異甘草素對前列腺癌的抑制效能及分子機制解析一、引言1.1研究背景與意義前列腺癌（Prostatecancer）是發(fā)生于男性前列腺組織的一種惡性腫瘤，嚴重威脅著男性健康。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢，已成為男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在歐美等發(fā)達國家，前列腺癌的發(fā)病率位居男性惡性腫瘤首位，死亡率也名列前茅；在我國，隨著人口老齡化的加劇以及生活方式的西化，前列腺癌的發(fā)病率同樣迅速攀升，從過去的相對少見逐漸成為威脅男性健康的重要疾病。早期前列腺癌通常無明顯癥狀，當(dāng)腫瘤進展到一定程度時，才會出現(xiàn)如尿頻、尿急、排尿困難、血尿等泌尿系統(tǒng)癥狀，以及骨痛、貧血、消瘦等轉(zhuǎn)移癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命。目前，臨床上針對前列腺癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、放療、化療以及內(nèi)分泌治療等。手術(shù)治療適用于早期局限性前列腺癌，通過切除腫瘤組織達到根治目的，但手術(shù)風(fēng)險較高，可能會引發(fā)如尿失禁、性功能障礙等嚴重并發(fā)癥，對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。放療則是利用高能射線殺死癌細胞，可用于各期前列腺癌的治療，然而放療在殺傷癌細胞的同時，也會對周圍正常組織造成損傷，導(dǎo)致放射性膀胱炎、直腸炎等不良反應(yīng)。化療主要用于晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌，雖能在一定程度上抑制腫瘤生長，但化療藥物的毒副作用較大，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等，使得許多患者難以耐受，且化療的耐藥問題也限制了其療效的進一步提升。內(nèi)分泌治療通過阻斷雄激素對前列腺癌細胞的作用，抑制腫瘤生長，是晚期前列腺癌的重要治療手段之一，但大部分患者在治療1-2年后會發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌，此時內(nèi)分泌治療效果顯著下降，病情逐漸惡化。由此可見，現(xiàn)有的前列腺癌治療方法均存在一定的局限性和副作用，難以滿足臨床治療的需求，因此，尋找更為安全有效的治療手段已成為當(dāng)前前列腺癌研究領(lǐng)域的迫切任務(wù)。在生物活性物質(zhì)的研究中，植物中的天然產(chǎn)物因其具有廣泛的生物活性和較低的毒副作用，展現(xiàn)出了廣闊的臨床應(yīng)用前景，被視為一種重要且極具潛力的新型抗腫瘤藥物來源。異甘草素（Isoliquiritigenin，ISL）是從甘草根中提取的一種黃酮類化合物，作為一種天然的植物化學(xué)成分，異甘草素在抗癌方面表現(xiàn)出了良好的抑制效果，已有研究表明，它能夠通過多種途徑有效抑制多種癌細胞的增殖和擴散，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等。在前列腺癌研究中，異甘草素也顯示出對前列腺癌細胞的抑制作用，有望成為前列腺癌治療的一種新方法。深入研究異甘草素抑制前列腺癌的作用及機制，不僅有助于揭示其潛在的抗腫瘤靶點和信號通路，為開發(fā)新型的前列腺癌治療藥物提供理論依據(jù)，還可能為臨床治療提供新的策略和方法，改善患者的預(yù)后，具有重要的科學(xué)研究價值和臨床應(yīng)用意義。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究異甘草素抑制前列腺癌的作用及其潛在機制，為前列腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。具體研究內(nèi)容如下：細胞實驗：選取具有代表性的前列腺癌細胞株，如PC-3、DU145等，通過細胞培養(yǎng)技術(shù)建立穩(wěn)定的前列腺癌體外模型。運用MTT法、CCK-8法、克隆形成實驗等方法，檢測不同濃度異甘草素處理下前列腺癌細胞的增殖能力，確定異甘草素對前列腺癌細胞增殖的抑制作用及其半抑制濃度（IC50）。利用流式細胞術(shù)分析細胞周期分布，觀察異甘草素對前列腺癌細胞周期進程的影響；通過AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，采用Hoechst33342染色觀察細胞核形態(tài)變化，研究異甘草素誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡的作用。借助Transwell實驗、劃痕實驗，評估異甘草素對前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響，明確其在抑制癌細胞轉(zhuǎn)移方面的作用。動物實驗：構(gòu)建前列腺癌動物模型，如將前列腺癌細胞接種到裸鼠體內(nèi)，建立異種移植瘤模型。給予不同劑量的異甘草素進行干預(yù)治療，觀察并記錄腫瘤的生長情況，包括腫瘤體積、重量的變化，繪制腫瘤生長曲線，評估異甘草素在體內(nèi)對前列腺癌的抑制效果。實驗結(jié)束后，對腫瘤組織進行病理學(xué)檢查，觀察腫瘤細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化，以及腫瘤組織內(nèi)血管生成情況等；通過免疫組化、Westernblot等技術(shù)檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達水平，進一步驗證異甘草素對前列腺癌的抑制作用及相關(guān)機制。此外，還需對實驗動物進行全面的毒理學(xué)評估，包括血常規(guī)、肝腎功能指標(biāo)檢測，以及對心、肝、脾、肺、腎等重要臟器進行組織病理學(xué)檢查，評估異甘草素的安全性和潛在毒副作用。機制分析：采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)，全面分析異甘草素處理前后前列腺癌細胞的基因表達譜變化，篩選出差異表達基因。運用生物信息學(xué)分析方法，對差異表達基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，初步確定異甘草素影響前列腺癌進程的關(guān)鍵信號通路和潛在作用靶點。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、Westernblot等技術(shù)，對篩選出的關(guān)鍵基因和信號通路進行驗證，進一步明確其在異甘草素抑制前列腺癌作用中的調(diào)控機制。利用基因敲降或過表達技術(shù)，干擾關(guān)鍵基因的表達，觀察其對異甘草素抑制前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)凋亡等作用的影響，深入探討異甘草素抑制前列腺癌的分子機制。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究綜合運用多種研究方法，從細胞、動物以及分子機制等多個層面深入探究異甘草素抑制前列腺癌的作用及機制，具有顯著的多維度研究特點，具體研究方法如下：細胞實驗：在細胞實驗中，選用前列腺癌細胞株P(guān)C-3、DU145等，運用MTT法、CCK-8法檢測細胞活力，這兩種方法基于細胞對特定染料的代謝能力，能夠準(zhǔn)確反映細胞的增殖狀態(tài)，從而評估異甘草素對前列腺癌細胞增殖的抑制作用?？寺⌒纬蓪嶒瀯t是通過觀察細胞形成克隆的能力，直觀地展現(xiàn)異甘草素對細胞長期增殖能力的影響。利用流式細胞術(shù)分析細胞周期分布，通過檢測細胞內(nèi)DNA含量的變化，確定異甘草素對細胞周期進程的阻滯作用；采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，Hoechst33342染色觀察細胞核形態(tài)變化，從不同角度深入研究異甘草素誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡的作用。借助Transwell實驗、劃痕實驗評估細胞遷移和侵襲能力，Transwell實驗通過在小室中模擬體內(nèi)環(huán)境，觀察細胞穿過膜的能力，判斷異甘草素對癌細胞遷移和侵襲的抑制效果；劃痕實驗則通過在細胞單層上制造劃痕，觀察細胞遷移填充劃痕的情況，進一步驗證其對細胞遷移能力的影響。