色譜技術及應用1 凝膠過濾技術1)、Gelfiltrationchromatography(GFC)原理操作與原理：含有不同組分的溶液，通過網(wǎng)狀結構的凝膠粒子(a)，小分子擴散進入凝膠相，大分子被排阻于凝膠相外，加入洗脫劑后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子進入下層新的凝膠相中，重復上述擴散和排阻。這樣最先流出的為最大的分子，最后流出的為最小分子，分段收集可以獲得按分子量大小分布的各組分。分子篩色譜:

從上可見，凝膠過濾具有分子篩的作用。分離關系：組分0的M最大，不能進入gel，洗脫體積為空隙體積V0；組分t的M最小，能進入到gel的細孔中，其洗脫體積接近柱體積Vt,組分1-2在V0-Vt之間.顯然，GFC能分離洗脫體積在V0-Vt之間的組分。對于組分1和2，兩峰距離m1 凝膠過濾技術分配系數(shù)m影響因素：分子量,分子形狀,gel孔徑結構；與pH,I,T無關.2)、凝膠介質對介質的要求：1st

親水性高；2nd

表面惰性，不發(fā)生化學和物理變化；3rd

高穩(wěn)定性，有較寬的pH和I適應范圍；4th

具有一定的孔徑分布；5th

機械強度高，耐高壓操作，壽命長。 商品化的介質均能滿足1-4條的要求。介質的類型：1st Sephadex2nd

Sephacryl3rd

Superose/-dex,Sepharose4th Cellulose5th

TSKgel1 凝膠過濾技術3)、凝膠介質特征參數(shù)排阻極限(exclusionlimit)：指不能擴散到凝膠網(wǎng)絡內部的最小分子的M。如，SephadexG50的排阻極限為30kD。分級范圍(fractionationrange)：能阻滯組分并且使組分相互之間得到分離的組分分子量范圍。如，SephadexG50的分級在1.5-30KD內。溶脹率/吸水率：

如，SephadexG50的溶脹率=500±30%。

意義:凝膠粒徑：軟gel粒徑較大，在50-150

m之間；硬gel較小，在5-50m之間。粒徑越小，HETP越小，分離效率越高。床體積(bedvolume)：1g干燥gel溶脹后所占有的體積。如，SephadexG50的床體積為9-11cm3/g干膠?？障扼w積(voidvolume)：凝膠之間的空隙體積，即V0。

空隙體積一般用平均分子量在2000KD水溶性藍葡聚糖(bluedextran)測定。1 凝膠過濾技術4)、影響因素線速度：1stHW40F凝膠的排阻極限小，在該凝膠中蛋白質的m=0，故HETP=2Dz/u(Dz

udp)=常數(shù)。2ndHW55F凝膠的排阻極限較大，在此，m>0,HETPu;在u=0處，直線交于點2Dz/u。3rd

當u<0.2cm/min,NaCl的HETP隨流速降低急劇增大。這主要由于分子的擴散影響。進樣體積：

1st

在一定相對料液體積范圍內，HETP為常數(shù)；2nd

但，之后，HETP隨料液相對體積的增加而急劇增大。

3rd

意義：為得到較高的分離度，料液體積需根據(jù)溶質的m差別控制在適當?shù)姆秶鷥?，在不影響分離度的前提下取最大值。料液濃度 依據(jù)GFC的原理，tr和HETP與濃度無關。但實驗表明，當濃度較高時，洗脫曲線出現(xiàn)吐舌、拖尾、甚至雙峰；使HETP極度上升。這主要為樣品黏度高造成。經(jīng)驗表明，料液與流動相的黏度比應控制在2以內。1 凝膠過濾技術分子量M和分配系數(shù)m1st

在GFC分級范圍內m與M關系 此時，分離度方程為 方程示：b值越大，即凝膠分級范圍越小，Rs越大。2nd

因此，一定料液時，根據(jù)組分的M選擇分級范圍較小的介質，提高Rs和料液的處理量。凝膠的粒徑1st

dp,HETP.故dp

是N的最佳途徑；2nd

dp10倍,而h和v不變，u10倍，HETP(=hdp)10倍，R10倍1 凝膠過濾技術5）、應用1st

分離純化

M：x0-106，

d:0.x-x00nm之間；

種類：肽、脂質、抗生素、糖、核酸、病毒(50-400nm)。2nd

除熱原、過敏原 如青霉噻唑蛋白–SephadexG25凝膠柱。3rd 脫鹽/置換buffer1 凝膠過濾技術4th

M測定 原理： 挑選標準蛋白質：cytC(12500),Mb(16900),胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋白(45000)和Hb(64500).

條件：在凝膠介質分級范圍內.

