第51課時

基因工程課標要求1.闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定等步驟。考情分析1.重組DNA技術的基本工具2024·江西卷，12；2024·山東卷，5；2023·新課標卷，62.基因工程的基本操作程序2024·河北卷，22；2024·重慶卷，19；2024·湖南卷，21；2024·甘肅卷，24；2024·安徽卷，20；2024·山東卷，25；2024·全國甲卷，38；2024·新課標卷，35；2024·黑吉遼卷，25；2023·全國乙卷，38；2023·全國甲卷，38；2023·湖北卷，4；2023·廣東卷，20考點一

重組DNA技術的基本工具1.基因工程的概念指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫重組DNA技術。操作環(huán)境：操作水平：原理：結果：意義（優(yōu)點）：DNA分子水平基因重組賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產品。定向改造生物性狀；克服遠緣雜交不親和障礙。體外環(huán)境考點一

重組DNA技術的基本工具2.基因工程的理論基礎考點一

重組DNA技術的基本工具3.基因工程的工具（1）限制酶切割DNA分子的工具是限制性內切核酸酶，又稱限制酶。來源：主要是從原核生物中分離純化出來的種類：數千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶。）作用：能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。限制酶的限制作用實際就是一種通過限制性降解外源DNA來維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。限制酶一般不會剪切自身DNA的原因，可能是不包含被自身限制酶識別的序列，也可能是通過甲基化修飾作用使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化來避免被識別，達到保護自身遺傳物質的目的?？键c一

重組DNA技術的基本工具3.基因工程的工具（1）限制酶大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。一般來說一種限制酶只能識別一種序列，在特定的位點進行切割。注：Y為C或T，R為G或A?？键c一

重組DNA技術的基本工具3.基因工程的工具（1）限制酶DNA分子經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。當限制酶在它識別序列的中心軸線（圖中虛線）兩側將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產生的是黏性末端；當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產生的是平末端。任何兩個平末端之間都可以相互連接；同尾酶（能切割產生相同末端的限制酶）切割產生的黏性末端之間可以相互連接。考點一

重組DNA技術的基本工具3.基因工程的工具（1）限制酶基因工程中限制酶的選擇要求①不破壞目的基因：不能在目的基因內部存在限制酶切位點；②目的基因兩端存在酶切位點：能將目的基因從所在的DNA上切割下來；③保留啟動子、終止子、復制原點：這些結構對于基因表達載體在細胞內進行復制，穩(wěn)定存在并表達具有重要作用。④不破壞所有的標記基因：標記基因便于重組DNA分子的篩選。⑤質粒上的酶切位點位于啟動子和終止子之間：便于插入的目的基因表達。⑥連接處的黏性末端相同：相同的黏性末端才能被DNA連接酶連接起來。為避免目的基因和質粒自身環(huán)化和隨意連接，可以用雙酶切法進行酶切?？键c一

重組DNA技術的基本工具3.基因工程的工具（2）DNA連接酶能將兩個DNA片段連接起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體相同點不同點都能將雙鏈DNA片段“縫合“起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵。E.coliDNA連接酶連接具有平末端的DNA片段的效率要遠遠低于T4DNA連接酶。考點一

重組DNA技術的基本工具3.基因工程的工具（3）載體載體能將外源基因送入受體細胞，并在受體細胞內對目的基因進行大量復制。類型：質粒、噬菌體和動植物病毒等。

大腸桿菌及質粒結構模式圖質粒是最常用的載體，它是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA。考點一

重組DNA技術的基本工具3.基因工程的工具（3）載體基因工程中載體的選擇要求①有一個至多個限制酶切割位點；（便于目的基因插入）②在受體細胞中穩(wěn)定存在并能自我復制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制；（使目的基因穩(wěn)定存在且數量可擴增）③具有特殊的標記基因；（便于重組DNA分子的篩選）④對受體細胞無害。（避免受體細胞受到損傷）考點一

