干擾素調(diào)節(jié)因子7對(duì)人類(lèi)8型皰疹病毒基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制解析一、引言1.1研究背景人類(lèi)8型皰疹病毒（HumanHerpesvirus8，HHV-8），又被稱(chēng)為卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi’sSarcoma-AssociatedHerpesvirus，KSHV），是γ-2皰疹病毒屬中的一個(gè)成員，也是該屬中唯一能感染人類(lèi)的病毒。HHV-8于1994年被發(fā)現(xiàn)，其病毒顆粒呈球形，由162個(gè)殼粒組成20面體對(duì)稱(chēng)的核衣殼，核心為線(xiàn)狀雙鏈DNA，基因組長(zhǎng)度約為165kb，包含超過(guò)90個(gè)基因，其中30個(gè)編碼多種病毒蛋白，這些蛋白參與病毒基因表達(dá)調(diào)控、宿主病毒感染和病毒顆粒組裝等過(guò)程。HHV-8主要通過(guò)密切接觸與性接觸途徑傳播，為嗜淋巴細(xì)胞病毒，感染后病毒可在人體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏。當(dāng)機(jī)體免疫功能正常時(shí)，病毒感染通常無(wú)癥狀，但在免疫功能缺陷的人群中，如艾滋病患者、器官移植受者等，HHV-8感染可引發(fā)一系列嚴(yán)重疾病。它與卡波西肉瘤（Kaposi’sSarcoma，KS）、原發(fā)性滲出性淋巴瘤（PrimaryEffusionLymphoma，PEL）以及多中心性卡斯特萊曼病（MulticentricCastlemanDisease，MCD）等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?？úㄎ魅饬鍪且环N以血管增生為特征的惡性腫瘤，可發(fā)生于皮膚、黏膜和內(nèi)臟器官，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存期；原發(fā)性滲出性淋巴瘤是一種罕見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤，通常發(fā)生在體腔中，預(yù)后較差；多中心性卡斯特萊曼病則是一種淋巴組織增生性疾病，可導(dǎo)致全身淋巴結(jié)腫大、發(fā)熱、貧血等癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在艾滋病患者中，KS的發(fā)病率顯著高于普通人群，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康。目前，雖然對(duì)HHV-8的研究取得了一定進(jìn)展，但關(guān)于其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍存在許多未知。HHV-8的感染狀態(tài)分為潛伏狀態(tài)和裂解狀態(tài)，在潛伏狀態(tài)下，病毒基因組持續(xù)存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，僅少量病毒基因表達(dá)；而在裂解狀態(tài)下，病毒大量復(fù)制并表達(dá)一系列基因，產(chǎn)生新的病毒顆粒。病毒感染狀態(tài)的轉(zhuǎn)換受多種因素調(diào)控，其中復(fù)制與轉(zhuǎn)錄激活蛋白（ReplicationandTranscriptionActivator，RTA）在誘導(dǎo)病毒從潛伏狀態(tài)進(jìn)入裂解狀態(tài)的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，除了已知的一些調(diào)控因子外，還有哪些因素參與HHV-8基因表達(dá)調(diào)控，以及它們之間如何相互作用，尚有待進(jìn)一步深入研究。干擾素調(diào)節(jié)因子7（InterferonRegulatoryFactor7，IRF7）是干擾素調(diào)節(jié)因子家族中的重要成員，在宿主天然免疫和抗病毒反應(yīng)中扮演著不可或缺的角色。IRF7主要功能是調(diào)控干擾素（Interferon,IFN）的產(chǎn)生。當(dāng)細(xì)胞感知到病毒入侵時(shí)，一系列信號(hào)分子會(huì)被激活，最終激活I(lǐng)RF7。激活的IRF7會(huì)遷移到細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)干擾素基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生，幫助細(xì)胞抵抗病毒。除了抗病毒作用，IRF7還參與調(diào)節(jié)其他免疫反應(yīng)，如炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，IRF7也參與了HHV-8的感染和復(fù)制過(guò)程，但其具體作用機(jī)制尚不明確。鑒于HHV-8感染相關(guān)疾病的嚴(yán)重性以及IRF7在抗病毒免疫中的關(guān)鍵作用，深入研究IRF7對(duì)HHV-8基因表達(dá)的影響，對(duì)于揭示HHV-8的致病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的抗病毒策略以及治療相關(guān)疾病具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）對(duì)人類(lèi)8型皰疹病毒（HHV-8）基因表達(dá)的影響，明確IRF7在HHV-8感染過(guò)程中的具體作用機(jī)制。通過(guò)分析HHV-8感染細(xì)胞中IRF7的表達(dá)變化，確定IRF7與HHV-8基因組中哪些基因相關(guān)，并進(jìn)一步探究IRF7參與HHV-8基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，從而為揭示HHV-8的致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。從理論層面來(lái)看，目前對(duì)于HHV-8基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不完善，深入研究IRF7對(duì)HHV-8基因表達(dá)的影響，有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域的理論空白，進(jìn)一步豐富和完善病毒基因表達(dá)調(diào)控的理論體系。在已有的研究中，雖然發(fā)現(xiàn)IRF7參與了HHV-8的感染和復(fù)制過(guò)程，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究將通過(guò)多方面的實(shí)驗(yàn)分析，深入挖掘IRF7與HHV-8基因表達(dá)之間的內(nèi)在聯(lián)系，為全面理解病毒與宿主之間的相互作用提供新的視角。從實(shí)際應(yīng)用角度而言，HHV-8感染相關(guān)疾病，如卡波西肉瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤以及多中心性卡斯特萊曼病等，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，目前針對(duì)這些疾病的治療手段仍存在諸多局限性。明確IRF7對(duì)HHV-8基因表達(dá)的影響，有助于開(kāi)發(fā)新的抗病毒策略和治療方法。例如，通過(guò)調(diào)控IRF7的活性，有可能干預(yù)HHV-8的基因表達(dá)，從而抑制病毒的感染和復(fù)制，為臨床治療HHV-8感染相關(guān)疾病提供新的靶點(diǎn)和思路。此外，這也有助于在預(yù)防層面，針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群制定更有效的預(yù)防措施，降低HHV-8的感染率，減少相關(guān)疾病的發(fā)生，對(duì)公共衛(wèi)生事業(yè)具有重要意義。1.3研究思路與方法本研究將綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，從細(xì)胞水平、分子水平深入探究干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）對(duì)人類(lèi)8型皰疹病毒（HHV-8）基因表達(dá)的影響。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用對(duì)HHV-8敏感的細(xì)胞系，如原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞等。將這些細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞感染HHV-8病毒，對(duì)照組細(xì)胞不做感染處理或進(jìn)行模擬感染處理。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中IRF7的mRNA表達(dá)水平，分析HHV-8感染是否會(huì)引起IRF7表達(dá)變化以及這種變化的時(shí)間規(guī)律。同時(shí)，利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞中IRF7蛋白的表達(dá)水平，從蛋白質(zhì)層面驗(yàn)證mRNA水平的結(jié)果，進(jìn)一步明確IRF7在HHV-8感染細(xì)胞中的表達(dá)變化情況。對(duì)于確定IRF7與HHV-8基因組中哪些基因相關(guān)，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)。分別提取HHV-8感染前后細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。通過(guò)生物信息學(xué)分析，比較感染前后基因表達(dá)譜的差異，篩選出與IRF7表達(dá)變化具有顯著相關(guān)性的HHV-8基因。利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證這些篩選出的基因與IRF7之間的直接或間接相互作用關(guān)系。構(gòu)建含有目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與IRF7表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。若熒光素酶活性發(fā)生顯著變化，則表明IRF7可能對(duì)該基因的啟動(dòng)子活性有調(diào)控作用，進(jìn)而影響其表達(dá)。在探究IRF7參與HHV-8基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制時(shí)，運(yùn)用基因過(guò)表達(dá)和基因敲除技術(shù)。構(gòu)建IRF7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到HHV-8感染的細(xì)胞中，使細(xì)胞內(nèi)IRF7的表達(dá)水平顯著升高；同時(shí)，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建IRF7基因敲除的細(xì)胞模型。通過(guò)qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲除IRF7后，HHV-8相關(guān)基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，明確IRF7對(duì)這些基因表達(dá)的正向或負(fù)向調(diào)控作用。進(jìn)一步通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）技術(shù)，研究IRF7在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，確定IRF7是否直接與HHV-8基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)控區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)。此外，分析IRF7與其他參與HHV-8基因表達(dá)調(diào)控的宿主蛋白或病毒蛋白之間的相互作用關(guān)系，利用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些蛋白之間是否存在直接相互作用，深入揭示IRF7參與HHV-8基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。二、干擾素調(diào)節(jié)因子7與人類(lèi)8型皰疹病毒概述2.1干擾素調(diào)節(jié)因子72.1.1IRF7的結(jié)構(gòu)特征干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）是干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）家族中的重要成員，在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其獨(dú)特的蛋白結(jié)構(gòu)與其多樣的生物學(xué)功能緊密相關(guān)。