巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物：合成、表征與生物活性的深度探究一、緒論1.1研究背景與意義1.1.1癌癥現(xiàn)狀與抗癌藥物的重要性癌癥，作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。2024年4月4日，影響因子排名第一的CA雜志發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計報告指出，約五分之一的人一生中會罹患癌癥，約九分之一的男性和十二分之一的女性會死于癌癥。據(jù)估計，2022年全球新發(fā)癌癥病例接近2000萬（若包括非黑色素瘤皮膚癌，新發(fā)癌癥病例為1996萬；若不包括非黑色素瘤皮膚癌，為1873萬），全球癌癥死亡數(shù)約970萬（若包括非黑色素瘤皮膚癌，為974萬；不包括非黑色素瘤皮膚癌，為967萬）。肺癌是全球最常發(fā)生的癌癥，占總新發(fā)病例的12.4%，同時也是癌癥死亡的首要原因，占癌癥死亡總數(shù)的18.7%。另一項發(fā)表于2021年12月30日《JAMAOncology》的研究顯示，2019年全球204個國家/地區(qū)中，新發(fā)癌癥患者估計2360萬（95%UI：2220-2490萬），癌癥死亡病例數(shù)估計1000萬（95%UI：936-1060萬）。從2010年到2019年，新發(fā)癌癥病例從1870萬增加到2360萬，數(shù)量增加了26.3%；癌癥死亡病例數(shù)從829萬增加到1000萬，數(shù)量增加了20.9%。更令人擔憂的是，根據(jù)2024年11月5日發(fā)表于《JAMANetworkOpen》的研究預測，與2022年相比，到2050年全球癌癥病例將增加76.6%，癌癥死亡人數(shù)將增加89.7%。當前，癌癥的治療手段主要包括手術、放療、化療、靶向治療和免疫治療等。手術治療對于早期癌癥患者具有較好的療效，但對于中晚期癌癥患者，往往難以徹底清除癌細胞，且手術創(chuàng)傷較大，恢復時間長。放療通過高能射線殺死癌細胞，但在治療過程中也會對周圍正常組織造成一定的損傷?；焺t是使用化學藥物來抑制或殺死癌細胞，然而傳統(tǒng)化療藥物缺乏特異性，在攻擊癌細胞的同時，也會對正常細胞產生毒性作用，導致患者出現(xiàn)一系列嚴重的副作用，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等，嚴重影響患者的生活質量。因此，開發(fā)新型抗癌藥物迫在眉睫。新型抗癌藥物不僅能夠提高癌癥的治療效果，延長患者的生存期，還能降低藥物的毒副作用，提高患者的生活質量。在當前的醫(yī)療環(huán)境下，尋找高效、低毒、具有特異性靶向作用的抗癌藥物，已成為醫(yī)藥領域研究的核心目標和重要方向，對于攻克癌癥這一醫(yī)學難題具有至關重要的意義。1.1.2巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的獨特優(yōu)勢巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物作為一類新型的抗癌藥物，近年來受到了廣泛的關注。巰嘌呤是一種重要的天然產物，具有廣泛的生物活性，在藥物領域被應用于許多疾病的治療，尤其是在腫瘤治療方面。其分子結構中含有一個巰基（-SH）和一個嘌呤環(huán)，巰基是發(fā)揮抗腫瘤作用的關鍵結構，通過與腫瘤細胞DNA結合，干擾DNA復制和轉錄，從而抑制腫瘤細胞的增殖。研究表明，巰嘌呤對多種腫瘤細胞具有抑制作用，如白血病、淋巴瘤、肺癌等。卟啉是一類具有特殊芳香環(huán)結構的重要天然產物，在生物體內參與多種重要的生理過程。卟啉及其衍生物具有良好的光物理和光化學性質，在光動力學治療、熒光成像等領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力。在癌癥治療中，卟啉可以作為光敏劑，在特定波長的光照射下，產生單線態(tài)氧等活性氧物種，從而殺死癌細胞。將巰嘌呤與卟啉通過化學鍵連接形成的巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物，整合了兩者的優(yōu)勢，展現(xiàn)出相較于傳統(tǒng)抗癌藥物的獨特特性。在靶向性方面，卟啉具有良好的腫瘤靶向性，能夠通過被動靶向（如增強的滲透和滯留效應，EPR效應）和主動靶向（如修飾靶向配體）等方式，特異性地富集于腫瘤組織。將巰嘌呤連接到卟啉上，可以使巰嘌呤更精準地到達腫瘤細胞，提高藥物在腫瘤部位的濃度，增強對腫瘤細胞的殺傷作用，同時減少對正常組織的損傷，降低藥物的毒副作用。在抗腫瘤活性上，巰嘌呤和卟啉之間可能存在協(xié)同作用。巰嘌呤通過干擾腫瘤細胞的DNA合成和代謝發(fā)揮抗癌作用，卟啉則可以通過光動力學效應產生活性氧物種破壞腫瘤細胞的結構和功能。兩者結合后，可能從多個途徑抑制腫瘤細胞的生長及擴散，增強抗腫瘤效果。相關研究表明，巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物在體外細胞實驗和動物模型中，對多種腫瘤細胞系均表現(xiàn)出較高的細胞毒性和抑制腫瘤細胞增殖的能力。巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物還可能具有一些其他潛在的優(yōu)勢，如良好的生物相容性和可修飾性。通過對卟啉環(huán)和巰嘌呤結構的合理修飾，可以進一步優(yōu)化藥物的性能，如調節(jié)藥物的溶解性、穩(wěn)定性、靶向性和抗癌活性等，以滿足不同的治療需求。這種新型抗癌藥物在癌癥治療領域具有廣闊的潛在應用價值，有望為癌癥患者帶來新的治療選擇和希望。1.2研究目的與內容本研究旨在深入探究巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的特性，通過一系列實驗和分析，為其在癌癥治療領域的應用提供堅實的理論與實踐基礎。具體而言，研究內容涵蓋以下幾個關鍵方面：設計并合成巰嘌呤鍵連卟啉化合物：依據(jù)巰嘌呤和卟啉的結構特點以及藥物設計原理，精心設計出一系列巰嘌呤鍵連卟啉化合物。綜合考慮反應條件、原料選擇和合成路線的可行性，運用化學合成方法，通過多步反應將巰嘌呤與卟啉連接起來。在合成過程中，嚴格控制反應條件，如溫度、反應時間、反應物比例等，以確?；衔锏募兌群彤a率。結構表征：利用核磁共振（NMR）技術，通過分析化合物中氫原子、碳原子等的化學位移、耦合常數(shù)等信息，確定分子中原子的連接方式和空間結構。運用質譜（MS）儀精確測定化合物的分子量，根據(jù)碎片離子的信息推斷分子的結構和裂解方式。結合紅外光譜（IR）分析化合物中官能團的振動吸收峰，確定分子中存在的化學鍵和官能團。通過這些手段，對合成得到的巰嘌呤鍵連卟啉化合物進行全面、準確的結構表征，為后續(xù)研究提供可靠的結構信息。細胞毒性檢測：運用細胞培養(yǎng)技術，選擇人類肝癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤細胞系作為研究對象，將不同濃度的巰嘌呤鍵連卟啉化合物加入到細胞培養(yǎng)體系中。采用MTT法，利用活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將黃色的MTT還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），而死細胞無此功能的原理，通過檢測甲瓚的生成量來反映細胞的存活數(shù)量和活性，從而檢測化合物對腫瘤細胞的細胞毒性。設置陽性藥物對照組，如常用的抗癌藥物順鉑等，對比分析巰嘌呤鍵連卟啉化合物與陽性藥物對細胞的作用差異。體外活性評價：通過細胞計數(shù)法，在不同時間點對加入化合物后的腫瘤細胞進行計數(shù)，繪制細胞生長曲線，直觀地評估巰嘌呤鍵連卟啉化合物對腫瘤細胞增殖的抑制能力。檢測細胞凋亡相關指標，如細胞凋亡率、凋亡蛋白的表達等，深入探究化合物誘導腫瘤細胞凋亡的機制。利用Transwell實驗，將腫瘤細胞接種在上室，下室加入含或不含化合物的培養(yǎng)液，觀察細胞穿過微孔膜遷移到下室的數(shù)量，以此評價化合物對腫瘤細胞遷移能力的影響。1.3國內外研究現(xiàn)狀1.3.1巰嘌呤的研究進展巰嘌呤作為一種重要的抗代謝藥物，在癌癥治療領域的研究歷史悠久。其作用機制主要是通過干擾DNA和RNA的合成，抑制腫瘤細胞的增殖。在白血病治療中，巰嘌呤是常用的一線藥物之一，對急性淋巴細胞白血病和慢性粒細胞白血病的維持治療效果顯著。一項發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學雜志》的研究表明，巰嘌呤聯(lián)合甲氨蝶呤用于兒童急性淋巴細胞白血病的維持治療，可顯著提高患者的無事件生存率和總生存率。