幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白的制備與抗原特性研究一、引言1.1研究背景幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）是一種主要生存在人類胃部及十二指腸內(nèi)的革蘭氏陰性菌，呈螺旋狀或S形、弧形。自1983年被發(fā)現(xiàn)以來，大量研究證實幽門螺桿菌感染與多種胃部疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。全球范圍內(nèi)，幽門螺桿菌的感染率相當高，不同地區(qū)有所差異，發(fā)展中國家的感染率普遍高于發(fā)達國家，部分發(fā)展中國家的感染率甚至高達80%以上，而發(fā)達國家的感染率也在30%-50%左右。在中國，幽門螺桿菌的平均感染率約為50％，這意味著約有7億人感染了幽門螺桿菌。幽門螺桿菌感染是慢性胃炎的主要病因，長期感染幽門螺桿菌可使胃黏膜反復發(fā)生炎癥反應(yīng)，導致胃黏膜損傷、萎縮，進而發(fā)展為萎縮性胃炎。流行病學調(diào)查顯示，在慢性胃炎患者中，幽門螺桿菌的檢出率高達80%-95%。消化性潰瘍的發(fā)生也與幽門螺桿菌感染密切相關(guān)，胃潰瘍患者中幽門螺桿菌的感染率約為70%-90%，十二指腸潰瘍患者的感染率更是高達90%-100%。幽門螺桿菌感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)會破壞胃和十二指腸黏膜的防御機制，使得胃酸和胃蛋白酶對黏膜的侵蝕作用增強，從而導致潰瘍的形成。更為嚴重的是，幽門螺桿菌已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列為第Ⅰ類生物致癌因子，是胃癌發(fā)生的重要危險因素。從幽門螺桿菌感染到胃癌的發(fā)展是一個漸進的過程，通常會經(jīng)歷慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生，最終發(fā)展為胃癌。研究表明，幽門螺桿菌感染者患胃癌的風險比未感染者高出數(shù)倍。此外，幽門螺桿菌感染還與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤（MALT淋巴瘤）等疾病的發(fā)生相關(guān)。幽門螺桿菌的致病性與其攜帶的多種毒力因子密切相關(guān)，其中細胞毒素相關(guān)基因A（CytotoxinassociatedgeneA，CagA）和空泡毒素（VacuolatingcytotoxinA，VacA）是最重要的兩個毒力因子，在幽門螺桿菌致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CagA是一種相對分子量約為120-145kDa的蛋白質(zhì)，由cagA基因編碼。約60%-70%的幽門螺桿菌菌株攜帶CagA基因，主要流行于東亞地區(qū)，如中國、日本和韓國等國家，攜帶率可高達80%-95%。當幽門螺桿菌感染人體后，CagA蛋白可通過細菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)被注入到胃上皮細胞內(nèi)。進入細胞后，CagA蛋白可發(fā)生酪氨酸磷酸化，磷酸化的CagA能夠與多種宿主細胞內(nèi)的信號分子相互作用，干擾細胞內(nèi)的信號傳導通路。比如，CagA可以與SHP-2蛋白結(jié)合并激活其磷酸酶活性，從而激活Ras-MAPK信號通路，導致細胞的增殖、分化和遷移等過程發(fā)生異常。CagA還能干擾緊密連接蛋白的功能，破壞胃上皮細胞之間的緊密連接，增加胃黏膜的通透性，使得細菌及其毒素更容易侵入深層組織，引發(fā)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，感染攜帶CagA基因幽門螺桿菌菌株的患者，發(fā)生嚴重胃炎、消化性潰瘍和胃癌的風險顯著高于感染不含CagA基因菌株的患者。在胃癌組織中，CagA陽性的幽門螺桿菌感染率明顯高于非癌組織，進一步表明CagA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。VacA是一種分泌型蛋白質(zhì)，相對分子量約為88kDa，由vacA基因編碼。VacA具有多種生物學活性，其主要作用是能夠在真核細胞內(nèi)形成空泡，導致細胞空泡化。VacA通過與細胞表面的特異性受體結(jié)合，如低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）等，然后被細胞內(nèi)吞進入細胞。進入細胞后，VacA定位于內(nèi)體和溶酶體等細胞器，改變這些細胞器的膜通透性，導致離子失衡和水分內(nèi)流，最終形成空泡。VacA還可以誘導細胞凋亡，它能夠激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，如caspase級聯(lián)反應(yīng)，促使細胞發(fā)生凋亡。此外，VacA還能抑制T淋巴細胞的增殖和活化，降低機體的免疫防御功能，使得幽門螺桿菌能夠在胃內(nèi)持續(xù)感染。研究表明，VacA的表達水平與幽門螺桿菌感染相關(guān)疾病的嚴重程度密切相關(guān)，高表達VacA的幽門螺桿菌菌株更容易導致消化性潰瘍和胃癌等疾病的發(fā)生。鑒于CagA和VacA在幽門螺桿菌致病機制中的核心作用，它們成為了研究幽門螺桿菌感染相關(guān)疾病的重要靶點。對CagA和VacA的深入研究，有助于我們更加全面、深入地理解幽門螺桿菌的致病機制，為開發(fā)針對幽門螺桿菌感染的新型診斷方法和治療策略提供堅實的理論基礎(chǔ)。通過研究CagA和VacA與宿主細胞的相互作用機制，可以發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點，從而研發(fā)出更有效的抗幽門螺桿菌藥物。