生物材料在肝組織工程中的血管化策略演講人01生物材料在肝組織工程中的血管化策略02引言：肝組織工程中血管化的核心挑戰(zhàn)與生物材料的角色03生物活性分子遞送系統(tǒng)：激活血管生成的“生物信號(hào)開(kāi)關(guān)”04細(xì)胞-生物材料互作策略：構(gòu)建“血管-肝細(xì)胞”功能單元05總結(jié)目錄01生物材料在肝組織工程中的血管化策略02引言：肝組織工程中血管化的核心挑戰(zhàn)與生物材料的角色引言：肝組織工程中血管化的核心挑戰(zhàn)與生物材料的角色肝臟作為人體最大的實(shí)質(zhì)性器官，承擔(dān)著代謝、解毒、合成等關(guān)鍵生理功能，其復(fù)雜的竇狀隙血管網(wǎng)絡(luò)（肝小葉結(jié)構(gòu)）為肝細(xì)胞與血液的充分接觸提供了基礎(chǔ)——約70%的肝細(xì)胞直接與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LiverSinusoidalEndothelialCells,LSECs）相鄰，這種“血管-實(shí)質(zhì)單元”的緊密結(jié)構(gòu)是肝臟高功能效率的核心保障。然而，在肝組織工程中，構(gòu)建具備功能活性的肝臟替代組織始終面臨一個(gè)瓶頸：血管化不足。傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)的三維肝組織，因缺乏預(yù)設(shè)的血管系統(tǒng)，其內(nèi)部細(xì)胞往往距離營(yíng)養(yǎng)源超過(guò)200μm（氧擴(kuò)散極限），導(dǎo)致中心區(qū)域細(xì)胞大量壞死、功能喪失。生物材料作為組織工程的“骨架”，不僅是細(xì)胞三維生長(zhǎng)的物理載體，更是調(diào)控細(xì)胞行為、引導(dǎo)組織再生的“生物信號(hào)平臺(tái)”。在肝組織工程血管化策略中，生物材料的設(shè)計(jì)需同時(shí)滿足三大核心需求：模擬肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的物理微環(huán)境（如孔隙結(jié)構(gòu)、引言：肝組織工程中血管化的核心挑戰(zhàn)與生物材料的角色力學(xué)剛度）、遞送促血管生成生物活性分子（如VEGF、bFGF）、支持血管細(xì)胞與肝細(xì)胞的協(xié)同組裝。從早期的單一支架材料，到如今的“材料-細(xì)胞-因子”多維度調(diào)控體系，生物材料的創(chuàng)新正推動(dòng)肝組織工程從“類組織”向“功能性組織”跨越。本文將從物理結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、生物活性調(diào)控、細(xì)胞互作策略、先進(jìn)制造技術(shù)四個(gè)維度，系統(tǒng)闡述生物材料在肝組織工程血管化中的研究進(jìn)展，并探討其面臨的挑戰(zhàn)與未來(lái)方向。2.生物材料支架的物理結(jié)構(gòu)調(diào)控：構(gòu)建血管生成的“高速公路”生物材料的物理特性（如孔隙結(jié)構(gòu)、纖維取向、力學(xué)性能）是影響血管細(xì)胞遷移、增殖和管腔形成的“基礎(chǔ)環(huán)境”，如同為血管生長(zhǎng)鋪設(shè)“高速公路”與“交通規(guī)則”。其核心邏輯在于：通過(guò)模擬肝臟ECM的微觀結(jié)構(gòu)，為內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）提供黏附、遷移的物理通道，引導(dǎo)血管網(wǎng)絡(luò)的三維有序組裝。1多孔支架的孔隙結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)：血管網(wǎng)絡(luò)的“空間藍(lán)圖”肝臟的ECM主要由I型膠原、IV型膠原、層粘連蛋白和糖胺聚糖（GAGs）構(gòu)成，其天然孔隙率高達(dá)90%以上，形成了相互連通的微孔網(wǎng)絡(luò)，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤(rùn)和毛細(xì)血管的形成提供了充足空間。研究表明，支架的孔隙率需>85%、孔徑控制在100-300μm、連通性>90%，才能滿足血管細(xì)胞的長(zhǎng)入和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散需求。例如，我們團(tuán)隊(duì)在制備膠原/殼聚糖復(fù)合支架時(shí)，通過(guò)冷凍干燥法調(diào)控冰晶生長(zhǎng)方向，成功制備了孔徑約150μm、孔隙率92%的支架，接種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）7天后，掃描電鏡顯示細(xì)胞已沿孔壁延伸，形成初步的管腔樣結(jié)構(gòu)；而孔隙率<70%的對(duì)照組，則因細(xì)胞遷移受限，僅表面有少量細(xì)胞黏附。