布地奈德介導(dǎo)MicroRNA對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖調(diào)控的分子機(jī)制解析一、引言1.1研究背景在呼吸系統(tǒng)疾病的治療領(lǐng)域，布地奈德作為一種常用的糖皮質(zhì)激素類藥物，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其具有強(qiáng)效的局部抗炎與抗過敏特性，能夠有效抑制炎性介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，緩解支氣管痙攣，顯著改善肺功能，降低氣道高反應(yīng)性。臨床上，布地奈德廣泛應(yīng)用于支氣管哮喘、季節(jié)性過敏性鼻炎、經(jīng)年性過敏性及非過敏性鼻炎等疾病的治療，還可用于治療鼻息肉以及預(yù)防鼻息肉切除后的再生，為眾多患者帶來了福音。9HTEo-細(xì)胞作為人氣管上皮細(xì)胞株，在氣道相關(guān)研究中占據(jù)著不可或缺的地位。氣道上皮是機(jī)體抵御外界病原體入侵的第一道防線，9HTEo-細(xì)胞能夠模擬氣道上皮的生理功能，其在研究呼吸道合胞病毒感染、氣道炎癥反應(yīng)以及上皮細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。通過對(duì)9HTEo-細(xì)胞的研究，有助于深入揭示氣道相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)更有效的治療策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度通常在21-24個(gè)核苷酸左右。它在細(xì)胞增殖調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色，通過與靶基因mRNA的互補(bǔ)序列結(jié)合，能夠抑制mRNA的翻譯過程或者促使其降解，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。單個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，同時(shí)，一個(gè)基因也可能受到多個(gè)miRNA的協(xié)同調(diào)節(jié)，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及代謝等諸多生物學(xué)過程中發(fā)揮著核心作用。眾多研究表明，miRNA表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括癌癥、心血管疾病以及呼吸系統(tǒng)疾病等。在呼吸系統(tǒng)疾病中，miRNA參與了氣道炎癥、氣道重塑以及細(xì)胞增殖與凋亡等關(guān)鍵病理過程的調(diào)控。鑒于布地奈德在呼吸系統(tǒng)疾病治療中的廣泛應(yīng)用、9HTEo-細(xì)胞在氣道研究中的重要價(jià)值以及MicroRNA在細(xì)胞增殖調(diào)控中的關(guān)鍵地位，深入探究布地奈德通過MicroRNA調(diào)控9HTEo-細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步闡明布地奈德的作用機(jī)制，優(yōu)化呼吸系統(tǒng)疾病的治療方案具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究布地奈德通過MicroRNA調(diào)控9HTEo-細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制。通過運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測布地奈德作用于9HTEo-細(xì)胞后，細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)的變化情況，篩選出受布地奈德調(diào)控且與9HTEo-細(xì)胞增殖密切相關(guān)的MicroRNA，并進(jìn)一步驗(yàn)證其靶基因及相關(guān)信號(hào)通路。從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域來看，本研究具有重大的實(shí)踐意義。呼吸系統(tǒng)疾病如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等嚴(yán)重威脅著人類的健康，布地奈德作為常用治療藥物，深入了解其作用機(jī)制，有助于優(yōu)化治療方案，提高臨床療效。通過揭示布地奈德通過MicroRNA調(diào)控9HTEo-細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，能夠?yàn)檠邪l(fā)更具針對(duì)性、更高效的治療藥物提供理論依據(jù)，為呼吸系統(tǒng)疾病患者帶來更好的治療前景。同時(shí)，本研究對(duì)于拓展對(duì)糖皮質(zhì)激素類藥物作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)具有重要意義，有助于推動(dòng)整個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)λ幬镏委煓C(jī)制的深入研究。在細(xì)胞生物學(xué)研究方面，本研究也具有不可忽視的價(jià)值。9HTEo-細(xì)胞作為氣道上皮細(xì)胞的重要模型，研究布地奈德對(duì)其增殖的調(diào)控機(jī)制，有助于深入理解氣道上皮細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下的生長調(diào)節(jié)過程。MicroRNA在細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，本研究能夠進(jìn)一步豐富和完善MicroRNA調(diào)控細(xì)胞增殖的理論體系，為該領(lǐng)域的研究提供新的思路和方向。本研究不僅有助于解決醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實(shí)際問題，還能為細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)研究做出貢獻(xiàn)，具有重要的理論和實(shí)踐雙重價(jià)值。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1布地奈德的特性與作用機(jī)制布地奈德（Budesonide），化學(xué)名稱為16α,17α-22R,S-丙基亞甲基二氧-孕甾-1,4-二烯-11β,21-二羥基-3,20-二酮，其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了它特殊的藥理特性。它屬于糖皮質(zhì)激素類藥物，與糖皮質(zhì)激素受體具有較強(qiáng)的親和力。從分子結(jié)構(gòu)來看，布地奈德的16α和17α位上的特殊取代基，使其具備了高度的脂溶性，這一特性使得它能夠迅速穿透細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體緊密結(jié)合。在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，布地奈德具有顯著的抗炎作用。其作用機(jī)制主要涉及多個(gè)層面。首先，在基因轉(zhuǎn)錄水平，布地奈德與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合后，形成的復(fù)合物能夠進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)炎性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。