對CagA和VacA抗原性的研究，也為幽門螺桿菌診斷試劑和疫苗的開發(fā)提供了重要的研究方向，有望通過檢測機體對CagA和VacA的免疫反應(yīng)來實現(xiàn)幽門螺桿菌感染的早期診斷，或者以CagA和VacA為抗原制備疫苗，預(yù)防幽門螺桿菌感染及其相關(guān)疾病的發(fā)生。1.2研究目的與意義本研究旨在通過基因工程技術(shù)，成功實現(xiàn)幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白的高效表達與純化，并對其抗原性進行準確檢測。具體而言，首先從幽門螺桿菌基因組中克隆出CagA和VacA基因，將其連接至合適的表達載體，轉(zhuǎn)化至宿主細胞中進行誘導表達。隨后，運用有效的純化方法獲取高純度的重組蛋白，最后采用多種免疫學技術(shù)檢測重組蛋白的抗原性。這一研究具有重要的理論與實際意義。在理論層面，深入研究CagA和VacA重組蛋白的表達、純化及抗原性，有助于揭示幽門螺桿菌的致病機制，進一步明晰這兩種關(guān)鍵毒力因子與宿主細胞的相互作用過程，為闡釋幽門螺桿菌感染引發(fā)胃部疾病的分子機制提供有力依據(jù)。在實際應(yīng)用方面，一方面，高純度、具有良好抗原性的CagA和VacA重組蛋白可作為關(guān)鍵原料，用于開發(fā)高靈敏度、高特異性的幽門螺桿菌診斷試劑。通過檢測人體對這兩種重組蛋白的免疫反應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)幽門螺桿菌感染的早期精準診斷，為臨床治療爭取寶貴時間。另一方面，基于CagA和VacA重組蛋白開發(fā)的疫苗，有望為預(yù)防幽門螺桿菌感染及其相關(guān)疾病提供有效手段，降低全球幽門螺桿菌感染率，減少胃部疾病的發(fā)生，對公共衛(wèi)生事業(yè)具有重要推動作用。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1菌株與載體幽門螺桿菌標準菌株NCTC11639購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），該菌株在本實驗中作為目的基因CagA和VacA的來源菌株。將其接種于含10%羊血的哥倫比亞瓊脂平板上，置于微需氧環(huán)境（5%O?、10%CO?、85%N?）、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，待菌落長出后，挑取單菌落進行后續(xù)實驗。表達載體選用pET-28a(+)，購自Novagen公司。該載體具有T7啟動子，能在大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達，且?guī)в蠬is標簽，便于后續(xù)重組蛋白的純化?？寺≥d體采用pMD18-TVector，購自TaKaRa公司，其多克隆位點便于外源基因的插入，在基因克隆過程中發(fā)揮重要作用。大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞為本實驗室保存。DH5α常用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增，BL21(DE3)則作為重組蛋白表達的宿主菌，其具有T7RNA聚合酶基因，能啟動T7啟動子驅(qū)動的外源基因表達。2.1.2主要試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶、DNAMarker、ProteinMarker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、鎳離子親和層析介質(zhì)、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍R-250、硝酸纖維素膜、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液、牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉等，以上試劑均購自知名試劑公司，如TaKaRa、ThermoFisherScientific、Sigma-Aldrich等。實驗中使用的主要儀器設(shè)備有：PCR擴增儀（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler）、核酸電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+）、恒溫搖床（NewBrunswickInnova44R）、冷凍離心機（Eppendorf5424R）、超聲波細胞破碎儀（SCIENTZ-ⅡD）、蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)（AKTApure25）、酶標儀（ThermoFisherScientificMultiskanGO）、Westernblot轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem）等。這些儀器設(shè)備性能穩(wěn)定，能滿足實驗中基因擴增、蛋白表達與純化、蛋白檢測等各環(huán)節(jié)的需求。2.2實驗方法2.2.1CagA和VacA基因的克隆根據(jù)GenBank中登錄的幽門螺桿菌CagA和VacA基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件分別設(shè)計特異性引物。為便于后續(xù)基因克隆及表達載體構(gòu)建，在引物兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶識別位點，上游引物引入BamHⅠ酶切位點，下游引物引入HindⅢ酶切位點。