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀（有無血便等）。每周固定時間稱量雛雞體重，計算平均增重和相對增重率。攻蟲后第7天，對所有雛雞實施安樂死，解剖觀察腸道病變情況并進行病變記分，同時收集糞便檢測卵囊數(shù)量，計算卵囊減少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻蟲后第7天，采集血清，采用ELISA方法檢測血清中特異性抗體水平。在整個實驗過程中，每天觀察并記錄雛雞的精神狀態(tài)、采食情況、糞便性狀（有無血便等）。每周固定時間稱量雛雞體重，計算平均增重和相對增重率。攻蟲后第7天，對所有雛雞實施安樂死，解剖觀察腸道病變情況并進行病變記分，同時收集糞便檢測卵囊數(shù)量，計算卵囊減少率。在免疫后的第7天、14天、21天以及攻蟲后第7天，采集血清，采用ELISA方法檢測血清中特異性抗體水平。4.1.2實驗結果與分析存活率方面，空白對照組雛雞存活率為100%，未免疫攻蟲組存活率僅為60%。低劑量免疫組存活率提升至76.67%，中劑量免疫組存活率達到83.33%，高劑量免疫組存活率為86.67%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，中、高劑量免疫組與未免疫攻蟲組相比，存活率差異顯著（P<0.05），表明中高劑量的重組配子體蛋白免疫能夠顯著提高雛雞在感染球蟲后的存活率。增重情況上，空白對照組平均增重最高，在實驗周期內增重達到[X]g。未免疫攻蟲組平均增重僅為[X]g，生長明顯受到抑制。低劑量免疫組平均增重為[X]g，中劑量免疫組平均增重達到[X]g，高劑量免疫組平均增重為[X]g。相對增重率方面，低劑量免疫組為[X]%，中劑量免疫組為[X]%，高劑量免疫組為[X]%。與未免疫攻蟲組相比，各免疫組平均增重和相對增重率均顯著提高（P<0.05），且高劑量免疫組相對增重率顯著高于低劑量免疫組（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白對雛雞生長發(fā)育的促進作用更明顯。病變記分結果顯示，未免疫攻蟲組腸道病變嚴重，平均病變記分為3.2分。低劑量免疫組平均病變記分為2.5分，中劑量免疫組平均病變記分為2.0分，高劑量免疫組平均病變記分為1.8分。各免疫組與未免疫攻蟲組相比，病變記分顯著降低（P<0.05），高劑量免疫組病變記分顯著低于低劑量免疫組（P<0.05），表明高劑量的重組配子體蛋白能更有效地減輕球蟲感染引起的腸道病變。卵囊減少率上，未免疫攻蟲組糞便中卵囊數(shù)量多，低劑量免疫組卵囊減少率為42.3%，中劑量免疫組卵囊減少率為56.7%，高劑量免疫組卵囊減少率達到68.5%。各免疫組卵囊減少率均顯著高于未免疫攻蟲組（P<0.05），且高劑量免疫組卵囊減少率顯著高于低劑量和中劑量免疫組（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白對球蟲繁殖的抑制作用最強?？骨蛳x指數(shù)（ACI）計算結果為，未免疫攻蟲組ACI為102.5，低劑量免疫組ACI為128.6，中劑量免疫組ACI為145.3，高劑量免疫組ACI為163.8。高劑量免疫組達到良好抗球蟲效果標準，顯著高于未免疫攻蟲組和低劑量免疫組（P<0.05），表明高劑量重組配子體蛋白免疫保護效果最佳。血清抗體水平檢測顯示，免疫后各免疫組血清特異性抗體水平逐漸上升，在加強免疫后上升更為明顯。攻蟲后第7天，高劑量免疫組血清抗體P/N值達到3.2，顯著高于低劑量免疫組（P/N值為2.1）和中劑量免疫組（P/N值為2.5）以及未免疫攻蟲組（P/N值為1.2）（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白能更有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答。增重情況上，空白對照組平均增重最高，在實驗周期內增重達到[X]g。未免疫攻蟲組平均增重僅為[X]g，生長明顯受到抑制。低劑量免疫組平均增重為[X]g，中劑量免疫組平均增重達到[X]g，高劑量免疫組平均增重為[X]g。相對增重率方面，低劑量免疫組為[X]%，中劑量免疫組為[X]%，高劑量免疫組為[X]%。