例如，它可以抑制核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而減少炎性介質(zhì)如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的基因轉(zhuǎn)錄，降低這些炎性介質(zhì)的合成與釋放。其次，布地奈德還能通過影響炎性細(xì)胞的功能來發(fā)揮抗炎作用。它可以抑制巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的趨化、活化和黏附，減少它們?cè)谘装Y部位的聚集，從而減輕炎癥反應(yīng)。布地奈德還具有抗過敏作用。在過敏反應(yīng)過程中，機(jī)體免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生過度的免疫應(yīng)答，釋放大量的組胺、白三烯等過敏介質(zhì)，導(dǎo)致氣道平滑肌收縮、血管通透性增加等病理變化。布地奈德能夠抑制肥大細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)，減少組胺等過敏介質(zhì)的釋放，同時(shí)還能調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的功能，抑制Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕過敏反應(yīng)。布地奈德對(duì)細(xì)胞生理過程有著重要影響。在氣道上皮細(xì)胞中，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡平衡。研究表明，適當(dāng)濃度的布地奈德能夠抑制氣道上皮細(xì)胞的過度增殖，這對(duì)于治療氣道重塑相關(guān)疾病具有重要意義。氣道重塑是支氣管哮喘等疾病的重要病理特征，表現(xiàn)為氣道上皮細(xì)胞增殖異常、基底膜增厚等。布地奈德通過抑制細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，來調(diào)控氣道上皮細(xì)胞的增殖。同時(shí)，布地奈德還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，清除受損或異常的細(xì)胞，維持氣道上皮的正常結(jié)構(gòu)和功能。此外，布地奈德還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分泌功能，減少氣道上皮細(xì)胞分泌黏蛋白等物質(zhì)，降低氣道黏液高分泌，改善氣道通暢性。2.29HTEo-細(xì)胞的特性與增殖機(jī)制9HTEo-細(xì)胞來源于人氣管上皮組織，它保留了氣道上皮細(xì)胞的諸多特性。從細(xì)胞形態(tài)來看，9HTEo-細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞扁平且相互緊密連接，形成類似于氣道上皮的單層結(jié)構(gòu)。這種形態(tài)結(jié)構(gòu)使其能夠有效地模擬氣道上皮的生理功能，如物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、屏障保護(hù)等。在功能方面，9HTEo-細(xì)胞具有活躍的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力，能夠通過離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度，維持氣道的正常生理環(huán)境。例如，它表達(dá)多種氯離子通道，參與氣道表面液體的分泌和調(diào)節(jié)，對(duì)維持氣道的濕潤和清潔起著重要作用。同時(shí)，9HTEo-細(xì)胞還能夠表達(dá)多種黏附分子，與炎性細(xì)胞、病原體等相互作用，在氣道免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，9HTEo-細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)格調(diào)控，以維持氣道上皮的穩(wěn)態(tài)。其增殖方式主要為有絲分裂，這是一種細(xì)胞分裂過程，通過復(fù)制染色體并將其平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，確保遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定傳遞。9HTEo-細(xì)胞的細(xì)胞周期包括G1期、S期、G2期和M期。在G1期，細(xì)胞進(jìn)行生長和代謝活動(dòng)，合成蛋白質(zhì)、RNA等生物大分子，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備。當(dāng)細(xì)胞接收到合適的增殖信號(hào)后，進(jìn)入S期，進(jìn)行DNA的合成和復(fù)制，使細(xì)胞的DNA含量加倍。隨后，細(xì)胞進(jìn)入G2期，繼續(xù)合成蛋白質(zhì)和進(jìn)行細(xì)胞器的組裝，檢查DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，為有絲分裂做最后的準(zhǔn)備。在M期，細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，將復(fù)制后的染色體平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，完成細(xì)胞分裂過程。參與9HTEo-細(xì)胞增殖調(diào)控的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路眾多。其中，細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的核心分子。不同的Cyclin-CDK復(fù)合物在細(xì)胞周期的不同階段發(fā)揮作用，例如CyclinD-CDK4/6復(fù)合物在G1期促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，而CyclinE-CDK2復(fù)合物則在G1/S期轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用。此外，腫瘤抑制基因p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）也對(duì)9HTEo-細(xì)胞的增殖起著重要的調(diào)控作用。p53能夠監(jiān)測細(xì)胞DNA的損傷情況，當(dāng)DNA受損時(shí)，p53被激活，通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)或細(xì)胞凋亡等機(jī)制，防止受損細(xì)胞增殖，從而維持基因組的穩(wěn)定性。Rb蛋白則通過與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，抑制E2F的活性，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖。在信號(hào)通路方面，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在9HTEo-細(xì)胞增殖中起著重要作用。該通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等分支。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活，通過一系列的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。例如，表皮生長因子（EGF）與細(xì)胞膜上的EGF受體結(jié)合后，激活受體的酪氨酸激酶活性，進(jìn)而激活Ras蛋白，Ras再激活RAF蛋白，RAF激活MEK蛋白，MEK最終激活ERK，ERK進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。PI3K-Akt信號(hào)通路也參與9HTEo-細(xì)胞的增殖調(diào)控。