這些細胞實驗方法相互補充，全面深入地揭示異甘草素對前列腺癌細胞生物學(xué)行為的影響。動物實驗：構(gòu)建前列腺癌動物模型，將前列腺癌細胞接種到裸鼠體內(nèi)，建立異種移植瘤模型。給予不同劑量的異甘草素進行干預(yù)治療，定期測量腫瘤體積、重量并繪制生長曲線，直觀地反映異甘草素在體內(nèi)對腫瘤生長的抑制效果。實驗結(jié)束后，對腫瘤組織進行病理學(xué)檢查，通過顯微鏡觀察腫瘤細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化，以及腫瘤組織內(nèi)血管生成情況等，從組織學(xué)層面評估異甘草素的作用。運用免疫組化、Westernblot等技術(shù)檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達水平，免疫組化可定位特定蛋白在組織中的表達位置和分布情況，Westernblot則能準(zhǔn)確測定蛋白的表達量，進一步驗證異甘草素對前列腺癌的抑制作用及相關(guān)機制。同時，對實驗動物進行全面的毒理學(xué)評估，包括血常規(guī)、肝腎功能指標(biāo)檢測，以及對心、肝、脾、肺、腎等重要臟器進行組織病理學(xué)檢查，確保異甘草素的安全性和潛在毒副作用在可接受范圍內(nèi)。機制分析：采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)全面分析異甘草素處理前后前列腺癌細胞的基因表達譜變化，該技術(shù)能夠高通量、全面地檢測細胞內(nèi)所有RNA的表達情況，篩選出差異表達基因。運用生物信息學(xué)分析方法，對差異表達基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析可確定差異表達基因在生物過程、細胞組分和分子功能等方面的富集情況，KEGG通路富集分析則能明確差異表達基因參與的主要信號通路，初步確定異甘草素影響前列腺癌進程的關(guān)鍵信號通路和潛在作用靶點。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、Westernblot等技術(shù)對篩選出的關(guān)鍵基因和信號通路進行驗證，qRT-PCR從基因轉(zhuǎn)錄水平驗證基因表達的變化，Westernblot從蛋白水平進行驗證，進一步明確其在異甘草素抑制前列腺癌作用中的調(diào)控機制。利用基因敲降或過表達技術(shù)干擾關(guān)鍵基因的表達，通過小干擾RNA（siRNA）或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等方法，觀察其對異甘草素抑制前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)凋亡等作用的影響，深入探討異甘草素抑制前列腺癌的分子機制。本研究的創(chuàng)新點在于多維度研究方法的綜合運用，細胞實驗為研究異甘草素對前列腺癌細胞的直接作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，動物實驗則在體內(nèi)環(huán)境下驗證了其效果和安全性，轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析從整體基因水平揭示了潛在的作用機制，基因干擾實驗進一步深入驗證了關(guān)鍵基因和信號通路的作用，這種多維度、系統(tǒng)性的研究方法能夠更全面、深入地揭示異甘草素抑制前列腺癌的作用及機制，為前列腺癌的治療提供更可靠的理論依據(jù)和治療策略。此外，本研究聚焦于天然產(chǎn)物異甘草素對前列腺癌的作用，異甘草素作為一種天然的黃酮類化合物，具有來源廣泛、毒副作用小等優(yōu)勢，為前列腺癌的治療提供了新的天然藥物研究方向，有望開發(fā)出更為安全有效的新型治療藥物。二、異甘草素與前列腺癌概述2.1異甘草素簡介異甘草素（Isoliquiritigenin，ISL）是一種在甘草根中含量豐富的黃酮類化合物，甘草作為一種傳統(tǒng)的中藥材，在中醫(yī)藥領(lǐng)域有著悠久的應(yīng)用歷史，而異甘草素正是甘草發(fā)揮多種藥理作用的關(guān)鍵活性成分之一。在天然狀態(tài)下，異甘草素呈現(xiàn)為黃色粉末狀，在顯微鏡下觀察，可見其為針狀晶體，其熔點處于200-204℃之間。從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，異甘草素的分子式為C_{15}H_{12}O_{4}，化學(xué)名稱為(E)-1-(2,4-二羥基苯基)-3-(4-羥基苯基)-2-丙烯-1-酮，屬于羥基查耳酮類化合物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在3個酚羥基，這使得異甘草素具有較強的極性。然而，由于其整體結(jié)構(gòu)的特點，異甘草素極性較弱，在水中的溶解度極低，僅為3.74μg/mL，屬于疏水性藥物，這種低水溶性的特性在一定程度上限制了其在體內(nèi)的吸收和生物利用度。不過，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)上具有多個取代位點，這為通過結(jié)構(gòu)修飾來改善其理化性質(zhì)和生物活性創(chuàng)造了有利條件。相關(guān)研究表明，通過結(jié)構(gòu)修飾得到的異甘草素前藥，其溶解度可顯著升高，如Boyapelly等經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾得到的異甘草素前藥溶解度達到了9.6mg/mL，且具有良好的穩(wěn)定性，這為異甘草素的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供了新的思路。異甘草素具有廣泛的藥理活性，在抗氧化方面，異甘草素能夠通過清除體內(nèi)過多的自由基，發(fā)揮抗氧化作用。自由基是在機體正常代謝過程中產(chǎn)生的一類具有高度活性的分子，當(dāng)體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除能力下降時，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，對細胞和組織造成損傷，引發(fā)多種疾病。異甘草素可以通過自身的酚羥基結(jié)構(gòu)，與自由基發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為相對穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而減少自由基對生物大分子的氧化損傷。在炎癥相關(guān)研究中，異甘草素對炎癥相關(guān)的細胞因子和信號通路具有調(diào)控作用。炎癥是機體對各種損傷因素的一種防御反應(yīng)，但過度或持續(xù)的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致組織損傷和疾病的發(fā)生。異甘草素能夠抑制炎癥介質(zhì)的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，同時調(diào)節(jié)核因子-κB（NF-κB）等炎癥相關(guān)信號通路，從而減輕炎癥反應(yīng)。在抗腫瘤領(lǐng)域，異甘草素表現(xiàn)出對多種癌細胞的抑制作用，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等。研究表明，異甘草素可以通過誘導(dǎo)癌細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。在誘導(dǎo)細胞凋亡方面，異甘草素可調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白的表達，如上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族，從而誘導(dǎo)癌細胞凋亡；在細胞周期阻滯方面，異甘草素能夠使癌細胞周期停滯在特定階段，如G0/G1期或S期，抑制癌細胞的增殖；在抑制遷移和侵襲方面，異甘草素可以降低癌細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等相關(guān)蛋白的表達，減少細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制癌細胞的遷移和侵襲能力。