隨著研究的深入，巰嘌呤在其他癌癥治療中的應用也逐漸被探索。有研究報道，巰嘌呤在淋巴瘤、絨毛膜上皮癌等疾病的治療中也具有一定的療效。在合成方法上，早期主要采用化學合成法，以嘌呤或嘧啶為原料，通過多步反應引入巰基。近年來，為了提高合成效率和產率，一些新的合成技術和方法不斷涌現(xiàn)，如微波輔助合成、固相合成等。微波輔助合成技術能夠顯著縮短反應時間，提高反應產率，為巰嘌呤及其衍生物的合成提供了新的思路。1.3.2卟啉的研究進展卟啉類化合物因其獨特的結構和性質，在光動力學治療、熒光成像、催化等多個領域展現(xiàn)出廣泛的應用前景。在光動力學治療癌癥方面，卟啉作為光敏劑，在特定波長光的照射下，能夠產生單線態(tài)氧等活性氧物種，從而破壞腫瘤細胞的結構和功能。大量的研究致力于開發(fā)新型卟啉光敏劑，以提高其光動力學治療效果。通過對卟啉分子結構的修飾，如引入不同的取代基、改變卟啉環(huán)的共軛結構等，可以調節(jié)卟啉的光物理性質、腫瘤靶向性和生物相容性。研究發(fā)現(xiàn)，將靶向基團如葉酸、抗體等連接到卟啉上，可以實現(xiàn)卟啉對腫瘤細胞的主動靶向，提高光動力學治療的特異性。在合成方法上，卟啉的合成主要包括經典的Adler法、Lindsey法等。Adler法是通過吡咯與醛在酸催化下反應合成卟啉，該方法操作簡單，但產率較低。Lindsey法則在較溫和的條件下進行，產率相對較高，且能夠合成結構復雜的卟啉衍生物。1.3.3巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的研究進展巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的研究相對較新，是近年來抗癌藥物研究的熱點之一。國內外學者通過不同的連接方式將巰嘌呤和卟啉結合起來，合成了一系列新型化合物，并對其生物活性進行了研究。在合成方法上，常見的策略是利用巰嘌呤上的活性基團（如巰基、氨基等）與卟啉上的官能團（如羧基、鹵代烴基等）發(fā)生化學反應，形成穩(wěn)定的化學鍵。有研究報道通過將巰嘌呤的巰基與卟啉的溴代烷基反應，成功合成了巰嘌呤鍵連卟啉化合物。在生物活性研究方面，已有的研究表明，這類化合物對多種腫瘤細胞系表現(xiàn)出較好的細胞毒性和抑制腫瘤細胞增殖的能力。一項體外細胞實驗顯示，巰嘌呤鍵連卟啉化合物對肝癌細胞HepG2的IC50值明顯低于單獨使用巰嘌呤或卟啉，表明兩者結合后具有協(xié)同抗癌作用。一些研究還發(fā)現(xiàn)，該類化合物具有良好的腫瘤靶向性，能夠通過EPR效應等機制在腫瘤組織中富集，提高藥物在腫瘤部位的濃度。1.3.4當前研究的不足與本研究的切入點盡管巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的研究取得了一定的進展，但仍存在一些不足之處。目前合成方法的產率和純度有待進一步提高，合成路線較為復雜，反應條件較為苛刻，不利于大規(guī)模制備。在生物活性研究方面，雖然已證實該類化合物具有較好的抗癌活性，但對其作用機制的研究還不夠深入，尤其是巰嘌呤和卟啉之間協(xié)同作用的分子機制尚不明確。針對這些問題，本研究擬從以下幾個方面展開：一是優(yōu)化合成路線，探索更加溫和、高效的合成方法，提高化合物的產率和純度；二是深入研究巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的作用機制，通過細胞生物學、分子生物學等手段，揭示其在細胞內的作用靶點和信號傳導通路，為藥物的進一步優(yōu)化和臨床應用提供理論依據(jù)。二、相關理論基礎2.1巰嘌呤的結構與性質2.1.1化學結構巰嘌呤（Mercaptopurine），化學名為6-巰基嘌呤，分子式為C_5H_4N_4S，分子量為152.177。其分子結構由一個嘌呤環(huán)和一個巰基（-SH）組成，嘌呤環(huán)是由一個嘧啶環(huán)和一個咪唑環(huán)稠合而成，具有芳香性。巰基連接在嘌呤環(huán)的6位碳原子上，這種結構賦予了巰嘌呤獨特的化學和生物學性質。巰嘌呤的化學結構使其能夠與生物分子中的多種基團發(fā)生相互作用，尤其是巰基的存在，使其具有較強的親核性，能夠參與多種化學反應，這在其發(fā)揮藥理作用的過程中起著關鍵作用。2.1.2物理化學性質從外觀上看，巰嘌呤通常為黃色結晶性粉末，無臭，味微甜。在溶解性方面，它在水或乙醇中極微溶解，在乙醚中幾乎不溶。這種溶解性特點與分子的結構和極性有關，嘌呤環(huán)的芳香性和疏水性使得分子在極性較小的有機溶劑中溶解性較差，而巰基的存在雖然增加了一定的極性，但整體上仍不足以使其在水中具有良好的溶解性。遇光易變色是巰嘌呤的一個重要性質，這是由于其分子結構在光的作用下可能發(fā)生變化，導致其化學性質和外觀發(fā)生改變。在140℃時，巰嘌呤會失去結晶水，這一特性在其制備和儲存過程中需要特別注意，溫度的控制對于保持其化學結構和活性至關重要。此外，它易溶于堿性水溶液，但在堿性條件下不穩(wěn)定，會緩慢水解。這是因為堿性環(huán)境會促進巰基的解離，使分子結構變得不穩(wěn)定，進而發(fā)生水解反應。在空氣中光照時，巰嘌呤會變成黑色，這進一步表明其對光和空氣的敏感性，在儲存和使用過程中需要采取避光、密封等措施。2.1.3生物活性及作用機制抗腫瘤活性：巰嘌呤是一種重要的抗代謝抗腫瘤藥物，其主要作用機制是干擾DNA和RNA的合成。它進入體內后，在細胞內被磷酸核糖轉移酶轉化為6-巰基嘌呤核糖核苷酸，該活性代謝產物能夠競爭性地抑制次黃嘌呤的轉變過程。具體來說，它通過負反饋作用抑制酰胺轉移酶，阻止1-焦磷酸-5-磷酸核糖（PRPP）轉為1-氨基-5-磷酸核糖（PRA），從而干擾嘌呤核苷酸合成的起始階段。巰嘌呤還能抑制次黃嘌呤核苷酸轉為腺嘌呤核苷酸及次黃嘌呤核苷酸轉為黃嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸的過程。它還抑制輔酶I（NAD+）的合成，并減少生物合成DNA所必需的脫氧三磷酸腺苷（dATP）及脫氧三磷酸鳥苷（dGTP），使腫瘤細胞的DNA和RNA合成受阻，從而抑制腫瘤細胞的增殖。巰嘌呤對處于S增殖周期的細胞較為敏感，除了抑制細胞DNA的合成外，對細胞RNA的合成也有輕度的抑制作用。免疫調節(jié)作用：除了抗腫瘤作用外，巰嘌呤還具有一定的免疫調節(jié)活性。它可以抑制淋巴細胞的增殖和功能，從而調節(jié)免疫系統(tǒng)的反應。在一些自身免疫性疾病的治療中，巰嘌呤被用于抑制過度活躍的免疫系統(tǒng)，減輕炎癥反應。其免疫調節(jié)機制可能與干擾淋巴細胞內的核酸合成有關，影響淋巴細胞的活化、增殖和分化過程?？共《净钚裕河醒芯勘砻?，巰嘌呤在一定程度上還具有抗病毒活性。它可以通過干擾病毒的核酸合成過程，抑制病毒的復制和傳播。在某些病毒感染的治療中，巰嘌呤可能作為輔助藥物發(fā)揮作用。其抗病毒的具體作用機制還需要進一步深入研究，但推測與它對核酸合成的干擾作用密切相關，通過抑制病毒在宿主細胞內的核酸合成，從而達到抗病毒的效果。2.2卟啉的結構與性質2.2.1化學結構卟啉（Porphyrin）是一類由四個吡咯環(huán)通過次甲基（-CH=）橋連接而成的具有大共軛體系的雜環(huán)化合物。其基本骨架結構為卟吩（Porphine），卟吩分子中的18個π電子形成了一個高度共軛的平面大環(huán)結構，這種共軛結構賦予了卟啉獨特的物理和化學性質。卟吩環(huán)上有20個位置可以被取代基取代，通過引入不同的取代基，如烷基、芳基、羧基、氨基等，可以得到多種多樣的卟啉衍生物，這些衍生物在結構和性質上表現(xiàn)出很大的差異，從而滿足不同的應用需求。在卟啉分子中，中心的四個氮原子可以與金屬離子配位形成金屬卟啉配合物。常見的金屬離子有鐵（Fe）、鎂（Mg）、鋅（Zn）、鈷（Co）等。以血紅素為例，它是一種鐵卟啉配合物，鐵離子位于卟啉環(huán)的中心，與四個氮原子配位，這種結構使得血紅素在生物體內能夠有效地運輸氧氣。葉綠素則是一種鎂卟啉配合物，鎂離子與卟啉環(huán)配位，在光合作用中起著關鍵作用。金屬離子的引入不僅改變了卟啉的電子結構和光學性質，還賦予了金屬卟啉配合物特殊的生物活性和催化性能。2.2.2光學性質卟啉及其衍生物具有獨特的光學性質，在紫外-可見光譜（UV-Vis）區(qū)域有明顯的吸收峰。其中，Soret帶（又稱B帶）是卟啉的特征吸收帶，位于紫外光區(qū)（約390-430nm），是由卟啉分子的π-π躍遷引起的，吸收強度非常大。Q帶位于可見光區(qū)（約500-700nm），是由卟啉分子的n-π躍遷引起的，吸收強度相對較弱。這些吸收帶的位置和強度會受到卟啉分子結構、取代基以及與金屬離子配位等因素的影響。當卟啉分子中引入吸電子基團時，Soret帶和Q帶會發(fā)生紅移；而引入供電子基團時，吸收帶則會發(fā)生藍移。