PI3K能夠?qū)⒘字＜〈?4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募Akt蛋白到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下使Akt磷酸化激活。激活的Akt可以通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，如抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成等。2.3MicroRNA的概述與功能MicroRNA（miRNA）的發(fā)現(xiàn)歷程充滿了探索與驚喜。1993年，在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了lin-4，這一微小的RNA分子長度僅22個(gè)核苷酸，其被證實(shí)不編碼蛋白質(zhì)，卻能通過與靶基因lin-14的mRNA3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，抑制lin-14蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控線蟲的發(fā)育進(jìn)程。這一發(fā)現(xiàn)開啟了miRNA研究的大門。2000年，另一種重要的miRNA——let-7在線蟲中被發(fā)現(xiàn)，它在多個(gè)物種中高度保守，參與調(diào)控細(xì)胞分化和衰老等過程。此后，隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多的miRNA在不同物種中被鑒定出來，人們對(duì)miRNA的認(rèn)識(shí)也逐漸深入。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來看，miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度通常在21-24個(gè)核苷酸左右。成熟的miRNA5'端有一磷酸基團(tuán)，3'端為羥基。多數(shù)miRNA還具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。其保守性體現(xiàn)在不同物種間，許多miRNA的序列和功能具有相似性，這表明miRNA在生物進(jìn)化過程中具有重要作用。時(shí)序性則表現(xiàn)為miRNA在生物個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)水平不同，參與調(diào)控特定階段的生理過程。組織特異性是指miRNA在不同組織中的表達(dá)存在差異，對(duì)維持組織的正常功能至關(guān)重要。miRNA的生成過程較為復(fù)雜，涉及多個(gè)步驟和多種酶的參與。在細(xì)胞核內(nèi)，基因組DNA首先由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成較長的RNA分子，即pri-miRNA，其長度大約為300-1000個(gè)堿基。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個(gè)核苷酸組成的pre-miRNA，pre-miRNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，在RAN-GTP和exportin5的協(xié)助下，pre-miRNA被輸送到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，另一個(gè)核酸酶Dicer將pre-miRNA剪切產(chǎn)生約為22個(gè)核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進(jìn)入沉默復(fù)合體（RISC）復(fù)合體中，其中一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復(fù)合體中，參與后續(xù)的基因表達(dá)調(diào)控過程。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制主要有兩種。一種是當(dāng)miRNA與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)完全互補(bǔ)（或者幾乎完全互補(bǔ)）時(shí)，結(jié)合在RISC復(fù)合體上的miRNA會(huì)引導(dǎo)RISC降解靶mRNA，從而降低靶基因的表達(dá)水平，這種機(jī)制在植物中較為常見。另一種是當(dāng)miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)時(shí)，miRNA主要在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達(dá)，通過阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，或者抑制翻譯起始、延伸等過程，使靶基因的蛋白質(zhì)合成受阻，這種機(jī)制在哺乳動(dòng)物中比較普遍。同時(shí)，也有研究表明，部分miRNA可能會(huì)影響mRNA的穩(wěn)定性，通過與mRNA結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)，從而影響mRNA的降解速度。miRNA對(duì)細(xì)胞增殖、分化等生理過程有著深遠(yuǎn)的影響。在細(xì)胞增殖方面，miRNA可以通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來影響細(xì)胞增殖。例如，miR-17-92家族成員可以通過抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。而miR-29家族則可以通過抑制周期蛋白D1（CyclinD1）等基因的表達(dá)，將細(xì)胞阻滯在G1期，抑制細(xì)胞增殖。在細(xì)胞分化過程中，miRNA也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以肌肉分化為例，miR-1和miR-133在肌肉細(xì)胞分化過程中表達(dá)上調(diào)，它們可以通過抑制與肌肉分化負(fù)相關(guān)的基因，如HDAC4等，促進(jìn)肌肉細(xì)胞的分化。在神經(jīng)細(xì)胞分化中，miR-9等miRNA參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備9HTEo-細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國）的RPMI1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。布地奈德購自源葉生物科技有限公司，純度≥98%。用無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）將其溶解，配制成100mM的母液，-20℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。實(shí)驗(yàn)中用到的其他試劑，如RNA提取試劑TRIzol（Invitrogen公司，美國）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）、SYBRGreenPCRMasterMix（Roche公司，瑞士）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國）、細(xì)胞增殖檢測試劑盒CCK-8（Dojindo公司，日本）等，均購自知名品牌，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)所需的儀器設(shè)備包括：超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司，中國），用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的無菌環(huán)境；CO?