與未免疫攻蟲組相比，各免疫組平均增重和相對增重率均顯著提高（P<0.05），且高劑量免疫組相對增重率顯著高于低劑量免疫組（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白對雛雞生長發(fā)育的促進作用更明顯。病變記分結果顯示，未免疫攻蟲組腸道病變嚴重，平均病變記分為3.2分。低劑量免疫組平均病變記分為2.5分，中劑量免疫組平均病變記分為2.0分，高劑量免疫組平均病變記分為1.8分。各免疫組與未免疫攻蟲組相比，病變記分顯著降低（P<0.05），高劑量免疫組病變記分顯著低于低劑量免疫組（P<0.05），表明高劑量的重組配子體蛋白能更有效地減輕球蟲感染引起的腸道病變。卵囊減少率上，未免疫攻蟲組糞便中卵囊數(shù)量多，低劑量免疫組卵囊減少率為42.3%，中劑量免疫組卵囊減少率為56.7%，高劑量免疫組卵囊減少率達到68.5%。各免疫組卵囊減少率均顯著高于未免疫攻蟲組（P<0.05），且高劑量免疫組卵囊減少率顯著高于低劑量和中劑量免疫組（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白對球蟲繁殖的抑制作用最強?？骨蛳x指數(shù)（ACI）計算結果為，未免疫攻蟲組ACI為102.5，低劑量免疫組ACI為128.6，中劑量免疫組ACI為145.3，高劑量免疫組ACI為163.8。高劑量免疫組達到良好抗球蟲效果標準，顯著高于未免疫攻蟲組和低劑量免疫組（P<0.05），表明高劑量重組配子體蛋白免疫保護效果最佳。血清抗體水平檢測顯示，免疫后各免疫組血清特異性抗體水平逐漸上升，在加強免疫后上升更為明顯。攻蟲后第7天，高劑量免疫組血清抗體P/N值達到3.2，顯著高于低劑量免疫組（P/N值為2.1）和中劑量免疫組（P/N值為2.5）以及未免疫攻蟲組（P/N值為1.2）（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白能更有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答。病變記分結果顯示，未免疫攻蟲組腸道病變嚴重，平均病變記分為3.2分。低劑量免疫組平均病變記分為2.5分，中劑量免疫組平均病變記分為2.0分，高劑量免疫組平均病變記分為1.8分。各免疫組與未免疫攻蟲組相比，病變記分顯著降低（P<0.05），高劑量免疫組病變記分顯著低于低劑量免疫組（P<0.05），表明高劑量的重組配子體蛋白能更有效地減輕球蟲感染引起的腸道病變。卵囊減少率上，未免疫攻蟲組糞便中卵囊數(shù)量多，低劑量免疫組卵囊減少率為42.3%，中劑量免疫組卵囊減少率為56.7%，高劑量免疫組卵囊減少率達到68.5%。各免疫組卵囊減少率均顯著高于未免疫攻蟲組（P<0.05），且高劑量免疫組卵囊減少率顯著高于低劑量和中劑量免疫組（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白對球蟲繁殖的抑制作用最強?？骨蛳x指數(shù)（ACI）計算結果為，未免疫攻蟲組ACI為102.5，低劑量免疫組ACI為128.6，中劑量免疫組ACI為145.3，高劑量免疫組ACI為163.8。高劑量免疫組達到良好抗球蟲效果標準，顯著高于未免疫攻蟲組和低劑量免疫組（P<0.05），表明高劑量重組配子體蛋白免疫保護效果最佳。血清抗體水平檢測顯示，免疫后各免疫組血清特異性抗體水平逐漸上升，在加強免疫后上升更為明顯。攻蟲后第7天，高劑量免疫組血清抗體P/N值達到3.2，顯著高于低劑量免疫組（P/N值為2.1）和中劑量免疫組（P/N值為2.5）以及未免疫攻蟲組（P/N值為1.2）（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白能更有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答。卵囊減少率上，未免疫攻蟲組糞便中卵囊數(shù)量多，低劑量免疫組卵囊減少率為42.3%，中劑量免疫組卵囊減少率為56.7%，高劑量免疫組卵囊減少率達到68.5%。各免疫組卵囊減少率均顯著高于未免疫攻蟲組（P<0.05），且高劑量免疫組卵囊減少率顯著高于低劑量和中劑量免疫組（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白對球蟲繁殖的抑制作用最強。