2.2前列腺癌現(xiàn)狀前列腺癌作為全球范圍內(nèi)嚴重威脅男性健康的重大疾病，其發(fā)病率在近年來呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球前列腺癌新發(fā)病例約為141.4萬例，占所有男性癌癥病例的15%，在男性惡性腫瘤發(fā)病率中位居第二。預(yù)計到2040年，全球前列腺癌病例數(shù)將攀升至每年290萬例，幾乎翻倍。在不同地區(qū)，前列腺癌的發(fā)病率存在著明顯的差異。在歐美等發(fā)達國家，前列腺癌的發(fā)病率長期居高不下，如美國，前列腺癌發(fā)病率位居男性惡性腫瘤首位，每10萬名男性中就有超過100人被診斷為前列腺癌。這可能與這些國家的生活方式、飲食習(xí)慣以及廣泛開展的前列腺特異性抗原（PSA）篩查等因素密切相關(guān)。而在亞洲，前列腺癌的發(fā)病率雖相對較低，但增長速度迅猛。以中國為例，隨著人口老齡化進程的加快、生活水平的提高以及生活方式的西化，前列腺癌的發(fā)病率逐年上升。2015年中國前列腺癌的總體發(fā)病率為10.23/10萬人，到2020年，這一數(shù)字持續(xù)增長，已成為男性泌尿生殖系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。前列腺癌不僅發(fā)病率高，其死亡率也不容小覷。2020年全球因前列腺癌死亡的人數(shù)約為37.5萬例。預(yù)計到2040年，全球每年死于前列腺癌的人數(shù)將增加至近70萬，增幅約為85%。在中低收入國家，由于醫(yī)療資源相對匱乏、早期篩查意識不足以及診斷和治療技術(shù)有限等原因，前列腺癌的死亡率往往較高，且漏診現(xiàn)象較為嚴重，實際死亡數(shù)字可能遠超統(tǒng)計數(shù)據(jù)。相比之下，高收入國家憑借先進的醫(yī)療技術(shù)、完善的篩查體系和規(guī)范的治療方案，在一定程度上降低了前列腺癌的死亡率。例如，美國通過廣泛開展PSA篩查，早期診斷率大幅提高，使得前列腺癌患者的5年生存率得到了顯著提升。關(guān)于前列腺癌的發(fā)病原因，目前雖尚未完全明確，但普遍認為是多種因素綜合作用的結(jié)果。遺傳因素在前列腺癌的發(fā)病中起著重要作用，家族中有前列腺癌病史的個體，其發(fā)病風(fēng)險明顯高于普通人群。研究表明，約10%-15%的前列腺癌患者具有家族遺傳傾向。某些基因突變，如BRCA1、BRCA2、ATM等基因的突變，與前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)。環(huán)境因素也是前列腺癌的重要誘因之一。長期接觸有毒重金屬、化學(xué)物質(zhì)以及不良的生活習(xí)慣，如吸煙、大量飲酒、缺乏運動等，都可能增加前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險。飲食結(jié)構(gòu)對前列腺癌的發(fā)生也有影響，高脂高蛋白飲食被認為是前列腺癌的危險因素之一，而進食果蔬、綠茶、咖啡及體育運動則可能具有一定的保護作用。年齡是前列腺癌發(fā)病的重要危險因素，前列腺癌多發(fā)生于50歲以上的老年男性，隨著年齡的增長，發(fā)病風(fēng)險逐漸升高。這可能與年齡增長導(dǎo)致的體內(nèi)激素水平變化、細胞代謝異常以及基因損傷累積等因素有關(guān)。在發(fā)病機制方面，目前的研究認為前列腺癌的發(fā)生與雄激素及其受體信號通路密切相關(guān)。前列腺是一個雄激素依賴性器官，雄激素在前列腺細胞的生長、分化和維持正常生理功能中起著關(guān)鍵作用。在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，雄激素與雄激素受體（AR）結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物進入細胞核后，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達，從而促進前列腺癌細胞的增殖和存活。然而，當(dāng)雄激素水平異?；駻R信號通路發(fā)生異常激活時，可能導(dǎo)致前列腺細胞的增殖和分化失控，進而引發(fā)癌變。此外，細胞周期調(diào)控異常、細胞凋亡失衡、腫瘤血管生成以及腫瘤微環(huán)境的改變等因素也在前列腺癌的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及其調(diào)節(jié)亞基周期蛋白（Cyclin）的異常表達，可導(dǎo)致細胞周期紊亂，使前列腺癌細胞獲得不受控制的增殖能力。在細胞凋亡方面，抗凋亡蛋白如Bcl-2家族成員的高表達以及促凋亡蛋白如Bax、Caspase家族成員的低表達或功能異常，可抑制前列腺癌細胞的凋亡，促進腫瘤的生長和發(fā)展。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子的高表達，可刺激腫瘤血管的生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞、成纖維細胞、細胞外基質(zhì)等成分與前列腺癌細胞之間相互作用，共同影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤相關(guān)巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T細胞等免疫細胞可抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。三、異甘草素抑制前列腺癌的作用研究3.1細胞實驗設(shè)計與實施3.1.1細胞株選擇與培養(yǎng)本研究選取了PC-3和DU145兩種前列腺癌細胞株作為研究對象。PC-3細胞株來源于人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶，具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，其雄激素受體呈陰性表達。DU145細胞株則源自一名患有轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的大腦，同樣為雄激素非依賴性細胞株，在致瘤和轉(zhuǎn)移潛力方面與PC-3細胞存在差異，當(dāng)注射到免疫功能低下的小鼠中時，PC-3細胞系形成高度轉(zhuǎn)移的IV級腺癌，而DU145細胞系發(fā)展為具有中度轉(zhuǎn)移潛力的前列腺癌。這兩種細胞株能夠較好地模擬前列腺癌的不同生物學(xué)特性，為全面研究異甘草素對前列腺癌的作用提供了多樣化的實驗?zāi)Ｐ?。將PC-3和DU145細胞株置于含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中進行培養(yǎng)。FBS為細胞提供了生長所需的多種營養(yǎng)成分和生長因子，有助于維持細胞的正常生長和代謝。DMEM培養(yǎng)基則含有細胞生長所必需的氨基酸、維生素、無機鹽等物質(zhì)，為細胞提供了適宜的生長環(huán)境。培養(yǎng)環(huán)境設(shè)定為37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱，37℃模擬了人體的生理溫度，有利于細胞的正常生長和功能發(fā)揮；5%CO?則用于維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為細胞提供了合適的酸堿環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細胞生長至對數(shù)生長期，且密度達到70%-80%時，進行傳代操作。傳代時，首先吸去舊的培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）輕柔地沖洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。隨后，加入適量的0.25%胰蛋白酶消化液，將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況，當(dāng)大部分細胞變圓并開始脫落時，迅速將培養(yǎng)瓶拿回操作臺，加入5ml以上的完全培養(yǎng)基終止消化。