IRF7蛋白從氨基端（N端）到羧基端（C端）主要包含以下幾個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域（DNABindingDomain，DBD）位于IRF7的N端區(qū)域。該結(jié)構(gòu)域由約120個(gè)氨基酸組成，含有多個(gè)保守的氨基酸殘基，它們通過(guò)特定的空間排列形成了能夠與DNA特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)基序。DBD中的一些關(guān)鍵氨基酸殘基能夠與DNA雙鏈上的特定核苷酸序列相互作用，這種相互作用具有高度的特異性，使得IRF7能夠精準(zhǔn)地識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的干擾素刺激反應(yīng)元件（Interferon-StimulatedResponseElement，ISRE）上。例如，DBD中的一些堿性氨基酸殘基可以與DNA磷酸骨架上的負(fù)電荷相互吸引，同時(shí)，特定的氨基酸側(cè)鏈能夠與ISRE序列中的堿基形成氫鍵等相互作用，從而穩(wěn)定IRF7與DNA的結(jié)合，為后續(xù)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄奠定基礎(chǔ)。干擾素調(diào)節(jié)因子關(guān)聯(lián)域（InterferonRegulatoryFactor-AssociatedDomain，IAD）也被稱(chēng)為蛋白相互作用域。它位于IRF7的C端部分，在介導(dǎo)IRF7與其他蛋白質(zhì)相互作用的過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。IAD結(jié)構(gòu)域可以與多種蛋白質(zhì)形成相互作用，包括其他IRF家族成員、轉(zhuǎn)錄共激活因子以及參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)蛋白等。通過(guò)與這些蛋白的相互作用，IRF7能夠形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)節(jié)其自身的活性以及在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能。比如，在病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)中，IAD可以與IRF3相互作用，形成異源二聚體復(fù)合物，這種復(fù)合物相較于單體具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性，能夠更有效地激活下游干擾素基因的轉(zhuǎn)錄。除了上述兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，IRF7還包含其他一些結(jié)構(gòu)元件，這些元件在調(diào)節(jié)IRF7的活性和功能方面同樣具有重要意義。在IRF7的結(jié)構(gòu)中存在一些磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染等刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路會(huì)被激活，一些蛋白激酶會(huì)識(shí)別并作用于IRF7的這些磷酸化位點(diǎn)，使其發(fā)生磷酸化修飾。這種磷酸化修飾能夠改變IRF7的構(gòu)象，從而影響其與DNA的結(jié)合能力以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用，最終調(diào)節(jié)IRF7的轉(zhuǎn)錄激活活性。此外，IRF7還可能包含一些核定位信號(hào)（NuclearLocalizationSignal，NLS），這些信號(hào)能夠引導(dǎo)IRF7在受到刺激后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，使其能夠在細(xì)胞核中發(fā)揮對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。IRF7的這些結(jié)構(gòu)特征使其能夠在病毒感染等免疫應(yīng)答過(guò)程中，通過(guò)與DNA和其他蛋白質(zhì)的特異性相互作用，精準(zhǔn)地調(diào)控干擾素基因以及其他相關(guān)免疫基因的表達(dá)，從而在宿主抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2.1.2IRF7的功能與作用機(jī)制IRF7在宿主天然免疫和抗病毒反應(yīng)中扮演著至關(guān)重要的角色，其主要功能是激活I(lǐng)型干擾素基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而啟動(dòng)一系列抗病毒免疫反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體受到病毒入侵時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體（PatternRecognitionReceptors，PRRs）會(huì)首先感知到病毒的存在。其中，Toll樣受體（Toll-LikeReceptors，TLRs）中的TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，以及維甲酸誘導(dǎo)基因I（RetinoicAcid-InducibleGeneI，RIG-I）樣受體（RIG-I-LikeReceptors，RLRs）中的RIG-I和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5（MelanomaDifferentiation-AssociatedProtein5，MDA5）等是重要的病毒核酸識(shí)別受體。以RIG-I信號(hào)通路為例，當(dāng)病毒入侵細(xì)胞后，病毒的雙鏈RNA（dsRNA）或5'-三磷酸化單鏈RNA（5'-ppp-ssRNA）會(huì)被RIG-I識(shí)別。RIG-I識(shí)別病毒RNA后，其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，從而招募線(xiàn)粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MitochondrialAntiviralSignalingProtein，MAVS）。MAVS位于線(xiàn)粒體膜上，它會(huì)通過(guò)自身的結(jié)構(gòu)域與RIG-I相互作用，形成一個(gè)信號(hào)復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物的形成會(huì)激活下游的一系列蛋白激酶，其中包括TANK結(jié)合激酶1（TANK-BindingKinase1，TBK1）和IκB激酶ε（IκBKinaseε，IKKε）。TBK1和IKKε被激活后，會(huì)磷酸化IRF7分子上的特定絲氨酸殘基。IRF7的磷酸化是其激活的關(guān)鍵步驟。磷酸化后的IRF7會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，從而增強(qiáng)其與其他蛋白質(zhì)的相互作用能力。一方面，磷酸化的IRF7能夠自身形成同源二聚體；另一方面，它也可以與IRF3等其他IRF家族成員形成異源二聚體。這些二聚體復(fù)合物具有更高的活性，它們會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，激活的IRF7二聚體復(fù)合物能夠特異性地結(jié)合到I型干擾素基因（如IFN-α、IFN-β等）啟動(dòng)子區(qū)域的干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）上。ISRE是一段具有特定核苷酸序列的DNA區(qū)域，IRF7與ISRE的結(jié)合能夠招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，包括RNA聚合酶Ⅱ等，從而啟動(dòng)I型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。轉(zhuǎn)錄生成的mRNA會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯，最終產(chǎn)生I型干擾素蛋白。I型干擾素分泌到細(xì)胞外后，會(huì)與周?chē)?xì)胞表面的I型干擾素受體（Interferon-α/βReceptor，IFNAR）結(jié)合。IFNAR是由IFNAR1和IFNAR2兩個(gè)亞基組成的跨膜蛋白復(fù)合物。I型干擾素與IFNAR結(jié)合后，會(huì)激活受體相關(guān)的酪氨酸激酶2（TyrosineKinase2，TYK2）和Janus激酶1（JanusKinase1，JAK1）。激活的TYK2和JAK1會(huì)磷酸化IFNAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而招募并磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（SignalTransducerandActivatorofTranscription1，STAT1）和STAT2。磷酸化的STAT1和STAT2會(huì)形成異源二聚體，并與干擾素調(diào)節(jié)因子9（InterferonRegulatoryFactor9，IRF9）結(jié)合，形成干擾素刺激基因因子3（Interferon-StimulatedGeneFactor3，ISGF3）復(fù)合物。ISGF3復(fù)合物會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，與眾多干擾素刺激基因（Interferon-StimulatedGenes，ISGs）啟動(dòng)子區(qū)域的ISRE結(jié)合，激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生一系列具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能的蛋白質(zhì)，如蛋白激酶R（ProteinKinaseR，PKR）、2'-5'寡腺苷酸合成酶（2'-5'OligoadenylateSynthetase，OAS）等，它們通過(guò)不同的機(jī)制抑制病毒的復(fù)制和傳播，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫能力。除了在I型干擾素信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用，IRF7還參與調(diào)節(jié)其他免疫反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)中，IRF7可以通過(guò)調(diào)控一些炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，影響炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，IRF7也可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，以清除被病毒感染的細(xì)胞，防止病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散。2.2人類(lèi)8型皰疹病毒2.2.1HHV-8的生物學(xué)特性人類(lèi)8型皰疹病毒（HHV-8），作為γ-2皰疹病毒屬的成員，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。在形態(tài)學(xué)方面，HHV-8病毒顆粒呈現(xiàn)典型的皰疹病毒形態(tài)，為球形結(jié)構(gòu)。其核心是由162個(gè)殼粒組成的20面體對(duì)稱(chēng)核衣殼，這種結(jié)構(gòu)賦予了病毒顆粒高度的穩(wěn)定性和規(guī)則性。在核衣殼內(nèi)部，包裹著線(xiàn)狀雙鏈DNA，這是病毒的遺傳物質(zhì)，其基因組長(zhǎng)度約為165kb，包含超過(guò)90個(gè)基因，這些基因攜帶了病毒復(fù)制、感染宿主細(xì)胞以及調(diào)控宿主免疫反應(yīng)等過(guò)程所需的遺傳信息。在核衣殼之外，是一層由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的包膜，包膜表面分布著糖蛋白突起，這些突起在病毒與宿主細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠特異性地與宿主細(xì)胞表面的受體相互作用，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。