作圖：6）、優(yōu)點1st

如其他色譜相比，操作簡便，介質價廉易得；適合于大規(guī)模生產(chǎn)；2nd

溶質和介質不發(fā)生任何形式的相互作用，故操作條件溫和，回收率接近100%；3rd

分離結束后，無須對分離介質進行清洗和再生，故容易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；4th 作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快，精度高；與超濾相比，剪切力小，蛋白質的回收率高。5th

分離機理簡單，操作參數(shù)少，易于放大。7）、缺點1st

分離僅限于分子量的差別，選擇性低，處理量少；2nd

經(jīng)GFC洗脫后，產(chǎn)品被稀釋。因此需濃縮單元操作。2 離子交換劑色譜原理(ionexchangerchromatography,IEC)1st

荷電溶質在離子交換劑上的分配系數(shù)m I-離子強度；A和B為常數(shù),均為pH的函數(shù)，在物理意義上，B為溶質的靜電荷數(shù)與交換劑的離子價數(shù)之比(對于pro,一般大于10)。m

-離子強度無限大時的溶質分配系數(shù),為靜電作用外的非特異性吸附引起的溶質在交換劑上分配。2nd

意義：對于pro.和aa

調節(jié)Ivalue

調節(jié)|pH–pI| value操作1st

恒定洗脫(Sephadex常用)缺點：洗脫體積大,溶質洗脫不盡2nd

I線性梯度洗脫(lineargradientelution)2 離子交換劑色譜3ndpH線性梯度洗脫(lineargradientelution)4th

線性梯度洗脫的優(yōu)缺點優(yōu)點：流動相I/pH連續(xù)變化，不易出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣；缺點：需要特殊的濃度梯度設備，如梯度混合器。5th

階梯洗脫法(stepwiseelution)2 離子交換劑色譜6th階梯洗脫法的優(yōu)缺點優(yōu)點：無須特殊設備，操作簡單；缺點：流動相濃度不斷變化，易出現(xiàn)干擾峰，容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)象。線性洗脫時間定義：GHdI/dV-離子強度梯度(mol/l)，F(xiàn)-流動相流量(l/s).利用GH和Ip關系圖及上述方程，可算tr2 離子交換劑色譜分離度和柱效1st

分離度意義：4因素可控制2nd

柱效意義：I+dIImi富集效應2 離子交換劑色譜應用：3 疏水性吸附色譜疏水性色譜原理1)、吸附1stpro疏水性2ndpro稀疏水性差異3rd

原有吸附介質的親水性4th

親水性介質的改造hydrophobicinteractionchromatography,HIC2)、影響pro水化層因素1st

水化層(hydrationshell) tighthydrationshell(0.35gwater/1gpro) loosehydrationshell(2gwater/1gpro)2ndionicstrength3rd|pH水

–pI|Value

|pH水

–pI|Value

zeta電勢

水化層

4th

增加親水性物質 離子：SCN-，ClO4-，I-

有機物：乙二醇、丙三醇等含羥基物質5th

表面活性劑TighthydrationshellProteincoreLoosehydrationshell洗脫方法?3 疏水性吸附色譜3)、洗脫方法降低離子強度增加|pH–pI|[乙二醇]or[I-][表面活性劑]4)、富集效應I+dIImi3 疏水性吸附色譜分離效率和柱效1st

分離效率2nd

柱效3rd

降低顆粒大小的極端重要性3 疏水性吸附色譜Applications3 疏水性吸附色譜特點：1st互補工具：HIC主要用于蛋白質類分離純化，雖然HIC不如IEC的應用廣泛，但可以作為IEC的互補工具。如方法得當，HIC與IEC的分離效率相當。2nd

與鹽析銜接：由于在高濃度鹽溶液中疏水性較大，因此HIC可直接分離鹽析后的蛋白質溶液。3rd

可以通過調節(jié)疏水性配基鏈長和密度來控制吸附性能的大小，因此可根據(jù)目標產(chǎn)物的性質選擇適當?shù)奈絼?th

疏水性吸附的種類多，選擇余地大，價格與離子交換劑相當。4 聚焦色譜2)、聚焦色譜原理：基于離子交換原理，根據(jù)兩性電解質pI的差別進行分離純化的洗脫層析法。固定相：聚合緩沖離子交換劑(poly-bufferexchanger),特點是在較寬pH范圍內具有緩沖能力。流動相：polybuffer的水溶液，特點在較寬pH范圍內具有緩沖能力。Poly-bufferandPoly-bufferexchangerManypolybufferswithdifferentpIsAkindofPoly-bufferwithapI4 聚焦色譜洗脫發(fā)生的變化：在柱內pH緩慢變化，在軸向形成連續(xù)的pH梯度，使溶質依據(jù)其pI或吸附或洗脫，漸漸向下移動，彼此分離。以陰離子交換劑為例4 聚焦色譜對應的色譜圖4 聚焦色譜2)5 反相色譜反相色譜(reversedphasechromatography,RPC)固定相：非極性的反相介質，即為疏水性介質(R1,R2多為甲基，R為C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制備的試劑最多，統(tǒng)稱為ODS–Octadecylsilica)。烷基化密度：45%，55%的羥基用 三甲基氯硅烷覆蓋，使表面完全 非極性化。

溶質在介質上的分配系數(shù)處決于溶質的疏水性，疏水性大，m高。流動相：極性有機溶劑的水溶液(甲醇,