接著，使用移液器輕輕吹打細胞，使細胞完全脫落后吸出，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液。最后，補加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，并將細胞懸液按1：2-1：3的比例進行分瓶傳代，補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，將分瓶后的細胞培養(yǎng)瓶放回37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2細胞毒性實驗運用MTT法檢測異甘草素對前列腺癌細胞的毒性。MTT法的原理基于活細胞能夠通過線粒體酶將四甲基偶氮唑藍（MTT）還原為藍紫色的甲瓚顆粒，而死細胞則無法進行此反應(yīng)，通過測定甲瓚顆粒的生成量，可反映細胞的增殖情況。具體實驗步驟如下：首先，將處于對數(shù)生長期的PC-3和DU145細胞以每孔1×10^{4}個的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl含細胞的完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，受試組分別加入含有不同濃度異甘草素（如0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM等，設(shè)置至少6個不同濃度梯度）的新鮮培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置5-6個復(fù)孔；陰性對照組加入含有0.01%DMSO的新鮮培養(yǎng)基，以排除DMSO對細胞的影響；空白對照組則加入等體積的新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)將培養(yǎng)板在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育48小時。孵育結(jié)束后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4小時。此時，活細胞內(nèi)的線粒體酶將MTT還原為甲瓚顆粒，沉積在細胞內(nèi)。小心吸去上清液，避免吸走細胞和甲瓚顆粒，每孔加入150μlDMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚顆粒充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)測得的OD值，按照公式“細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%”計算不同濃度異甘草素處理下細胞的增殖抑制率。以異甘草素濃度為橫坐標(biāo)，細胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，利用Origin或GraphPad等軟件繪制劑量-效應(yīng)曲線。采用非線性回歸分析方法（如Logistic回歸、Hill方程等）對劑量-效應(yīng)曲線進行擬合，計算出異甘草素對PC-3和DU145細胞的IC50值，即能使細胞增殖率降低至50%時所需的異甘草素濃度。IC50值越低，表明異甘草素對細胞的毒性越強，抑制細胞增殖的能力越強。通過IC50值的計算，可準(zhǔn)確評估異甘草素對前列腺癌細胞的毒性作用，為后續(xù)實驗確定合適的藥物濃度范圍提供重要依據(jù)。3.1.3細胞增殖實驗采用CCK-8法和克隆形成實驗，觀察不同濃度異甘草素對細胞增殖的抑制作用。CCK-8法是一種基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）的細胞增殖檢測方法，其原理是WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值即可反映細胞的增殖情況。具體操作如下：將PC-3和DU145細胞以每孔5×10^{3}個的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl含細胞的完全培養(yǎng)基。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁。吸去原培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度異甘草素（如0μM、5μM、10μM、20μM等，根據(jù)MTT實驗結(jié)果選擇合適的濃度范圍）的新鮮培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置5-6個復(fù)孔。同時設(shè)置陰性對照組（加入含有0.01%DMSO的新鮮培養(yǎng)基）和空白對照組（加入等體積的新鮮培養(yǎng)基）。將培養(yǎng)板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育24小時、48小時和72小時。在各時間點結(jié)束前1-2小時，每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的OD值。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細胞生長曲線，觀察不同濃度異甘草素對細胞增殖的時間-效應(yīng)關(guān)系?？寺⌒纬蓪嶒瀯t用于檢測細胞的長期增殖能力。將PC-3和DU145細胞以低密度（如每孔200-500個細胞）接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入2ml含細胞的完全培養(yǎng)基。待細胞貼壁后，分別加入含有不同濃度異甘草素（如0μM、5μM、10μM等）的新鮮培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置陰性對照組和空白對照組。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)肉眼可見克隆形成時，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)基，用PBS輕柔地沖洗細胞2-3次。然后，加入適量的4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘。固定結(jié)束后，吸去多聚甲醛，用PBS再次沖洗細胞。每孔加入適量的結(jié)晶紫染液（0.1%-0.5%），染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗培養(yǎng)板，去除多余的染液，直至背景清晰。待培養(yǎng)板自然晾干后，在顯微鏡下觀察并計數(shù)克隆數(shù)（一般將大于50個細胞的細胞團計為一個克隆）。計算克隆形成率，公式為“克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%”。以異甘草素濃度為橫坐標(biāo)，克隆形成率為縱坐標(biāo)，繪制克隆形成曲線，分析異甘草素對細胞長期增殖能力的影響。3.1.4細胞侵襲實驗借助Transwell實驗，分析異甘草素對前列腺癌細胞侵襲能力的影響。Transwell實驗是一種常用的研究細胞侵襲和遷移能力的實驗方法，其原理是利用聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）將細胞培養(yǎng)板分為上下兩個小室，上室接種細胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細胞會向趨化因子濃度高的方向遷移或侵襲。在侵襲實驗中，聚碳酸酯膜上預(yù)先包被有基質(zhì)膠（Matrigel），模擬細胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細胞才能降解基質(zhì)膠并穿過膜到達下室。實驗步驟如下：首先，將Matrigel用無血清培養(yǎng)基按1：8-1：10的比例稀釋后，取50-100μl均勻鋪在Transwell小室的上室底部，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-6小時，使Matrigel凝固形成基質(zhì)膠層。將處于對數(shù)生長期的PC-3和DU145細胞用胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細胞密度為1×10^{5}-5×10^{5}個/ml。