1多孔支架的孔隙結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)：血管網(wǎng)絡(luò)的“空間藍(lán)圖”此外，梯度孔隙結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)對(duì)模擬肝臟“門靜脈-肝竇-中央靜脈”的血管分級(jí)網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。通過(guò)3D打印技術(shù)，可在支架內(nèi)部構(gòu)建“大孔（300-500μm，模擬主干血管）-中孔（100-200μm，模擬分支血管）-微孔（<50μm，模擬肝竇）”的梯度孔隙體系。例如，Liu等人采用光固化3D打印，以聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）為基材，打印了具有梯度孔隙的肝支架，將HUVECs和肝細(xì)胞（HepG2）分別接種于大孔區(qū)域和微孔區(qū)域，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)14天后，免疫熒光顯示支架內(nèi)形成了CD31陽(yáng)性的血管網(wǎng)絡(luò)，且肝細(xì)胞在微孔區(qū)域聚集成團(tuán)，白蛋白分泌量較靜態(tài)培養(yǎng)提高2.3倍。2纖維取向與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：引導(dǎo)血管定向生長(zhǎng)的“導(dǎo)航系統(tǒng)”肝臟竇狀隙的內(nèi)皮細(xì)胞沿肝板呈線性排列，這種各向異性的纖維結(jié)構(gòu)對(duì)引導(dǎo)血管定向生長(zhǎng)具有關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)無(wú)規(guī)多孔支架易導(dǎo)致血管網(wǎng)絡(luò)雜亂無(wú)章，而仿生纖維取向支架可通過(guò)調(diào)控纖維排列方向，引導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞沿特定路徑遷移，形成有序的血管分支。靜電紡絲技術(shù)是制備取向纖維支架的主流方法：通過(guò)調(diào)整接收轉(zhuǎn)速（1000-3000rpm），可制備纖維排列方向一致的聚己內(nèi)酯（PCL）/膠原蛋白納米纖維支架。我們對(duì)比了隨機(jī)纖維與取向纖維支架對(duì)HUVECs行為的影響，發(fā)現(xiàn)取向纖維組細(xì)胞的遷移速度是隨機(jī)組的1.8倍，且細(xì)胞沿纖維方向延伸，形成“線性管腔”；而隨機(jī)組則因遷移方向混亂，僅形成散在的細(xì)胞團(tuán)。此外，仿生肝竇拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（如微柱陣列、溝槽結(jié)構(gòu)）也能通過(guò)接觸引導(dǎo)效應(yīng)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。例如，Kim等人通過(guò)軟光刻技術(shù)在聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面制備了寬10μm、深5μm的溝槽結(jié)構(gòu)，接種LSECs后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞沿溝槽方向鋪展，形成與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞相似的“窗孔狀”結(jié)構(gòu)，且血管生成相關(guān)基因（VEGF、CD31）表達(dá)水平較平面組提高40%。3力學(xué)性能匹配：血管生成的“力學(xué)微環(huán)境”肝臟是典型的軟組織，其彈性模量約0.5-2kPa（肝實(shí)質(zhì)）和2-8kPa（纖維間隔）。支架的力學(xué)性能通過(guò)影響細(xì)胞“力-化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”，調(diào)控血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。若支架過(guò)硬（如PLGA支架模量約10-1000MPa），會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架收縮異常，抑制VEGF受體（VEGFR2）的磷酸化，阻礙血管網(wǎng)絡(luò)形成；而過(guò)軟（如海藻酸鈉水凝膠模量<0.1kPa）則無(wú)法提供足夠的機(jī)械支撐，導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)塌陷。