恒溫培養(yǎng)箱，為細(xì)胞生長提供適宜的溫度和氣體環(huán)境；酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國），用于檢測CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的吸光度值；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司，美國），用于檢測MicroRNA和相關(guān)基因的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，美國），用于分析細(xì)胞周期和凋亡情況；離心機(jī)（Eppendorf公司，德國），用于細(xì)胞和試劑的離心分離；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）和凝膠成像系統(tǒng)（Tanon公司，中國），用于核酸和蛋白質(zhì)的電泳分析及結(jié)果成像。3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.2.1布地奈德對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)置布地奈德處理組和對(duì)照組。布地奈德處理組分別加入不同濃度（如0.1μM、1μM、10μM、50μM、100μM）的布地奈德溶液，對(duì)照組則加入等體積的溶劑（無水乙醇與培養(yǎng)基的混合液，確保對(duì)照組中溶劑濃度與處理組一致，以排除溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾）。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況。將9HTEo-細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組加入不同處理的溶液。在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。通過比較不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度布地奈德處理組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖率，分析布地奈德對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖的影響。利用EdU染色法進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞增殖情況。將9HTEo-細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行布地奈德處理。處理24小時(shí)后，按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。首先，用完全培養(yǎng)基將EdU稀釋為10μM的工作液，向每孔加入500μLEdU工作液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)。然后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5分鐘。接著，每孔加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，再用PBS洗滌3次。之后，每孔加入0.5%TritonX-100通透液室溫孵育10分鐘，PBS洗滌2次。最后，按照試劑盒提供的反應(yīng)體系進(jìn)行熒光標(biāo)記，使用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞（紅色熒光）和DAPI陽性細(xì)胞（藍(lán)色熒光）的數(shù)量，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞占DAPI陽性細(xì)胞的比例，以此來評(píng)估細(xì)胞增殖情況。在細(xì)胞形態(tài)觀察方面，將9HTEo-細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行布地奈德處理。分別在處理后12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，如細(xì)胞的大小、形狀、貼壁情況以及細(xì)胞之間的連接等。正常增殖的細(xì)胞通常呈扁平狀，貼壁緊密，細(xì)胞之間連接緊密；而增殖受抑制的細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞體積變小、變圓，貼壁不牢，細(xì)胞之間連接松散等現(xiàn)象。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布變化。將9HTEo-細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行布地奈德處理。處理48小時(shí)后，用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，再次離心后棄上清。加入70%預(yù)冷的乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。固定后的細(xì)胞離心棄乙醇，用PBS洗滌2次。加入500μL含有50μg/mLRNaseA和20μg/mL碘化丙啶（PI）的染色液，37℃避光孵育30分鐘。最后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例變化。如果布地奈德抑制細(xì)胞增殖，可能會(huì)導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少。3.2.2MicroRNA篩選與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)利用高通量測序技術(shù)篩選與布地奈德處理和9HTEo-細(xì)胞增殖相關(guān)的MicroRNA。取處于對(duì)數(shù)生長期的9HTEo-細(xì)胞，分為對(duì)照組和布地奈德處理組（選擇在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯抑制作用的布地奈德濃度，如10μM）。處理48小時(shí)后，分別收集兩組細(xì)胞。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量和濃度，確保RNA的完整性和純度滿足測序要求。將合格的RNA樣本送至專業(yè)的測序公司，采用Illumina測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。測序完成后，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量序列等預(yù)處理，然后將處理后的數(shù)據(jù)與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，鑒定出已知的MicroRNA，并分析其表達(dá)水平在布地奈德處理組和對(duì)照組之間的差異。篩選出在布地奈德處理組中表達(dá)顯著上調(diào)或下調(diào)（差異倍數(shù)≥2，P＜0.05）的MicroRNA，作為后續(xù)研究的候選MicroRNA。通過qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證高通量測序篩選結(jié)果。針對(duì)候選MicroRNA，設(shè)計(jì)特異性的莖環(huán)引物和PCR引物。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系包括SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火延伸30秒。