重組DNA技術的基本工具3.基因工程的工具（3）載體標記基因的作用：便于重組DNA分子的篩選標記基因最常見的是抗生素的抗性基因，也可以是熒光蛋白基因。高中階段常見的酶及其作用練習：基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。下列關于基因工程的敘述，錯誤的有________。①基因工程的原理是基因突變②從操作層面看，基因工程是在細胞水平上進行設計和施工的③基因工程能克服遠緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳性狀④基因工程是在生物化學、分子生物學和微生物學等學科的基礎上發(fā)展起來的①②練習：EcoRⅠ限制酶的識別序列和切割位點為5′－G↓AATTC－3′，SmaⅠ限制酶的識別序列和切割位點為5′－CCC↓GGG－3′。下列關于限制酶(限制性內切核酸酶)的敘述，正確的是________。①限制酶只存在于原核生物中②限制酶能識別DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開③EcoRⅠ限制酶切割DNA分子后形成平末端④SmaⅠ限制酶切割DNA分子后形成黏性末端⑤EcoRⅠ限制酶是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶②⑤練習：1967年，世界上幾個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現了一種能夠將兩個DNA片段連接起來的酶，稱之為DNA連接酶。下列關于DNA連接酶的敘述，錯誤的有__________。①DNA連接酶催化磷酸二酯鍵的斷裂②T4DNA連接酶只能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段③E.coliDNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端④T4DNA連接酶連接具有平末端的DNA片段的效率要遠遠低于E.coliDNA連接酶⑤DNA連接酶與DNA聚合酶是同一種酶，作用相同①②④⑤練習：(2023·新課標卷，6)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是(

)A.質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B.質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接C練習：(多選)(2025·河北邢臺質檢聯盟期中)下列有關基因工程中載體的說法，正確的是(

)A.在進行基因工程操作中，被用作載體的質粒都是天然質粒B.所有的質粒都可以作為基因工程中的載體C.質粒是一種獨立于細菌染色體外的環(huán)狀DNA分子D.作為載體的質粒DNA分子上應有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因CD練習：(2025·陜西漢中模擬)質粒是基因工程中常用的一種載體。下列關于質粒的說法，錯誤的是(

)A.質粒中的嘌呤堿基數和嘧啶堿基數是相等的B.一些質?？梢哉系侥康募毎娜旧w上，隨受體DNA同步復制C.可以利用質粒上的特殊標記基因對目的基因進行篩選D.質粒至少應有三個限制酶識別切割位點，便于目的基因插入D練習：（2025·江蘇·高考真題）（多選）圖示人體正?；駻突變?yōu)橹虏』騛及HindⅢ切割位點。AluⅠ限制酶識別序列及切割位點為

，下列相關敘述正確的有（

）A．基因A突變?yōu)閍是一種堿基增添的突變B．用兩種限制酶分別酶切A基因后，形成的末端類型不同C．用兩種限制酶分別酶切a基因后，產生的片段大小一致D．產前診斷時，該致病基因可選用HindⅢ限制酶開展酶切鑒定BD目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定考點二

基因工程的基本操作程序考點二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(1)目的基因:在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞

或獲得

預期

等的基因。性狀表達產物根據不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質的基因，如與生物抗逆性、生產藥物、毒物降解、工業(yè)用酶等相關的基因，也可以是一些具有調控作用的因子?？键c二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(2)篩選合適的目的基因的方法①從相關的已知

的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。②利用

和序列比對工具進行篩選。(3)目的基因的獲取①人工合成目的基因。②利用PCR擴增目的基因

③從基因文庫中獲取結構和功能清晰序列數據庫b.借助DNA合成儀用化學方法直接人工合成。a.逆轉錄法合成目的基因?？键c二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(3)目的基因的獲取②利用PCR擴增目的基因PCR是__________________的縮寫，是一項根據___________________的原理，在________提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對_______________________進行大量復制的技術；聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外目的基因的核苷酸序列①全稱:②原理:③操作環(huán)境:④目的:⑤優(yōu)點:聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外(PCR擴增儀/PCR儀)對目的基因的核苷酸序列進行大量復制可以在短時間內大量擴增目的基因考點二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(3)目的基因的獲取②利用PCR擴增目的基因體內DNA復制參與的組分在DNA復制中的作用PCR中參與的組分解旋酶打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復制的模板4種脫氧核苷酸（實為dNTP）合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈緩沖物質維持pH穩(wěn)定Mg2+激活DNA聚合酶引物（短的單鏈RNA）使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸無需解旋酶，高溫解鏈DNA母鏈dNTP耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）緩沖液Mg2+引物（2種，短的單鏈DNA）考點二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(3)目的基因的獲?、诶肞CR擴增目的基因考點二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(3)目的基因的獲取②利用PCR擴增目的基因引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。(DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能)5’--3’5’3’5’3’引物引物子鏈延伸子鏈延伸引物是決定PCR特異性的關鍵。3’--5’PCR中的數量關系復制次數123nDNA分子數片段248含引物的DNA分子數248含其中一種引物的DNA分子數137同時含兩種引物的DNA分子數026共消耗引物的對數137共消耗引物的個數2614含脫氧核苷酸鏈等長的DNA分子數0022n2n2n－12n－22n－12n－2n2n+1－2考點二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(3)目的基因的獲取PCR引物的設計①引物能與DNA模板通過堿基互補配對結合;②2種引物之間不能互補配對結合；③某一引物不能自身折疊出現局部堿基互補配對；④引物不能太短，太短特異性差，一般在18-25bp；⑤有時需要在2種引物的5’端添加不同的限制酶的識別序列；⑥引物的3'端不可以修飾，否則會阻礙向3'方向的延伸?？键c二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(3)目的基因的獲取②利用PCR擴增目的基因考點二