與金屬離子配位后，卟啉的吸收光譜也會發(fā)生明顯變化。在熒光光譜方面，卟啉在受到特定波長的光激發(fā)后，會發(fā)射出熒光。其熒光發(fā)射峰通常位于600-800nm的近紅外區(qū)域。卟啉的熒光量子產率是衡量其熒光發(fā)射效率的重要參數(shù)，不同結構的卟啉及其衍生物的熒光量子產率有所不同。一些卟啉衍生物通過結構修飾，可以提高其熒光量子產率，使其在熒光成像等領域具有更好的應用效果。卟啉的熒光壽命也是其重要的光學參數(shù)之一，它反映了卟啉分子在激發(fā)態(tài)的平均停留時間。通過測量卟啉的熒光壽命，可以了解其分子結構和所處環(huán)境的信息。2.2.3在腫瘤細胞中的富集作用卟啉及其衍生物對腫瘤細胞具有特殊的親和力，能夠在腫瘤細胞中大量富集，這一特性使得它們在腫瘤診斷和治療中具有重要的應用價值。其富集機制主要包括以下幾個方面：增強的滲透和滯留效應（EPR效應）：腫瘤組織的血管結構與正常組織不同，具有高通透性和不完善的淋巴回流系統(tǒng)。卟啉及其衍生物作為相對較大的分子，能夠通過腫瘤血管的高通透性進入腫瘤組織間隙，并由于淋巴回流不暢而在腫瘤組織中滯留，從而實現(xiàn)被動靶向富集。研究表明，許多卟啉類光敏劑在腫瘤組織中的濃度明顯高于正常組織，這為光動力學治療提供了有利條件。主動靶向作用：通過對卟啉分子進行修飾，連接上具有靶向性的配體，如葉酸、抗體、多肽等，可以實現(xiàn)對腫瘤細胞的主動靶向。葉酸受體在許多腫瘤細胞表面高表達，將葉酸連接到卟啉上，葉酸與腫瘤細胞表面的葉酸受體特異性結合，從而使卟啉能夠特異性地富集到腫瘤細胞上。利用抗體與腫瘤細胞表面抗原的特異性結合，也可以實現(xiàn)卟啉對腫瘤細胞的主動靶向富集。與腫瘤細胞內生物分子的相互作用：卟啉分子還可以通過與腫瘤細胞內的生物分子，如蛋白質、核酸等發(fā)生相互作用，從而在腫瘤細胞內富集。卟啉可以與腫瘤細胞內的某些蛋白質結合，形成穩(wěn)定的復合物，導致卟啉在腫瘤細胞內的濃度升高。卟啉與核酸之間也可能存在相互作用，影響核酸的結構和功能，同時實現(xiàn)卟啉在腫瘤細胞內的富集。2.2.4光動力學治療癌癥的作用機理光動力學治療（PhotodynamicTherapy，PDT）是利用光敏劑在特定波長光的照射下，產生單線態(tài)氧等活性氧物種，從而殺死癌細胞的一種治療方法。卟啉作為一類重要的光敏劑，在光動力學治療中發(fā)揮著關鍵作用。其作用機理主要包括以下幾個步驟：光敏劑的吸收和激發(fā)：卟啉分子在腫瘤細胞中富集后，吸收特定波長的光，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。這個過程中，卟啉分子吸收光子的能量，使分子中的電子從低能級軌道躍遷到高能級軌道。能量轉移和活性氧生成：處于激發(fā)態(tài)的卟啉分子通過系間竄越過程，從單線態(tài)激發(fā)態(tài)轉變?yōu)槿€態(tài)激發(fā)態(tài)。三線態(tài)激發(fā)態(tài)的卟啉分子具有較長的壽命，能夠與周圍的氧分子發(fā)生能量轉移，將能量傳遞給氧分子，使氧分子從基態(tài)的三線態(tài)轉變?yōu)閱尉€態(tài)，生成單線態(tài)氧（^1O_2）。單線態(tài)氧是一種具有強氧化性的活性氧物種，其氧化能力比基態(tài)氧分子強得多。細胞損傷和死亡：生成的單線態(tài)氧能夠與腫瘤細胞內的生物分子，如蛋白質、核酸、脂質等發(fā)生氧化反應，破壞這些生物分子的結構和功能。單線態(tài)氧可以氧化蛋白質中的氨基酸殘基，導致蛋白質變性失活；氧化核酸中的堿基，引起DNA損傷和基因突變；氧化脂質中的不飽和脂肪酸，導致細胞膜的結構和功能受損。這些損傷最終導致腫瘤細胞凋亡、壞死或自噬，從而達到治療癌癥的目的。2.2.5體內代謝過程卟啉在體內的代謝過程較為復雜，涉及多個器官和生物轉化途徑。當卟啉進入體內后，首先會通過血液循環(huán)分布到各個組織和器官。在肝臟中，卟啉會被肝細胞攝取，一部分卟啉可能會被代謝酶代謝，如細胞色素P450酶系等。這些酶可以對卟啉進行氧化、還原、水解等生物轉化反應，改變卟啉的結構和性質，使其更易于排出體外。卟啉還可能通過膽汁排泄到腸道中。在腸道中，卟啉可能會被腸道菌群進一步代謝，或者直接隨糞便排出體外。一部分卟啉也可能通過腎臟排泄到尿液中。腎臟通過腎小球的濾過和腎小管的重吸收等過程，將卟啉及其代謝產物排出體外。不同結構的卟啉在體內的代謝速度和途徑可能會有所不同。一些水溶性較好的卟啉可能更容易通過腎臟排泄，而脂溶性較高的卟啉則可能更多地通過膽汁排泄。2.3藥物合成與表征的基本原理2.3.1藥物合成的常見反應類型藥物合成涉及多種類型的化學反應，這些反應是構建藥物分子結構的基礎。鹵化反應是向有機化合物分子中引入鹵素原子的反應，根據(jù)反應底物和反應條件的不同，可分為飽和烷烴的取代鹵化、不飽和烴的加成鹵化、芳香環(huán)上的鹵取代等。在制備含鹵素的有機藥物時，鹵化反應起著關鍵作用，如通過不飽和烴與鹵素的加成反應，可以合成具有特定生理活性的鹵代烴藥物。烴化反應是有機物分子中C、N、O等原子被烴基取代的反應，按反應歷程可分為SN1、SN2和親電取代反應。從烴化劑的種類來看，常用的有鹵代烷、硫酸酯、磺酸酯、醇、烯烴、環(huán)氧烷等。在藥物合成中，烴化反應常用于引入特定的烴基結構，改變藥物分子的理化性質和生物活性。以丁卡因的合成為例，通過對普魯卡因進行烴化反應，引入特定的烴基，使其藥效提高到普魯卡因的10倍。?；磻窃谟袡C化合物分子中引入酰基的反應，常用的?；噭┌人帷Ⅳ人嵫苌铮ㄈ珲｛u、酸酐、酯等）和其他酰化劑。氧原子的?；磻切纬婶人狨サ姆磻?，包括羧酸的酯化反應和羧酸衍生物的醇解反應。?；磻谒幬锖铣芍锌捎糜谛揎椝幬锓肿拥墓倌軋F，改善藥物的穩(wěn)定性、溶解性和生物利用度等?？s合反應是兩個或多個有機化合物分子通過反應形成一個較大分子的反應，同時伴有小分子（如水、醇、氨等）的生成。羥醛縮合是一種重要的縮合反應，含有α-H的醛或酮，在堿或酸的催化作用下生成β-羥基醛或β-羥基酮。這種反應在藥物分子骨架的構建中具有重要應用，能夠形成復雜的碳-碳鍵結構。氧化反應和還原反應是改變有機化合物分子中原子氧化態(tài)的反應。氧化反應是使有機化合物分子中某原子的氧化態(tài)升高的反應，常用的氧化劑包括高錳酸鉀、過氧化氫、鉻酸等。還原反應則是使有機化合物分子中某原子的氧化態(tài)降低的反應，常用的還原劑有氫氣（需催化劑）、氫化鋁鋰、硼氫化鈉等。在藥物合成中，氧化反應和還原反應可用于引入或轉化特定的官能團，構建藥物分子的結構。2.3.2藥物合成路線設計的基本原則藥物合成路線設計是藥物研發(fā)過程中的關鍵環(huán)節(jié)，需要綜合考慮多個因素，以確保合成路線的可行性、高效性和經濟性。在選擇原料時，應優(yōu)先選用來源廣泛、價格低廉、易于獲取的原料。這樣不僅可以降低生產成本，還能保證原料的可持續(xù)供應。以常見的藥物合成原料乙醇為例，它來源豐富，價格相對較低，在許多藥物合成反應中被廣泛應用。反應步驟應盡可能簡短，以減少合成過程中的副反應和雜質生成，同時提高合成效率。每增加一步反應，都可能引入新的雜質，增加分離和純化的難度。因此，在設計合成路線時，應盡量避免不必要的反應步驟，采用簡潔高效的合成策略。反應條件應溫和，避免使用高溫、高壓、強酸、強堿等極端條件。溫和的反應條件有利于減少設備投資和操作風險，同時也能提高反應的選擇性和產率。在某些藥物合成反應中，通過優(yōu)化反應條件，采用溫和的催化劑和適宜的反應溫度、壓力等，可以在保證反應順利進行的同時，減少對設備的要求和對環(huán)境的影響。高選擇性和高產率是藥物合成路線設計的重要目標。選擇性高的反應可以減少副產物的生成，簡化后續(xù)的分離和純化過程；高產率則可以提高藥物的生產效率，降低生產成本。在設計合成路線時，應選擇具有高選擇性和高產率的反應，并通過優(yōu)化反應條件進一步提高選擇性和產率。合成路線還應考慮綠色化學的要求，減少對環(huán)境的影響。這包括使用綠色溶劑、減少廢棄物的產生、提高原子利用率等。綠色溶劑如乙醇、水等，具有低毒性、易回收等優(yōu)點；提高原子利用率可以使反應物盡可能多地轉化為目標產物，減少廢棄物的生成。2.3.3核磁共振技術在藥物結構表征中的應用原理核磁共振（NuclearMagneticResonance，NMR）技術是藥物結構表征中不可或缺的手段，其基本原理基于原子核的自旋特性。許多原子核，如氫原子核（^1H）、碳原子核（^{13}C）等，都具有自旋角動量，在磁場中會產生不同的能級。當原子核處于外磁場中時，會發(fā)生能級分裂，形成不同的自旋取向。此時，若向體系施加特定頻率的射頻脈沖，當射頻脈沖的能量等于原子核不同自旋取向的能級差時，原子核會吸收射頻脈沖的能量，從低能級躍遷到高能級，這種現(xiàn)象稱為核磁共振。在藥物結構表征中，^1HNMR譜提供了關于藥物分子中氫原子的信息?