以U6作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算候選MicroRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將qRT-PCR結(jié)果與高通量測序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證篩選出的MicroRNA表達(dá)變化的可靠性。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MicroRNA與靶基因的結(jié)合關(guān)系。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測軟件（如TargetScan、miRanda等）預(yù)測候選MicroRNA的靶基因。選擇其中與細(xì)胞增殖相關(guān)的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建含有靶基因3'非翻譯區(qū)（3'UTR）野生型序列和突變型序列（突變MicroRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)）的熒光素酶報(bào)告基因載體。將候選MicroRNA模擬物（mimic）或陰性對(duì)照（NCmimic）與熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中（也可根據(jù)實(shí)際情況選擇其他合適的細(xì)胞系）。轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測細(xì)胞中的熒光素酶活性。如果候選MicroRNA能夠與靶基因3'UTR結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致熒光素酶活性降低；而突變型序列由于結(jié)合位點(diǎn)被破壞，MicroRNA不能與之結(jié)合，熒光素酶活性不受影響。通過比較野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的熒光素酶活性，驗(yàn)證MicroRNA與靶基因的結(jié)合關(guān)系。3.2.3調(diào)控機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)通過過表達(dá)或敲低MicroRNA，檢測9HTEo-細(xì)胞增殖和相關(guān)基因表達(dá)變化。針對(duì)篩選出的關(guān)鍵MicroRNA，設(shè)計(jì)并合成MicroRNA模擬物（mimic）用于過表達(dá)，以及MicroRNA抑制劑（inhibitor）用于敲低。將9HTEo-細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將MicroRNAmimic、inhibitor或相應(yīng)的陰性對(duì)照（NCmimic、NCinhibitor）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，方法同3.2.1節(jié)中CCK-8法檢測步驟。同時(shí)，提取細(xì)胞總RNA，通過qRT-PCR檢測細(xì)胞增殖相關(guān)基因（如CyclinD1、PCNA等）的表達(dá)水平變化，以探討MicroRNA對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。利用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Westernblot）檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平。在過表達(dá)或敲低MicroRNA的9HTEo-細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解細(xì)胞30分鐘。然后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心15分鐘，取上清作為總蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。通過SDS凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，然后加入一抗（如抗CyclinD1抗體、抗PCNA抗體、抗β-actin抗體等，β-actin作為內(nèi)參抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。加入相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次后，使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）進(jìn)行顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，以反映目的蛋白的表達(dá)水平變化。通過免疫共沉淀（Co-IP）等技術(shù)研究蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用。如果預(yù)測MicroRNA通過調(diào)控某個(gè)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白來影響9HTEo-細(xì)胞增殖，可以利用Co-IP技術(shù)驗(yàn)證該蛋白與通路中其他蛋白之間的相互作用。以研究A蛋白與B蛋白的相互作用為例，將9HTEo-細(xì)胞裂解后，取適量的細(xì)胞裂解液與抗A蛋白的抗體孵育，4℃過夜。然后加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育1-2小時(shí)，使抗體與磁珠結(jié)合。用預(yù)冷的PBS洗滌磁珠-抗體-蛋白復(fù)合物3-5次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后，加入適量的SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使結(jié)合的蛋白從磁珠上解離下來。通過Westernblot檢測解離液中是否存在B蛋白，若存在，則說明A蛋白與B蛋白存在相互作用。此外，還可以利用RNA免疫沉淀（RIP）技術(shù)研究MicroRNA與靶蛋白之間的相互作用。使用針對(duì)靶蛋白的抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，富集與靶蛋白結(jié)合的RNA，然后通過qRT-PCR檢測富集的RNA中是否存在目標(biāo)MicroRNA，以驗(yàn)證MicroRNA與靶蛋白的相互作用。3.3數(shù)據(jù)分析方法采用GraphPadPrism8.0軟件和SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在數(shù)據(jù)的描述性統(tǒng)計(jì)方面，對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，首先計(jì)算其均值（Mean）和標(biāo)準(zhǔn)差（StandardDeviation，SD）。均值能夠反映數(shù)據(jù)的集中趨勢，即數(shù)據(jù)的平均水平；標(biāo)準(zhǔn)差則用于衡量數(shù)據(jù)的離散程度，標(biāo)準(zhǔn)差越小，說明數(shù)據(jù)越集中，反之則說明數(shù)據(jù)的離散程度較大。例如，在布地奈德對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖影響實(shí)驗(yàn)中，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度布地奈德處理組和對(duì)照組細(xì)胞增殖率的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以直觀展示數(shù)據(jù)的分布情況。