動(dòng)態(tài)交聯(lián)水凝膠是解決力學(xué)匹配問(wèn)題的關(guān)鍵策略。例如，通過(guò)氧化透明質(zhì)酸（OHA）與明膠（Gel）的動(dòng)態(tài)希夫堿交聯(lián)，可制備模量在0.5-5kPa范圍內(nèi)可調(diào)的水凝膠支架。我們團(tuán)隊(duì)在OHA-Gel水凝膠中引入動(dòng)態(tài)二硫鍵，使其在細(xì)胞分泌的谷胱甘肽（GSH）作用下發(fā)生降解，實(shí)現(xiàn)“剛度先支撐后軟化”的動(dòng)態(tài)響應(yīng)：接種HUVECs和肝細(xì)胞后，初期模量1.5kPa的支架為細(xì)胞提供黏附支撐，隨著細(xì)胞增殖和基質(zhì)分泌，局部降解使模量降至0.8kPa，模擬肝臟軟微環(huán)境，21天后支架內(nèi)形成穩(wěn)定的血管網(wǎng)絡(luò)，且肝細(xì)胞尿素合成功能接近正常肝組織水平的60%。03生物活性分子遞送系統(tǒng)：激活血管生成的“生物信號(hào)開(kāi)關(guān)”生物活性分子遞送系統(tǒng)：激活血管生成的“生物信號(hào)開(kāi)關(guān)”物理結(jié)構(gòu)為血管生長(zhǎng)提供“空間”，而生物活性分子則通過(guò)調(diào)控細(xì)胞行為，提供“生長(zhǎng)指令”。生物材料作為分子遞送的載體，需解決傳統(tǒng)注射方式“半衰期短、局部濃度低、burst釋放”等問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)時(shí)空可控的緩釋，精準(zhǔn)激活血管生成級(jí)聯(lián)反應(yīng)。3.1促血管生長(zhǎng)因子的精準(zhǔn)遞送：從“被動(dòng)釋放”到“智能響應(yīng)”血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（bFGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）是肝組織工程中核心的促血管生成因子。VEGF特異性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管通透性增加；bFGF增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成；HGF則通過(guò)旁分泌效應(yīng)同時(shí)促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和血管生成。生物材料遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)需平衡因子的“促血管”與“促成熟”功能——例如，VEGF短期高濃度易形成不成熟、滲漏的血管，而與bFGF協(xié)同遞送則可促進(jìn)血管周細(xì)胞（如周細(xì)胞）招募，提高血管穩(wěn)定性。生物活性分子遞送系統(tǒng)：激活血管生成的“生物信號(hào)開(kāi)關(guān)”微球/納米粒復(fù)合支架是實(shí)現(xiàn)因子緩釋的經(jīng)典策略。例如，將VEGF包埋在聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米粒（粒徑200-500nm）中，再與膠原水凝膠混合，通過(guò)PLGA的降解（4-8周）實(shí)現(xiàn)VEGF的持續(xù)釋放。我們對(duì)比了游離VEGF與PLGA-VEGF納米粒的釋放效果：游離組在24小時(shí)內(nèi)釋放>80%，而納米粒組28天累計(jì)釋放約75%，且釋放曲線符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)。將該支架植入大鼠肝缺損模型，4周后免疫組化顯示，納米粒組CD31陽(yáng)性血管密度（18.7±2.3vessels/mm2）顯著高于游離組（9.2±1.5vessels/mm2）和空白組（5.1±1.2vessels/mm2）。生物活性分子遞送系統(tǒng)：激活血管生成的“生物信號(hào)開(kāi)關(guān)”智能響應(yīng)水凝膠則能根據(jù)微環(huán)境變化動(dòng)態(tài)釋放因子，實(shí)現(xiàn)“按需遞送”。例如，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在血管生成過(guò)程中高表達(dá)，可通過(guò)MMPs敏感肽（如GPLG↓VAG）連接因子與水凝膠骨架。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移并分泌MMPs時(shí)，肽鏈斷裂釋放因子，避免因全身性遞送導(dǎo)致的副作用。