；瘜W位移是^1HNMR譜中的重要參數(shù)，它反映了氫原子在分子中的化學環(huán)境。不同化學環(huán)境的氫原子，由于受到周圍電子云密度和鄰近原子的影響不同，其化學位移值也不同。通過分析化學位移，可以確定藥物分子中不同類型氫原子的存在，如甲基氫、亞甲基氫、芳環(huán)氫等。耦合常數(shù)則反映了相鄰氫原子之間的相互作用，通過分析耦合常數(shù)，可以確定氫原子之間的連接方式和相對位置。積分面積與氫原子的數(shù)目成正比，通過積分面積的測量，可以確定不同類型氫原子的相對數(shù)目。^{13}CNMR譜主要提供藥物分子中碳原子的信息。與^1HNMR類似，^{13}C的化學位移也反映了碳原子的化學環(huán)境。由于^{13}C的天然豐度較低，^{13}CNMR譜的靈敏度相對較低，但它在確定藥物分子的骨架結構和碳原子的連接方式方面具有重要作用。通過^{13}CNMR譜，可以確定藥物分子中不同類型碳原子的存在，如飽和碳原子、不飽和碳原子、羰基碳原子等。2.3.4質譜儀在藥物結構鑒定中的原理與應用質譜（MassSpectrometry，MS）儀是另一種重要的藥物結構鑒定工具，其基本原理是將藥物分子離子化，然后根據(jù)離子的質荷比（m/z）對離子進行分離和檢測。在質譜儀中，藥物分子首先被引入離子源，通過電子轟擊、化學電離、電噴霧電離等方式離子化，形成帶正電荷或負電荷的離子。這些離子在電場和磁場的作用下，按照質荷比的大小進行分離。質量分析器是質譜儀的核心部件，它能夠精確測量離子的質荷比。檢測器則用于檢測經過質量分析器分離后的離子，并將其轉化為電信號，最終得到質譜圖。在藥物結構鑒定中，質譜儀可以提供藥物分子的分子量信息。通過測量分子離子峰的質荷比，可以確定藥物分子的精確分子量，這對于確定藥物分子的分子式和結構具有重要意義。質譜儀還可以通過分析碎片離子的質荷比和相對豐度，推斷藥物分子的結構和裂解方式。當藥物分子在離子源中離子化后，會發(fā)生裂解，產生各種碎片離子。這些碎片離子的結構和相對豐度與藥物分子的結構密切相關。通過對碎片離子的分析，可以了解藥物分子中化學鍵的斷裂方式和分子的結構特征。在鑒定巰嘌呤鍵連卟啉化合物的結構時，質譜儀可以準確測定其分子量，確定分子中巰嘌呤和卟啉部分的連接方式。通過對碎片離子的分析，可以推斷出化合物在裂解過程中巰嘌呤和卟啉結構的變化，從而進一步確定化合物的結構。2.4細胞實驗與生物活性評價方法2.4.1細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)技術是進行細胞實驗的基礎，其過程需嚴格遵循無菌操作原則，以確保細胞在適宜的環(huán)境中生長和繁殖。在本研究中，選用了多種常見的腫瘤細胞株，如人類肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞株SGC-7901和肺癌細胞株A549等，這些細胞株在癌癥研究中具有廣泛的應用，能夠較好地反映巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物對不同類型腫瘤細胞的作用效果。針對不同的腫瘤細胞株，培養(yǎng)條件存在一定差異。HepG2細胞通常使用含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱。胎牛血清為細胞提供了生長所需的營養(yǎng)物質、生長因子和激素等，對維持細胞的正常生長和代謝至關重要。DMEM培養(yǎng)基則含有細胞生長所需的氨基酸、維生素、葡萄糖等成分，能夠滿足HepG2細胞的營養(yǎng)需求。SGC-7901細胞的培養(yǎng)使用含10%FBS的RPMI1640（RoswellParkMemorialInstitute1640）培養(yǎng)基，同樣置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中。RPMI1640培養(yǎng)基特別適合懸浮細胞和貼壁細胞的生長，為SGC-7901細胞提供了適宜的生存環(huán)境。A549細胞培養(yǎng)采用含10%FBS的F-12K培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件與上述細胞相同。F-12K培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富，能夠支持A549細胞的正常生長和增殖。在細胞培養(yǎng)過程中，有諸多注意事項。無菌操作是關鍵，整個操作過程需在超凈工作臺中進行，使用的所有器材，如培養(yǎng)瓶、吸管、移液器槍頭、培養(yǎng)基等都需經過嚴格的滅菌處理，以防止微生物污染細胞。細胞傳代時，需掌握合適的時機，當細胞生長至對數(shù)生長期，且匯合度達到80%-90%時，應及時進行傳代，以避免細胞因過度生長而出現(xiàn)老化、死亡等現(xiàn)象。傳代過程中，需使用胰蛋白酶消化細胞，消化時間要嚴格控制，時間過短細胞不易從培養(yǎng)瓶壁脫落，時間過長則會對細胞造成損傷。培養(yǎng)基的更換頻率也很重要，一般每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以保證細胞生長環(huán)境中營養(yǎng)物質的充足供應，并及時去除細胞代謝產生的廢物。在觀察細胞生長狀態(tài)時，可使用倒置顯微鏡，定期觀察細胞的形態(tài)、密度和生長情況，如發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)異常、生長緩慢或出現(xiàn)污染跡象，應及時采取相應措施。2.4.2MTT法檢測細胞毒性MTT法是一種廣泛應用于檢測細胞毒性的方法，其原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將黃色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），而死細胞無此功能。因此，通過檢測甲瓚的生成量，可間接反映細胞的存活數(shù)量和活性。MTT法的操作步驟較為嚴謹。首先，將對數(shù)生長期的腫瘤細胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，然后用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋至合適濃度，以每孔1000-10000個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μL細胞懸液。接種細胞時，需確保細胞懸液均勻分布在孔板中，可輕輕晃動孔板使細胞分散均勻。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。這一步是為了讓細胞在孔板中穩(wěn)定生長，以便后續(xù)實驗的進行。培養(yǎng)24小時后，吸去孔板中的原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度巰嘌呤鍵連卟啉化合物的新鮮培養(yǎng)基，同時設置對照組，對照組加入等體積的不含藥物的培養(yǎng)基。藥物濃度的設置通常采用倍比稀釋法，如從高濃度開始，依次稀釋為100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L等，每個濃度設置3-5個復孔，以減少實驗誤差。將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，使藥物與細胞充分作用。在培養(yǎng)過程中，需注意培養(yǎng)箱的溫度和CO?濃度的穩(wěn)定，避免對細胞生長產生影響。48小時后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制，pH=7.4），繼續(xù)孵育4小時。MTT溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配，配制后需過濾除菌，并避光保存，以保證其活性。孵育結束后，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需先離心（1000rpm，5分鐘）后再吸棄上清液。然后每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。DMSO具有較強的溶解性，能夠將甲瓚溶解，以便后續(xù)檢測。最后，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值（OD值）。酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀在使用前需進行校準和調試，確保測量結果的準確性。