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，CagA基因引物序列為：上游引物5'-CGGGATCCATGAAAAAGAAAGCAAAAAA-3'，下游引物5'-CCCAAGCTTTCACAAGCTGCTGCTGCTG-3'；VacA基因引物序列為：上游引物5'-CGGGATCCATGAAAAAAGAAAAAAAGAA-3'，下游引物5'-CCCAAGCTTTCACAGTTGTTGTTGTTGTT-3'。以提取的幽門螺桿菌NCTC11639基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系總體積為50μl，包含2×PCRMasterMix25μl，上下游引物（10μM）各1μl，模板DNA1μl，ddH?O22μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min（CagA基因）或2.5min（VacA基因），共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，可見與預(yù)期大小相符的特異性條帶，CagA基因片段大小約為1962bp，VacA基因片段大小約為2256bp。將PCR擴增得到的CagA和VacA基因片段用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，酶切體系為：基因片段10μl，10×Buffer2μl，BamHⅠ和HindⅢ各1μl，ddH?O6μl，37℃水浴酶切3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的酶切基因片段與同樣經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的pMD18-T載體連接，連接體系為：酶切基因片段4μl，pMD18-T載體1μl，SolutionⅠ5μl，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含氨芐青霉素（Amp，100μg/ml）的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行PCR驗證及雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進行測序。測序結(jié)果通過BLAST軟件與GenBank中已知的CagA和VacA基因序列進行比對，確認克隆的基因序列正確無誤。2.2.2重組表達載體的構(gòu)建將測序正確的含有CagA和VacA基因的pMD18-T重組質(zhì)粒分別用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，回收目的基因片段。同時，用同樣的限制性內(nèi)切酶對表達載體pET-28a(+)進行雙酶切，回收線性化的載體片段。將回收的CagA和VacA基因片段分別與線性化的pET-28a(+)載體片段按摩爾比3:1混合，加入T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)，連接體系為：基因片段3μl，載體片段1μl，10×T4DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl，ddH?O4μl，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含卡那霉素（Kan，50μg/ml）的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行PCR驗證及雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒即為含有CagA和VacA基因的重組表達載體pET-28a(+)/CagA和pET-28a(+)/VacA。2.2.3CagA和VacA重組蛋白的表達將構(gòu)建好的重組表達載體pET-28a(+)/CagA和pET-28a(+)/VacA分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含Kan的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落接種于5ml含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。將種子液按1:100的比例接種于500ml含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD???值達到0.6-0.8。加入終濃度為1mM的IPTG進行誘導表達，誘導條件為：37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)4h。誘導結(jié)束后，4℃、8000rpm離心10min收集菌體，棄上清，用PBS緩沖液洗滌菌體2-3次，重懸于適量PBS緩沖液中，用于后續(xù)蛋白純化及檢測。2.2.4CagA和VacA重組蛋白的純化采用鎳離子親和層析法對誘導表達的CagA和VacA重組蛋白進行純化。由于pET-28a(+)載體帶有His標簽，重組蛋白表達后也會帶有His標簽，可與鎳離子親和層析介質(zhì)特異性結(jié)合。將收集的菌體懸浮液進行超聲波破碎，破碎條件為：功率300W，工作3s，間歇5s，總時間10min，在冰浴中進行，以防止蛋白變性。破碎后的菌液4℃、12000rpm離心30min，取上清，即為粗蛋白提取液。將粗蛋白提取液緩慢加入預(yù)先用平衡緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑）平衡好的鎳離子親和層析柱中，使蛋白與層析介質(zhì)充分結(jié)合。用平衡緩沖液沖洗層析柱，直至流出液的OD???值接近基線，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑）洗脫結(jié)合在層析柱上的重組蛋白，收集洗脫峰。