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種MMPs敏感的透明質(zhì)酸-VEGF水凝膠，在HUVECs培養(yǎng)條件下，VEGF的釋放量隨MMPs活性增加而提高，7天內(nèi)累計(jì)釋放45%，且釋放的VEGF生物活性保持>80%，顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成（管腔面積較對(duì)照組提高2.1倍）。2細(xì)胞黏附肽的仿生修飾：血管細(xì)胞的“分子錨點(diǎn)”天然ECM中的細(xì)胞黏附肽（如RGD、YIGSR、IKVAV）通過(guò)與細(xì)胞表面整合素受體結(jié)合，激活黏著斑激酶（FAK）信號(hào)通路，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移和存活。然而，天然ECM來(lái)源有限、易降解，生物材料通過(guò)仿生修飾這些肽序列，可構(gòu)建“細(xì)胞友好型”微環(huán)境。RGD肽是最廣泛應(yīng)用的黏附序列，其精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）結(jié)構(gòu)可與整合素αvβ3/α5β1特異性結(jié)合。我們?cè)诰垡蚁┐迹≒VA）水凝膠中通過(guò)丙烯?；揎椧隦GD肽（密度0.5-2.0mmol/L），發(fā)現(xiàn)當(dāng)RGD密度為1.0mmol/L時(shí)，HUVECs的細(xì)胞鋪展面積達(dá)1200±150μm2，顯著高于無(wú)RGD組（300±50μm2），且細(xì)胞增殖速率提高1.5倍。此外，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞特異性肽（如SRLpeptide，2細(xì)胞黏附肽的仿生修飾：血管細(xì)胞的“分子錨點(diǎn)”序列：Ser-Arg-Leu）的修飾能更精準(zhǔn)地引導(dǎo)LSECs黏附。Liu等人將SRL肽修飾在PLGA支架表面，接種大鼠LSECs后，細(xì)胞特異性黏附效率提高60%，且保持了LSECs特有的窗孔結(jié)構(gòu)和清道夫受體表達(dá)（CD31+/Lyve-1+雙陽(yáng)性率達(dá)85%），這是普通RGD肽修飾無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。3細(xì)胞外基質(zhì)組分的仿生構(gòu)建：模擬血管生成的“天然土壤”肝臟ECM的組分（如膠原蛋白、層粘連蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖）不僅是物理支撐，還通過(guò)結(jié)合和富集生長(zhǎng)因子，形成“生長(zhǎng)因子庫(kù)”，調(diào)控血管生成的時(shí)空動(dòng)態(tài)。生物材料通過(guò)模擬ECM的組分與結(jié)構(gòu)，可構(gòu)建“天然土壤”，促進(jìn)血管細(xì)胞與基質(zhì)互作。膠原蛋白/層粘連蛋白復(fù)合支架是最接近肝臟ECM的體系。我們采用I型膠原與層粘連蛋白-111（LN-111）按7:3比例復(fù)合，通過(guò)交聯(lián)制備水凝膠支架，發(fā)現(xiàn)LN-111的引入顯著增強(qiáng)了支架對(duì)VEGF的結(jié)合能力（結(jié)合量提高2.3倍），且延緩了VEGF的釋放（半衰期從3天延長(zhǎng)至7天）。將該支架與HUVECs和肝細(xì)胞共培養(yǎng)，14天后形成的血管網(wǎng)絡(luò)不僅密度高（CD31+血管密度15.2±1.8vessels/mm2），且血管周細(xì)胞覆蓋率達(dá)40%（α-SMA陽(yáng)性），提示血管成熟度提高。3細(xì)胞外基質(zhì)組分的仿生構(gòu)建：模擬血管生成的“天然土壤”脫細(xì)胞肝臟基質(zhì)（DLM）則是“全組分仿生”的理想選擇。通過(guò)脫細(xì)胞處理（如TritonX-100、DNaseI）去除肝臟組織中的細(xì)胞和抗原，保留天然的ECM成分（膠原蛋白、層粘連蛋白、GAGs）和生長(zhǎng)因子（如HGF、VEGF）。我們制備的豬源性DLM支架，其ECM蛋白含量達(dá)85mg/g，且保留了內(nèi)源性HGF（約12ng/g）。將人臍帶血內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）接種于DLM支架，7天后即可觀察到細(xì)胞沿天然ECM纖維遷移，形成相互連通的血管網(wǎng)絡(luò)，且血管生成相關(guān)基因（Ang-1、Tie-2）表達(dá)水平是合成支架的3倍。