免疫組化常用抗體及應(yīng)用手冊一、免疫組化與抗體應(yīng)用概述免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry,IHC）通過抗原-抗體特異性結(jié)合原理，定位檢測組織/細胞中目標蛋白的表達，是病理診斷、腫瘤分型及科研探索的核心技術(shù)之一。抗體的特異性、效價及適用場景直接決定染色結(jié)果的準確性與可重復(fù)性。本手冊聚焦臨床與科研中高頻使用的抗體，從靶點功能、適用樣本、典型場景及技術(shù)要點展開說明，為從業(yè)者提供實用參考。二、腫瘤診斷核心抗體及應(yīng)用（一）上皮性腫瘤相關(guān)抗體上皮組織來源的腫瘤（如癌）需通過上皮標志物明確起源，同時結(jié)合增殖、預(yù)后標志物判斷生物學(xué)行為。1.細胞角蛋白（Cytokeratin,CK）家族靶點與亞型：CK是上皮細胞中間絲蛋白，包含CK5/6、CK7、CK8/18、CK19、CK20等亞型，不同亞型對應(yīng)不同上皮組織特性。適用樣本：石蠟包埋組織、冰凍切片（新鮮組織需優(yōu)化固定條件）。典型應(yīng)用：*CK7+CK20組合*：鑒別消化系統(tǒng)腫瘤（如結(jié)直腸癌CK20+、CK7-；胃癌多為CK7+、CK20±）；*CK5/6+P63*：輔助診斷鱗狀細胞癌（鱗癌常雙陽，腺癌多陰性）。注意要點：高溫修復(fù)時需選擇合適的抗原修復(fù)液（如pH9.0EDTA或檸檬酸緩沖液）；正常上皮（如皮膚、乳腺導(dǎo)管）也會表達CK，需結(jié)合組織形態(tài)學(xué)判斷。2.人表皮生長因子受體2（HER2）靶點功能：HER2過表達與乳腺癌、胃癌等腫瘤的侵襲性及靶向治療敏感性相關(guān)。適用樣本：乳腺癌、胃癌等實體瘤的石蠟切片（需嚴格質(zhì)控，避免脫片）。典型應(yīng)用：乳腺癌HER2免疫組化（IHC）初篩，陽性（3+）提示可直接使用曲妥珠單抗；胃癌HER2檢測需結(jié)合FISH確認基因擴增（IHC2+時）。注意要點：組織固定需用中性福爾馬林，固定時間4-48小時；染色時設(shè)置陽性對照（已知HER2+組織）與陰性對照。（二）間葉性腫瘤相關(guān)抗體間葉腫瘤（如肉瘤）需通過間葉標志物與上皮標志物的“反向表達”（上皮-間葉轉(zhuǎn)化相關(guān)研究除外）明確診斷。1.波形蛋白（Vimentin）靶點功能：間葉細胞特異性中間絲蛋白，是間葉腫瘤的“泛標志物”。適用樣本：肉瘤、黑色素瘤、部分癌（如腎透明細胞癌）的石蠟/冰凍切片。典型應(yīng)用：鑒別癌（CK+、Vimentin-）與肉瘤（Vimentin+、CK-）；輔助診斷血管肉瘤、平滑肌肉瘤等。注意要點：部分正常組織（如血管內(nèi)皮、淋巴細胞）也會弱表達，需結(jié)合其他標志物；修復(fù)液選擇pH9.0EDTA可提升染色強度。2.CD34靶點功能：造血干細胞及血管內(nèi)皮細胞標志物，常用于血管源性腫瘤診斷。適用樣本：血管肉瘤、胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）、孤立性纖維性腫瘤的石蠟切片。典型應(yīng)用：血管肉瘤（CD34+）與卡波西肉瘤（HHV8+、CD34-）的鑒別；GIST中CD34常與DOG1、c-Kit（CD117）聯(lián)合使用。注意要點：骨髓活檢需注意紅細胞背景干擾，可延長洗滌時間；部分間質(zhì)瘤CD34表達缺失，需結(jié)合其他標志物。（三）淋巴造血系統(tǒng)腫瘤抗體淋巴造血腫瘤需通過CD系列抗體明確細胞來源、分化階段及克隆性。