基因工程的基本操作程序2.基因表達載體的構建——基因工程的核心步驟構建基因表達載體的目的：讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代;使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。考點二

基因工程的基本操作程序2.基因表達載體的構建——基因工程的核心步驟“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質位置功能DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰決定氨基酸的堿基mRNA上三個相鄰的堿基基因上游非編碼區(qū)基因下游非編碼區(qū)mRNA上mRNA上RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA。終止轉錄的結構。翻譯起始的部位（編碼氨基酸）。翻譯結束的部位（一般不編碼氨基酸）考點二

基因工程的基本操作程序2.基因表達載體的構建——基因工程的核心步驟質粒限制酶限制酶DNA連接酶同種限制酶或產生相同黏性末端的限制酶切割重組DNA分子限制酶切割位點目的基因限制酶切割位點獲取目的基因考點二

基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取將同一種限制酶切割獲得的目的基因和質粒混合后加DNA連接酶會出現的連接方式有:質粒目的基因自身環(huán)化目的基因自身環(huán)化質粒自身環(huán)化質粒與目的基因正、反向連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接反向連接自身連接+使用雙酶切法可以避免錯誤的連接?？键c二

基因工程的基本操作程序3.將目的基因導入受體細構建好的基因表達載體需要通過一定的方式才能進入受體細胞。目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程稱為轉化?？键c二

基因工程的基本操作程序3.將目的基因導入受體細花粉管通道法：可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。考點二

基因工程的基本操作程序3.將目的基因導入受體細農桿菌轉化法：將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達考點二

基因工程的基本操作程序3.將目的基因導入受體細將目的基因導入動物受精卵最常用的一種方法是利用顯微注射將目的基因注入動物的受精卵中，這個受精卵將發(fā)育成為具有新性狀的動物。顯微注射法：考點二

基因工程的基本操作程序3.將目的基因導入受體細Ca2+處理轉化法：大腸桿菌Ca2+表達載體

Ca2+處理法示意圖Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法、花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞或受精卵受精卵原核細胞轉化過程目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA中→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細胞（感受態(tài)）→基因表達載體導入細胞中考點二

基因工程的基本操作程序3.將目的基因導入受體細考點二

基因工程的基本操作程序4.目的基因的檢測與鑒定考點二

基因工程的基本操作程序4.目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測包括通過PCR等技術檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉錄出了mRNA；從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交，檢測目的基因是否翻譯成相應蛋白等。檢測目的基因是否導入：可以根據目的基因的序列設計引物，通過PCR進行擴增，如果能夠擴增出目的基因片段，說明該基因已經整合到了受體細胞中?；蛘咧苯舆M行DNA分子雜交。檢測目的基因是否轉錄：通常提取受體細胞的總RNA，將其中的mRNA反轉錄成cDNA，進行PCR?；蛘咧苯舆M行分子雜交。檢測目的基因是否表達出相應蛋白質：從受體細胞中提取蛋白質后，進行電泳分離，然后利用目的蛋白的抗體進行檢測?？键c二

基因工程的基本操作程序4.目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測基因探針：一段帶有標記（放射性同位素標記或熒光標記）能與目的基因的的一條鏈堿基互補配對的單鏈核苷酸片段。檢測方法：將待測DNA或RNA與基因探針混合，如果發(fā)生了核酸雜交，則說明有目的基因。DNA分子雜交分子雜交（2）個體生物學水平的鑒定考點二

基因工程的基本操作程序4.目的基因的檢測與鑒定轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽溶液處理正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常練習：構建因表達載體的過程分為酶切和連接兩個步驟。下圖為構建基因表達載體時所用的載體及目的基因所在DNA片段上限制酶的識別切割位點情況。①構建基因表達載體時________(“能”或“不能”)選擇EcoRⅠ，原因是_________________________________。不能EcoRⅠ會破壞目的基因②選擇SpeⅠ進行單酶切構建基因表達載體時，容易出現目的基因和載體的自身環(huán)化，以及目的基因的反向鏈接，導致目的基因轉錄時________出現錯誤，無法表達正常的蛋白質。模板鏈③選擇BamHⅠ與BglⅡ進行雙酶切構建基因表達載體時，能否避免單酶切時出現的目的基因和載體的自身環(huán)化，以及目的基因的反向鏈接？為什么？不能，因為BamHⅠ與BglⅡ雖然識別序列不同，但是切割后產生的黏性末端相同。④選擇BamHⅠ與HindⅢ進行雙酶切構建基因表達載體時，能否避免單酶切時出現的目的基因和載體的自身環(huán)化，以及目的基因的反向鏈接？為什么？能，因為BamHⅠ與HindⅢ切割后產生的黏性末端不同。練習：(2023·湖北卷，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是(