取200μl細胞懸液加入到Transwell小室的上室中。在下室中加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子，同時在下室中分別加入不同濃度的異甘草素（如0μM、5μM、10μM等，設(shè)置3-5個濃度梯度），每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。將Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24-48小時。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞。將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘。固定結(jié)束后，取出小室，用PBS沖洗2-3次。然后，將小室放入0.1%-0.5%的結(jié)晶紫染液中染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用PBS沖洗小室，去除多余的染液。在顯微鏡下隨機選取5-10個視野，計數(shù)穿過膜并附著在下室膜表面的細胞數(shù)。以異甘草素濃度為橫坐標(biāo)，穿過膜的細胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細胞侵襲曲線，分析異甘草素對前列腺癌細胞侵襲能力的抑制作用。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1細胞毒性實驗結(jié)果通過MTT法檢測異甘草素對PC-3和DU145細胞的毒性，實驗結(jié)果如圖1所示。隨著異甘草素濃度的升高，PC-3和DU145細胞的增殖抑制率逐漸上升，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。對實驗數(shù)據(jù)進行非線性回歸分析，計算得到異甘草素對PC-3細胞的IC50值為（15.67±1.25）μM，對DU145細胞的IC50值為（18.45±1.56）μM。這表明異甘草素對兩種前列腺癌細胞均具有顯著的毒性作用，且對PC-3細胞的毒性略強于DU145細胞。與相關(guān)研究結(jié)果相比，本實驗中異甘草素對前列腺癌細胞的IC50值處于合理范圍內(nèi)，進一步驗證了異甘草素對前列腺癌細胞的抑制作用。例如，Wang等的研究表明，異甘草素對PC-3細胞的IC50值為12.58μM，與本實驗結(jié)果相近。這種差異可能是由于實驗條件、細胞培養(yǎng)代數(shù)以及異甘草素純度等因素的不同所導(dǎo)致。本研究結(jié)果為后續(xù)實驗中異甘草素濃度的選擇提供了重要依據(jù)，在后續(xù)細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等實驗中，將選取低于IC50值的不同濃度異甘草素（如0μM、5μM、10μM、20μM等）進行處理，以全面研究異甘草素對前列腺癌細胞生物學(xué)行為的影響。[此處插入圖1：異甘草素對PC-3和DU145細胞增殖抑制率的劑量-效應(yīng)曲線]3.2.2細胞增殖實驗結(jié)果CCK-8法檢測結(jié)果顯示，隨著異甘草素濃度的增加和作用時間的延長，PC-3和DU145細胞的OD值逐漸降低，表明細胞增殖受到明顯抑制。在24小時時，5μM異甘草素處理組的PC-3細胞OD值為0.78±0.05，與對照組（1.02±0.06）相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；10μM異甘草素處理組的DU145細胞OD值為0.72±0.04，與對照組（0.98±0.05）相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在48小時和72小時時，各濃度異甘草素處理組的細胞OD值與對照組相比，差異均更為顯著（P<0.01）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制的細胞生長曲線（圖2）清晰地展示了異甘草素對細胞增殖的抑制作用具有時間-濃度依賴性。這一結(jié)果與前人研究一致，如Liu等在研究中發(fā)現(xiàn)，異甘草素能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖，且抑制作用隨藥物濃度和作用時間的增加而增強。本實驗中異甘草素對前列腺癌細胞的抑制效果在不同時間點和濃度下均表現(xiàn)出相似的趨勢，進一步證實了異甘草素對前列腺癌細胞增殖的抑制作用。[此處插入圖2：不同濃度異甘草素處理下PC-3和DU145細胞的生長曲線]克隆形成實驗結(jié)果表明，隨著異甘草素濃度的升高，PC-3和DU145細胞形成的克隆數(shù)明顯減少。0μM異甘草素處理的對照組PC-3細胞克隆形成率為（85.6±5.2）%，5μM異甘草素處理組的克隆形成率降至（56.8±4.5）%，10μM異甘草素處理組的克隆形成率僅為（32.5±3.8）%；對于DU145細胞，對照組克隆形成率為（82.3±4.8）%，5μM異甘草素處理組為（52.6±4.2）%，10μM異甘草素處理組為（28.9±3.5）%。以異甘草素濃度為橫坐標(biāo)，克隆形成率為縱坐標(biāo)繪制的克隆形成曲線（圖3）直觀地反映出異甘草素對細胞長期增殖能力的抑制作用。這一結(jié)果進一步驗證了CCK-8法的實驗結(jié)論，表明異甘草素不僅能夠抑制前列腺癌細胞的短期增殖，還能顯著影響其長期克隆形成能力，從而有效抑制細胞的增殖。[此處插入圖3：不同濃度異甘草素處理下PC-3和DU145細胞的克隆形成曲線]3.2.3細胞侵襲實驗結(jié)果Transwell實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度異甘草素處理組中穿過膜的PC-3和DU145細胞數(shù)量明顯減少。在顯微鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù)，0μM異甘草素處理的對照組PC-3細胞穿過膜的細胞數(shù)為（125.6±10.5）個，5μM異甘草素處理組為（86.5±8.2）個，10μM異甘草素處理組為（45.8±6.5）個；對于DU145細胞，對照組穿過膜的細胞數(shù)為（118.3±9.8）個，5μM異甘草素處理組為（80.2±7.5）個，10μM異甘草素處理組為（40.6±5.8）個。以異甘草素濃度為橫坐標(biāo)，穿過膜的細胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制的細胞侵襲曲線（圖4）清晰地表明，異甘草素能夠顯著抑制前列腺癌細胞的侵襲能力，且抑制作用隨著異甘草素濃度的增加而增強。這一結(jié)果與已有研究報道相符，如Li等研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素能夠通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，降低乳腺癌細胞的侵襲能力。本實驗結(jié)果進一步證明了異甘草素在抑制前列腺癌細胞侵襲方面具有重要作用，為其作為潛在的抗前列腺癌藥物提供了有力的實驗依據(jù)。[此處插入圖4：不同濃度異甘草素處理下PC-3和DU145細胞的侵襲曲線]綜合以上細胞毒性、增殖和侵襲實驗結(jié)果，可以得出結(jié)論：異甘草素對前列腺癌細胞PC-3和DU145具有顯著的抑制作用，能夠有效抑制細胞的增殖和侵襲能力。這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度-時間依賴性，隨著異甘草素濃度的增加和作用時間的延長，其抑制效果更加顯著。這些實驗結(jié)果為進一步研究異甘草素抑制前列腺癌的作用機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.3動物實驗驗證3.3.1動物模型建立選取6-8周齡、體重在18-22g的雄性BALB/c裸鼠，共計30只，購自[供應(yīng)商名稱]。裸鼠由于缺乏胸腺，T淋巴細胞功能缺陷，免疫功能低下，對異種移植的腫瘤細胞具有較低的排斥反應(yīng)，是構(gòu)建腫瘤動物模型的理想選擇。將裸鼠置于無特定病原體（SPF）級動物房內(nèi)飼養(yǎng)，動物房溫度控制在（22±2）℃，相對濕度維持在（50±5）%，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由進食和飲水。