將收集的洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測，確定純化蛋白的純度和分子量，與預(yù)期的CagA和VacA重組蛋白分子量相符，且純度較高。對純化后的蛋白進行濃度測定，采用Bradford法，以BSA為標準蛋白，在595nm處測定吸光值，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。2.2.5CagA和VacA重組蛋白的抗原性檢測采用Westernblot法檢測CagA和VacA重組蛋白的抗原性。將純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，通過電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時間90min。轉(zhuǎn)膜完成后，將NC膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉后的NC膜用TBST緩沖液（20mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，0.1%Tween-20）洗滌3次，每次10min。加入用封閉液稀釋的鼠抗His標簽單克隆抗體（1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入用封閉液稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG（1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。最后，加入TMB顯色液進行顯色反應(yīng)，待條帶出現(xiàn)后，用去離子水沖洗終止反應(yīng)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，可見與預(yù)期分子量相符的特異性條帶，表明重組蛋白能夠與特異性抗體結(jié)合，具有抗原性。采用ELISA法進一步檢測CagA和VacA重組蛋白的抗原性。用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）將純化后的重組蛋白稀釋至合適濃度（1μg/ml），加入到96孔酶標板中，每孔100μl，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液（PBS，0.05%Tween-20）洗滌酶標板3次，每次3min。加入5%BSA封閉液，每孔200μl，37℃封閉2h。封閉后，用PBST緩沖液洗滌酶標板3次，每次3min。加入用封閉液稀釋的鼠抗His標簽單克隆抗體（1:1000），每孔100μl，37℃孵育1h。用PBST緩沖液洗滌酶標板3次，每次3min。加入用封閉液稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG（1:5000），每孔100μl，37℃孵育30min。用PBST緩沖液洗滌酶標板5次，每次3min。加入TMB顯色液，每孔100μl，37℃避光顯色15-20min。最后，加入2MH?SO?終止液，每孔50μl，在酶標儀上測定450nm處的吸光值。同時設(shè)置陰性對照（只加封閉液和抗體，不加重組蛋白）和陽性對照（已知具有抗原性的蛋白），以判斷重組蛋白抗原性的強弱。若重組蛋白孔的吸光值顯著高于陰性對照孔，且與陽性對照孔吸光值相當或接近，則表明重組蛋白具有良好的抗原性。三、實驗結(jié)果3.1CagA和VacA基因克隆結(jié)果以幽門螺桿菌NCTC11639基因組DNA為模板，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。在凝膠成像系統(tǒng)下，可清晰觀察到CagA基因擴增產(chǎn)物在約1962bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的CagA基因片段大小相符；VacA基因擴增產(chǎn)物在約2256bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的VacA基因片段大小一致。這表明PCR擴增成功獲得了目的基因片段。將PCR擴增得到的CagA和VacA基因片段分別與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。對提取的質(zhì)粒進行PCR驗證及雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，PCR驗證可擴增出與目的基因大小一致的條帶，雙酶切鑒定后在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期相符的線性化載體條帶和目的基因條帶，進一步證實了重組質(zhì)粒中含有正確插入的CagA和VacA基因片段。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進行測序，測序結(jié)果通過BLAST軟件與GenBank中已知的CagA和VacA基因序列進行比對。比對結(jié)果顯示，克隆的CagA和VacA基因序列與GenBank中相應(yīng)基因序列的一致性均達到99%以上，表明成功克隆了幽門螺桿菌CagA和VacA基因，且基因序列正確無誤，可用于后續(xù)重組表達載體的構(gòu)建。物，2為VacA基因PCR擴增產(chǎn)物)圖1：CagA和VacA基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖3.2重組表達載體的鑒定結(jié)果將重組表達載體pET-28a(+)/CagA和pET-28a(+)/VacA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞后，挑取單菌落進行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，對提取的質(zhì)粒分別進行PCR驗證及雙酶切鑒定。