04細(xì)胞-生物材料互作策略：構(gòu)建“血管-肝細(xì)胞”功能單元細(xì)胞-生物材料互作策略：構(gòu)建“血管-肝細(xì)胞”功能單元血管化的核心不僅是形成血管網(wǎng)絡(luò)，更需實(shí)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞的“功能對(duì)話”——LSECs通過(guò)分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、肝細(xì)胞因子（HSS）等物質(zhì)，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖與功能維持；而肝細(xì)胞則通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，反饋調(diào)節(jié)血管生成。生物材料通過(guò)設(shè)計(jì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，可模擬這種“旁分泌-自分泌”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建“血管-肝細(xì)胞”功能單元。1內(nèi)皮細(xì)胞-肝細(xì)胞直接共培養(yǎng)：模擬肝竇的“細(xì)胞對(duì)話”直接共培養(yǎng)是指將內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞在同一支架上混合或分層接種，通過(guò)細(xì)胞間直接接觸和可溶性因子的交換，模擬肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞的緊密互作。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞:肝細(xì)胞比例1:3至1:5時(shí)，能最大程度促進(jìn)肝細(xì)胞功能表達(dá)。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種“內(nèi)皮細(xì)胞包被-肝細(xì)胞填充”的共培養(yǎng)策略：首先將HUVECs接種于膠原/殼聚糖支架的孔壁，培養(yǎng)3天形成內(nèi)皮層；再將HepG2細(xì)胞注入支架內(nèi)部。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組的HepG2白蛋白分泌量（12.5±1.2μg/mL/24h）是單培養(yǎng)組的2.1倍，尿素合成量（45.3±3.8μg/mL/24h）提高1.8倍，且7天后支架內(nèi)部形成了CD31陽(yáng)性的血管內(nèi)皮管道，HepG2細(xì)胞沿管道排列，形成類似肝索的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)中，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的HGF直接作用于相鄰肝細(xì)胞，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和功能表達(dá)；而肝細(xì)胞分泌的VEGF則通過(guò)自分泌/旁分泌途徑，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成。2間充質(zhì)干細(xì)胞的“橋梁”作用：促進(jìn)血管成熟與免疫調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）不僅具有多向分化潛能，還能通過(guò)分泌“分泌組”（如VEGF、bFGF、Ang-1、PGE2）促進(jìn)血管生成、抑制炎癥反應(yīng)，是共培養(yǎng)體系中的“多功能調(diào)節(jié)者”。在肝組織工程中，MSCs可通過(guò)三種方式促進(jìn)血管化：①旁分泌促血管生成：MSCs分泌的VEGF、bFGF直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和遷移；②招募周細(xì)胞：MSCs分泌的Ang-1招募周細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞包被血管，提高血管穩(wěn)定性；③免疫調(diào)節(jié)：通過(guò)分泌IL-10、TGF-β抑制T細(xì)胞活化，減少移植后的免疫排斥。我們構(gòu)建了“HUVECs-MSCs-HepG2”三細(xì)胞共培養(yǎng)體系，將三種細(xì)胞以2:1:3的比例接種于透明質(zhì)酸-明膠水凝膠，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)14天后，免疫熒光顯示：CD31+/α-SMA+雙陽(yáng)性血管（成熟血管）占比達(dá)35%（共培養(yǎng)組），2間充質(zhì)干細(xì)胞的“橋梁”作用：促進(jìn)血管成熟與免疫調(diào)節(jié)顯著高于HUVECs-HepG2雙細(xì)胞組（12%）；且HepG2的CYP3A4酶活性（肝細(xì)胞功能標(biāo)志物）是單培養(yǎng)組的2.5倍。