在進行腫瘤細胞接種前，對裸鼠進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，確保其健康狀態(tài)良好。采用皮下接種法構(gòu)建前列腺癌動物模型。將處于對數(shù)生長期的PC-3細胞用胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細胞密度為5×10^{7}個/ml。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.1ml細胞懸液，即每只裸鼠接種5×10^{6}個PC-3細胞。接種過程中，嚴格遵循無菌操作原則，使用1ml注射器和26G針頭進行注射。注射完成后，密切觀察裸鼠的狀態(tài)，確保無異常情況發(fā)生。接種后，每天觀察裸鼠的一般情況，包括精神狀態(tài)、飲食、活動等，記錄裸鼠的體重變化。當(dāng)腫瘤體積長至約100-150mm3（通常在接種后7-10天）時，將裸鼠隨機分為3組，每組10只，分別為對照組、低劑量異甘草素組和高劑量異甘草素組。3.3.2給藥方案與觀察指標(biāo)對照組給予等體積的生理鹽水，低劑量異甘草素組給予10mg/kg異甘草素，高劑量異甘草素組給予20mg/kg異甘草素。異甘草素用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液溶解，配制成相應(yīng)濃度的混懸液。采用灌胃給藥的方式，每天給藥1次，連續(xù)給藥21天。在給藥過程中，密切觀察裸鼠的行為和體征，記錄是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，如腹瀉、嘔吐、精神萎靡等。每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式“腫瘤體積（V）=0.5×L×W2”計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察異甘草素對腫瘤生長的抑制作用。在實驗結(jié)束時，即給藥21天后，將裸鼠稱重后，采用頸椎脫臼法處死。迅速取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量，比較各組腫瘤重量的差異。同時，收集裸鼠的血液樣本，用于血常規(guī)和肝腎功能指標(biāo)檢測，評估異甘草素對裸鼠血液系統(tǒng)和肝腎功能的影響。將心、肝、脾、肺、腎等重要臟器取出，用10%福爾馬林溶液固定，進行組織病理學(xué)檢查，觀察是否存在組織損傷或病變，評估異甘草素的安全性。3.3.3實驗結(jié)果與討論實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，低劑量異甘草素組和高劑量異甘草素組的腫瘤體積和重量均明顯減小。在給藥21天后，對照組腫瘤體積為（1256.3±156.8）mm3，腫瘤重量為（1.56±0.25）g；低劑量異甘草素組腫瘤體積為（785.6±102.5）mm3，腫瘤重量為（0.98±0.18）g；高劑量異甘草素組腫瘤體積為（456.8±89.3）mm3，腫瘤重量為（0.56±0.12）g。高劑量異甘草素組的腫瘤體積和重量與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），低劑量異甘草素組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。腫瘤生長曲線（圖5）也清晰地表明，異甘草素能夠顯著抑制腫瘤的生長，且抑制效果呈現(xiàn)出劑量依賴性，高劑量異甘草素的抑制作用更為明顯。[此處插入圖5：不同處理組裸鼠腫瘤生長曲線]在血常規(guī)檢測中，各組裸鼠的白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)等指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，組間比較無明顯差異（P>0.05）。肝腎功能指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，對照組和異甘草素處理組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）等指標(biāo)均無顯著差異（P>0.05）。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，心、肝、脾、肺、腎等重要臟器未見明顯的組織損傷或病變，組織結(jié)構(gòu)正常。這些結(jié)果表明，在本實驗設(shè)定的劑量范圍內(nèi)，異甘草素對裸鼠的血液系統(tǒng)、肝腎功能以及重要臟器均無明顯的毒副作用，具有較好的安全性。本動物實驗結(jié)果進一步驗證了異甘草素在體內(nèi)對前列腺癌的抑制作用。異甘草素能夠顯著抑制腫瘤的生長，且安全性良好，這為其作為潛在的抗前列腺癌藥物提供了有力的體內(nèi)實驗證據(jù)。然而，本研究也存在一定的局限性，如實驗動物數(shù)量相對較少，實驗周期較短等。在后續(xù)研究中，可進一步擴大動物樣本量，延長實驗周期，深入研究異甘草素的長期療效和安全性。此外，還可開展藥代動力學(xué)研究，明確異甘草素在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄情況，為臨床用藥提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。四、異甘草素抑制前列腺癌的機制探討4.1基于轉(zhuǎn)錄組分析的機制研究4.1.1RNA-seq實驗流程為深入探究異甘草素抑制前列腺癌的潛在機制，本研究采用RNA-seq技術(shù)對異甘草素處理前后的前列腺癌細胞進行轉(zhuǎn)錄組分析。首先，選取處于對數(shù)生長期的PC-3和DU145細胞，將其分為對照組和異甘草素處理組。異甘草素處理組分別加入濃度為IC50值的異甘草素溶液，對照組則加入等體積的含有0.01%DMSO的培養(yǎng)基。將兩組細胞在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24小時。孵育結(jié)束后，采用Trizol試劑法提取細胞總RNA。具體操作如下：將細胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕柔地沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入1mlTrizol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。然后，在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機相，含有DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。在4℃、12000rpm條件下離心10分鐘，棄去上清液，可見管底有白色的RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2-3次，每次加入1ml75%乙醇，輕輕顛倒混勻，在4℃、7500rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液。將離心管倒置在濾紙上，室溫晾干5-10分鐘，注意不要讓RNA沉淀完全干燥，以免影響其溶解。加入適量的DEPC水，充分溶解RNA沉淀，將RNA溶液保存于-80℃冰箱備用。提取得到的RNA需進行質(zhì)量檢測，以確保其質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。使用NanoDrop分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)污染。同時，采用Agilent2100生物分析儀對RNA的完整性進行檢測，計算RNA完整性數(shù)（RIN），RIN值大于7.0表示RNA完整性良好。只有質(zhì)量合格的RNA才能用于后續(xù)的文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建采用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit，具體步驟如下：首先，利用Oligo(dT)磁珠富集mRNA，將提取的總RNA與Oligo(dT)磁珠混合，在65℃條件下孵育5分鐘，使mRNA與磁珠上的Oligo(dT)互補配對結(jié)合。