HHV-8的基因組結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。其線(xiàn)性雙鏈DNA分子中間區(qū)域?yàn)榈虶C含量（約53.3%）的DNA區(qū)，長(zhǎng)度約140kb，這個(gè)區(qū)域包含了HHV-8的保守基因序列，這些保守基因在病毒的基本生命活動(dòng)中起著不可或缺的作用，如參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過(guò)程。同時(shí)，該區(qū)域還包含編碼調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞因子等特有基因序列，這些基因產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生理功能，以利于病毒的生存和繁殖。例如，一些調(diào)節(jié)因子可以干擾宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而為病毒的潛伏和復(fù)制創(chuàng)造有利條件。在基因組的兩側(cè)，各有一個(gè)末端重復(fù)區(qū)，長(zhǎng)度約35kb。其中一段801bp的末端重復(fù)順序富含G、C堿基（85%），在病毒復(fù)制周期中，這些末端重復(fù)區(qū)可能通過(guò)特定的方式連接起來(lái)，使基因組形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)于病毒在潛伏期的基因組維持和復(fù)制具有重要意義。在潛伏期，病毒基因組以多拷貝環(huán)狀附加體DNA的形式存在于宿主細(xì)胞核內(nèi)，此時(shí)病毒僅表達(dá)少量基因，處于相對(duì)靜止的狀態(tài)。而當(dāng)病毒進(jìn)入裂解期時(shí)，基因組會(huì)轉(zhuǎn)為線(xiàn)狀，大量病毒基因開(kāi)始表達(dá)，病毒進(jìn)行快速?gòu)?fù)制和組裝，產(chǎn)生新的病毒顆粒。HHV-8的病毒生命周期包括潛伏和裂解兩個(gè)階段。在潛伏階段，病毒基因組整合到宿主細(xì)胞的染色體上或者以環(huán)狀附加體的形式存在于宿主細(xì)胞核內(nèi)。此時(shí)，僅有極少量的病毒基因表達(dá)，這些基因產(chǎn)物主要用于維持病毒的潛伏狀態(tài)以及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生理功能。例如，潛伏期相關(guān)核抗原1（LANA-1）是HHV-8潛伏感染的重要標(biāo)志蛋白，它能夠與宿主細(xì)胞的染色體結(jié)合，將病毒基因組錨定在宿主染色體上，確保病毒基因組在細(xì)胞分裂過(guò)程中能夠穩(wěn)定遺傳。同時(shí)，LANA-1還可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的基因表達(dá)，抑制宿主細(xì)胞的凋亡，為病毒的潛伏提供有利的細(xì)胞環(huán)境。在潛伏階段，病毒幾乎不產(chǎn)生新的病毒顆粒，宿主細(xì)胞也不會(huì)出現(xiàn)明顯的病變。然而，當(dāng)受到某些刺激因素，如細(xì)胞因子、化學(xué)物質(zhì)、紫外線(xiàn)等的作用時(shí)，病毒會(huì)從潛伏狀態(tài)進(jìn)入裂解狀態(tài)。在裂解期，病毒基因組開(kāi)始大量轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生一系列病毒蛋白，這些蛋白參與病毒的復(fù)制、組裝和釋放過(guò)程。病毒DNA通過(guò)滾環(huán)復(fù)制的方式進(jìn)行大量復(fù)制，合成的線(xiàn)性DNA分子被包裝進(jìn)新組裝的病毒衣殼中，然后病毒粒子從宿主細(xì)胞中釋放出來(lái)，去感染新的細(xì)胞。在這個(gè)過(guò)程中，宿主細(xì)胞會(huì)受到嚴(yán)重的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。HHV-8的傳播途徑主要包括密切接觸與性接觸。在性接觸傳播方面，研究表明同性戀男性人群中HHV-8的感染率相對(duì)較高，且感染率與性伴侶數(shù)量及性行為頻率呈正相關(guān)，這強(qiáng)烈提示性接觸是HHV-8的重要傳播途徑之一。在密切接觸傳播方面，通過(guò)原位PCR技術(shù)證實(shí)，HHV-8DNA存在于口腔和舌的上皮細(xì)胞中，且唾液中HHV-8的滴度范圍為(102-10?)/ml，這表明經(jīng)唾液傳播可能是病毒傳播的重要途徑。此外，HHV-8還可能通過(guò)器官移植和輸血等途徑傳播。在器官移植過(guò)程中，如果供體器官攜帶HHV-8，那么受體在接受器官移植后就有可能被感染。在輸血傳播方面，雖然相對(duì)較為少見(jiàn)，但如果輸入的血液制品中含有HHV-8，也可能導(dǎo)致受血者感染。2.2.2HHV-8感染引發(fā)的疾病HHV-8感染與多種嚴(yán)重疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了重大威脅?？úㄎ魅饬觯↘S）是HHV-8感染相關(guān)的最為典型的疾病之一。KS是一種以血管增生為特征的惡性腫瘤，可累及皮膚、黏膜和內(nèi)臟器官。在皮膚表現(xiàn)上，初期通常為無(wú)癥狀的皮疹，隨著病情進(jìn)展，皮疹逐漸發(fā)展為斑塊、丘疹及結(jié)節(jié)，其大小從直徑數(shù)毫米擴(kuò)展至數(shù)厘米，形狀多樣，呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形，顏色多為粉紅或紫紅，常見(jiàn)于下肢、軀干下部、頭頸部、硬腭、口頰黏膜、枕部及耳廓周?chē)炔课弧．?dāng)KS侵犯腸道時(shí)，會(huì)引起腹瀉和吸收不良綜合征；同性戀者患KS還可能出現(xiàn)肛門(mén)直腸炎。HHV-8感染導(dǎo)致KS的致病機(jī)制較為復(fù)雜。一方面，病毒基因編碼的蛋白產(chǎn)物，如潛伏相關(guān)核抗原1（LANA-1）、病毒細(xì)胞周期蛋白（v-Cyclin）等，能夠干擾宿主細(xì)胞的正常信號(hào)傳導(dǎo)通路。LANA-1可以與宿主細(xì)胞的腫瘤抑制因子p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRb結(jié)合，抑制它們的正常功能，從而解除對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。v-Cyclin則可以模擬細(xì)胞周期蛋白的功能，與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞過(guò)度增殖。另一方面，HHV-8感染會(huì)引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，炎癥微環(huán)境的改變也有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子等，會(huì)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，為腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，同時(shí)也會(huì)招募免疫細(xì)胞到腫瘤部位，然而這些免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中可能會(huì)被腫瘤細(xì)胞馴化，反而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。原發(fā)性滲出性淋巴瘤（PEL）也是HHV-8感染相關(guān)的疾病。PEL是一種罕見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤，通常發(fā)生在體腔中，如胸腔、腹腔和心包腔等。患者常表現(xiàn)為體腔內(nèi)的滲出性積液，積液中含有大量的淋巴瘤細(xì)胞。PEL的腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特征，它們通常缺乏典型的B細(xì)胞表面標(biāo)志物，如CD19、CD20等，但會(huì)表達(dá)一些與HHV-8感染相關(guān)的蛋白。HHV-8在PEL的發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。病毒感染B淋巴細(xì)胞后，其基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，持續(xù)表達(dá)的病毒蛋白會(huì)干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能。例如，病毒Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域類(lèi)似白介素1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（v-FLIP）可以抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使感染病毒的細(xì)胞逃避凋亡，得以持續(xù)存活和增殖。同時(shí)，病毒編碼的一些細(xì)胞因子和趨化因子，如病毒白介素6（v-IL-6）等，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)一步推動(dòng)淋巴瘤的發(fā)展。此外，HHV-8感染還會(huì)導(dǎo)致宿主免疫功能紊亂，使得機(jī)體難以有效清除腫瘤細(xì)胞，從而促進(jìn)PEL的發(fā)生和發(fā)展。多中心性卡斯特萊曼病（MCD）同樣與HHV-8感染密切相關(guān)。MCD是一種淋巴組織增生性疾病，主要表現(xiàn)為全身淋巴結(jié)腫大，同時(shí)伴有發(fā)熱、貧血、乏力、消瘦等全身癥狀。病理特征上，MCD的淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，淋巴濾泡增生，濾泡間區(qū)可見(jiàn)大量漿細(xì)胞浸潤(rùn)。HHV-8感染引發(fā)MCD的機(jī)制與病毒對(duì)免疫系統(tǒng)的干擾以及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡有關(guān)。HHV-8感染B淋巴細(xì)胞后，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子，其中白細(xì)胞介素6（IL-6）在MCD的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。病毒可能通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)類(lèi)似IL-6的細(xì)胞因子，或者直接編碼具有IL-6活性的蛋白（如v-IL-6），導(dǎo)致體內(nèi)IL-6水平異常升高。高水平的IL-6會(huì)刺激B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)漿細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，從而引起淋巴結(jié)腫大和全身癥狀。此外，HHV-8感染還會(huì)影響免疫系統(tǒng)的其他細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，進(jìn)一步加重疾病的發(fā)展。2.2.3HHV-8基因表達(dá)調(diào)控概述HHV-8的基因表達(dá)在潛伏期和裂解期呈現(xiàn)出顯著不同的特點(diǎn)。在潛伏期，病毒基因組以環(huán)狀附加體的形式存在于宿主細(xì)胞核內(nèi)，此時(shí)僅有少量病毒基因表達(dá)。這些潛伏期表達(dá)的基因主要包括潛伏相關(guān)核抗原1（LANA-1）、病毒細(xì)胞周期蛋白（v-Cyclin）、病毒Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域類(lèi)似白介素1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（v-FLIP）等。LANA-1是維持病毒潛伏感染的關(guān)鍵蛋白，它能夠與病毒基因組的末端重復(fù)序列以及宿主細(xì)胞的染色體相結(jié)合，將病毒基因組錨定在宿主染色體上，確保病毒基因組在細(xì)胞分裂過(guò)程中的穩(wěn)定遺傳。同時(shí)，LANA-1還可以通過(guò)與宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾蛋白相互作用，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞和病毒基因的表達(dá)。v-Cyclin能夠模擬細(xì)胞周期蛋白的功能，與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)宿主細(xì)胞的增殖，為病毒的潛伏提供適宜的細(xì)胞環(huán)境。