×第64講微生物培養(yǎng)技術高三一輪復習授課人：Search近5年高考真題考察方向2022河北、北京、山東、廣東、全國微生物的培養(yǎng)與應用綜合2023重慶、江蘇，2025全國培養(yǎng)基的成分及其功能2024山東，2023遼寧微生物的培養(yǎng)與菌種保藏2024江蘇，2023北京，2022天津、江蘇、海南微生物的接種方法2024江蘇，2023北京，2022湖南無菌技術2024浙江，2023山東土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)2024寧夏，2023廣東、全國、浙江培養(yǎng)基的類型及其應用2024重慶，2022遼寧其他微生物的分離與計數(shù)考情分析本節(jié)內(nèi)容考頻適中，題型主要以選擇題為主，部分是填空題，題目考查難度較易，常結合發(fā)酵工程、種群、群落、能量流動、物質(zhì)循環(huán)等一起考察，部分結合表格進行考察1．生命觀念：結合生活或生產(chǎn)實例,舉例說出發(fā)酵工程及相關技術的基本原理。2．科學探究：針對人類生產(chǎn)或生活的某一需求,在發(fā)酵工程中選取恰當?shù)募夹g和方法,嘗試提出初步的工程學構想,進行簡單的設計和制作學習目標1微生物的基本培養(yǎng)技術2微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)本節(jié)綱要一、微生物的基本培養(yǎng)技術1、培養(yǎng)基的配制(1)概念：人們按照微生物對

的不同需求，配制出供其_________的營養(yǎng)基質(zhì)。營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖(2)作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或

。(3)微生物：積累其代謝物個體微小（肉眼不可見）、結構簡單包括：細菌、真菌、病毒及一些原生生物【注意】病毒為非細胞結構生物，只能在活細胞中營寄生生活，目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)。一、微生物的基本培養(yǎng)技術1、培養(yǎng)基的配制(4)營養(yǎng)構成碳源無機碳源:有機碳源:氮源NH4＋、NO3-、NH3等。牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。CO2、CO32-、HCO3-。葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。無機氮源:有機氮源:無機鹽Zn、Cu、Mn、Co、Mo等大量元素:微量元素:Ca、K、Mg等只有自養(yǎng)微生物能利用異養(yǎng)微生物水主要提供碳源的是牛肉膏，主要提供氮源的是蛋白胨固氮菌培養(yǎng)基可以不加氮源，自養(yǎng)型微生物可以不加碳源一、微生物的基本培養(yǎng)技術1、培養(yǎng)基的配制(5)特殊需求滿足微生物對

、

、

的需求。特殊營養(yǎng)物質(zhì)pHO2④培養(yǎng)厭氧微生物時，需要提供

的條件。①培養(yǎng)乳酸桿菌時，需要在培養(yǎng)基中添加

；②培養(yǎng)霉菌時，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；③培養(yǎng)細菌時，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；維生素酸性中性或弱堿性無氧維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等一、微生物的基本培養(yǎng)技術1、培養(yǎng)基的配制(6)培養(yǎng)基的成分及其類型劃分標準培養(yǎng)基種類特點用途物理性質(zhì)功能用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運動微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)、保藏菌種允許特定微生物生長,同時抑制其他微生物生長的培養(yǎng)基培養(yǎng)、分離出特定微生物（加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌）在培養(yǎng)基中加入某種指示劑,用以鑒別某種微生物鑒別不同種類微生物，如用伊紅美藍培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌

選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基少量凝固劑一、微生物的基本培養(yǎng)技術2、無菌技術(1)概念：泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，避免雜菌污染的方法。獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關鍵

。防止雜菌污染(3)手段:主要包括______和______。消毒滅菌消毒:

指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。滅菌:

指使用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。區(qū)別在于是否能夠把

等所有微生物去除。芽孢和孢子(2)目的:防止雜菌污染，同時避免細菌污染環(huán)境和感染操作者一、微生物的基本培養(yǎng)技術2、無菌技術類型適用范圍操作方法消毒滅菌煮沸消毒法日常生活用品100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學藥劑生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線紫外線照射30min灼燒滅菌最徹底，常用于接種工具直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌常用于玻璃器皿和金屬器具物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100kPa,溫度121℃,15～30min（4）消毒與滅菌的比較接種室、接種箱，超凈工作臺一、微生物的基本培養(yǎng)技術2、無菌技術（5）消毒和滅菌工作的兩個方面:①對實驗操作的_____、操作者的__________，進行清潔和消毒。②將用于微生物培養(yǎng)的_____、_________和_______等進行滅菌。空間衣著和手器皿接種用具培養(yǎng)基注意:避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。為了避免周圍環(huán)境中微生物的污染，操作都應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行?！鞠嚓P信息】生物消毒法：利用生物或其代謝物除去環(huán)境中的部分微生物的方法一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)（1）培養(yǎng)物、純培養(yǎng)物、純培養(yǎng)的概念:一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)（2）菌落:②特征形狀、大小、光澤度、顏色、透明度等?！氰b定菌種的重要依據(jù)③獲得單菌落的方法a.平板劃線法b.稀釋涂布平板法①概念：分散的微生物(單一個體)在適宜的

表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結構的

。

固體培養(yǎng)基子細胞群體一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)（3）探究——酵母菌的純培養(yǎng):①原理:②獲得單菌落的方法:平板劃線法和稀釋涂布平板法③步驟:想方設法在培養(yǎng)基上得到

的肉眼可見的

，即可獲得較純的菌種由一個細胞繁殖而來菌落配置培養(yǎng)基滅菌倒平板接種和分離培養(yǎng)調(diào)PH調(diào)PH等步驟，應在滅菌前，避免再次污染一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)③步驟:稱取去皮的馬鈴薯200g，切成小塊加水1000mL，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛用紗布過濾，得到濾液濾液中加入20g葡萄糖，15~20g瓊脂用蒸餾水定容至1000mL滅菌配置培養(yǎng)基培養(yǎng)基滅菌：濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌法）培養(yǎng)皿滅菌：干熱滅菌法一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)③步驟:倒平板待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。冷凝后平板倒置灼燒滅菌防止瓶口微生物污染培養(yǎng)基一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)③步驟:倒平板（1）平板冷凝后，為什么要將平板倒置？（2）怎么檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格？防止培養(yǎng)基表面的水分過度揮發(fā)；防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染在接種前隨機取若干個滅菌后的未接種的平板，先行培養(yǎng)一段時間，觀察是否有菌落存在一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)③步驟:接種和分離酵母菌平板劃線法⑥將皿蓋打開一條縫隙，將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃3-5條平行線，蓋上皿蓋。⑤試管口通過火焰，并塞上棉塞②在火焰旁冷卻接種環(huán)，拔出酵母菌培養(yǎng)液試管的棉塞③試管口通過火焰④在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復以上操作，作第三、四、五次劃線。①灼燒接種環(huán)，直至接種環(huán)金屬絲燒紅一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)③步驟:接種和分離酵母菌平板劃線法分區(qū)劃線法12345連續(xù)劃線法①接種環(huán)只蘸一次菌液，但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次；②劃線首尾不能相接；③每次劃線前接種環(huán)進行滅菌；④在作第二次以及其后的劃線操作時，從上一次劃線的末端開始劃線劃線后，培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。最后一次劃線已經(jīng)將酵母菌稀釋成單個細胞，如果與第一次劃線相連，則增加了酵母菌數(shù)目，得不到純化的效果。劃3個平板（重復實驗）1個不劃線（空白對照）一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)③步驟:接種和分離酵母菌平板劃線法思考：a.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？灼燒時期目的取菌種前每次劃線前接種結束后殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個細胞殺死接種環(huán)上原有微生物一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)③步驟:接種和分離酵母菌平板劃線法思考：b.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？思考：c.在做第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。一、微生物的基本培養(yǎng)技術3、微生物的純培養(yǎng)（3）探究——酵母菌的純培養(yǎng):③步驟：