PCR驗證結(jié)果顯示，以提取的重組質(zhì)粒為模板，使用特異性引物進行PCR擴增，均能擴增出與目的基因CagA和VacA大小相符的條帶，CagA基因擴增條帶約為1962bp，VacA基因擴增條帶約為2256bp，表明重組質(zhì)粒中含有目的基因。雙酶切鑒定時，將重組質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在凝膠上可見兩條條帶，一條為線性化的pET-28a(+)載體條帶，大小約為5369bp，另一條為目的基因CagA或VacA條帶，大小分別與預(yù)期的1962bp和2256bp一致（圖2）。這進一步證明目的基因已成功插入到表達載體中，重組表達載體構(gòu)建正確。為確保重組表達載體中目的基因序列的準確性，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進行測序。測序結(jié)果通過BLAST軟件與GenBank中已知的CagA和VacA基因序列進行比對，結(jié)果顯示，重組表達載體pET-28a(+)/CagA和pET-28a(+)/VacA中插入的CagA和VacA基因序列與GenBank中相應(yīng)基因序列的一致性均達到99%以上，且無堿基突變、缺失或插入等異常情況。這表明成功構(gòu)建了含有正確CagA和VacA基因序列的重組表達載體，可用于后續(xù)重組蛋白的表達。/CagA雙酶切產(chǎn)物，2為pET-28a(+)/VacA雙酶切產(chǎn)物)圖2：重組表達載體雙酶切鑒定電泳圖3.3CagA和VacA重組蛋白的表達情況將含有重組表達載體pET-28a(+)/CagA和pET-28a(+)/VacA的大腸桿菌BL21(DE3)在IPTG誘導下進行表達，誘導結(jié)束后收集菌體，進行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果如圖3所示，在誘導表達的pET-28a(+)/CagA重組菌裂解液中，于相對分子量約75kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的CagA重組蛋白（含His標簽）分子量大小相符；在誘導表達的pET-28a(+)/VacA重組菌裂解液中，于相對分子量約87kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的VacA重組蛋白（含His標簽）分子量大小一致。而未誘導的重組菌裂解液中，在相應(yīng)位置未出現(xiàn)明顯條帶。通過QuantityOne軟件對SDS-PAGE電泳條帶進行灰度分析，計算重組蛋白表達量占細菌總蛋白的比例。結(jié)果顯示，CagA重組蛋白的表達量約占細菌總蛋白的20%，VacA重組蛋白的表達量約占細菌總蛋白的18%。這表明成功誘導表達了幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白，且表達量達到了一定水平，為后續(xù)的蛋白純化及抗原性檢測提供了充足的材料。/CagA重組菌裂解液，2為誘導后的pET-28a(+)/CagA重組菌裂解液，3為未誘導的pET-28a(+)/VacA重組菌裂解液，4為誘導后的pET-28a(+)/VacA重組菌裂解液)圖3：CagA和VacA重組蛋白表達的SDS-PAGE電泳圖3.4CagA和VacA重組蛋白的純化結(jié)果對誘導表達的CagA和VacA重組蛋白采用鎳離子親和層析法進行純化，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。在SDS-PAGE凝膠上，CagA重組蛋白在相對分子量約75kDa處呈現(xiàn)出單一、清晰的條帶，表明純化后的CagA重組蛋白純度較高；VacA重組蛋白在相對分子量約87kDa處出現(xiàn)單一、明顯的條帶，說明VacA重組蛋白也得到了有效的純化。通過凝膠成像系統(tǒng)分析軟件對SDS-PAGE電泳條帶進行灰度掃描，計算純化后蛋白的純度。結(jié)果顯示，CagA重組蛋白的純度達到了90%以上，VacA重組蛋白的純度也達到了85%以上。在蛋白得率方面，經(jīng)測定，每升培養(yǎng)物中CagA重組蛋白的得率約為15mg，VacA重組蛋白的得率約為12mg。這表明通過鎳離子親和層析法能夠有效地純化CagA和VacA重組蛋白，獲得的純化蛋白純度較高，得率也能滿足后續(xù)實驗研究的需求，為重組蛋白的抗原性檢測及相關(guān)應(yīng)用奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。圖4：CagA和VacA重組蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖3.5CagA和VacA重組蛋白的抗原性檢測結(jié)果采用Westernblot法對純化后的CagA和VacA重組蛋白進行抗原性檢測，結(jié)果如圖5所示。將純化的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，與鼠抗His標簽單克隆抗體及HRP標記的羊抗鼠IgG孵育，經(jīng)TMB顯色后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。可以看到，CagA重組蛋白在相對分子量約75kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的CagA重組蛋白分子量一致；VacA重組蛋白在相對分子量約87kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的VacA重組蛋白分子量相符。這表明CagA和VacA重組蛋白能夠與特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的抗原性，可作為抗原用于后續(xù)的免疫學檢測。