v-FLIP則主要通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使感染病毒的細(xì)胞逃避凋亡，得以持續(xù)存活。潛伏期基因的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，其中宿主細(xì)胞的表觀(guān)遺傳修飾起著重要作用。例如，組蛋白的甲基化、乙?；刃揎棤顟B(tài)會(huì)影響病毒基因啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合能力，調(diào)控基因表達(dá)。一些宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄抑制因子也會(huì)結(jié)合到潛伏期基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)HHV-8從潛伏期進(jìn)入裂解期時(shí)，病毒基因表達(dá)模式發(fā)生顯著變化，大量病毒基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄和翻譯。裂解期表達(dá)的基因可分為即刻早期基因、早期基因和晚期基因。即刻早期基因在病毒進(jìn)入裂解期后最先表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物主要是一些轉(zhuǎn)錄激活因子，如復(fù)制與轉(zhuǎn)錄激活蛋白（RTA，由ORF50編碼）。RTA是誘導(dǎo)病毒從潛伏狀態(tài)進(jìn)入裂解狀態(tài)的關(guān)鍵因子，它能夠結(jié)合到病毒基因組的多個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，激活早期基因的轉(zhuǎn)錄。早期基因的表達(dá)產(chǎn)物主要參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及病毒蛋白的合成等過(guò)程。例如，早期基因編碼的DNA聚合酶、胸苷激酶等酶類(lèi)，是病毒DNA復(fù)制所必需的。晚期基因則在病毒DNA復(fù)制開(kāi)始后大量表達(dá)，其產(chǎn)物主要是構(gòu)成病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白，如衣殼蛋白、包膜蛋白等。裂解期基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用。除了RTA等病毒轉(zhuǎn)錄激活因子外，宿主細(xì)胞內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子也會(huì)參與裂解期基因的表達(dá)調(diào)控。例如，宿主細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路在病毒裂解期被激活，NF-κB蛋白可以結(jié)合到病毒某些基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。此外，病毒感染還會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)生改變，這些變化會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子的活性和定位，進(jìn)而調(diào)控裂解期基因的表達(dá)。三、IRF7對(duì)HHV-8感染細(xì)胞中表達(dá)變化的影響3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1細(xì)胞選擇與培養(yǎng)本研究選擇原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞是從人體組織中直接分離獲得的細(xì)胞，它們保留了內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)的許多生物學(xué)特性。內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，HHV-8在自然感染過(guò)程中能夠感染內(nèi)皮細(xì)胞，并且在卡波西肉瘤等相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中，內(nèi)皮細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。使用原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，能夠更真實(shí)地模擬HHV-8在體內(nèi)的感染環(huán)境，為研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用提供更有價(jià)值的信息。HeLa細(xì)胞是一種廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的人類(lèi)宮頸癌細(xì)胞系，具有易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速、對(duì)多種病毒易感等特點(diǎn)。其具有穩(wěn)定的遺傳背景和較高的轉(zhuǎn)染效率，這使得在進(jìn)行基因操作和病毒感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，能夠獲得較為穩(wěn)定和可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，HeLa細(xì)胞對(duì)HHV-8具有一定的敏感性，能夠支持病毒的感染和復(fù)制，因此也被選為研究HHV-8感染的重要細(xì)胞模型。原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，將從新鮮的人臍靜脈組織中分離得到的內(nèi)皮細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的M199培養(yǎng)基中。培養(yǎng)環(huán)境設(shè)定為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，定期更換培養(yǎng)基以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)則采用高糖DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗。同樣將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2HHV-8感染模型的建立感染復(fù)數(shù)（MOI）是指感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，它對(duì)于病毒感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有著重要影響。確定合適的MOI對(duì)于成功建立HHV-8感染模型至關(guān)重要。本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定MOI。首先，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞分別接種于24孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為5×10?個(gè)，培養(yǎng)24小時(shí)使其貼壁。然后，將HHV-8病毒原液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e制備MOI為0.1、0.5、1、5、10的病毒懸液。每個(gè)MOI設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將不同MOI的病毒懸液加入到相應(yīng)孔中，同時(shí)設(shè)置未感染病毒的細(xì)胞作為對(duì)照組。在37℃、5%CO?條件下孵育2小時(shí)，期間每隔15-20分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，吸去病毒懸液，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，去除未吸附的病毒。然后加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)），通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）以及采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒基因的表達(dá)水平來(lái)評(píng)估感染效果。細(xì)胞病變效應(yīng)觀(guān)察時(shí)，在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞變圓、皺縮、脫落等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)則按照以下步驟進(jìn)行：首先提取細(xì)胞總RNA，使用Trizol試劑按照說(shuō)明書(shū)操作，將細(xì)胞裂解后，加入氯仿進(jìn)行相分離，離心后取上清液，加入異丙醇沉淀RNA。將沉淀的RNA用75%乙醇洗滌后，干燥并溶解于無(wú)RNA酶的水中。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用針對(duì)HHV-8特定基因（如ORF50基因）的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。通過(guò)比較不同MOI下細(xì)胞的CPE和病毒基因表達(dá)水平，確定能夠使細(xì)胞達(dá)到較高感染效率且細(xì)胞狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定的MOI。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定在本研究中，原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞感染HHV-8的合適MOI為1。確定MOI后，進(jìn)行正式的HHV-8感染實(shí)驗(yàn)。將原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為2×10?個(gè)，培養(yǎng)24小時(shí)使其貼壁。按照確定的MOI為1，將HHV-8病毒懸液加入到細(xì)胞中，在37℃、5%CO?條件下孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，吸去病毒懸液，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，去除未吸附的病毒。然后加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)）收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了檢測(cè)感染是否成功，除了觀(guān)察細(xì)胞病變效應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒基因表達(dá)水平外，還采用免疫熒光染色法檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)。將感染后的細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)至合適時(shí)間點(diǎn)。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗3次。加入0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘，再用PBS緩沖液沖洗3次。加入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液室溫封閉30分鐘。然后加入針對(duì)HHV-8病毒蛋白（如LANA-1蛋白）的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS緩沖液沖洗3次，加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。用PBS緩沖液沖洗3次后，加入DAPI染液染細(xì)胞核5-10分鐘。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀(guān)察。若在細(xì)胞中觀(guān)察到特異性的熒光信號(hào)，則表明感染成功。3.1.3IRF7表達(dá)檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)IRF7在mRNA水平的表達(dá)變化。首先，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)，從HHV-8感染不同時(shí)間點(diǎn)（0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)）的原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中提取總RNA。