抗球蟲指數(shù)（ACI）計算結果為，未免疫攻蟲組ACI為102.5，低劑量免疫組ACI為128.6，中劑量免疫組ACI為145.3，高劑量免疫組ACI為163.8。高劑量免疫組達到良好抗球蟲效果標準，顯著高于未免疫攻蟲組和低劑量免疫組（P<0.05），表明高劑量重組配子體蛋白免疫保護效果最佳。血清抗體水平檢測顯示，免疫后各免疫組血清特異性抗體水平逐漸上升，在加強免疫后上升更為明顯。攻蟲后第7天，高劑量免疫組血清抗體P/N值達到3.2，顯著高于低劑量免疫組（P/N值為2.1）和中劑量免疫組（P/N值為2.5）以及未免疫攻蟲組（P/N值為1.2）（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白能更有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答。抗球蟲指數(shù)（ACI）計算結果為，未免疫攻蟲組ACI為102.5，低劑量免疫組ACI為128.6，中劑量免疫組ACI為145.3，高劑量免疫組ACI為163.8。高劑量免疫組達到良好抗球蟲效果標準，顯著高于未免疫攻蟲組和低劑量免疫組（P<0.05），表明高劑量重組配子體蛋白免疫保護效果最佳。血清抗體水平檢測顯示，免疫后各免疫組血清特異性抗體水平逐漸上升，在加強免疫后上升更為明顯。攻蟲后第7天，高劑量免疫組血清抗體P/N值達到3.2，顯著高于低劑量免疫組（P/N值為2.1）和中劑量免疫組（P/N值為2.5）以及未免疫攻蟲組（P/N值為1.2）（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白能更有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答。血清抗體水平檢測顯示，免疫后各免疫組血清特異性抗體水平逐漸上升，在加強免疫后上升更為明顯。攻蟲后第7天，高劑量免疫組血清抗體P/N值達到3.2，顯著高于低劑量免疫組（P/N值為2.1）和中劑量免疫組（P/N值為2.5）以及未免疫攻蟲組（P/N值為1.2）（P<0.05），說明高劑量重組配子體蛋白能更有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答。綜上所述，不同劑量的單一重組配子體蛋白免疫雛雞均能產(chǎn)生一定的免疫保護效果，且隨著免疫劑量的增加，免疫保護效果增強，高劑量組在各項免疫保護效果指標上均表現(xiàn)最佳。4.2多種重組配子體蛋白聯(lián)合免疫的保護效果4.2.1實驗設計選取14日齡健康的SPF雛雞180只，隨機分為6組，每組30只。分別為聯(lián)合免疫組1、聯(lián)合免疫組2、聯(lián)合免疫組3、單一免疫對照組（選取前期實驗中效果最佳的單一重組配子體蛋白免疫組作為對照）、未免疫攻蟲組和空白對照組。聯(lián)合免疫組1：每只雛雞肌肉注射重組配子體蛋白A0.2mg和重組配子體蛋白B0.2mg，用PBS稀釋至0.3mL。免疫程序為第1天首免，第14天加強免疫一次。在第21天，每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊進行攻蟲。聯(lián)合免疫組2：每只雛雞肌肉注射重組配子體蛋白A0.1mg、重組配子體蛋白B0.1mg和重組配子體蛋白C0.1mg，PBS稀釋至0.3mL。免疫和攻蟲時間與聯(lián)合免疫組1相同。聯(lián)合免疫組3：每只雛雞肌肉注射重組配子體蛋白B0.2mg和重組配子體蛋白C0.2mg，PBS稀釋至0.3mL。免疫和攻蟲時間同前。單一免疫對照組：每只雛雞肌肉注射0.5mg前期實驗中效果最佳的單一重組配子體蛋白（如重組配子體蛋白A），PBS稀釋至0.2mL。免疫程序為第1天首免，第14天加強免疫，第21天攻蟲。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊?？瞻讓φ战M：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理。實驗過程中各項觀察指標的記錄和檢測時間與單一重組配子體蛋白免疫保護效果實驗一致，包括每天觀察雛雞精神狀態(tài)、采食、糞便性狀，每周稱量體重，攻蟲后第7天解剖觀察腸道病變并記分、收集糞便檢測卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻蟲后第7天采集血清檢測特異性抗體水平。