完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。作對照，該培養(yǎng)皿無菌落說明培養(yǎng)基沒有污染培養(yǎng)酵母菌一、微生物的基本培養(yǎng)技術4、菌種的保存（1）臨時保藏將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基，在合適的溫度下培養(yǎng)，菌落長成后置于4℃冰箱保藏。每3-6個月，要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。（2）長期保存

甘油管藏法:在3ml的甘油瓶中，裝入1ml甘油后滅菌。將1ml培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的冷凍箱中保存。保存時間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。這種保存方法的缺點是:二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)1.選擇培養(yǎng)基(1)概念:在微生物學中，將允許__________的微生物生長，同時__________其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱為選擇培養(yǎng)基。特定種類抑制或阻止(2)自然界中目的菌株篩選的依據(jù):根據(jù)它對___________的要求,到相應的環(huán)境中去尋找。(3)實驗室中微生物篩選的原理:人為提供有利于_______生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、PH等),同時___________其他微生物的生長。生存環(huán)境目的菌抑制或阻止怎么證明一個選擇培養(yǎng)基具有選擇性呢？應該設置完全培養(yǎng)基(如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)作為對照，若完全培養(yǎng)基中生長的菌落數(shù)均多于該選擇培養(yǎng)基，則該選擇培養(yǎng)基具有選擇性；二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)1.選擇培養(yǎng)基(4)類型:①利用改變培養(yǎng)條件進行選擇培養(yǎng)。②利用添加某種化學物質(zhì)進行選擇培養(yǎng)。③利用營養(yǎng)缺陷進行選擇培養(yǎng)。70～80℃的高溫分離耐高溫的水生棲熱菌加入青霉素分離酵母菌、霉菌等真菌加高濃度食鹽金黃色葡萄球菌不加含碳有機物的碳源的培養(yǎng)基分離出自養(yǎng)型微生物不加氮源的培養(yǎng)基分離出固氮菌二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)1.選擇培養(yǎng)基(5)篩選能分解尿素的細菌:尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，但植物并不能利用尿素。土壤中部分細菌能利用尿素分解氨，氨被植物利用CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶①實驗原理:

能合成

的細菌才能分解尿素

配置以

為唯一氮源的培養(yǎng)基，能夠生長的細菌就是能分解尿素的細菌脲酶尿素土壤中尿素分解菌之所以能將尿素分解，是因為它們能合成脲酶二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)1.選擇培養(yǎng)基(5)篩選能分解尿素的細菌:②數(shù)量統(tǒng)計:直接計數(shù)法：間接計數(shù)法：稀釋涂布平板法③實驗流程:土壤取樣配置土壤溶液和制備培養(yǎng)基系列稀釋涂布平板與培養(yǎng)菌落計數(shù)顯微鏡直接計數(shù)法二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)2.微生物的選擇培養(yǎng)（1）稀釋涂布平板法

將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。

基本操作:①梯度稀釋；②涂布平板①梯度稀釋1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL無菌水90mL無菌水10g土壤取樣二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)2.微生物的選擇培養(yǎng)（1）稀釋涂布平板法②涂布平板a.取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。c.將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。d.用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。b.將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。注意：多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)2.微生物的選擇培養(yǎng)（1）稀釋涂布平板法培養(yǎng)并觀察培養(yǎng)基菌落:

待涂布的菌液被

后，將平板

，放入

中培養(yǎng)

d，在涂布有

菌液的平板上就可以觀察到分離的

。培養(yǎng)基吸收倒置恒溫培養(yǎng)箱合適濃度單菌落1~2二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)3.微生物的數(shù)量測定（1）稀釋涂布平板法——間接計數(shù)法因為當兩個或多個細胞連在一起時，繁殖后形成的還是一個菌落。計數(shù)原則：選擇菌落數(shù)為30~300的平板計數(shù)。同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低統(tǒng)計的結果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)。PS:如果不同平板間差異不大，則可以用其平均值作為估算的最終結果。如果3個平板菌落數(shù)差異太大，如230、34、240，則應重新實驗二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)3.微生物的數(shù)量測定（1）稀釋涂布平板法——間接計數(shù)法例：某同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每g樣品中的菌落數(shù)是(涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.

2.34×108B.

2.34×109C.

234D.