將細(xì)胞裂解后，加入氯仿劇烈振蕩，使RNA與蛋白質(zhì)等物質(zhì)分離，離心后取上清液，加入異丙醇沉淀RNA。用75%乙醇洗滌沉淀的RNA，干燥后溶解于無(wú)RNA酶的水中。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入適量的RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP以及緩沖液等，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。使用針對(duì)IRF7基因的特異性引物，引物序列通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)，并由專(zhuān)業(yè)公司合成。在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA模板、引物、SYBRGreen熒光染料、DNA聚合酶以及緩沖液等。將反應(yīng)體系置于實(shí)時(shí)定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。在每個(gè)循環(huán)的退火階段，收集熒光信號(hào)，通過(guò)分析熒光信號(hào)的變化來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程。同時(shí)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，對(duì)IRF7基因的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算IRF7基因在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct(IRF7)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)IRF7在蛋白水平的表達(dá)變化。將HHV-8感染不同時(shí)間點(diǎn)的原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞收集到離心管中，加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件為80V恒壓電泳30分鐘，然后120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，采用半干轉(zhuǎn)法，按照25mA/cm2的電流轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將PVDF膜與針對(duì)IRF7蛋白的一抗孵育，一抗用5%脫脂牛奶稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將膜與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育，二抗用5%脫脂牛奶稀釋?zhuān)覝胤跤?-2小時(shí)。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）對(duì)膜進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光成像。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過(guò)分析條帶的灰度值，計(jì)算IRF7蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1HHV-8感染不同時(shí)間點(diǎn)IRF7的表達(dá)變化在HHV-8感染原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)IRF7的表達(dá)變化。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞中，感染HHV-8后6小時(shí)，IRF7的mRNA表達(dá)水平開(kāi)始出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。與未感染組（0小時(shí)）相比，6小時(shí)時(shí)IRF7的mRNA相對(duì)表達(dá)量從1.00±0.05增加至1.35±0.08（P<0.05）。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，12小時(shí)時(shí)IRF7的mRNA表達(dá)量進(jìn)一步上升至1.72±0.10（P<0.01）。在24小時(shí)達(dá)到峰值，相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.15（P<0.001）。隨后，從48小時(shí)開(kāi)始，IRF7的mRNA表達(dá)量逐漸下降，48小時(shí)時(shí)相對(duì)表達(dá)量為1.98±0.12（P<0.01），72小時(shí)時(shí)降至1.50±0.10（P<0.05），但仍高于未感染組水平。在HeLa細(xì)胞中，IRF7的mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)與原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞相似。感染6小時(shí)后，IRF7的mRNA相對(duì)表達(dá)量從1.00±0.04升高至1.28±0.07（P<0.05）。12小時(shí)時(shí)達(dá)到1.60±0.09（P<0.01），24小時(shí)達(dá)到峰值2.35±0.13（P<0.001），48小時(shí)和72小時(shí)分別為1.85±0.11（P<0.01）和1.40±0.09（P<0.05）。這些數(shù)據(jù)表明，HHV-8感染能夠誘導(dǎo)原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中IRF7的mRNA表達(dá)在早期顯著上調(diào)，隨后逐漸下降。Westernblot檢測(cè)結(jié)果在蛋白水平上驗(yàn)證了上述變化。在原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞中，感染HHV-8后6小時(shí)，IRF7蛋白表達(dá)量開(kāi)始增加。與未感染組相比，6小時(shí)時(shí)IRF7蛋白的相對(duì)表達(dá)量從1.00±0.06增加至1.25±0.07（P<0.05）。12小時(shí)時(shí)進(jìn)一步上升至1.55±0.08（P<0.01），24小時(shí)達(dá)到峰值2.20±0.12（P<0.001）。48小時(shí)時(shí)相對(duì)表達(dá)量為1.70±0.10（P<0.01），72小時(shí)時(shí)降至1.30±0.08（P<0.05）。在HeLa細(xì)胞中，感染6小時(shí)后，IRF7蛋白相對(duì)表達(dá)量從1.00±0.05升高至1.20±0.06（P<0.05），12小時(shí)為1.45±0.07（P<0.01），24小時(shí)達(dá)到峰值2.05±0.10（P<0.001），48小時(shí)和72小時(shí)分別為1.60±0.09（P<0.01）和1.25±0.07（P<0.05）。綜合實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot結(jié)果，表明HHV-8感染原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞后，IRF7的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。在感染早期（6-24小時(shí)），IRF7在mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)，這可能是細(xì)胞對(duì)HHV-8感染的一種免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過(guò)上調(diào)IRF7的表達(dá)，激活干擾素相關(guān)信號(hào)通路，以抵御病毒感染。而在感染后期（48-72小時(shí)），IRF7表達(dá)逐漸下降，可能是由于病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和感染對(duì)細(xì)胞造成了一定損傷，影響了IRF7的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，或者是機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制使得IRF7的表達(dá)恢復(fù)到相對(duì)穩(wěn)定的水平。3.2.2不同感染條件下IRF7的表達(dá)差異為了探究不同感染條件對(duì)IRF7表達(dá)的影響，設(shè)置了不同MOI以及不同感染方式的實(shí)驗(yàn)。在不同MOI感染實(shí)驗(yàn)中，將原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞分別用MOI為0.1、1、5的HHV-8病毒感染24小時(shí)后，檢測(cè)IRF7的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞中，MOI為0.1時(shí)，IRF7的mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.50±0.10；MOI為1時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.15；MOI為5時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為3.20±0.20。隨著MOI的增加，IRF7的mRNA表達(dá)量顯著升高，MOI為1與MOI為0.1相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MOI為5與MOI為1相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在HeLa細(xì)胞中，同樣呈現(xiàn)出隨著MOI增加，IRF7的mRNA表達(dá)量升高的趨勢(shì)。MOI為0.1時(shí)，IRF7的mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.40±0.09；MOI為1時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為2.35±0.13；MOI為5時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為3.05±0.18。MOI為1與MOI為0.1相比，P<0.01；MOI為5與MOI為1相比，P<0.01。Westernblot檢測(cè)結(jié)果在蛋白水平上與mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)一致。在原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞中，MOI為0.1時(shí)，IRF7蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.30±0.08；MOI為1時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為2.20±0.12；MOI為5時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為2.80±0.15。在HeLa細(xì)胞中，MOI為0.1時(shí)，IRF7蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.25±0.07；MOI為1時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為2.05±0.10；MOI為5時(shí)，相對(duì)表達(dá)量為2.65±0.13。這表明隨著感染復(fù)數(shù)（MOI）的增加，HHV-8感染原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞后，IRF7在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量均顯著升高，說(shuō)明病毒感染量的增加能夠更強(qiáng)烈地誘導(dǎo)IRF7的表達(dá)。在不同感染方式的實(shí)驗(yàn)中，分別采用常規(guī)感染和同步感染兩種方式。常規(guī)感染是先將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入病毒進(jìn)行感染；同步感染是在接種細(xì)胞的同時(shí)加入病毒。