)A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D練習：(2024·江蘇卷，23)為了高效純化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人員將ELP50片段插入pET－SOD構建重組質粒pET－SOD－ELP50，以融合表達SOD－ELP50蛋白，過程如圖1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列為：限制酶a識別序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b識別序列，50為重復次數。請回答下列問題：(1)步驟①雙酶切時，需使用的限制酶a和限制酶b分別是___________________。(2)步驟②轉化時，科研人員常用________處理大腸桿菌，使細胞處于感受態(tài)，轉化后的大腸桿菌采用含有________________的培養(yǎng)基進行篩選。用PCR技術篩選成功導入pET－SOD－ELP50的大腸桿菌，應選用的一對引物是_________________。EcoRⅠ、HindⅢCaCl2卡那霉素S－F和E－R(3)步驟③大腸桿菌中RNA聚合酶與________結合，驅動轉錄，翻譯SOD－ELP50蛋白。已知蛋白質中氨基酸殘基的平均相對分子質量約為0.11kDa，將表達的蛋白先進行凝膠電泳，然后用SOD抗體進行雜交，顯示的條帶應是________(從圖2的“A～D”中選填)。啟動子C練習：(2024·江蘇卷，23)為了高效純化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人員將ELP50片段插入pET－SOD構建重組質粒pET－SOD－ELP50，以融合表達SOD－ELP50蛋白，過程如圖1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列為：限制酶a識別序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b識別序列，50為重復次數。請回答下列問題：(4)步驟④為探尋高效純化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人員研究了溫度、NaCl對SOD－ELP50蛋白純化效果的影響，部分結果如圖3。①20℃時，加入NaCl后實驗結果是_______________________________________。②100℃時，導致各組中所有蛋白都沉淀的原因是_____________________________。③據圖分析，融合表達SOD－ELP50蛋白的優(yōu)點有______________________________________________________________________________________。SOD－ELP50組純化蛋白含量比SOD組高高溫使蛋白變性，離心后沉淀純化回收率高、雜蛋白少、低溫下純化有利于酶活性的保持練習：（2025·安徽·高考真題）質粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，將該質粒導入大腸桿菌細胞后，其編碼的酶可分解X-gal，產生藍色物質，進而形成藍色菌落，如圖所示。科研小組以該質粒作為載體，采用基因工程技術實現人源干擾素基因在大腸桿菌中的高效表達。下列敘述錯誤的是（

）A．使用氯化鈣處理大腸桿菌以提高轉化效率，可增加篩選平板上白色和藍色菌落數B．如果篩選平板中僅含卡那霉素，生長出的白色菌落不可判定為含目的基因的菌株C．因質粒K中含兩個標記基因，篩選平板中長出的白色菌落即為表達目標蛋白的菌株D．若篩選平板中藍色菌落偏多，原因可能是質粒K經酶切后自身環(huán)化并導入了大腸桿菌C練習：（2025·河北·高考真題）（多選）X染色體上的D基因異常可導致人體患病，在男性中發(fā)病率為1/3500，某患病男孩（其母親沒有患?。染色體上的基因D和H內各有一處斷裂，斷裂點間的染色體片段發(fā)生顛倒重接。研究者對患兒和母親的DNA進行了PCR檢測，所用引物和擴增產物電泳結果如圖。不考慮其他變異，下列分析錯誤的是（

）注：引物組合S1和S2，R1和R2可分別用于對正?；駾和H序列的擴增檢測A．該病患者中男性顯著多于女性，女性中攜帶者的占比為1/3500B．用R1和R2對母親和患兒DNA進行PCR檢測的結果相同C．與正常男性相比，患病男孩X染色體上的基因排列順序發(fā)生改變D．利用S1和S2進行PCR檢測，可診斷母親再次孕育的胎兒是否患該病AB練習：（2025·黑吉遼蒙卷·高考真題）香樹脂醇具有抗炎等功效，從植物中提取難度大、產率低。通過在酵母菌中表達外源香樹脂醇合酶基因N，可高效生產香樹脂醇?；卮鹣铝袉栴}。(1)可從