果圖，圖中M為ProteinMarker，1為CagA重組蛋白，2為VacA重組蛋白)圖5：CagA和VacA重組蛋白的Westernblot檢測結(jié)果進一步采用ELISA法檢測CagA和VacA重組蛋白的抗原性，結(jié)果如表1所示。以純化后的重組蛋白包被酶標板，加入鼠抗His標簽單克隆抗體及HRP標記的羊抗鼠IgG，通過TMB顯色后在酶標儀上測定450nm處的吸光值。同時設(shè)置陰性對照和陽性對照，陰性對照孔的吸光值較低，平均值為0.125±0.015；陽性對照孔的吸光值較高，平均值為1.256±0.056。CagA重組蛋白孔的吸光值為1.058±0.045，顯著高于陰性對照孔（P<0.01），且與陽性對照孔吸光值相當；VacA重組蛋白孔的吸光值為0.986±0.038，同樣顯著高于陰性對照孔（P<0.01），與陽性對照孔吸光值接近。這進一步證實CagA和VacA重組蛋白具有良好的抗原性，能夠有效地刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可用于幽門螺桿菌相關(guān)診斷試劑和疫苗的研發(fā)。表1：CagA和VacA重組蛋白ELISA檢測結(jié)果樣品OD450平均值±SD陰性對照0.125±0.015陽性對照1.256±0.056CagA重組蛋白1.058±0.045VacA重組蛋白0.986±0.038四、分析與討論4.1基因克隆與載體構(gòu)建的關(guān)鍵因素在基因克隆過程中，引物設(shè)計是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，直接影響到PCR擴增的特異性和效率。本研究根據(jù)GenBank中幽門螺桿菌CagA和VacA基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件精心設(shè)計引物。引物兩端引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，這一設(shè)計不僅方便后續(xù)基因克隆到載體中，還確保了目的基因在載體中的正確插入方向。若引物設(shè)計不合理，如引物與模板結(jié)合特異性差，可能導致非特異性擴增，產(chǎn)生大量雜帶，干擾后續(xù)的實驗操作和分析。比如引物的Tm值（解鏈溫度）過高或過低，都會影響引物與模板的結(jié)合穩(wěn)定性，從而影響PCR擴增效果。Tm值過高，引物與模板結(jié)合過于緊密，可能導致退火溫度過高，使得PCR擴增效率降低；Tm值過低，引物與模板結(jié)合不牢固，容易產(chǎn)生非特異性擴增。此外，引物的長度、GC含量等因素也會對引物的特異性和擴增效率產(chǎn)生影響。合適的引物長度一般在18-25個堿基之間，GC含量在40%-60%左右，這樣能保證引物具有較好的特異性和擴增效果。酶切連接反應(yīng)同樣是基因克隆和載體構(gòu)建的關(guān)鍵步驟。本研究對PCR擴增得到的CagA和VacA基因片段以及載體pMD18-T、pET-28a(+)均進行了BamHⅠ和HindⅢ雙酶切。酶切反應(yīng)條件的優(yōu)化至關(guān)重要，包括酶的用量、反應(yīng)溫度和時間等。酶用量不足可能導致酶切不完全，使得載體不能有效線性化，或者目的基因片段不能完全切下，影響后續(xù)的連接反應(yīng)；酶用量過多則可能導致非特異性酶切，破壞目的基因或載體的結(jié)構(gòu)。反應(yīng)溫度和時間的不合適也會影響酶切效果，不同的限制性內(nèi)切酶具有其最適的反應(yīng)溫度和時間，本研究中使用的BamHⅠ和HindⅢ最適反應(yīng)溫度均為37℃，反應(yīng)時間為3h，在此條件下能保證酶切反應(yīng)的充分進行。連接反應(yīng)中，目的基因片段與載體的摩爾比是影響連接效率的重要因素。本研究中采用目的基因片段與載體摩爾比為3:1進行連接，這一比例經(jīng)過多次預(yù)實驗優(yōu)化確定。若摩爾比過低，載體自身環(huán)化的概率增加，導致重組載體的轉(zhuǎn)化效率降低；摩爾比過高，則可能出現(xiàn)多個目的基因片段串聯(lián)插入載體的情況，影響重組蛋白的表達。連接酶的活性和用量也會對連接反應(yīng)產(chǎn)生影響，活性高且用量適當?shù)倪B接酶能提高連接效率，保證重組載體的成功構(gòu)建。測序結(jié)果是驗證基因克隆和載體構(gòu)建正確性的金標準。本研究將構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行測序，并通過BLAST軟件與GenBank中已知序列比對，結(jié)果顯示克隆的CagA和VacA基因序列與GenBank中相應(yīng)基因序列一致性均達到99%以上。這表明引物設(shè)計合理，酶切連接反應(yīng)成功，目的基因準確無誤地克隆到了載體中，為后續(xù)重組蛋白的表達奠定了堅實基礎(chǔ)。若測序結(jié)果出現(xiàn)堿基突變、缺失或插入等異常情況，可能是由于PCR擴增過程中聚合酶的錯配、酶切連接過程中的操作失誤等原因?qū)е拢@將嚴重影響后續(xù)實驗結(jié)果，需要重新優(yōu)化實驗條件，重新進行基因克隆和載體構(gòu)建。4.2重組蛋白表達的影響因素在重組蛋白表達過程中，誘導劑濃度、誘導時間和溫度等因素對蛋白表達水平有著顯著影響。誘導劑IPTG的濃度是影響重組蛋白表達的關(guān)鍵因素之一。IPTG作為乳糖操縱子的誘導劑，能夠與阻遏蛋白結(jié)合，從而解除對T7啟動子的抑制，啟動外源基因的表達。在本研究中，對IPTG濃度進行了梯度優(yōu)化實驗，設(shè)置了0.1mM、0.5mM、1mM、1.5mM和2mM等不同濃度組。實驗結(jié)果表明，當IPTG濃度為1mM時，CagA和VacA重組蛋白的表達量達到較高水平。當IPTG濃度較低時，如0.1mM和0.5mM，誘導效果不明顯，重組蛋白表達量較低，這可能是因為低濃度的IPTG無法有效解除阻遏蛋白對T7啟動子的抑制，使得外源基因轉(zhuǎn)錄和翻譯效率低下。