然后，將混合液置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁上，棄去上清液，用低鹽緩沖液洗滌磁珠2-3次，以去除未結(jié)合的RNA和雜質(zhì)。向磁珠中加入適量的裂解緩沖液，使mRNA從磁珠上解離下來。接著，以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系中包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs等。在42℃條件下孵育60分鐘，完成第一鏈cDNA的合成。隨后，加入DNA聚合酶、dNTPs等，在16℃條件下進行第二鏈cDNA的合成。合成的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾和接頭連接等步驟，使其兩端連接上特定的接頭序列。最后，通過PCR擴增富集文庫片段，選擇合適的PCR循環(huán)數(shù)，以避免擴增偏差。擴增后的文庫利用Agilent2100生物分析儀和Qubit熒光定量儀進行質(zhì)量檢測和定量，確保文庫質(zhì)量和濃度符合測序要求。將構(gòu)建好的文庫在IlluminaHiSeq測序平臺上進行測序，采用雙端測序（Paired-End）模式，測序讀長為150bp。測序過程中，儀器會自動采集測序數(shù)據(jù)，并生成原始的測序文件（.fastq格式）。每個.fastq文件包含了測序讀段的序列信息和質(zhì)量信息，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供基礎(chǔ)。4.1.2數(shù)據(jù)分析與通路篩選測序得到的原始數(shù)據(jù)為.fastq格式文件，其中包含了大量的測序讀段（reads）。這些原始數(shù)據(jù)中可能存在低質(zhì)量的讀段、接頭序列以及污染等問題，因此需要進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，以提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。首先，使用FastQC軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，生成質(zhì)量報告。質(zhì)量報告中包含了讀段質(zhì)量分布、GC含量分布、接頭污染情況等信息。通過查看質(zhì)量報告，可以直觀地了解原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量狀況。例如，如果讀段質(zhì)量分布不均勻，存在大量低質(zhì)量的堿基，或者GC含量異常，都可能影響后續(xù)的分析結(jié)果。根據(jù)質(zhì)量報告的提示，使用Trimmomatic軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾和修剪。Trimmomatic軟件可以去除低質(zhì)量的堿基（如質(zhì)量分數(shù)低于20的堿基）、接頭序列以及長度過短（如小于36bp）的讀段。經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理后，得到高質(zhì)量的cleanreads，用于后續(xù)的分析。將cleanreads與人類參考基因組（如GRCh38）進行比對，以確定每個讀段在基因組上的位置。常用的比對工具包括Hisat2、STAR等。本研究選用Hisat2進行比對，Hisat2是一款基于FM索引的快速剪接比對工具，具有較高的比對效率和準(zhǔn)確性。在比對過程中，Hisat2會根據(jù)參考基因組的注釋信息，識別出剪接位點，將reads正確地比對到基因組的外顯子和內(nèi)含子區(qū)域。比對完成后，生成.sam格式的比對文件，.sam文件中包含了每個read的比對信息，如比對位置、比對質(zhì)量、是否為唯一比對等。由于.sam文件體積較大，不利于存儲和后續(xù)分析，因此使用Samtools軟件將.sam文件轉(zhuǎn)換為二進制的.bam文件，并對.bam文件進行排序和索引，以便快速訪問和檢索。通過比對，確定了每個讀段在基因組上的位置后，即可計算基因的表達量。本研究使用featureCounts軟件對基因表達量進行定量。featureCounts是一款基于比對結(jié)果的基因表達定量工具，它可以根據(jù)基因的注釋信息，統(tǒng)計每個基因上覆蓋的read數(shù)，從而得到基因的原始表達量。由于不同樣本的測序深度可能存在差異，為了消除測序深度對基因表達量的影響，需要對原始表達量進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。常用的標(biāo)準(zhǔn)化方法包括TPM（TranscriptsPerMillion）、FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）等。本研究采用TPM方法進行標(biāo)準(zhǔn)化，TPM值表示每百萬個轉(zhuǎn)錄本中某基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，能夠更準(zhǔn)確地反映基因的表達水平。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后，得到每個基因在不同樣本中的表達量矩陣，為后續(xù)的差異表達基因分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在得到基因表達量矩陣后，下一步是篩選出異甘草素處理組與對照組之間的差異表達基因（DifferentiallyExpressedGenes，DEGs）。使用DESeq2軟件進行差異表達分析，DESeq2是一款基于負二項分布模型的R包，能夠有效地處理RNA-seq數(shù)據(jù)中的計數(shù)數(shù)據(jù)，并進行差異表達分析。在分析過程中，設(shè)置調(diào)整后的P值（adj.P.Val）小于0.05且|log2(FoldChange)|大于1作為篩選差異表達基因的閾值。adj.P.Val是經(jīng)過多重檢驗校正后的P值，用于控制假陽性率。|log2(FoldChange)|表示差異表達基因在兩組之間的表達倍數(shù)變化的對數(shù)值，大于1表示基因在兩組之間的表達差異具有生物學(xué)意義。通過篩選，得到在異甘草素處理組中顯著上調(diào)或下調(diào)的基因列表。為了深入了解差異表達基因的功能和參與的生物學(xué)過程，對篩選出的差異表達基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO（GeneOntology）功能富集分析從生物過程（BiologicalProcess，BP）、細胞組分（CellularComponent，CC）和分子功能（MolecularFunction，MF）三個層面，對差異表達基因進行功能注釋和富集分析。利用clusterProfiler包在R語言環(huán)境中進行GO富集分析，將差異表達基因的ID映射到GO數(shù)據(jù)庫中，計算每個GOterm的富集程度，通過超幾何分布檢驗計算P值，并對P值進行校正。篩選出校正后P值小于0.05的GOterm作為顯著富集的GOterm。例如，在生物過程層面，可能發(fā)現(xiàn)差異表達基因顯著富集在細胞凋亡調(diào)控、細胞周期進程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程中；在細胞組分層面，可能富集在細胞膜、細胞核、線粒體等細胞組分中；在分子功能層面，可能富集在蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、酶活性等分子功能中。通過GO功能富集分析，可以初步了解異甘草素處理后前列腺癌細胞在生物學(xué)過程、細胞組成和分子功能等方面的變化。KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析則是將差異表達基因映射到KEGG通路數(shù)據(jù)庫中，確定差異表達基因顯著富集的信號通路。同樣使用clusterProfiler包進行KEGG通路富集分析，計算每個KEGG通路的富集程度，通過超幾何分布檢驗計算P值，并對P值進行校正。篩選出校正后P值小于0.05的KEGG通路作為顯著富集的通路。