23.4B二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)3.微生物的數(shù)量測定（2）顯微鏡直接計數(shù)法——直接計數(shù)法①原理:利用細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板在顯微鏡下觀察、計數(shù)，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量。②缺點:統(tǒng)計的結果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和，不能區(qū)分死菌與活菌。細菌計數(shù)板計數(shù)法：較小的細胞血細胞計數(shù)板計數(shù)法：較大的細胞顯微鏡直接計數(shù)二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)拓展：平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較主要方法稀釋涂布平板法平板劃線法主要步驟接種工具菌體獲取能否用于計數(shù)共同點系列梯度稀釋操作和涂布平板操作接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線涂布器接種環(huán)從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體在具有顯著的菌落特征的區(qū)域挑取菌體可以計數(shù)，但是操作復雜，需涂布多個平板不能計數(shù)使培養(yǎng)基上形成由單個細菌細胞繁殖而來的子細胞群體——菌落二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)拓展：剛剛的實驗只是初步篩選了能分解尿素的細菌，如何對分離的菌種進行進一步的鑒定？鑒別培養(yǎng)基（2）實驗思路：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。（1）實驗原理：分解尿素的細菌合成的脲酶可以將尿素分解成氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細菌，若指示劑變紅，可確定該細菌能夠分解尿素可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強。液體培養(yǎng)基：可以直接看液體的變色情況。固體培養(yǎng)基：二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品(不影響微生物正常生長)，使微生物的某種代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中的特定指示劑或化學藥品發(fā)生反應。從而達到鑒定的作用。伊紅——亞甲藍培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌（大腸桿菌菌落呈深紫色并有金屬光澤）剛果紅培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)鑒別培養(yǎng)基①纖維素分解菌的篩選與鑒定方法:②纖維素分解菌的篩選方法的原理:【拓展】纖維素分解菌的篩選（通過顏色反應直接對微生物進行篩選與鑒定）剛果紅染色法我們就可以通過觀察是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。二、微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)鑒別培養(yǎng)基【拓展】纖維素分解菌的篩選③纖維素分解菌的實驗過程:土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋涂布平板挑選產(chǎn)生透明圈的菌落富含纖維素的環(huán)境用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，以增加纖維素分解菌的濃度，以纖維素為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基）制備系列稀釋液將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（含剛果紅的鑒別培養(yǎng)基）（固體培養(yǎng)基）牛刀小試1.【2024重慶高考】養(yǎng)殖場糞便是農(nóng)家肥的重要來源，其中某些微生物可使氨氮化合物轉(zhuǎn)化為尿素進而產(chǎn)生NH3，影響畜禽健康。為篩選糞便中能利用氨氮化合物且減少NH3產(chǎn)生的微生物。興趣小組按圖進行實驗獲得目的菌株，正確的是（）A．①通常在等比稀釋后用平板劃線法獲取單個菌落B．②挑取在2種培養(yǎng)基上均能生長的用于后續(xù)的實驗C．③可通過添加脲酶并檢測活性，篩選得到甲、乙D．糞便中添加菌株甲比乙更有利于NH3的減少CA、平板劃線法無需稀釋，A錯誤；B、由圖可知，②篩選不能在尿素唯一氮源培養(yǎng)基上生長，而能在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌株用于后續(xù)的實驗，B錯誤；C、所篩選出的菌株之所以不能利用尿素，可能是由于不產(chǎn)生脲酶或分泌脲酶抑制劑，所以③可通過添加脲酶并檢測活性，篩選得到甲、乙，C正確；D、由圖可知，甲不產(chǎn)生脲酶而乙可以產(chǎn)生脲酶，且乙同時分泌脲酶抑制劑，糞便中可能還含有其他能產(chǎn)生脲酶的菌株使甲能夠產(chǎn)生NH3，所以糞便中添加菌株乙比甲更有利于NH3的減少，D錯誤。牛刀小試2.【2024浙江高考】脲酶催化尿素水解，產(chǎn)生的氨可作為細菌的氮源。脲酶被去除鎳后失去活性。下列敘述錯誤的是（）A．鎳是組成脲酶的重要元素B．鎳能提高尿素水解