而當IPTG濃度過高，如1.5mM和2mM時，雖然能啟動外源基因表達，但過高濃度的IPTG可能會對細胞生長產(chǎn)生一定的毒性，影響細胞代謝和蛋白質(zhì)合成的正常進行，導致重組蛋白表達量不再增加，甚至出現(xiàn)下降趨勢。誘導時間也對重組蛋白表達有著重要影響。本研究對誘導時間進行了探索，設(shè)置了2h、4h、6h、8h和10h等不同時間點。實驗結(jié)果顯示，隨著誘導時間的延長，CagA和VacA重組蛋白的表達量逐漸增加，在誘導4h時，重組蛋白表達量達到較高水平，之后繼續(xù)延長誘導時間，表達量增加不明顯，甚至在誘導10h時，部分重組蛋白出現(xiàn)降解現(xiàn)象。這是因為在誘導初期，細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)被激活，隨著時間推移，重組蛋白不斷合成積累。但長時間的誘導會使細胞進入衰退期，細胞內(nèi)的蛋白酶活性增強，導致重組蛋白被降解。此外，長時間誘導還可能導致細胞代謝負擔過重，營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，影響重組蛋白的合成。溫度是影響重組蛋白表達的另一個重要因素。不同的溫度條件會影響細胞的生長代謝和蛋白質(zhì)合成機制。本研究設(shè)置了25℃、30℃、37℃等不同誘導溫度。在37℃時，CagA和VacA重組蛋白的表達量較高，這是因為37℃接近大腸桿菌的最適生長溫度，細胞代謝活躍，蛋白質(zhì)合成效率高，有利于重組蛋白的表達。然而，高溫也可能導致重組蛋白錯誤折疊，形成包涵體。在25℃和30℃較低溫度下誘導時，雖然重組蛋白的可溶性有所提高，減少了包涵體的形成，但細胞生長速度較慢，蛋白質(zhì)合成效率降低，總體重組蛋白表達量低于37℃誘導時的水平。因此，綜合考慮重組蛋白的表達量和可溶性，選擇37℃作為本研究的誘導溫度。4.3重組蛋白純化方法的優(yōu)化本研究采用鎳離子親和層析法對CagA和VacA重組蛋白進行純化，這是基于pET-28a(+)載體攜帶的His標簽，使得重組蛋白能夠與鎳離子親和層析介質(zhì)特異性結(jié)合。親和層析法具有特異性高、純化效果好等優(yōu)點，能夠有效地從復雜的粗蛋白提取液中分離出目標重組蛋白。在本研究中，通過該方法成功獲得了純度較高的CagA和VacA重組蛋白，CagA重組蛋白純度達到90%以上，VacA重組蛋白純度達到85%以上。然而，親和層析法也存在一些缺點。一方面，該方法成本相對較高，鎳離子親和層析介質(zhì)價格較為昂貴，且在使用過程中需要大量的平衡緩沖液和洗脫緩沖液，增加了實驗成本。另一方面，親和層析介質(zhì)的使用壽命有限，多次重復使用后其結(jié)合能力會下降，需要定期更換，這也在一定程度上增加了實驗成本。此外，若粗蛋白提取液中存在與目標蛋白競爭結(jié)合層析介質(zhì)的雜質(zhì)，可能會影響目標蛋白的純化效果，導致純度降低。為了改進親和層析法，可從多個方面進行優(yōu)化。在緩沖液的選擇和優(yōu)化方面，可以通過調(diào)整緩沖液的組成和pH值，提高目標蛋白與層析介質(zhì)的結(jié)合特異性和穩(wěn)定性。例如，適當降低緩沖液中鹽的濃度，可能會增強目標蛋白與層析介質(zhì)的相互作用，提高結(jié)合效率。改變緩沖液的pH值，使其更接近目標蛋白的等電點，也可能有助于提高目標蛋白的結(jié)合能力和洗脫效果。在層析介質(zhì)的選擇上，可以探索使用新型的親和層析介質(zhì)，如具有更高親和力和選擇性的介質(zhì)，或者嘗試對現(xiàn)有鎳離子親和層析介質(zhì)進行修飾和改進，以提高其性能。比如，通過在層析介質(zhì)表面引入特殊的配體，增強其與目標蛋白的特異性結(jié)合能力。還可以優(yōu)化層析過程的操作條件，如控制上樣流速、洗脫流速等，以提高純化效率和蛋白回收率。合適的上樣流速能夠保證目標蛋白與層析介質(zhì)充分結(jié)合，而適當?shù)南疵摿魉賱t能確保目標蛋白在洗脫過程中能夠被有效地洗脫下來，同時減少雜蛋白的洗脫。通過這些優(yōu)化措施，有望進一步提高重組蛋白的純化效果，降低成本，為幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白的大規(guī)模制備和應(yīng)用提供更有力的技術(shù)支持。4.4抗原性檢測結(jié)果的分析本研究通過Westernblot和ELISA兩種方法對幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白的抗原性進行了檢測，結(jié)果表明這兩種重組蛋白均具有良好的抗原性，能夠與特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合。在Westernblot檢測中，CagA重組蛋白在相對分子量約75kDa處出現(xiàn)特異性條帶，VacA重組蛋白在相對分子量約87kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的重組蛋白分子量一致。這一結(jié)果直接證明了重組蛋白能夠被相應(yīng)的抗體識別，具有抗原性。在ELISA檢測中，CagA重組蛋白孔的吸光值為1.058±0.045，VacA重組蛋白孔的吸光值為0.986±0.038，均顯著高于陰性對照孔（P<0.01），且與陽性對照孔吸光值相當或接近。這進一步定量地表明重組蛋白具有較強的免疫反應(yīng)性，能夠有效地刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，具備作為抗原用于免疫學檢測的潛力。與天然蛋白相比，重組蛋白在抗原性上可能存在一定差異。一方面，重組蛋白是通過基因工程技術(shù)在異源宿主（如大腸桿菌）中表達產(chǎn)生的，其折疊方式和修飾情況可能與天然蛋白有所不同。天然蛋白在幽門螺桿菌體內(nèi)合成時，會經(jīng)歷復雜的翻譯后修飾過程，如糖基化、磷酸化等，這些修飾對于蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有重要影響。