1.CD3與CD20靶點功能：CD3標記T淋巴細胞，CD20標記B淋巴細胞，是淋巴瘤分型的基礎(chǔ)標志物。適用樣本：淋巴結(jié)、骨髓、結(jié)外淋巴組織的石蠟/冰凍切片（冰凍切片需新鮮固定）。典型應(yīng)用：鑒別T細胞淋巴瘤（CD3+）與B細胞淋巴瘤（CD20+）；結(jié)合CD4/CD8判斷T細胞亞群（如CD4+輔助T細胞、CD8+細胞毒性T細胞）。注意要點：石蠟切片需高溫抗原修復(fù)（pH6.0檸檬酸緩沖液效果更佳）；正常淋巴組織中T、B細胞呈“鑲嵌式”分布，需結(jié)合形態(tài)學(xué)判斷腫瘤性增生。2.Ki-67靶點功能：增殖細胞核抗原，反映細胞增殖活性，與腫瘤惡性程度、預(yù)后相關(guān)。適用樣本：各類腫瘤的石蠟切片（需避免擠壓、壞死組織）。典型應(yīng)用：乳腺癌Ki-67指數(shù)（陽性細胞比例）指導(dǎo)內(nèi)分泌治療（低Ki-67更敏感）；淋巴瘤Ki-67輔助判斷侵襲性（如套細胞淋巴瘤Ki-67＞30%提示預(yù)后差）。注意要點：計數(shù)時需選擇腫瘤細胞密集區(qū)（“熱點區(qū)”），避免間質(zhì)細胞干擾；不同克隆號抗體（如MIB-1）的染色閾值略有差異，需統(tǒng)一判讀標準。三、病理分型與鑒別診斷抗體（一）神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤抗體神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NETs）需通過特異性標志物明確分化程度與起源。1.突觸素（Synaptophysin,Syn）與嗜鉻粒蛋白A（CgA）靶點功能：Syn標記突觸小泡，CgA標記神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，二者是NETs的核心標志物。適用樣本：肺、胃腸道、胰腺等部位的NETs石蠟切片。典型應(yīng)用：鑒別NETs（Syn+、CgA+）與腺癌/鱗癌（Syn-、CgA-）；結(jié)合Ki-67區(qū)分G1（低增殖）、G2（中增殖）、G3（高增殖，如神經(jīng)內(nèi)分泌癌）。注意要點：部分類癌（高分化NETs）CgA表達較弱，需結(jié)合Syn；修復(fù)液選擇pH9.0EDTA可增強CgA染色強度。（二）黑色素瘤與癌的鑒別抗體黑色素瘤易與低分化癌混淆，需通過黑色素細胞標志物明確。1.S-100蛋白與HMB45靶點功能：S-100是泛黑色素細胞標志物，HMB45特異性標記黑色素小體相關(guān)蛋白。適用樣本：皮膚、黏膜、眼內(nèi)等部位的黑色素瘤石蠟切片。典型應(yīng)用：鑒別黑色素瘤（S-100+、HMB45+）與癌（CK+、S-100-）；輔助診斷促結(jié)締組織增生性黑色素瘤（S-100+、HMB45-）。注意要點：部分朗格漢斯細胞（皮膚）、施萬細胞（神經(jīng)）也會表達S-100，需結(jié)合HMB45；冰凍切片染色時需縮短固定時間，避免抗原丟失。四、科研探索類熱門抗體及應(yīng)用（一）腫瘤微環(huán)境研究抗體腫瘤微環(huán)境（TME）包含免疫細胞、基質(zhì)細胞及細胞因子，是科研熱點方向。1.PD-L1（CD274）靶點功能：程序性死亡配體1，通過與PD-1結(jié)合抑制T細胞活性，是免疫治療（如抗PD-1/PD-L1單抗）的核心靶點。適用樣本：腫瘤組織石蠟切片（需使用經(jīng)驗證的克隆號，如22C3、SP263）。典型應(yīng)用：預(yù)測免疫治療響應(yīng)（PD-L1高表達提示可能獲益）；研究腫瘤免疫逃逸機制（結(jié)合CD8+T細胞、FoxP3+Treg細胞分析）。