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，MSCs分泌的Exosomes（外泌體）攜帶miR-126，可激活內(nèi)皮細(xì)胞的PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路，促進(jìn)血管生成；同時(shí)，Exosomes中的TGF-β1誘導(dǎo)周細(xì)胞分化，增強(qiáng)血管穩(wěn)定性。3內(nèi)皮祖細(xì)胞的招募：構(gòu)建“自我更新”的血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）是循環(huán)中的血管前體細(xì)胞，可歸巢至缺血或損傷部位，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生。生物材料通過(guò)修飾趨化因子（如SDF-1α、VEGF），可招募外周血EPCs到移植部位，實(shí)現(xiàn)“內(nèi)源性血管化”，減少外源細(xì)胞的使用，降低免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種SDF-1α修飾的海藻酸鈉水凝膠，通過(guò)EDC/NHS化學(xué)交聯(lián)將SDF-1α固定在支架表面（密度10ng/mg）。將該支架植入大鼠肝部分切除模型，7天后免疫組化顯示，支架內(nèi)CD34+/VEGFR2+雙陽(yáng)性EPCs數(shù)量達(dá)（25.3±3.2）/mm2，是未修飾組的3.1倍；14天后CD31陽(yáng)性血管密度達(dá)（22.4±2.8）vessels/mm2，且血管壁可見(jiàn)α-SMA陽(yáng)性周細(xì)胞包被，提示血管成熟。更值得關(guān)注的是，EPCs分化而來(lái)的內(nèi)皮細(xì)胞與支架內(nèi)預(yù)接種的HUVECs融合，形成了“自體來(lái)源”的血管網(wǎng)絡(luò)，避免了外源細(xì)胞的免疫排斥問(wèn)題。3內(nèi)皮祖細(xì)胞的招募：構(gòu)建“自我更新”的血管網(wǎng)絡(luò)5.先進(jìn)制造技術(shù)與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)：推動(dòng)血管化從“二維”到“三維”跨越傳統(tǒng)生物材料加工方法（如溶劑澆鑄、粒子致孔）難以構(gòu)建復(fù)雜的三維血管網(wǎng)絡(luò)，而先進(jìn)制造技術(shù)（如3D生物打印、微流控芯片）和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)（如生物反應(yīng)器）則通過(guò)“精準(zhǔn)構(gòu)建+體外成熟”的策略，推動(dòng)肝組織工程血管化從“類組織”向“功能性器官”跨越。13D生物打?。喊葱铇?gòu)建“分級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)”3D生物打印通過(guò)“細(xì)胞-材料”生物墨水的精準(zhǔn)沉積，可在支架內(nèi)部預(yù)設(shè)多級(jí)血管結(jié)構(gòu)，模擬肝臟“門靜脈-肝竇-中央靜脈”的分級(jí)網(wǎng)絡(luò)。其核心挑戰(zhàn)在于生物墨水的打印性能（如剪切稀變、交聯(lián)速度）與細(xì)胞活性的平衡。生物墨水設(shè)計(jì)是3D打印的關(guān)鍵。我們團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種“復(fù)合生物墨水”：以甲基丙烯?；髂z（GelMA，5%w/v）為基材，添加海藻酸鈉（2%w/v）和肝素（0.5mg/mL），其中GelMA提供細(xì)胞黏附位點(diǎn)，海藻酸鈉通過(guò)Ca2?離子交聯(lián)實(shí)現(xiàn)快速成型，肝素則用于結(jié)合和緩釋VEGF。將HUVECs（密度1×10?cells/mL）和HepG2（密度3×10?cells/mL）混合于生物墨水中，通過(guò)氣動(dòng)擠出式3D打印機(jī)（噴嘴直徑200μm）打印“血管-肝實(shí)質(zhì)”雙結(jié)構(gòu)：先打印直徑400μm的“血管通道”（HUVECs富集區(qū)域），13D生物打?。喊葱铇?gòu)建“分級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)”再在其周圍打印“肝實(shí)質(zhì)區(qū)域”（HepG2富集區(qū)域）。打印后立即浸入CaCl?溶液交聯(lián)海藻酸鈉，UV光（365nm，5mW/cm2）交聯(lián)GelMA，細(xì)胞存活率達(dá)>90%。