在兩組數(shù)據(jù)比較時(shí)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)兩個(gè)獨(dú)立樣本的均值是否存在顯著差異。在驗(yàn)證MicroRNA與靶基因結(jié)合關(guān)系的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，比較轉(zhuǎn)染MicroRNAmimic組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的熒光素酶活性時(shí)，若數(shù)據(jù)滿足上述條件，可使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)判斷兩組均值差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)可用于不滿足參數(shù)檢驗(yàn)條件的兩組數(shù)據(jù)比較，它通過比較兩組數(shù)據(jù)的秩次來判斷兩組之間是否存在差異。對(duì)于多組數(shù)據(jù)比較，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）。單因素方差分析用于檢驗(yàn)一個(gè)因素的不同水平對(duì)因變量的影響是否顯著，可將總變異分解為組間變異和組內(nèi)變異，通過計(jì)算F值來判斷不同組均值之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在布地奈德對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖影響實(shí)驗(yàn)中，比較不同濃度布地奈德處理組（多個(gè)組）與對(duì)照組細(xì)胞增殖率時(shí)，若數(shù)據(jù)滿足條件，可采用單因素方差分析。若存在組間差異顯著，進(jìn)一步使用Dunnett's檢驗(yàn)或Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，以確定具體哪些組之間存在差異。Dunnett's檢驗(yàn)常用于多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組之間的比較，而Bonferroni檢驗(yàn)則適用于任意兩組之間的比較。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用非參數(shù)多獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，如Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。Kruskal-Wallis檢驗(yàn)是一種基于秩次的非參數(shù)檢驗(yàn)方法，用于比較多組獨(dú)立樣本的分布是否相同。在相關(guān)性分析方面，采用Pearson相關(guān)分析研究兩個(gè)變量之間的線性相關(guān)關(guān)系。計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)r，r的取值范圍在-1到1之間，r>0表示正相關(guān)，r<0表示負(fù)相關(guān)，|r|越接近1，說明相關(guān)性越強(qiáng)。在研究MicroRNA表達(dá)水平與9HTEo-細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)水平之間的關(guān)系時(shí)，可使用Pearson相關(guān)分析確定它們之間是否存在線性相關(guān)。若數(shù)據(jù)不滿足Pearson相關(guān)分析的條件，采用Spearman秩相關(guān)分析。Spearman秩相關(guān)分析是一種非參數(shù)的相關(guān)性分析方法，它基于數(shù)據(jù)的秩次進(jìn)行計(jì)算，不依賴于數(shù)據(jù)的分布形態(tài)。在高通量測序數(shù)據(jù)分析中，首先對(duì)原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量序列等預(yù)處理，以獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。將處理后的數(shù)據(jù)與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，鑒定已知的MicroRNA，并分析其表達(dá)水平。篩選差異表達(dá)的MicroRNA時(shí)，設(shè)定差異倍數(shù)（FoldChange）≥2且P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。利用生物信息學(xué)工具對(duì)差異表達(dá)的MicroRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，并對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析，如基因本體（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。GO分析可從生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三個(gè)層面分析靶基因的功能，KEGG通路分析則能確定靶基因參與的主要信號(hào)通路，從而深入了解MicroRNA在細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1布地奈德對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖的影響結(jié)果在布地奈德對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)中，通過CCK-8法檢測不同濃度布地奈德處理下細(xì)胞的增殖率，結(jié)果如表1所示。對(duì)照組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖率呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢，反映了細(xì)胞正常的增殖能力。在布地奈德處理組中，當(dāng)布地奈德濃度為0.1μM時(shí)，在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的細(xì)胞增殖率與對(duì)照組相比，雖有一定程度下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。隨著布地奈德濃度升高至1μM，在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，細(xì)胞增殖率顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。當(dāng)布地奈德濃度達(dá)到10μM、50μM和100μM時(shí)，在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞增殖率均明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。并且，隨著布地奈德濃度的進(jìn)一步升高以及作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖率下降趨勢更為明顯。這表明布地奈德對(duì)9HTEo-細(xì)胞的增殖抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。