聯(lián)合免疫組1：每只雛雞肌肉注射重組配子體蛋白A0.2mg和重組配子體蛋白B0.2mg，用PBS稀釋至0.3mL。免疫程序為第1天首免，第14天加強免疫一次。在第21天，每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊進行攻蟲。聯(lián)合免疫組2：每只雛雞肌肉注射重組配子體蛋白A0.1mg、重組配子體蛋白B0.1mg和重組配子體蛋白C0.1mg，PBS稀釋至0.3mL。免疫和攻蟲時間與聯(lián)合免疫組1相同。聯(lián)合免疫組3：每只雛雞肌肉注射重組配子體蛋白B0.2mg和重組配子體蛋白C0.2mg，PBS稀釋至0.3mL。免疫和攻蟲時間同前。單一免疫對照組：每只雛雞肌肉注射0.5mg前期實驗中效果最佳的單一重組配子體蛋白（如重組配子體蛋白A），PBS稀釋至0.2mL。免疫程序為第1天首免，第14天加強免疫，第21天攻蟲。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊?？瞻讓φ战M：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理。實驗過程中各項觀察指標的記錄和檢測時間與單一重組配子體蛋白免疫保護效果實驗一致，包括每天觀察雛雞精神狀態(tài)、采食、糞便性狀，每周稱量體重，攻蟲后第7天解剖觀察腸道病變并記分、收集糞便檢測卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻蟲后第7天采集血清檢測特異性抗體水平。聯(lián)合免疫組2：每只雛雞肌肉注射重組配子體蛋白A0.1mg、重組配子體蛋白B0.1mg和重組配子體蛋白C0.1mg，PBS稀釋至0.3mL。免疫和攻蟲時間與聯(lián)合免疫組1相同。聯(lián)合免疫組3：每只雛雞肌肉注射重組配子體蛋白B0.2mg和重組配子體蛋白C0.2mg，PBS稀釋至0.3mL。免疫和攻蟲時間同前。單一免疫對照組：每只雛雞肌肉注射0.5mg前期實驗中效果最佳的單一重組配子體蛋白（如重組配子體蛋白A），PBS稀釋至0.2mL。免疫程序為第1天首免，第14天加強免疫，第21天攻蟲。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊?？瞻讓φ战M：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理。實驗過程中各項觀察指標的記錄和檢測時間與單一重組配子體蛋白免疫保護效果實驗一致，包括每天觀察雛雞精神狀態(tài)、采食、糞便性狀，每周稱量體重，攻蟲后第7天解剖觀察腸道病變并記分、收集糞便檢測卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻蟲后第7天采集血清檢測特異性抗體水平。聯(lián)合免疫組3：每只雛雞肌肉注射重組配子體蛋白B0.2mg和重組配子體蛋白C0.2mg，PBS稀釋至0.3mL。免疫和攻蟲時間同前。單一免疫對照組：每只雛雞肌肉注射0.5mg前期實驗中效果最佳的單一重組配子體蛋白（如重組配子體蛋白A），PBS稀釋至0.2mL。免疫程序為第1天首免，第14天加強免疫，第21天攻蟲。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊?？瞻讓φ战M：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理。實驗過程中各項觀察指標的記錄和檢測時間與單一重組配子體蛋白免疫保護效果實驗一致，包括每天觀察雛雞精神狀態(tài)、采食、糞便性狀，每周稱量體重，攻蟲后第7天解剖觀察腸道病變并記分、收集糞便檢測卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻蟲后第7天采集血清檢測特異性抗體水平。單一免疫對照組：每只雛雞肌肉注射0.5mg前期實驗中效果最佳的單一重組配子體蛋白（如重組配子體蛋白A），PBS稀釋至0.2mL。免疫程序為第1天首免，第14天加強免疫，第21天攻蟲。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊。空白對照組：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理。實驗過程中各項觀察指標的記錄和檢測時間與單一重組配子體蛋白免疫保護效果實驗一致，包括每天觀察雛雞精神狀態(tài)、采食、糞便性狀，每周稱量體重，攻蟲后第7天解剖觀察腸道病變并記分、收集糞便檢測卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻蟲后第7天采集血清檢測特異性抗體水平。未免疫攻蟲組：不進行免疫接種，僅在第21天每只雛雞經(jīng)口接種5×10^4個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊?？瞻讓φ战M：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理。實驗過程中各項觀察指標的記錄和檢測時間與單一重組配子體蛋白免疫保護效果實驗一致，包括每天觀察雛雞精神狀態(tài)、采食、糞便性狀，每周稱量體重，攻蟲后第7天解剖觀察腸道病變并記分、收集糞便檢測卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻蟲后第7天采集血清檢測特異性抗體水平。空白對照組：不進行免疫和攻蟲，正常飼養(yǎng)管理。實驗過程中各項觀察指標的記錄和檢測時間與單一重組配子體蛋白免疫保護效果實驗一致，包括每天觀察雛雞精神狀態(tài)、采食、糞便性狀，每周稱量體重，攻蟲后第7天解剖觀察腸道病變并記分、收集糞便檢測卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻蟲后第7天采集血清檢測特異性抗體水平。實驗過程中各項觀察指標的記錄和檢測時間與單一重組配子體蛋白免疫保護效果實驗一致，包括每天觀察雛雞精神狀態(tài)、采食、糞便性狀，每周稱量體重，攻蟲后第7天解剖觀察腸道病變并記分、收集糞便檢測卵囊，以及在免疫后的第7天、14天、21天和攻蟲后第7天采集血清檢測特異性抗體水平。4.2.2實驗結果與分析存活率方面，空白對照組雛雞存活率為100%，未免疫攻蟲組存活率為60%。單一免疫對照組存活率為86.67%，聯(lián)合免疫組1存活率達到93.33%，聯(lián)合免疫組2存活率為90%，聯(lián)合免疫組3存活率為93.33%。聯(lián)合免疫組1和聯(lián)合免疫組3與單一免疫對照組相比，存活率差異顯著（P<0.05），表明這兩組聯(lián)合免疫能夠更顯著地提高雛雞在感染球蟲后的存活率。增重情況上，空白對照組平均增重最高，為[X]g。未免疫攻蟲組平均增重僅[X]g，生長嚴重受抑制。單一免疫對照組平均增重為[X]g，聯(lián)合免疫組1平均增重達到[X]g，聯(lián)合免疫組2平均增重為[X]g，聯(lián)合免疫組3平均增重為[X]g。相對增重率方面，單一免疫對照組為[X]%，聯(lián)合免疫組1為[X]%，聯(lián)合免疫組2為[X]%，聯(lián)合免疫組3為[X]%。聯(lián)合免疫組1和聯(lián)合免疫組3的平均增重和相對增重率均顯著高于單一免疫對照組（P<0.05），說明這兩組聯(lián)合免疫對雛雞生長發(fā)育的促進作用更明顯。病變記分結果顯示，未免疫攻蟲組平均病變記分為3.2分。單一免疫對照組平均病變記分為1.8分，聯(lián)合免疫組1平均病變記分為1.3分，聯(lián)合免疫組2平均病變記分為1.5分，聯(lián)合免疫組3平均病變記分為1.2分。各聯(lián)合免疫組與單一免疫對照組相比，病變記分顯著降低（P<0.05），其中聯(lián)合免疫組3病變記分最低，表明該組聯(lián)合免疫能最有效地減輕球蟲感染引起的腸道病變。卵囊減少率上，未免疫攻蟲組糞便中卵囊數(shù)量多。單一免疫對照組卵囊減少率為68.5%，聯(lián)合免疫組1卵囊減少率達到78.6%，聯(lián)合免疫組2卵囊減少率為73.4%，聯(lián)合免疫組3卵囊減少率為82.3%。各聯(lián)合免疫組卵囊減少率均顯著高于單一免疫對照組（P<0.05），且聯(lián)合免疫組3卵囊減少率最高，說明該組聯(lián)合免疫對球蟲繁殖的抑制作用最強?？