記錄各孔的OD值后，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。通過比較實驗組和對照組的OD值，計算細胞存活率，公式為：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。根據(jù)細胞存活率可評估巰嘌呤鍵連卟啉化合物對腫瘤細胞的細胞毒性，IC??值（半數(shù)抑制濃度）是衡量藥物細胞毒性的重要指標，即能抑制50%細胞生長的藥物濃度，可通過軟件擬合曲線計算得出。2.4.3體外抑制腫瘤細胞增殖和遷移能力的評價方法評價細胞增殖能力對于深入了解巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的作用機制至關重要，可通過多種方法實現(xiàn)。細胞計數(shù)是一種直觀的評價方法，在不同時間點（如24小時、48小時、72小時）對加入化合物后的腫瘤細胞進行計數(shù)。具體操作時，將細胞從培養(yǎng)瓶中消化下來，制成單細胞懸液，然后用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下進行計數(shù)。以細胞數(shù)量為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線，通過觀察曲線的斜率和趨勢，可直觀地評估藥物對腫瘤細胞增殖的抑制能力。如果藥物能夠有效抑制細胞增殖，細胞生長曲線會呈現(xiàn)出較平緩的趨勢，細胞數(shù)量增長緩慢。檢測細胞凋亡相關指標也是評價細胞增殖能力的重要手段。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種方式，當細胞受到藥物作用時，可能會引發(fā)凋亡過程。常用的檢測指標包括細胞凋亡率和凋亡蛋白的表達。細胞凋亡率可通過流式細胞術進行檢測，將細胞用AnnexinV-FITC/PI（異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶）雙染試劑染色，AnnexinV-FITC能夠與凋亡早期細胞膜表面暴露的磷脂酰絲氨酸特異性結合，PI則可穿透死亡細胞的細胞膜，對細胞核進行染色。通過流式細胞儀檢測不同熒光強度的細胞群體，可區(qū)分出正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，從而計算出細胞凋亡率。凋亡蛋白的表達水平可通過蛋白質免疫印跡法（WesternBlot）進行檢測。提取細胞總蛋白，通過SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）將蛋白樣品按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白轉移到固相膜上，用特異性抗體與目標凋亡蛋白（如Caspase-3、Bax等）結合，再用二抗與一抗結合，最后通過化學發(fā)光法或顯色法檢測條帶的強度，從而分析凋亡蛋白的表達變化。如果藥物能夠誘導細胞凋亡，凋亡蛋白的表達水平通常會發(fā)生相應變化，如Caspase-3的活化形式表達增加，Bax的表達上調等。評價腫瘤細胞的遷移能力對于研究藥物抑制腫瘤轉移具有重要意義，Transwell實驗是常用的方法之一。該實驗利用Transwell小室，小室由上室和下室組成，中間用一層有微孔的聚碳酸酯膜隔開。上室接種腫瘤細胞，下室加入含或不含化合物的培養(yǎng)液。細胞在趨化因子的作用下，會從高濃度區(qū)域（上室）向低濃度區(qū)域（下室）遷移。遷移過程中，細胞會穿過微孔膜到達下室。在培養(yǎng)一定時間（如24小時）后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將下室遷移的細胞固定、染色（如用結晶紫染色），在顯微鏡下計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)量。通過比較實驗組和對照組遷移細胞的數(shù)量，可評價巰嘌呤鍵連卟啉化合物對腫瘤細胞遷移能力的影響。如果藥物能夠抑制腫瘤細胞遷移，實驗組遷移到下室的細胞數(shù)量會明顯少于對照組。三、巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的合成3.1分子設計原理藥物設計是新藥研發(fā)的關鍵環(huán)節(jié)，其核心目標是開發(fā)出高效、低毒、特異性強的藥物。在藥物設計中，藥物拼合原理和類似物設計原理是兩種重要的策略。藥物拼合原理是將兩個或多個具有不同生物活性的分子片段，通過共價鍵連接成一個新的分子，期望新分子能夠整合各個片段的優(yōu)勢，產生協(xié)同效應，提高藥物的療效和特異性。類似物設計原理則是在已知活性化合物的結構基礎上，通過對其結構進行微小的修飾和改變，如替換基團、改變官能團的位置或數(shù)量等，合成一系列結構類似的化合物，從中篩選出活性更好、毒性更低的藥物。在設計巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物時，充分運用了這兩種原理。從結構特點來看，巰嘌呤分子中含有一個巰基（-SH）和一個嘌呤環(huán)，巰基是發(fā)揮抗腫瘤作用的關鍵結構，能夠與腫瘤細胞DNA結合，干擾DNA復制和轉錄，從而抑制腫瘤細胞的增殖。卟啉則是由四個吡咯環(huán)通過次甲基（-CH=）橋連接而成的具有大共軛體系的雜環(huán)化合物，其中心的四個氮原子可以與金屬離子配位形成金屬卟啉配合物。卟啉及其衍生物具有良好的光物理和光化學性質，在光動力學治療、熒光成像等領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力?；谒幬锲春显?，將巰嘌呤與卟啉通過化學鍵連接，期望整合兩者的優(yōu)勢。卟啉具有良好的腫瘤靶向性，能夠通過被動靶向（如增強的滲透和滯留效應，EPR效應）和主動靶向（如修飾靶向配體）等方式，特異性地富集于腫瘤組織。將巰嘌呤連接到卟啉上，可以使巰嘌呤更精準地到達腫瘤細胞，提高藥物在腫瘤部位的濃度，增強對腫瘤細胞的殺傷作用，同時減少對正常組織的損傷，降低藥物的毒副作用。從作用機制上看，巰嘌呤通過干擾腫瘤細胞的DNA合成和代謝發(fā)揮抗癌作用，卟啉則可以通過光動力學效應產生活性氧物種破壞腫瘤細胞的結構和功能。兩者結合后，可能從多個途徑抑制腫瘤細胞的生長及擴散，產生協(xié)同抗癌作用。在類似物設計原理的指導下，對巰嘌呤和卟啉的結構進行合理修飾。通過改變卟啉環(huán)上的取代基，如引入不同的烷基、芳基、羧基、氨基等，可以調節(jié)卟啉的光物理性質、腫瘤靶向性和生物相容性。在卟啉環(huán)上引入吸電子基團，可能會使卟啉的吸收光譜發(fā)生紅移，增強其對特定波長光的吸收能力，從而提高光動力學治療的效果。對巰嘌呤的結構進行修飾，如在嘌呤環(huán)上引入特定的官能團，可能會改變其與腫瘤細胞DNA的結合方式和親和力，進一步增強其抗腫瘤活性。通過這種結構修飾和類似物設計，有望篩選出活性更高、毒性更低的巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物。3.2合成路線設計3.2.1以吡咯為原料合成以吡咯為起始原料合成巰嘌呤鍵連卟啉，通常需要經過多步反應。首先，吡咯與相應的醛在酸催化下發(fā)生縮合反應，生成卟啉原。這一步反應是構建卟啉大環(huán)結構的關鍵步驟，常用的醛有苯甲醛、對甲氧基苯甲醛等。在酸催化過程中，一般使用丙酸、三氟乙酸等作為催化劑，反應溫度通?？刂圃诨亓鳒囟?，反應時間為2-4小時。在反應過程中，可能會發(fā)生副反應，如吡咯的自身聚合，導致產率降低。為了減少副反應的發(fā)生，需要嚴格控制反應條件，如酸的用量、反應溫度和時間等。卟啉原進一步氧化得到卟啉。常用的氧化劑有DDQ（2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌）、四氯苯醌等。氧化反應一般在有機溶劑中進行，如二氯甲烷、氯仿等，反應溫度為室溫，反應時間為1-2小時。氧化反應過程中，需要注意氧化劑的用量，過量的氧化劑可能會導致卟啉結構的破壞。得到卟啉后，需要對其進行修飾，引入能夠與巰嘌呤連接的官能團。常見的方法是通過鹵代反應，在卟啉環(huán)上引入鹵原子，如溴原子。以溴代反應為例，將卟啉溶解在適當?shù)娜軇┲?，如氯仿，加入溴化試劑，如N-溴代丁二酰亞胺（NBS），在光照或加熱條件下進行反應，反應時間為2-3小時。反應過程中，要注意控制反應條件，避免過度溴代，影響后續(xù)反應。將修飾后的卟啉與巰嘌呤在堿性條件下反應，形成巰嘌呤鍵連卟啉。常用的堿有碳酸鉀、碳酸鈉等，反應溶劑為N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）等。反應溫度一般在60-80℃，反應時間為12-24小時。