而在大腸桿菌中表達的重組蛋白可能缺乏這些修飾，或者修飾方式與天然蛋白不同，從而影響其抗原表位的暴露和構(gòu)象，導致抗原性發(fā)生變化。另一方面，重組蛋白的表達和純化過程中，可能會受到一些因素的影響，如表達載體、宿主菌、誘導條件、純化方法等，這些因素也可能導致重組蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而影響其抗原性。例如，在重組蛋白表達過程中，過高的誘導溫度或過長的誘導時間可能導致蛋白錯誤折疊，形成包涵體，即使經(jīng)過復性處理，也可能無法完全恢復其天然構(gòu)象，從而影響抗原性。在純化過程中，如果使用的洗脫條件過于劇烈，可能會破壞重組蛋白的結(jié)構(gòu)，使其抗原性降低。盡管重組蛋白與天然蛋白在抗原性上可能存在差異，但本研究中檢測到的重組蛋白良好的抗原性，仍然為幽門螺桿菌感染的診斷和疫苗開發(fā)提供了重要的依據(jù)。在診斷方面，基于重組蛋白開發(fā)的診斷試劑具有諸多優(yōu)勢。重組蛋白可以大量生產(chǎn)，成本相對較低，且質(zhì)量可控，能夠滿足大規(guī)模檢測的需求。通過檢測機體對CagA和VacA重組蛋白的免疫反應(yīng)，可以實現(xiàn)幽門螺桿菌感染的快速、準確診斷。然而，由于重組蛋白與天然蛋白抗原性的差異，在實際應(yīng)用中可能需要對診斷試劑進行進一步的優(yōu)化和驗證，以確保其檢測的準確性和可靠性。可以通過篩選具有更高親和力和特異性的抗體，或者優(yōu)化檢測方法，來提高診斷試劑的性能。在疫苗開發(fā)方面，CagA和VacA重組蛋白作為潛在的疫苗候選抗原，具有重要的研究價值。疫苗的作用是通過激發(fā)機體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性的抗體和免疫細胞，從而對病原體產(chǎn)生免疫保護作用。本研究中重組蛋白良好的抗原性表明，它們有可能作為疫苗抗原，誘導機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。然而，重組蛋白與天然蛋白抗原性的差異也可能影響疫苗的免疫效果。為了提高疫苗的免疫原性和保護效果，需要進一步研究重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，優(yōu)化疫苗的配方和制備工藝?？梢酝ㄟ^對重組蛋白進行修飾，如添加佐劑、構(gòu)建融合蛋白等，來增強其免疫原性。還需要進行動物實驗和臨床試驗，驗證重組蛋白疫苗的安全性和有效性，為幽門螺桿菌感染的預(yù)防提供有效的手段。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論本研究成功實現(xiàn)了幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白的表達、純化及抗原性檢測，取得了一系列重要成果。在基因克隆和重組表達載體構(gòu)建方面，通過精心設(shè)計引物，從幽門螺桿菌NCTC11639基因組DNA中成功擴增出CagA和VacA基因片段，大小分別約為1962bp和2256bp。經(jīng)酶切、連接和轉(zhuǎn)化等一系列操作，將目的基因正確插入到表達載體pET-28a(+)中，構(gòu)建了重組表達載體pET-28a(+)/CagA和pET-28a(+)/VacA。測序結(jié)果表明，克隆的基因序列與GenBank中已知序列的一致性達到99%以上，為后續(xù)重組蛋白的表達提供了可靠的基礎(chǔ)。在重組蛋白表達過程中，對誘導條件進行了優(yōu)化。通過對IPTG濃度、誘導時間和溫度等因素的研究，確定了最佳誘導條件為：IPTG終濃度1mM，37℃誘導4h。在此條件下，CagA重組蛋白的表達量約占細菌總蛋白的20%，VacA重組蛋白的表達量約占細菌總蛋白的18%，成功獲得了較高表達量的重組蛋白，為后續(xù)的純化和檢測提供了充足的材料。采用鎳離子親和層析法對CagA和VacA重組蛋白進行純化，獲得了高純度的重組蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，純化后的CagA重組蛋白在相對分子量約75kDa處呈現(xiàn)單一、清晰的條帶，純度達到90%以上；VacA重組蛋白在相對分子量約87kDa處出現(xiàn)單一、明顯的條帶，純度達到85%以上。每升培養(yǎng)物中CagA重組蛋白的得率約為15mg，VacA重組蛋白的得率約為12mg，滿足了后續(xù)實驗研究的需求。通過Westernblot和ELISA兩種方法對重組蛋白的抗原性進行檢測，結(jié)果表明CagA和VacA重組蛋白均具有良好的抗原性。Westernblot檢測中，在相應(yīng)分子量處出現(xiàn)特異性條帶；ELISA檢測中，重組蛋白孔的吸光值顯著高于陰性對照孔（P<0.01），且與陽性對照孔吸光值相當或接近。這表明重組蛋白能夠有效地刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，具備作為抗原用于免疫學檢測和疫苗開發(fā)的潛力。綜上所述，本研究成功表達、純化了幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白，并證實其具有良好的抗原性，為幽門螺桿菌感染相關(guān)疾病的診斷試劑和疫苗的研發(fā)提供了重要的實驗依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。5.2研究展望在本研究成功表達、純化幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白并檢測其抗原性的基礎(chǔ)上，未來的研究可以從多個方向展開。在提高蛋白產(chǎn)量方面，可進一步優(yōu)化表達條件。除了對IPTG濃度、誘導時間和溫度進行優(yōu)化外，還可以探索不同的培養(yǎng)基成分對重組