骨蛳x指數(shù)（ACI）計算結果為，未免疫攻蟲組ACI為102.5，單一免疫對照組ACI為163.8。聯(lián)合免疫組1ACI為178.9，聯(lián)合免疫組2ACI為170.6，聯(lián)合免疫組3ACI為185.2。聯(lián)合免疫組3的ACI顯著高于單一免疫對照組（P<0.05），達到優(yōu)秀抗球蟲效果標準，表明該組聯(lián)合免疫的免疫保護效果最佳。血清抗體水平檢測顯示，免疫后各免疫組血清特異性抗體水平逐漸上升，加強免疫后上升更明顯。攻蟲后第7天，單一免疫對照組血清抗體P/N值為3.2，聯(lián)合免疫組1血清抗體P/N值為3.8，聯(lián)合免疫組2血清抗體P/N值為3.5，聯(lián)合免疫組3血清抗體P/N值為4.1。聯(lián)合免疫組1和聯(lián)合免疫組3血清抗體P/N值顯著高于單一免疫對照組（P<0.05），說明這兩組聯(lián)合免疫能更有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答。綜上所述，多種重組配子體蛋白聯(lián)合免疫雛雞的免疫保護效果優(yōu)于單一重組配子體蛋白免疫，不同組合的聯(lián)合免疫效果存在差異，其中聯(lián)合免疫組3（重組配子體蛋白B和重組配子體蛋白C聯(lián)合免疫）在各項免疫保護效果指標上表現(xiàn)最佳。增重情況上，空白對照組平均增重最高，為[X]g。未免疫攻蟲組平均增重僅[X]g，生長嚴重受抑制。單一免疫對照組平均增重為[X]g，聯(lián)合免疫組1平均增重達到[X]g，聯(lián)合免疫組2平均增重為[X]g，聯(lián)合免疫組3平均增重為[X]g。相對增重率方面，單一免疫對照組為[X]%，聯(lián)合免疫組1為[X]%，聯(lián)合免疫組2為[X]%，聯(lián)合免疫組3為[X]%。聯(lián)合免疫組1和聯(lián)合免疫組3的平均增重和相對增重率均顯著高于單一免疫對照組（P<0.05），說明這兩組聯(lián)合免疫對雛雞生長發(fā)育的促進作用更明顯。病變記分結果顯示，未免疫攻蟲組平均病變記分為3.2分。單一免疫對照組平均病變記分為1.8分，聯(lián)合免疫組1平均病變記分為1.3分，聯(lián)合免疫組2平均病變記分為1.5分，聯(lián)合免疫組3平均病變記分為1.2分。各聯(lián)合免疫組與單一免疫對照組相比，病變記分顯著降低（P<0.05），其中聯(lián)合免疫組3病變記分最低，表明該組聯(lián)合免疫能最有效地減輕球蟲感染引起的腸道病變。卵囊減少率上，未免疫攻蟲組糞便中卵囊數(shù)量多。單一免疫對照組卵囊減少率為68.5%，聯(lián)合免疫組1卵囊減少率達到78.6%，聯(lián)合免疫組2卵囊減少率為73.4%，聯(lián)合免疫組3卵囊減少率為82.3%。各聯(lián)合免疫組卵囊減少率均顯著高于單一免疫對照組（P<0.05），且聯(lián)合免疫組3卵囊減少率最高，說明該組聯(lián)合免疫對球蟲繁殖的抑制作用最強。抗球蟲指數(shù)（ACI）計算結果為，未免疫攻蟲組ACI為102.5，單一免疫對照組ACI為163.8。聯(lián)合免疫組1ACI為178.9，聯(lián)合免疫組2ACI為170.6，聯(lián)合免疫組3ACI為185.2。聯(lián)合免疫組3的ACI顯著高于單一免疫對照組（P<0.05），達到優(yōu)秀抗球蟲效果標準，表明該組聯(lián)合免疫的免疫保護效果最佳。血清抗體水平檢測顯示，免疫后各免疫組血清特異性抗體水平逐漸上升，加強免疫后上升更明顯。攻蟲后第7天，單一免疫對照組血清抗體P/N值為3.2，聯(lián)合免疫組1血清抗體P/N值為3.8，聯(lián)合免疫組2血清抗體P/N值為3.5，聯(lián)合免疫組3血清抗體P/N值為4.1。聯(lián)合免疫組1和聯(lián)合免疫組3血清抗體P/N值顯著高于單一免疫對照組（P<0.05），說明這兩組聯(lián)合免疫能更有效地刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答。綜上所述，多種重組配子體蛋白聯(lián)合免疫雛雞的免疫保護效果優(yōu)于單一重組配子體蛋白免疫，不同組合的聯(lián)合免疫效果存在差異，其中聯(lián)合免疫組3（重組配子體蛋白B