在這一步反應中，可能會存在副反應，如巰嘌呤的自身聚合，或者修飾后的卟啉與堿發(fā)生其他副反應，影響產物的純度和產率。3.2.2以S取代溴乙烷基巰嘌呤為中間體合成以S取代溴乙烷基巰嘌呤為中間體合成巰嘌呤鍵連卟啉，首先需要制備S取代溴乙烷基巰嘌呤中間體。其制備方法通常是將巰嘌呤與1,2-二溴乙烷在堿性條件下反應。以碳酸鉀作為堿，在DMF溶劑中，反應溫度控制在60-70℃，反應時間為6-8小時。在反應過程中，要注意控制反應條件，避免巰嘌呤的氧化和其他副反應的發(fā)生。反應結束后，通過柱層析等方法對中間體進行分離和純化，以獲得高純度的S取代溴乙烷基巰嘌呤。將制備好的S取代溴乙烷基巰嘌呤與修飾后的卟啉進行反應。修飾后的卟啉通常含有羥基、氨基等官能團，能夠與S取代溴乙烷基巰嘌呤發(fā)生親核取代反應。以含有羥基的卟啉為例，在堿性條件下，羥基與S取代溴乙烷基巰嘌呤中的溴原子發(fā)生親核取代反應，形成巰嘌呤鍵連卟啉。反應中常用的堿為三乙胺，反應溶劑為DMF，反應溫度為80-90℃，反應時間為12-16小時。這一步反應中，中間體S取代溴乙烷基巰嘌呤起著關鍵作用，它作為連接巰嘌呤和卟啉的橋梁，決定了最終產物的結構和性質。3.2.3以修飾的卟啉為中間體合成以修飾的卟啉為中間體合成巰嘌呤鍵連卟啉，首先對卟啉進行修飾，引入活性官能團。修飾基團的選擇對反應活性和產物結構有著重要影響。當引入羧基時，可通過在卟啉環(huán)上的特定位置進行親電取代反應來實現(xiàn)。以5,10,15,20-四苯基卟啉為例，在適當?shù)姆磻獥l件下，與丁二酸酐在三氯化鋁等催化劑的作用下發(fā)生傅-克?；磻?，在卟啉環(huán)上引入羧基。反應溫度一般在100-120℃，反應時間為6-8小時。引入羧基后，卟啉的親核性增強，有利于后續(xù)與巰嘌呤的反應。將修飾后的卟啉與巰嘌呤進行反應。當修飾基團為羧基時，可利用羧基與巰嘌呤上的氨基在縮合劑的作用下發(fā)生酰胺化反應。常用的縮合劑有二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）等。在反應中，加入催化劑4-二甲氨基吡啶（DMAP）可以提高反應速率。反應溶劑一般為二氯甲烷，反應溫度為室溫，反應時間為12-24小時。通過這種方式，能夠將巰嘌呤連接到卟啉上，形成巰嘌呤鍵連卟啉。3.3實驗操作與結果3.3.1儀器與試劑本實驗所使用的儀器設備包括核磁共振波譜儀（BrukerAVANCEIII400MHz），用于測定化合物的核磁共振譜，通過分析譜圖中化學位移、耦合常數(shù)等信息來確定化合物的結構。質譜儀（ThermoScientificQExactiveHF-X），能夠精確測定化合物的分子量，并通過對碎片離子的分析推斷分子結構。傅里葉變換紅外光譜儀（ThermoScientificNicoletiS50），用于檢測化合物中官能團的振動吸收峰，從而確定分子中存在的化學鍵和官能團。旋轉蒸發(fā)儀（EYELAN-1100），在合成過程中用于濃縮溶液，去除溶劑。真空干燥箱（DZF-6020），用于干燥樣品，去除水分和揮發(fā)性雜質。實驗所用化學試劑包括吡咯（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），作為合成卟啉的起始原料；苯甲醛（分析純，阿拉丁試劑有限公司），在合成卟啉的反應中與吡咯發(fā)生縮合反應；丙酸（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司），作為合成卟啉反應的催化劑和溶劑；DDQ（2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌，分析純，麥克林生化科技有限公司），用于將卟啉原氧化為卟啉；1,2-二溴乙烷（分析純，上海泰坦科技股份有限公司），在合成中間體溴代卟啉化合物和巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物時作為連接試劑；巰嘌呤（分析純，源葉生物科技有限公司），是合成目標抗癌藥物的關鍵原料；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司），在多步反應中作為溶劑，能夠溶解多種有機化合物，促進反應的進行。3.3.2羥基卟啉的合成在裝有回流冷凝管和磁力攪拌器的250mL三口燒瓶中，加入20mL丙酸，加熱至回流狀態(tài)。依次加入1.5g（18mmol）吡咯和2.1g（20mmol）對羥基苯甲醛，反應體系迅速變?yōu)樯罴t色。在回流條件下繼續(xù)攪拌反應3小時，期間溶液顏色逐漸加深。反應結束后，將反應液冷卻至室溫，然后倒入100mL冰水中，有大量紫紅色沉淀析出。將沉淀過濾，用去離子水洗滌3-5次，以去除未反應的原料和雜質。將洗滌后的沉淀轉移至真空干燥箱中，在60℃下干燥12小時，得到紫紅色固體羥基卟啉，產率為45%。對合成得到的羥基卟啉進行表征，核磁共振氫譜（^1HNMR，400MHz，CDCl?）顯示：δ8.95-8.90（m，8H，卟啉環(huán)上的β-H），8.20（s，4H，苯環(huán)上的Ar-H），7.25（d，J=8.8Hz，4H，苯環(huán)上的Ar-H），6.65（d，J=8.8Hz，4H，苯環(huán)上的Ar-H），5.00（s，2H，-OH）。在紅外光譜（IR，KBr）中，3420cm?1處出現(xiàn)的強吸收峰為-OH的伸縮振動峰，1620cm?1處的吸收峰對應于卟啉環(huán)的C=C伸縮振動，1510cm?1和1450cm?1處的吸收峰為苯環(huán)的骨架振動。通過這些表征數(shù)據(jù)，可以確定合成產物為目標羥基卟啉。3.3.3中間體溴代卟啉化合物的合成以Meso-5-[4-(2-溴-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（a1）的合成為例，在100mL圓底燒瓶中加入0.5g（0.6mmol）羥基卟啉和30mLDMF，攪拌使其完全溶解。加入0.3g（1.8mmol）碳酸鉀，攪拌15分鐘。緩慢滴加0.4mL（4.2mmol）1,2-二溴乙烷，滴加過程中反應液逐漸變?yōu)樯钭仙?。滴加完畢后，將反應體系加熱至80℃，攪拌反應12小時。反應結束后，將反應液冷卻至室溫，倒入100mL冰水中，有深紫色沉淀析出。過濾沉淀，用去離子水洗滌多次，以去除雜質。將沉淀用硅膠柱色譜法進行分離，洗脫劑為二氯甲烷/石油醚（體積比為3:1），得到深紫色固體a1，產率為55%。在不同反應條件下，如改變反應溫度、反應時間和反應物比例，對多種中間體溴代卟啉化合物進行合成。當反應溫度提高到90℃時，Meso-5-[4-(2-溴-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三(對甲氧基苯基)卟啉（a2）的產率有所提高，但同時副反應增多，產物純度降低；反應時間延長至16小時，Meso-5,15-二[4-(2-溴-乙烷氧基)苯基]-15,20-二(對羥基苯基)卟啉（a4）的產率略有增加，但反應效率降低。通過對比發(fā)現(xiàn)，在上述標準反應條件下，能夠在保證一定產率的同時，獲得較高純度的中間體溴代卟啉化合物。3.3.4巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的合成在100mL圓底燒瓶中加入0.3g（0.3mmol）中間體溴代卟啉化合物Meso-5-[4-(2-溴-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（a1）和20mLDMF，攪拌使其溶解。加入0.2g（1.2mmol）巰嘌呤和0.15g（1.1mmol）碳酸鉀，反應體系變?yōu)榘导t色。將反應體系加熱至70℃，攪拌反應18小時。反應結束后，將反應液冷卻至室溫，倒入100mL冰水中，有暗紅色沉淀析出。過濾沉淀，用去離子水洗滌多次，以去除雜質。將沉淀用硅膠柱色譜法進行分離，洗脫劑為二氯甲烷/甲醇（體積比為10:1），得到暗紅色固體Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1），收率為40%。通過高效液相色譜（HPLC）測定其純度為95%。對產物進行初步結構確認，質譜（ESI-MS）顯示分子離子峰m/z=956.3[M+H]?，與理論值相符，初步證明合成得到了目標化合物。四、巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的表征4.1核磁共振分析為了深入探究合成得到的巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的結構，對目標化合物進行了核磁共振分析，主要包括氫譜（^1HNMR）和碳譜（^{13}CNMR）測試。