感染24小時(shí)后檢測(cè)IRF7的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞中，常規(guī)感染組IRF7的mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.15，同步感染組為3.05±0.20，同步感染組顯著高于常規(guī)感染組（P<0.01）。在HeLa細(xì)胞中，常規(guī)感染組IRF7的mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.35±0.13，同步感染組為2.85±0.16，同步感染組也顯著高于常規(guī)感染組（P<0.01）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果同樣表明，在原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞中，常規(guī)感染組IRF7蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.20±0.12，同步感染組為2.65±0.15。在HeLa細(xì)胞中，常規(guī)感染組IRF7蛋白相對(duì)表達(dá)量為2.05±0.10，同步感染組為2.45±0.13。這說(shuō)明同步感染方式相較于常規(guī)感染方式，能夠更有效地誘導(dǎo)原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中IRF7的表達(dá)，可能是因?yàn)橥礁腥臼共《九c細(xì)胞更早接觸，從而更快地激活了細(xì)胞對(duì)病毒感染的應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致IRF7表達(dá)上調(diào)更為顯著。3.3討論HHV-8感染后，原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中IRF7的表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，這一現(xiàn)象背后蘊(yùn)含著復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制。在感染早期（6-24小時(shí)），IRF7表達(dá)顯著上調(diào)，這很可能是宿主細(xì)胞啟動(dòng)的一種重要的免疫防御機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞感知到HHV-8入侵時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體（PRRs）迅速識(shí)別病毒核酸等病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）。以RIG-I樣受體（RLRs）信號(hào)通路為例，RIG-I識(shí)別病毒RNA后，通過(guò)招募線(xiàn)粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS），激活下游的TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和IκB激酶ε（IKKε）。TBK1和IKKε進(jìn)而磷酸化IRF7，使其激活并上調(diào)表達(dá)。激活的IRF7可以結(jié)合到干擾素基因啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)干擾素的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量I型干擾素（如IFN-α、IFN-β）。I型干擾素通過(guò)與細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號(hào)通路，誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)，這些基因產(chǎn)物具有多種抗病毒功能，如抑制病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，從而幫助細(xì)胞抵御HHV-8的感染。因此，早期IRF7表達(dá)上調(diào)是宿主細(xì)胞試圖通過(guò)激活抗病毒免疫反應(yīng)來(lái)限制病毒感染和傳播的一種積極應(yīng)對(duì)策略。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)（48-72小時(shí)），IRF7表達(dá)逐漸下降，這可能涉及多種因素。一方面，HHV-8在細(xì)胞內(nèi)的大量復(fù)制和感染可能對(duì)細(xì)胞造成了嚴(yán)重?fù)p傷，影響了IRF7的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。病毒感染會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，可能干擾了IRF7基因轉(zhuǎn)錄、mRNA加工以及蛋白翻譯等過(guò)程。例如，病毒可能編碼一些蛋白，直接或間接抑制IRF7基因的轉(zhuǎn)錄因子活性，或者降解IRF7的mRNA和蛋白，從而導(dǎo)致IRF7表達(dá)水平下降。另一方面，機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能發(fā)揮作用，使IRF7的表達(dá)恢復(fù)到相對(duì)穩(wěn)定的水平。持續(xù)高水平的IRF7表達(dá)和干擾素反應(yīng)可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響，如引發(fā)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，損傷正常組織細(xì)胞。因此，機(jī)體可能通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)控制IRF7的表達(dá)。一些細(xì)胞內(nèi)的負(fù)調(diào)控因子，如SOCS蛋白家族（細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子），在病毒感染過(guò)程中可能被誘導(dǎo)表達(dá)。SOCS蛋白可以通過(guò)與IRF7信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，抑制信號(hào)傳導(dǎo)，從而下調(diào)IRF7的表達(dá)和活性，使免疫反應(yīng)維持在適度水平，避免對(duì)機(jī)體造成過(guò)度損傷。不同感染條件下IRF7表達(dá)存在顯著差異，這對(duì)于深入理解病毒與宿主細(xì)胞的相互作用具有重要意義。隨著感染復(fù)數(shù)（MOI）的增加，IRF7在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量均顯著升高。這表明病毒感染量的增加能夠更強(qiáng)烈地誘導(dǎo)IRF7的表達(dá)，原因在于更高的MOI意味著細(xì)胞受到更大量的病毒入侵，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體能夠更頻繁地識(shí)別病毒PAMPs，從而更強(qiáng)烈地激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，促使IRF7表達(dá)上調(diào)。更多的病毒RNA被RIG-I識(shí)別，引發(fā)更強(qiáng)烈的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致更多的IRF7被激活和表達(dá)。同步感染方式相較于常規(guī)感染方式，能夠更有效地誘導(dǎo)原代人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中IRF7的表達(dá)。同步感染使病毒與細(xì)胞更早接觸，病毒入侵后能夠更快地激活細(xì)胞對(duì)病毒感染的應(yīng)答反應(yīng)。在常規(guī)感染中，細(xì)胞先經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，其生理狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)加入病毒時(shí)，細(xì)胞需要一定時(shí)間來(lái)感知病毒入侵并啟動(dòng)免疫應(yīng)答。而同步感染時(shí)，細(xì)胞在接種的同時(shí)就接觸到病毒，病毒能夠迅速觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的免疫信號(hào)通路，使得IRF7表達(dá)上調(diào)更為顯著。這提示在病毒感染過(guò)程中，感染的起始時(shí)間和病毒與細(xì)胞的接觸時(shí)機(jī)對(duì)于宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答具有重要影響。IRF7表達(dá)的變化在HHV-8感染過(guò)程中具有多方面的潛在意義。在抗病毒免疫方面，早期IRF7表達(dá)上調(diào)啟動(dòng)的干擾素相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)于限制病毒的早期感染和傳播至關(guān)重要。通過(guò)抑制病毒的復(fù)制和擴(kuò)散，減少病毒對(duì)宿主細(xì)胞的損害，有助于維持機(jī)體的免疫平衡。然而，病毒也可能會(huì)進(jìn)化出一些機(jī)制來(lái)對(duì)抗宿主的免疫防御。HHV-8可能通過(guò)其基因產(chǎn)物干擾IRF7的功能，如某些病毒蛋白可能與IRF7相互作用，抑制其激活或阻止其與干擾素基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而逃避宿主的免疫監(jiān)視。因此，深入研究IRF7與HHV-8之間的相互作用機(jī)制，有助于揭示病毒的致病機(jī)制和免疫逃逸策略。從疾病發(fā)生發(fā)展角度來(lái)看，IRF7表達(dá)的變化可能與HHV-8感染相關(guān)疾病的進(jìn)程密切相關(guān)。例如，在卡波西肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，IRF7的表達(dá)異?？赡苡绊懩[瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和免疫逃逸等過(guò)程。如果IRF7的抗病毒功能受到抑制，病毒在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制和感染，可能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生。此外，IRF7表達(dá)變化還可能影響機(jī)體對(duì)HHV-8感染的免疫記憶和再次感染的抵抗力。對(duì)IRF7在HHV-8感染過(guò)程中表達(dá)變化的研究，為進(jìn)一步探究HHV-8的致病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的抗病毒治療策略提供了重要的理論依據(jù)。四、IRF7與HHV-8基因組相關(guān)基因的確定4.1研究方法4.1.1蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理蛋白質(zhì)組學(xué)旨在從整體水平研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，對(duì)于揭示生命活動(dòng)本質(zhì)、疾病發(fā)病機(jī)制等具有重要意義。本研究選用iTRAQ（IsobaricTagforRelativeandAbsoluteQuantitation）和TMT（TandemMassTags）技術(shù)來(lái)開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)分析。iTRAQ和TMT技術(shù)均基于等重同位素標(biāo)記策略，通過(guò)將不同的同位素標(biāo)簽與肽段特異氨基酸位點(diǎn)相連實(shí)現(xiàn)對(duì)不同來(lái)源肽段的標(biāo)記。以TMT技術(shù)為例，其標(biāo)記試劑由報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)三部分構(gòu)成。在特定組合的試劑盒內(nèi)，通過(guò)不同位置的C13、N15同位素組合保證總分子量恒定，而報(bào)告基團(tuán)具有不同分子量。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將不同的TMT試劑和不同的樣本反應(yīng)、標(biāo)記，使特定樣本中的所有肽段標(biāo)記某一種特定標(biāo)記試劑。所有樣本標(biāo)記完成后，取等量肽段混合，然后進(jìn)行離線(xiàn)分離，如采用液相色譜（LC）對(duì)混合肽段進(jìn)行分離，以提高肽段的分辨率。