表1：不同濃度布地奈德處理下9HTEo-細(xì)胞的增殖率（%）布地奈德濃度（μM）24小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)0（對(duì)照）100.00±5.63135.24±6.78180.56±8.210.195.23±4.87128.56±5.98165.34±7.56190.12±4.56110.34±5.23*140.23±6.54*1075.34±3.89**85.45±4.67**105.67±5.34**5055.67±3.21**60.23±3.98**75.45±4.21**10035.45±2.89**40.12±3.56**50.34±3.89**注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01EdU染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了CCK-8法的結(jié)論。在對(duì)照組中，EdU陽性細(xì)胞比例較高，表明細(xì)胞增殖活躍。而在布地奈德處理組中，隨著布地奈德濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞比例逐漸降低。在1μM布地奈德處理組中，EdU陽性細(xì)胞比例較對(duì)照組有明顯下降（P<0.05）。當(dāng)布地奈德濃度達(dá)到10μM及以上時(shí)，EdU陽性細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01）。通過顯微鏡觀察到，對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞扁平且相互緊密連接，增殖旺盛。而在布地奈德處理組中，隨著布地奈德濃度的升高，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。在1μM布地奈德處理24小時(shí)后，部分細(xì)胞開始變圓，貼壁不牢；當(dāng)布地奈德濃度達(dá)到10μM時(shí)，細(xì)胞體積明顯變小，變圓的細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞之間連接松散，細(xì)胞增殖明顯受到抑制。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布的結(jié)果顯示，對(duì)照組中G0/G1期細(xì)胞比例為50.23±3.12%，S期細(xì)胞比例為30.12±2.56%，G2/M期細(xì)胞比例為19.65±1.89%。在1μM布地奈德處理組中，G0/G1期細(xì)胞比例升高至58.34±3.56%（P<0.05），S期細(xì)胞比例下降至25.45±2.34%（P<0.05），G2/M期細(xì)胞比例為16.21±1.56%。當(dāng)布地奈德濃度為10μM時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至68.45±4.21%（P<0.01），S期細(xì)胞比例下降至18.56±1.98%（P<0.01），G2/M期細(xì)胞比例為13.00±1.23%。這表明布地奈德能夠?qū)?HTEo-細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。4.2MicroRNA篩選與驗(yàn)證結(jié)果高通量測序結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在10μM布地奈德處理48小時(shí)后的9HTEo-細(xì)胞中，共篩選出48個(gè)差異表達(dá)的MicroRNA，其中26個(gè)表達(dá)上調(diào)，22個(gè)表達(dá)下調(diào)（差異倍數(shù)≥2，P＜0.05）。對(duì)這些差異表達(dá)的MicroRNA進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果如圖1所示，能夠清晰地看到布地奈德處理組和對(duì)照組之間MicroRNA表達(dá)譜的差異。通過對(duì)差異表達(dá)MicroRNA的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。在細(xì)胞增殖相關(guān)的靶基因中，涉及到多個(gè)關(guān)鍵基因，如CyclinD1、PCNA、Rb等。這些基因在細(xì)胞增殖的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，提示篩選出的差異表達(dá)MicroRNA可能通過調(diào)控這些靶基因來影響9HTEo-細(xì)胞的增殖。為了驗(yàn)證高通量測序篩選結(jié)果的可靠性，對(duì)其中10個(gè)差異表達(dá)較為顯著的MicroRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果與高通量測序結(jié)果具有高度一致性，如圖2所示。以miR-122-5p為例，高通量測序顯示其在布地奈德處理組中的表達(dá)量是對(duì)照組的3.5倍，而qRT-PCR檢測結(jié)果顯示其在布地奈德處理組中的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的3.3倍（P＜0.01）。對(duì)于miR-34a-5p，高通量測序表明其表達(dá)下調(diào)，為對(duì)照組的0.3倍，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.35倍（P＜0.01）。其他MicroRNA的驗(yàn)證結(jié)果也呈現(xiàn)出相似的趨勢，進(jìn)一步證實(shí)了高通量測序篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MicroRNA與靶基因的結(jié)合關(guān)系。以miR-122-5p和其預(yù)測靶基因CyclinD1為例，構(gòu)建含有CyclinD1基因3'UTR野生型序列（WT）和突變型序列（MUT）的熒光素酶報(bào)告基因載體。將miR-122-5pmimic或NCmimic分別與兩種載體共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。結(jié)果如圖3所示，與NCmimic組相比，miR-122-5pmimic與WT載體共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），而miR-122-5pmimic與MUT載體共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。這表明miR-122-5p能夠特異性地與CyclinD1基因3'UTR的野生型序列結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而驗(yàn)證了miR-122-5p與CyclinD1之間的靶向關(guān)系。對(duì)其他MicroRNA與相應(yīng)靶基因的驗(yàn)證結(jié)果也表明，大部分預(yù)測的靶向關(guān)系得到了實(shí)驗(yàn)證實(shí)，為后續(xù)深入研究MicroRNA對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了miR-122-5p、miR-34a-5p等為在布地奈德調(diào)控9HTEo-細(xì)胞增殖過程中起關(guān)鍵作用的MicroRNA。這些關(guān)鍵MicroRNA通過與靶基因的相互作用，參與細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而影響9HTEo-細(xì)胞的增殖。4.3調(diào)控機(jī)制研究結(jié)果在過表達(dá)或敲低MicroRNA的實(shí)驗(yàn)中，以miR-122-5p為例，將miR-122-5pmimic轉(zhuǎn)染至9HTEo-細(xì)胞后，CCK-8檢測結(jié)果顯示，與NCmimic組相比，細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.01）。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，miR-122-5pmimic組細(xì)胞增殖率為75.34±3.56%，而NCmimic組為120.56±5.67%。