中查詢基因N的編碼序列，設計特定引物。如圖1所示，a鏈為轉錄模板鏈，為保證基因N與質粒pYL正確連接，需在引物1和引物2的5’端分別引入

和

限制酶識別序列。PCR擴增基因N，特異性酶切后，利用

連接DNA片段，構建重組質粒，大小約9.5kb（kb為千堿基對），假設構建重組質粒前后，質粒pYL對應部分大小基本不變?；驍祿欤ㄐ蛄袛祿欤hoⅠXbaⅠDNA連接酶(2)進一步篩選構建的質粒，以1-4號菌株中提取的質粒為模板，使用引物1和引物2進行PCR擴增，電泳PCR產物，結果如圖2。在第5組的PCR反應中，使用無菌水代替實驗組的模板DNA，目的是檢驗PCR反應中是否有

的污染。初步判斷實驗組

（從“1~4”中選填）的質粒中成功插入了基因N，理由是

。外源DNA1目的基因N大小為2.3kb，實驗組1的條帶大小與其相近(3)為提高香樹脂醇合酶催化效率，將編碼第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的堿基序列替換為編碼丙氨酸的堿基序列，丙氨酸的密碼子有GCA等。a是誘變第240位脯氨酸編碼序列的引物（GCA為誘變序列），b、c、d其中一條是誘變第243位苯丙氨酸的引物，其配對模板與a的配對模板相同。據此分析，丙氨酸的密碼子除GCA外，還有

。a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'd：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'GCC(4)進一步檢測轉基因酵母菌發(fā)酵得到的

含量并進行比較，可以選出最優(yōu)的香樹脂醇合酶基因的改造方案。香樹脂醇考點三DNA的粗提取與鑒定1.實驗原理（1）提取DNA的原理：DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的物理或化學方法對它們進行提取。DNA不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精；DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液中。（2）鑒定DNA的原理：在一定的溫度下（沸水?。?，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑?？键c三DNA的粗提取與鑒定2.實驗步驟（1）取材、研磨：稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。（2）過濾或離心：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液?；颍褐苯訉⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中，1500r/min的轉速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。（3）分離：在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液（體積分數為95%），靜置2-3min，溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分?；颍簩⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。。研磨液成分作用SDS使蛋白質變性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNA考點三DNA的粗提取與鑒定2.實驗步驟（4）鑒定：取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。鑒定結果對照組實驗組對照組實驗組練習：（2025·湖南·高考真題）用替代的實驗材料或者試劑開展下列實驗，不能達成實驗目的的是（）選項實驗內容替代措施A用高倍顯微鏡觀察葉綠體用“菠菜葉”替代“蘚類葉片”BDNA的粗提取與鑒定用“豬成熟紅細胞”替代“豬肝細胞”C觀察根尖分生區(qū)組織細胞的有絲分裂用“醋酸洋紅液”替代“甲紫溶液”D比較過氧化氫在不同條件下的分解用“過氧化氫酶溶液”替代“肝臟研磨液”B練習：（2024·安徽·高考真題）下列關于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是（

）A．實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低B．利用DNA和蛋白質在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNAC．DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物D．將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應，可檢測溶液中是否含有蛋白質雜質D練習：（2024·山東·高考真題）關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是（）A．整個提取過程中可以不使用離心機B．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中C．鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發(fā)生改變D．僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾A練習：（2023·廣東·高考真題）“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是（

）A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等C．沉淀：可反復多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現藍色D練習：（2022·北京·高考真題）下列高中生物學實驗中，對實驗結果不要求精確定量的是（）A．探究光照強度對光合作用強度的影響B(tài)．DNA的粗提取與鑒定C．探索生長素類調節(jié)劑促進插條生根的最適濃度D．模擬生物體維持pH的穩(wěn)定B練習：（2022·山東·高考真題）關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是（

）A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質B練習：（2021·山東·高考真題）粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是（

）A．加入適量的木瓜蛋白酶B．37～40℃的水浴箱中保溫10～15分鐘C．加入與濾液體積相等的、體積分數為95%的冷卻的酒精D．加入NaCl調節(jié)濃度至2mol/L→過濾→調節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/LA考點四DNA片段的擴增及電泳1.實驗原理（1）DNA片段擴增的原理：PCR利用了_________________和________________的原理。DNA的熱變性原理DNA半保留復制（2）DNA片段電泳鑒定的原理：DNA分子具有____________，在一定的____下，這些基團可以帶上___