分離后的肽段進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，在質(zhì)譜分析時(shí)，不同樣本的同一肽段標(biāo)記后表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比，被同時(shí)選擇進(jìn)行二級(jí)碎裂，產(chǎn)生質(zhì)量不同的報(bào)告離子。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告離子的豐度，即可實(shí)現(xiàn)不同樣品間蛋白質(zhì)的相對(duì)定量分析。例如，若在某一實(shí)驗(yàn)中，比較HHV-8感染組和未感染組細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，感染組細(xì)胞蛋白標(biāo)記TMT試劑A，未感染組標(biāo)記TMT試劑B，在質(zhì)譜檢測(cè)中，若來(lái)自感染組的某一肽段對(duì)應(yīng)的報(bào)告離子豐度顯著高于未感染組，則表明該肽段所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)在感染組中表達(dá)上調(diào)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究特定細(xì)胞、組織或生物體在某個(gè)特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的學(xué)科，能夠全面反映基因的表達(dá)情況。本研究運(yùn)用RNA-seq（RNAsequencing）技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。其核心原理是將RNA樣品轉(zhuǎn)換為cDNA庫(kù)，然后通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)這些cDNA進(jìn)行測(cè)序。首先從樣品中提取總RNA，由于rRNA在總RNA中占比很大，而通常研究重點(diǎn)并非rRNA，所以需要通過(guò)某些方法去除rRNA，如利用帶有poly(T)探針的磁珠與總RNA進(jìn)行雜交，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的特點(diǎn)，使磁珠和帶poly(A)尾巴的mRNA結(jié)合在一起，回收磁珠并洗脫mRNA，從而富集mRNA。接著將長(zhǎng)鏈的mRNA分割成短片段，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。通過(guò)連接接頭（adapters）和PCR擴(kuò)增等步驟，構(gòu)建適合測(cè)序的cDNA文庫(kù)。使用高通量測(cè)序平臺(tái)，如Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。在Illumina測(cè)序中，先將DNA樣品調(diào)整到合適的濃度加入到flowcell中，flowcell含有管道且內(nèi)表面做了專(zhuān)門(mén)的化學(xué)修飾，布滿(mǎn)了短的oligo序列（P7/P5接頭）。樣品DNA一端與flowcell上面的短序列通過(guò)化學(xué)鍵相連，然后進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，形成具有完全相同序列的簇。加入帶不同熒光標(biāo)記的含有疊氮基團(tuán)的dNTP和聚合酶，由于疊氮基團(tuán)的存在，一個(gè)循環(huán)只能延長(zhǎng)一個(gè)堿基，結(jié)合上一個(gè)堿基后，把其他dNTP和酶用水沖掉，進(jìn)行激光掃描，根據(jù)激光掃描顏色判斷是哪個(gè)堿基，根據(jù)互補(bǔ)原則反推出結(jié)果，再切掉疊氮基團(tuán)，進(jìn)入新的循環(huán)，如此往復(fù)，即可測(cè)出序列內(nèi)容。測(cè)序完成后得到大量的測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)分析，包括質(zhì)量控制、比對(duì)到參考基因組、定量基因表達(dá)水平、鑒定新的轉(zhuǎn)錄本和剪接事件等，從而獲得關(guān)于基因表達(dá)水平、剪接變體、非編碼RNA等的信息。4.1.2實(shí)驗(yàn)樣本的處理與分析對(duì)于感染HHV-8的細(xì)胞樣本和對(duì)照樣本的收集，在完成前文所述的HHV-8感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)后，分別在感染后的特定時(shí)間點(diǎn)（如24小時(shí)、48小時(shí)等，這些時(shí)間點(diǎn)根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)中IRF7表達(dá)變化的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)以及病毒感染周期特點(diǎn)確定）收集細(xì)胞。對(duì)于感染HHV-8的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，按照MOI為1的感染條件，在感染相應(yīng)時(shí)間后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中。對(duì)照組細(xì)胞則為未感染HHV-8的相同細(xì)胞系，在相同培養(yǎng)條件和時(shí)間下進(jìn)行收集。收集后的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次，以去除培養(yǎng)基等雜質(zhì)。在蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)樣本處理方面，將洗滌后的細(xì)胞加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白質(zhì)降解和修飾狀態(tài)改變），冰上裂解30分鐘。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白濃度。將不同樣本的蛋白濃度調(diào)整一致后，進(jìn)行蛋白酶解，常用胰蛋白酶在37℃條件下酶解過(guò)夜，將蛋白質(zhì)分解為肽段。酶解后的肽段按照iTRAQ或TMT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記。以TMT標(biāo)記為例，將不同樣本的肽段分別與不同的TMT試劑在適宜條件下反應(yīng)，使肽段與試劑充分結(jié)合。標(biāo)記完成后，將不同樣本的標(biāo)記肽段混合，進(jìn)行離線(xiàn)分離，如采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX）和反相液相色譜（RP-LC）等技術(shù)對(duì)混合肽段進(jìn)行分級(jí)分離。分離后的肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，使用高分辨率質(zhì)譜儀，如ThermoFisherScientific的QExactiveHF質(zhì)譜儀，在數(shù)據(jù)依賴(lài)型采集（DDA）模式下進(jìn)行檢測(cè)，獲得質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)樣本處理方面，將洗滌后的細(xì)胞使用Trizol試劑提取總RNA。按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，將細(xì)胞裂解后，加入氯仿進(jìn)行相分離，離心后取上清液，加入異丙醇沉淀RNA。用75%乙醇洗滌沉淀的RNA，干燥后溶解于無(wú)RNA酶的水中。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，同時(shí)使用Agilent2100生物分析儀檢測(cè)RNA的完整性，RIN值應(yīng)大于8.0。合格的RNA樣品進(jìn)行mRNA富集（如前文所述利用磁珠富集真核生物mRNA），然后將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷，以mRNA為模板，合成第一條cDNA鏈和第二條cDNA鏈。進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇。最后通過(guò)PCR富集得到cDNA文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit進(jìn)行初步定量，使用Agilent2100對(duì)文庫(kù)的插入片段（insertsize）進(jìn)行檢測(cè)，insertsize符合預(yù)期后，再用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞2nM）。完成庫(kù)檢后，將不同文庫(kù)按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行pooling，用IlluminaNovaseq等平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序原始數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)分析流程上，對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)，首先使用ProteomeDiscoverer等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（如Uniprot人類(lèi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)搜索匹配肽段的序列信息，鑒定蛋白質(zhì)的種類(lèi)。在定量分析方面，根據(jù)不同樣本中肽段對(duì)應(yīng)的報(bào)告離子豐度，計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和富集分析，利用GeneOntology（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類(lèi)，分析其參與的生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能；利用KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析，確定蛋白質(zhì)參與的主要代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。對(duì)于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的測(cè)序原始數(shù)據(jù)，首先進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，使用FastQC等工具檢查數(shù)據(jù)質(zhì)量，去除低質(zhì)量的讀段、去除接頭序列和污染序列等。然后使用Hisat2等軟件將處理后的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上。利用StringTie等軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝和定量分析，計(jì)算基因的表達(dá)量，常用每百萬(wàn)映射讀取中來(lái)自某基因每千堿基長(zhǎng)度的讀段數(shù)（FPKM）來(lái)表示基因表達(dá)水平。通過(guò)DESeq2等軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出感染HHV-8組與對(duì)照組之間差異表達(dá)的基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，同樣利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，分析差異表達(dá)基因在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能以及代謝通路等方面的富集情況。最后，將蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析結(jié)果進(jìn)行整合分析，尋找IRF7表達(dá)變化與HHV-8基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)，確定IRF7可能影響的HHV-8基因組相關(guān)基因。四、IRF7與HHV-8基因組相關(guān)基因的確定4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1差異表達(dá)基因和蛋白的篩選通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)感染HHV-8的細(xì)胞樣本和對(duì)照樣本進(jìn)行分析，成功篩選出一系列差異表達(dá)的基因和蛋白。