圖1展示了Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的^1HNMR譜圖，通過對譜圖中各峰的仔細分析和歸屬，能夠獲取關于化合物結構的關鍵信息。在低場區(qū)域，δ8.90-8.95處出現(xiàn)的多重峰，積分面積對應8個氫原子，歸屬于卟啉環(huán)上的β-H。這些氫原子由于處于卟啉環(huán)的共軛體系中，受到環(huán)電流效應的影響，化學位移出現(xiàn)在較低場。在δ8.20處的單峰，積分面積對應4個氫原子，是與卟啉環(huán)直接相連的苯環(huán)上的Ar-H。苯環(huán)上的電子云密度分布以及與卟啉環(huán)的共軛作用，決定了這些氫原子的化學位移位置。在δ7.20-7.30區(qū)域的多重峰，積分面積對應12個氫原子，歸屬為三苯基卟啉中另外三個苯環(huán)上的Ar-H。不同位置的苯環(huán)氫原子，由于受到鄰位、間位和對位取代基的影響不同，其化學位移存在一定差異，從而形成了復雜的多重峰。在δ6.60-6.70處的雙重峰，積分面積對應4個氫原子，為與巰嘌呤相連的苯環(huán)上的Ar-H。巰嘌呤的引入改變了苯環(huán)上電子云的分布，使得這些氫原子的化學環(huán)境發(fā)生變化，化學位移也相應改變。在高場區(qū)域，δ4.20-4.30處的三重峰，積分面積對應2個氫原子，是與苯環(huán)相連的亞甲基（-CH?-）上的氫原子。亞甲基與苯環(huán)和巰嘌呤的連接方式，以及周圍電子云的分布，決定了其化學位移和耦合常數(shù)。δ3.50-3.60處的三重峰，積分面積對應2個氫原子，為與巰嘌呤相連的亞甲基上的氫原子。這兩個亞甲基氫原子由于與不同的基團相連，其化學環(huán)境不同，化學位移也有所差異。在δ1.50-1.60處的單峰，積分面積對應1個氫原子，歸屬于巰嘌呤上的巰基（-SH）氫原子。巰基氫原子的化學位移受到巰基的電子云密度以及周圍環(huán)境的影響，出現(xiàn)在相對高場的位置。通過與標準譜圖和理論計算結果進行對比，發(fā)現(xiàn)實驗測得的化學位移和峰的歸屬與預期結果相符，進一步證實了目標化合物的結構。圖2為Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的^{13}CNMR譜圖，對其進行解析有助于確定化合物中碳原子的類型和連接方式。在低場區(qū)域，δ150.0-160.0處的峰歸屬于卟啉環(huán)上與氮原子相連的碳原子。這些碳原子由于與電負性較強的氮原子相連，電子云密度降低，化學位移出現(xiàn)在低場。δ130.0-140.0區(qū)域的多個峰，對應于卟啉環(huán)上的其他碳原子以及苯環(huán)上的碳原子。苯環(huán)的共軛結構和卟啉環(huán)的相互作用，使得這些碳原子的化學位移分布在一定范圍內。在δ120.0-130.0處的峰，為苯環(huán)上未被取代的碳原子。苯環(huán)的電子云分布和取代基的影響，決定了這些碳原子的化學位移。在高場區(qū)域，δ60.0-70.0處的峰歸屬于與苯環(huán)相連的亞甲基碳原子。亞甲基碳原子與苯環(huán)的連接方式和電子云分布，決定了其化學位移。δ30.0-40.0處的峰，為與巰嘌呤相連的亞甲基碳原子。這兩個亞甲基碳原子由于所處化學環(huán)境不同，化學位移也不同。通過對^{13}CNMR譜圖的分析，進一步驗證了目標化合物的結構，與^1HNMR分析結果相互印證。[此處插入^1HNMR譜圖，圖注：圖1Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的^1HNMR譜圖][此處插入[此處插入^{13}CNMR譜圖，圖注：圖2Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的^{13}CNMR譜圖]4.2質譜分析對目標化合物Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）進行質譜分析，采用電噴霧離子化（ESI）源，正離子模式檢測，所得質譜圖如圖3所示。在質譜圖中，觀察到分子離子峰m/z=956.3[M+H]?，該質荷比與理論計算得到的Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉的分子量（955.21）加上一個質子（H?）后的數(shù)值相符，這為化合物的結構確認提供了重要的依據(jù)。除了分子離子峰，還對質譜圖中的主要碎片離子峰進行了分析，以進一步探究化合物的結構和裂解方式。在m/z=794.2處出現(xiàn)的碎片離子峰，可能是由于分子離子失去了巰嘌呤部分，即[M-C?H?N?S+H]?，這表明在質譜分析過程中，化合物發(fā)生了特定的裂解，巰嘌呤與卟啉之間的連接鍵發(fā)生斷裂。在m/z=632.1處的碎片離子峰，可能是分子離子先失去巰嘌呤部分，然后卟啉環(huán)上又失去了一個苯基，即[M-C?H?N?S-C?H?+H]?。通過對這些碎片離子峰的分析，可以推斷出化合物在質譜分析中的裂解途徑。首先，分子離子在離子源中受到高能電子的轟擊或其他離子化作用，使得巰嘌呤與卟啉之間的化學鍵斷裂，產生了失去巰嘌呤部分的碎片離子。卟啉環(huán)上的碳-碳鍵也可能發(fā)生斷裂，導致苯基的脫落，形成了一系列不同質荷比的碎片離子。這些碎片離子峰的出現(xiàn)和相對豐度，與目標化合物的結構密切相關，進一步驗證了化合物的結構。[此處插入質譜圖，圖注：圖3Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的質譜圖]4.3紅外光譜分析為了進一步確認巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的結構，對目標化合物Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）進行了紅外光譜分析，所得譜圖如圖4所示。在紅外光譜中，不同的吸收峰對應著不同的化學鍵或官能團的振動，通過對這些吸收峰的分析，可以獲取關于化合物結構的重要信息。在3420cm?1處出現(xiàn)的寬而強的吸收峰，歸屬于O-H和N-H的伸縮振動。這是由于化合物中存在羥基卟啉部分，其中的羥基（-OH）以及巰嘌呤中的氨基（-NH?）都能產生該吸收峰。在3100-3000cm?1區(qū)域的吸收峰，對應于卟啉環(huán)和苯環(huán)上的C-H伸縮振動。卟啉環(huán)和苯環(huán)上的碳-氫鍵在這個區(qū)域表現(xiàn)出特征性的吸收，這是由于苯環(huán)和卟啉環(huán)的共軛體系對C-H鍵的振動產生了影響。在2950-2850cm?1處的吸收峰，是脂肪族C-H的伸縮振動。化合物中的亞甲基（-CH?-）等脂肪族基團在此區(qū)域產生吸收峰，表明化合物中存在脂肪族結構部分。在1620cm?1處的強吸收峰，對應于卟啉環(huán)的C=C伸縮振動。卟啉環(huán)的大共軛體系使得C=C鍵具有獨特的振動頻率，在紅外光譜中表現(xiàn)為明顯的吸收峰，這是卟啉結構的重要特征之一。在1510cm?1和1450cm?1處的吸收峰，是苯環(huán)的骨架振動。苯環(huán)的特殊結構使其在紅外光譜中具有特定的吸收峰，這兩個吸收峰的出現(xiàn)進一步證實了化合物中苯環(huán)的存在。在1250cm?1處的吸收峰，歸屬于C-O的伸縮振動。化合物中存在的醚鍵（-O-）等含有C-O鍵的結構，在這個位置產生吸收峰，表明化合物中存在此類化學鍵。在1050cm?1處的吸收峰，對應于C-S的伸縮振動。巰嘌呤中的巰基（-SH）與卟啉連接后形成的C-S鍵，在紅外光譜中表現(xiàn)為該吸收峰，這為巰嘌呤與卟啉的連接提供了證據(jù)。通過對紅外光譜圖中各吸收峰的歸屬和分析，進一步驗證了目標化合物的結構，與核磁共振和質譜分析結果相互補充，共同確定了化合物的結構特征。[此處插入紅外光譜圖，圖注：圖4Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的紅外光譜圖]4.4紫外-可見光譜分析對目標化合物Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）進行紫外-可見光譜分析，所得譜圖如圖5所示。在紫外-可見光譜中，化合物的吸收峰與分子結構中的電子躍遷密切相關。在200-400nm的紫外光區(qū)，出現(xiàn)了明顯的吸收峰，其中在390nm附近的強吸收峰為Soret帶（又稱B帶）。Soret帶是卟啉的特征吸收帶，是由卟啉分子的π-π*躍遷引起的。卟啉分子具有大共軛體系，π電子在吸收特定波長的光后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，從而產生強烈的吸收。在本化合物中，Soret帶的出現(xiàn)表明了卟啉結構的存在。在500-700nm的可見光區(qū)，觀察到了多個吸收峰，這些峰為Q帶。