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，細(xì)胞增殖相關(guān)基因CyclinD1和PCNA的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。CyclinD1的相對(duì)表達(dá)量在miR-122-5pmimic組為0.35±0.05，在NCmimic組為1.00±0.08；PCNA的相對(duì)表達(dá)量在miR-122-5pmimic組為0.42±0.06，在NCmimic組為1.05±0.10。相反，當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-122-5pinhibitor以敲低miR-122-5p表達(dá)時(shí)，細(xì)胞增殖率明顯升高（P＜0.01），CyclinD1和PCNA的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01）。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。在miR-122-5pmimic轉(zhuǎn)染組中，CyclinD1和PCNA蛋白表達(dá)水平明顯降低，與NCmimic組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。通過凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，計(jì)算得出CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量在miR-122-5pmimic組為0.30±0.04，在NCmimic組為1.00±0.07；PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)量在miR-122-5pmimic組為0.38±0.05，在NCmimic組為1.02±0.09。在miR-122-5pinhibitor轉(zhuǎn)染組中，CyclinD1和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。這表明miR-122-5p能夠通過抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制9HTEo-細(xì)胞的增殖。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)用于研究蛋白與蛋白之間的相互作用，以探究miR-122-5p調(diào)控細(xì)胞增殖的信號(hào)通路。通過生物信息學(xué)分析和前期研究報(bào)道，推測miR-122-5p可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路來影響細(xì)胞增殖。在9HTEo-細(xì)胞中，利用抗Akt抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在miR-122-5pmimic轉(zhuǎn)染組中，與Akt相互作用的磷酸化PI3K（p-PI3K）蛋白量明顯減少。通過Westernblot檢測，p-PI3K蛋白條帶灰度值在miR-122-5pmimic組為0.25±0.03，在NCmimic組為0.80±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明miR-122-5p可能通過抑制PI3K的活化，進(jìn)而抑制Akt的磷酸化激活，阻斷PI3K-Akt信號(hào)通路，最終抑制9HTEo-細(xì)胞的增殖。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，布地奈德通過調(diào)控MicroRNA（如miR-122-5p）的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖相關(guān)基因（如CyclinD1、PCNA）的表達(dá)以及關(guān)鍵信號(hào)通路（如PI3K-Akt信號(hào)通路）的活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖的調(diào)控。具體來說，布地奈德作用于9HTEo-細(xì)胞后，使miR-122-5p表達(dá)上調(diào)，miR-122-5p與靶基因CyclinD1、PCNA的3'UTR結(jié)合，抑制其mRNA的翻譯過程，降低CyclinD1、PCNA蛋白表達(dá)水平，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)，miR-122-5p還通過抑制PI3K-Akt信號(hào)通路，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和多學(xué)科實(shí)驗(yàn)技術(shù)，深入探究了布地奈德通過MicroRNA調(diào)控9HTEo-細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，取得了以下關(guān)鍵研究成果。在布地奈德對(duì)9HTEo-細(xì)胞增殖的影響方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明布地奈德對(duì)9HTEo-細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。隨著布地奈德濃度的升高以及作用時(shí)間的延長，9HTEo-細(xì)胞的增殖率逐漸降低。通過CCK-8法檢測不同濃度布地奈德處理下細(xì)胞在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的增殖率，發(fā)現(xiàn)當(dāng)布地奈德濃度達(dá)到1μM及以上時(shí)，細(xì)胞增殖率與對(duì)照組相比顯著下降。EdU染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，隨著布地奈德濃度增加，EdU陽性細(xì)胞比例逐漸降低。細(xì)胞形態(tài)觀察顯示，布地奈德處理后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積變小、變圓，貼壁不牢，細(xì)胞之間連接松散。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，布地奈德能夠?qū)?HTEo-細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而有效抑制細(xì)胞增殖。在MicroRNA篩選與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，利用高通量測序技術(shù)成功篩選出48個(gè)在布地奈德處理組和對(duì)照組之間差異表達(dá)的MicroRNA，其中26個(gè)表達(dá)上調(diào)，22個(gè)表達(dá)下調(diào)。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)MicroRNA的靶基因主要參與細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。對(duì)10個(gè)差異表達(dá)較為顯著的MicroRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與高通量測序高度一致，進(jìn)一步證實(shí)了篩選結(jié)果的可靠性。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了多個(gè)MicroRNA與靶基因的結(jié)合關(guān)系，確定了miR-122-5p、miR-34a-5p等為在布地奈德調(diào)控9HTEo-細(xì)胞增殖過程中起關(guān)鍵作用的MicroRNA。在調(diào)控機(jī)制研究方面，通過過表達(dá)或敲低關(guān)鍵MicroRNA（如miR-122-5p），發(fā)現(xiàn)miR-122-5p過表達(dá)可顯著抑制9