注意要點：不同克隆號的染色閾值不同（如22C3的陽性定義為腫瘤細胞≥1%）；需設(shè)置陽性對照（如扁桃體組織，生發(fā)中心周圍細胞PD-L1+）。2.CD8與FoxP3靶點功能：CD8標記細胞毒性T細胞，F(xiàn)oxP3標記調(diào)節(jié)性T細胞（Treg），反映TME的免疫活性與抑制狀態(tài)。適用樣本：腫瘤、炎癥組織的石蠟切片。典型應(yīng)用：分析“熱腫瘤”（CD8+T細胞浸潤多）與“冷腫瘤”（CD8+T細胞浸潤少）的免疫表型；研究Treg細胞在腫瘤免疫抑制中的作用（FoxP3+細胞比例與預(yù)后的相關(guān)性）。注意要點：石蠟切片需高溫修復(fù)（pH6.0檸檬酸緩沖液）；計數(shù)時需區(qū)分腫瘤內(nèi)與間質(zhì)內(nèi)的免疫細胞，避免假陽性。（二）細胞信號通路研究抗體信號通路異常是腫瘤發(fā)生的核心機制，相關(guān)抗體常用于機制研究。1.β-catenin（β-連環(huán)蛋白）靶點功能：Wnt通路核心分子，胞核/胞質(zhì)異常表達提示W(wǎng)nt通路激活，與結(jié)直腸癌、肝癌等相關(guān)。適用樣本：腫瘤、正常組織的石蠟切片。典型應(yīng)用：結(jié)直腸癌中β-catenin胞核陽性提示APC/CTNNB1基因突變；研究腫瘤細胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化（EMT）過程中β-catenin的核轉(zhuǎn)位。注意要點：正常上皮細胞β-catenin主要表達于胞膜，核陽性需結(jié)合形態(tài)學(xué)判斷；修復(fù)液選擇pH9.0EDTA可增強核染色信號。五、抗體應(yīng)用的共性技術(shù)要點（一）樣本處理與固定組織固定需及時（離體后1小時內(nèi)），使用中性福爾馬林（4%甲醛），固定時間4-24小時（避免過長導(dǎo)致抗原封閉）；冰凍切片需用OCT包埋，-80℃保存，染色前用丙酮/甲醇固定10分鐘。（二）抗原修復(fù)高溫修復(fù)（微波爐或壓力鍋）是主流方法，根據(jù)抗體選擇修復(fù)液：檸檬酸緩沖液（pH6.0）：適用于CK、CD系列、Ki-67；EDTA緩沖液（pH9.0）：適用于CgA、β-catenin、HER2；修復(fù)時間：石蠟切片通常10-15分鐘（壓力鍋需控制壓力與時間）。（三）抗體孵育與洗滌一抗孵育：4℃過夜（更優(yōu)）或室溫1-2小時，濃度按說明書調(diào)整（通常1:50-1:200）；二抗孵育：室溫30分鐘，選擇與一抗種屬匹配的二抗（如兔抗一抗用goatanti-rabbit）；洗滌：用PBS-T（含0.1%Tween-20）洗滌3次，每次5分鐘，避免非特異性結(jié)合。（四）結(jié)果判讀與質(zhì)控陽性對照：選擇已知陽性的組織（如乳腺癌HER2陽性對照、扁桃體CD3/CD20陽性對照）；陰性對照：用PBS代替一抗，或使用同型IgG對照；判讀標準：根據(jù)抗體類型（核、胞質(zhì)、胞膜）結(jié)合臨床/科研需求制定，如Ki-67計數(shù)熱點區(qū)、HER2按ASCO/CAP標準判讀。六、常見問題及解決方案（一）染色背景高原因：非特異性結(jié)合、封閉不足、抗體濃度過高；解決：延長洗滌時間（每次10分鐘，洗3次）、增加封閉時間（5%BSA封閉30分鐘）、降低一抗?jié)舛取＃ǘ╆栃孕盘柸踉颍嚎乖迯?fù)不充分、抗體效價低、孵育時間不足；解決：更換修復(fù)液（如從檸檬酸換為EDTA）、延長修復(fù)時