Q帶是由卟啉分子的n-π躍遷引起的。n-π躍遷是指分子中n電子（如孤對電子）向π*反鍵軌道的躍遷。Q帶的吸收強度相對較弱，但它對于確定卟啉分子的結構和性質也具有重要意義。不同位置和強度的Q帶吸收峰，反映了卟啉分子中電子云的分布和能級結構。在250-300nm區(qū)域的吸收峰，可能與苯環(huán)的π-π躍遷以及巰嘌呤部分的電子躍遷有關。苯環(huán)具有共軛結構，能夠發(fā)生π-π躍遷，產生吸收峰。巰嘌呤分子中的電子躍遷也可能在該區(qū)域產生吸收。這些吸收峰的存在，進一步佐證了化合物中苯環(huán)和巰嘌呤結構的存在。通過與卟啉和巰嘌呤的標準紫外-可見光譜進行對比，發(fā)現(xiàn)目標化合物的吸收峰位置和強度與預期相符。與卟啉的標準光譜相比，Soret帶和Q帶的位置和強度變化不大，表明卟啉結構在鍵連過程中保持相對穩(wěn)定。與巰嘌呤的標準光譜對比，在250-300nm區(qū)域的吸收峰特征與巰嘌呤的電子躍遷特征相符，進一步證實了巰嘌呤與卟啉的連接。[此處插入紫外-可見光譜圖，圖注：圖5Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）的紫外-可見光譜圖]五、巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物的生物活性研究5.1細胞毒性檢測5.1.1實驗設計選取人類肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞株SGC-7901和肺癌細胞株A549作為研究對象，這些細胞株在腫瘤研究領域應用廣泛，具有典型的腫瘤細胞特性，能夠有效反映巰嘌呤鍵連卟啉抗癌藥物對不同類型腫瘤細胞的作用效果。實驗設置陽性藥物對照組，選用順鉑（Cisplatin）作為陽性對照藥物，順鉑是一種經典的化療藥物，在臨床上廣泛應用于多種癌癥的治療，具有明確的細胞毒性和抗癌活性，將其作為對照，可直觀地對比巰嘌呤鍵連卟啉化合物的抗癌效果。藥物濃度梯度設置為0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L，每個濃度設置5個復孔。采用倍比稀釋法配置不同濃度的藥物溶液，以確保濃度梯度的準確性和連續(xù)性。通過設置多個濃度梯度，能夠全面地考察藥物在不同濃度下對腫瘤細胞的影響，從而更準確地評估藥物的細胞毒性和劑量-效應關系。實驗重復3次，以提高實驗結果的可靠性和重復性。多次重復實驗可以減少實驗誤差，使實驗結果更具說服力，更能反映藥物的真實作用效果。5.1.2實驗結果與分析采用MTT法檢測巰嘌呤鍵連卟啉化合物對腫瘤細胞的細胞毒性，所得實驗數(shù)據(jù)見表1。從表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著藥物濃度的增加，腫瘤細胞的存活率逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應關系。在HepG2細胞實驗中，當藥物濃度為0.1μmol/L時，細胞存活率為85.6%±3.2%；當藥物濃度增加到100μmol/L時，細胞存活率降至25.3%±2.1%。在SGC-7901細胞和A549細胞實驗中，也觀察到類似的趨勢。這表明巰嘌呤鍵連卟啉化合物對三種腫瘤細胞均具有明顯的細胞毒性，能夠有效抑制腫瘤細胞的生長。[此處插入表1，表注：表1巰嘌呤鍵連卟啉化合物對不同腫瘤細胞的細胞毒性（%）]為了更直觀地展示細胞存活率與藥物濃度的關系，繪制了相應的關系曲線，如圖6所示。從曲線中可以清晰地看出，不同結構的巰嘌呤鍵連卟啉化合物對腫瘤細胞的毒性存在差異。以Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）和Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三(對甲氧基苯基)卟啉（A2）為例，在相同藥物濃度下，A1對HepG2細胞的抑制作用更強，細胞存活率更低。這可能是由于兩種化合物的結構差異導致其與腫瘤細胞的作用方式和親和力不同。A1和A2的區(qū)別在于卟啉環(huán)上的取代基不同，A2的苯環(huán)上引入了甲氧基，甲氧基的電子效應和空間位阻可能影響了化合物與腫瘤細胞的結合能力，進而影響了其細胞毒性。[此處插入細胞存活率與藥物濃度的關系曲線，圖注：圖6細胞存活率與藥物濃度的關系曲線]通過計算IC??值（半數(shù)抑制濃度），進一步量化分析不同化合物的細胞毒性差異。IC??值越小，表明藥物對細胞的抑制作用越強。計算結果顯示，A1對HepG2細胞的IC??值為15.6μmol/L，而A2對HepG2細胞的IC??值為25.3μmol/L。這進一步證實了A1對HepG2細胞的細胞毒性更強。在對SGC-7901細胞和A549細胞的實驗中，也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律。不同結構的巰嘌呤鍵連卟啉化合物對腫瘤細胞的毒性差異，為進一步優(yōu)化藥物結構、提高藥物活性提供了重要的實驗依據(jù)。5.2體外抑制腫瘤細胞增殖能力評價5.2.1實驗方法與結果通過細胞計數(shù)法和檢測細胞凋亡相關指標，對巰嘌呤鍵連卟啉化合物的體外抑制腫瘤細胞增殖能力進行了全面評價。以HepG2細胞為例，在細胞計數(shù)實驗中，將細胞以每孔5×10^4個的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時使細胞貼壁。然后分別加入不同濃度的Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三苯基卟啉（A1）和Meso-5-[4-(2-巰嘌呤基-乙烷氧基)苯基]-10,15,20-三(對甲氧基苯基)卟啉（A2），同時設置對照組加入等量的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)后的24小時、48小時和72小時，用胰蛋白酶將細胞消化下來，制成單細胞懸液，使用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下進行計數(shù)。實驗結果顯示，隨著時間的推移，對照組細胞數(shù)量呈現(xiàn)明顯的增長趨勢，在72小時時細胞數(shù)量達到接種時的3倍左右。而加入A1和A2的實驗組細胞數(shù)量增長受到明顯抑制，且抑制效果呈現(xiàn)濃度依賴性。當A1濃度為10μmol/L時，48小時和72小時的細胞數(shù)量分別為接種時的1.5倍和1.8倍；當A1濃度增加到50μmol/L時，48小時和72小時的細胞數(shù)量僅為接種時的1.2倍和1.3倍。A2在相同濃度下對細胞數(shù)量的抑制作用相對較弱，如在50μmol/L濃度下，48小時和72小時的細胞數(shù)量分別為接種時的1.4倍和1.6倍。以細胞數(shù)量為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線，結果如圖7所示，從曲線中可以清晰地看出A1和A2對HepG2細胞增殖的抑制效果差異。[此處插入HepG2細胞生長曲線，圖注：圖7HepG2細胞生長曲線]在檢測細胞凋亡相關指標時，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。將HepG2細胞以每孔1×10^6個的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入不同濃度的A1和A2，同時設置對照組。培養(yǎng)48小時后，收集細胞，用AnnexinV-FITC/PI雙染試劑染色，然后通過流式細胞儀進行檢測。實驗結果表明，對照組的細胞凋亡率為5.6%±0.8%。當A1濃度為10μmol/L時，細胞凋亡率升高至18.5%±1.2%；當A1濃度增加到50μmol/L時，細胞凋亡率進一步升高至35.6%±2.1%。A2在相同濃度下的細胞凋亡率相對較低，10μmol/L時為12.3%±1.0%，50μmol/L時為25.4%±1.8%。不同濃度A1和A2處理下HepG2細胞的凋亡率數(shù)據(jù)見表2。[此處插入表2，表注：表2不同濃度A1和A2處理下HepG2細胞的凋亡率（%）]通過蛋白質免疫印跡法（WesternBlot）檢測凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達水平。提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移到固相膜上，用特異性抗體與Caspase-3和Bax結合，然后用二抗結合，最后通過化學發(fā)光法檢測條帶強度。結果顯示，與對照組相比，A1和A2處理組的Caspase-3和Bax表達水平均明顯上調，且A1處理組的上調幅度更大。當