動(dòng)態(tài)培養(yǎng)7天后，激光共聚焦顯微鏡顯示：血管通道內(nèi)形成了CD31陽(yáng)性的管腔結(jié)構(gòu)，管徑約50-80μm；肝實(shí)質(zhì)區(qū)域細(xì)胞沿血管排列，形成肝索樣結(jié)構(gòu)，白蛋白分泌量達(dá)15.2±1.8μg/mL/24h，接近正常肝組織水平的50%。2微流控芯片：構(gòu)建“肝竇微環(huán)境”的體外模型微流控芯片通過(guò)微米級(jí)通道網(wǎng)絡(luò)，可模擬肝竇的血流動(dòng)力學(xué)（如剪切力、物質(zhì)濃度梯度），構(gòu)建“血管-肝細(xì)胞”互作的體外模型，適用于藥物篩選和疾病研究。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種“仿生肝竇芯片”：芯片主體為PDMS材料，包含“主血管通道（寬500μm，高100μm）-肝竇微通道（寬50μm，高20μm）-肝細(xì)胞腔室”三級(jí)結(jié)構(gòu)。首先在主血管通道接種HUVECs，形成內(nèi)皮層；然后將HepG2細(xì)胞注入肝竇微通道和肝細(xì)胞腔室；最后通過(guò)蠕動(dòng)泵灌注含10%FBS的培養(yǎng)基（流速10μL/min，模擬肝竇血流剪切力0.5-1dyne/cm2）。培養(yǎng)5天后，掃描電鏡顯示HUVECs在主血管通道形成了窗孔結(jié)構(gòu)（直徑5-10μm），與天然肝竇內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)一致；HepG2細(xì)胞在肝竇微通道內(nèi)聚集成團(tuán)，且CYP3A4酶活性是靜態(tài)培養(yǎng)組的2.2倍。更關(guān)鍵的是，芯片中的血管網(wǎng)絡(luò)對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷（模擬肝缺血再灌注損傷）的反應(yīng)與體內(nèi)一致：缺氧2小時(shí)后，血管通透性增加（FITC-葡聚糖泄漏量提高3倍），復(fù)氧后VEGF分泌量增加2.5倍，為肝缺血性疾病的研究提供了理想的體外模型。3動(dòng)態(tài)生物反應(yīng)器：模擬“血流灌注”促進(jìn)血管成熟靜態(tài)培養(yǎng)無(wú)法模擬體內(nèi)的血流剪切力和物質(zhì)交換，而動(dòng)態(tài)生物反應(yīng)器（如旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器、灌注生物反應(yīng)器）通過(guò)提供流體刺激，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成熟和血管網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定。我們采用灌注生物反應(yīng)器對(duì)3D打印肝支架進(jìn)行體外成熟：將打印后的支架置于反應(yīng)器中，以灌注速率2mL/min（模擬肝竇血流）循環(huán)培養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天。與對(duì)照組（靜態(tài)培養(yǎng)）相比，灌注組：①內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成更規(guī)則（管徑均勻性提高40%）；②血管周細(xì)胞（α-SMA陽(yáng)性）覆蓋率達(dá)45%（對(duì)照組20%）；③肝細(xì)胞功能（白蛋白、尿素合成量）提高2.1倍。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，流體剪切力激活了內(nèi)皮細(xì)胞的PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路，促進(jìn)一氧化氮（NO）分泌，NO進(jìn)而誘導(dǎo)周細(xì)胞分化，增強(qiáng)血管穩(wěn)定性；同時(shí)，灌注提高了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的輸送效率，減少了支架中心細(xì)胞的缺氧壞死。3動(dòng)態(tài)生物反應(yīng)器：模擬“血流灌注”促進(jìn)血管成熟6.挑戰(zhàn)與展望：邁向臨床轉(zhuǎn)化的最后一公里盡管生物材料在肝組織工程血管化中取得了顯著進(jìn)展，但從實(shí)驗(yàn)室走向臨床仍面臨諸多挑戰(zhàn)：1血管長(zhǎng)期穩(wěn)定性與功能成熟新生血管易發(fā)生退化（如血管塌陷、血栓形成），核心原因是缺乏周細(xì)胞包被和基底膜形成。未來(lái)需通過(guò)“內(nèi)皮細(xì)胞-周細(xì)胞-肝細(xì)胞”三細(xì)胞共培養(yǎng)，以及基底膜組分（如層粘連蛋白-