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中，共檢測(cè)到18652個(gè)基因。以|log?(FoldChange)|≥1且P<0.05作為差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)感染HHV-8后，有1256個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中898個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，358個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。在這些差異表達(dá)基因中，與IRF7表達(dá)變化具有顯著相關(guān)性的基因有158個(gè)。通過(guò)對(duì)這些基因的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诓《靖腥尽⒚庖邞?yīng)答、細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在病毒感染相關(guān)方面，基因ORF50編碼的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄激活蛋白（RTA）表達(dá)顯著上調(diào)。RTA是HHV-8從潛伏狀態(tài)進(jìn)入裂解狀態(tài)的關(guān)鍵激活因子，它能夠結(jié)合到病毒基因組的多個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)一系列病毒基因的轉(zhuǎn)錄，在病毒的生命周期轉(zhuǎn)換中起著核心作用。與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因中，趨化因子CXCL10的表達(dá)也顯著上調(diào)。CXCL10在免疫細(xì)胞的招募和活化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它能夠吸引T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞到病毒感染部位，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，共鑒定到4862種蛋白質(zhì)。以|log?(FoldChange)|≥1且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)468種，其中296種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，172種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。與IRF7表達(dá)變化相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)有65種。例如，病毒蛋白LANA-1在感染HHV-8的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。LANA-1是HHV-8潛伏期的關(guān)鍵蛋白，它能夠與病毒基因組的末端重復(fù)序列以及宿主細(xì)胞的染色體相結(jié)合，維持病毒基因組在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定存在，同時(shí)還參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的基因表達(dá)。宿主細(xì)胞中的蛋白激酶C（PKC）家族成員PKC-δ表達(dá)也發(fā)生了變化，在感染后其表達(dá)下調(diào)。PKC-δ參與多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用，其表達(dá)下調(diào)可能影響細(xì)胞的正常生理功能，從而有利于病毒的感染和復(fù)制。將轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果進(jìn)行整合分析，發(fā)現(xiàn)有32個(gè)基因在mRNA和蛋白水平均呈現(xiàn)出與IRF7表達(dá)變化相關(guān)的差異表達(dá)。這些基因和蛋白的篩選為進(jìn)一步研究IRF7對(duì)HHV-8基因表達(dá)的影響提供了重要的靶點(diǎn)和線(xiàn)索。4.2.2基因和蛋白的功能注釋與富集分析對(duì)篩選出的與IRF7相關(guān)的差異表達(dá)基因和蛋白進(jìn)行功能注釋和富集分析，深入了解它們?cè)谏矬w內(nèi)的功能和參與的生物學(xué)過(guò)程。在基因功能注釋方面，利用GeneOntology（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。在生物過(guò)程分類(lèi)中，這些差異表達(dá)基因主要富集在病毒生命周期調(diào)控、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控等過(guò)程。在病毒生命周期調(diào)控方面，許多基因參與了HHV-8的潛伏和裂解轉(zhuǎn)換過(guò)程。如前面提到的ORF50基因，其編碼的RTA蛋白在病毒從潛伏狀態(tài)進(jìn)入裂解狀態(tài)的過(guò)程中起到關(guān)鍵的激活作用，通過(guò)與病毒基因組的特定區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)一系列裂解期基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控病毒的生命周期。在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)方面，差異表達(dá)基因涉及到干擾素信號(hào)通路、T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生等多個(gè)環(huán)節(jié)。干擾素信號(hào)通路相關(guān)基因的富集表明，IRF7可能通過(guò)影響干擾素信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)HHV-8感染的免疫反應(yīng)。在細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控方面，一些基因參與了細(xì)胞周期的各個(gè)階段，如G1期、S期和G2/M期的調(diào)控。這些基因的表達(dá)變化可能影響宿主細(xì)胞的增殖和分裂，為病毒的感染和復(fù)制提供適宜的細(xì)胞環(huán)境。在細(xì)胞組分分類(lèi)中，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的類(lèi)別。在細(xì)胞核中，許多基因編碼的蛋白質(zhì)參與了DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過(guò)程，它們?cè)诩?xì)胞核內(nèi)與病毒基因組或宿主細(xì)胞基因組相互作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在細(xì)胞質(zhì)中，一些基因編碼的蛋白參與了信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成等過(guò)程，這些蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)傳遞信號(hào)，協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)的各種生理活動(dòng)。在細(xì)胞膜上，部分基因編碼的蛋白作為受體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與了病毒的入侵和細(xì)胞間的物質(zhì)交換等過(guò)程。在分子功能分類(lèi)中，差異表達(dá)基因主要富集在DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活、蛋白激酶活性等功能類(lèi)別。DNA結(jié)合功能類(lèi)別的富集表明，許多基因編碼的蛋白質(zhì)能夠與DNA特異性結(jié)合，參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄激活功能類(lèi)別的基因則在啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它們通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，促進(jìn)RNA聚合酶與基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。蛋白激酶活性功能類(lèi)別的基因編碼的蛋白能夠催化蛋白質(zhì)的磷酸化修飾，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和功能，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。在蛋白功能注釋方面，同樣利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。在生物過(guò)程分類(lèi)中，差異表達(dá)蛋白主要富集在病毒感染、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝等過(guò)程。在病毒感染過(guò)程中，像LANA-1等病毒蛋白，通過(guò)與宿主細(xì)胞的相互作用，維持病毒的潛伏感染狀態(tài)，促進(jìn)病毒基因組的穩(wěn)定存在。在免疫調(diào)節(jié)方面，一些宿主細(xì)胞蛋白參與了免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌等過(guò)程，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。在細(xì)胞代謝方面，部分蛋白參與了碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝等過(guò)程，為細(xì)胞的正常生理活動(dòng)提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。利用KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因和蛋白主要富集在病毒感染相關(guān)通路、免疫相關(guān)通路和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路等。在病毒感染相關(guān)通路中，HHV-8感染通路顯著富集。在這條通路中，涉及到病毒的吸附、侵入、基因組復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)環(huán)節(jié)，差異表達(dá)基因和蛋白在這些環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。在免疫相關(guān)通路中，T細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路以及NF-κB信號(hào)通路等顯著富集。這些通路在免疫細(xì)胞的活化、增殖和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，IRF7可能通過(guò)影響這些通路來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)HHV-8感染的免疫反應(yīng)。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中，PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等富集明顯。這些信號(hào)通路參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理過(guò)程，差異表達(dá)基因和蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，進(jìn)而影響HHV-8的感染和復(fù)制。4.3結(jié)果討論通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)篩選出的與IRF7相關(guān)的差異表達(dá)基因和蛋白，為深入理解IRF7對(duì)HHV-8基因表達(dá)的影響提供了關(guān)鍵線(xiàn)索。這些基因和蛋白在病毒生命周期調(diào)控、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)以及細(xì)胞生理功能等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用。在病毒生命周期調(diào)控方面，ORF50基因編碼的RTA蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。RTA作為HHV-8