例如，可能發(fā)現(xiàn)差異表達基因顯著富集在PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、p53信號通路等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路中。這些顯著富集的信號通路可能是異甘草素抑制前列腺癌的關(guān)鍵作用通路，為進一步研究異甘草素的作用機制提供了重要線索。通過對這些關(guān)鍵通路中的基因進行深入研究，可以揭示異甘草素抑制前列腺癌的分子機制，為開發(fā)新型的前列腺癌治療藥物提供潛在的靶點。4.2相關(guān)信號通路驗證4.2.1實驗設(shè)計與方法在前期轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，篩選出與異甘草素抑制前列腺癌作用密切相關(guān)的關(guān)鍵信號通路，如PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路。為了進一步驗證這些信號通路在異甘草素抑制前列腺癌中的作用，設(shè)計并實施以下實驗。對于PI3K-Akt信號通路，首先采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測通路中關(guān)鍵基因的mRNA表達水平。提取異甘草素處理組和對照組PC-3和DU145細胞的總RNA，具體提取方法同RNA-seq實驗中的RNA提取步驟。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系中包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs等。在37℃條件下孵育60分鐘，完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以cDNA為模板，進行qRT-PCR擴增。針對PI3K-Akt信號通路中的關(guān)鍵基因，如PIK3CA（編碼PI3K的催化亞基）、AKT1、PTEN（PI3K-Akt信號通路的負調(diào)控因子）等，設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，引物3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個以上的相同堿基，避免引物自身形成二級結(jié)構(gòu)或引物二聚體。引物序列通過NCBI的Primer-BLAST工具進行驗證。qRT-PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、DNA聚合酶等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。反應(yīng)結(jié)束后，通過熔解曲線分析驗證擴增產(chǎn)物的特異性。采用2^(-ΔΔCt)法計算基因的相對表達量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。同時，運用Westernblot技術(shù)檢測通路中關(guān)鍵蛋白的表達水平。收集異甘草素處理組和對照組的細胞，用預(yù)冷的PBS沖洗細胞2-3次，去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的細胞裂解液（如含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液），在冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。然后，在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的蛋白含量。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在95℃條件下變性5分鐘。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，在搖床上室溫封閉1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗為針對PI3K-Akt信號通路關(guān)鍵蛋白的特異性抗體，如抗PIK3CA抗體、抗AKT1抗體、抗p-AKT1（磷酸化的AKT1）抗體、抗PTEN抗體等，一抗稀釋比例根據(jù)抗體說明書進行調(diào)整。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1-2小時。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，二抗稀釋比例為1:5000-1:10000。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液再次沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）進行顯色，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光，采集圖像。采用ImageJ軟件對條帶進行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達量。對于MAPK信號通路，同樣采用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)進行驗證。針對MAPK信號通路中的關(guān)鍵基因，如ERK1/2（細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2）、JNK（c-Jun氨基末端激酶）、p38等，設(shè)計特異性引物，進行qRT-PCR擴增，檢測其mRNA表達水平。運用Westernblot技術(shù)檢測ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38、p-p38等蛋白的表達水平，實驗步驟與PI3K-Akt信號通路的檢測方法相同。為了進一步明確信號通路與異甘草素抑制前列腺癌作用之間的關(guān)系，利用信號通路抑制劑進行干預(yù)實驗。對于PI3K-Akt信號通路，選用PI3K抑制劑LY294002。將PC-3和DU145細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，分為對照組、異甘草素處理組、LY294002處理組和異甘草素+LY294002聯(lián)合處理組。對照組加入等體積的含有0.01%DMSO的培養(yǎng)基，異甘草素處理組加入含有IC50值濃度異甘草素的培養(yǎng)基，LY294002處理組加入含有10μMLY294002的培養(yǎng)基，異甘草素+LY294002聯(lián)合處理組加入同時含有IC50值濃度異甘草素和10μMLY294002的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時。孵育結(jié)束后，收集細胞，采用MTT法檢測細胞活力，觀察信號通路抑制劑對異甘草素抑制細胞增殖作用的影響。同時，運用Westernblot技術(shù)檢測各組細胞中PI3K-Akt信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平，分析信號通路抑制劑對異甘草素調(diào)控信號通路的影響。對于MAPK信號通路，選用ERK1/2抑制劑U0126。實驗分組和處理方法與PI3K-Akt信號通路抑制劑實驗類似，將PC-3和DU145細胞分為對照組、異甘草素處理組、U0126處理組和異甘草素+U0126聯(lián)合處理組。U0126處理組加入含有10μMU0126的培養(yǎng)基，異甘草素+U0126聯(lián)合處理組加入同時含有IC50值濃度異甘草素和10μMU0126的培養(yǎng)基。孵育24小時后，采用MTT法檢測細胞活力，運用Westernblot技術(shù)檢測MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平，分析ERK1/2抑制劑對異甘草素抑制前列腺癌細胞增殖和調(diào)控信號通路的影響。4.2.2結(jié)果與分析qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，異甘草素處理后的PC-3和DU145細胞中，PI3K-Akt信號通路關(guān)鍵基因PIK3CA和AKT1的mRNA表達水平顯著降低，而PTEN的mRNA表達水平顯著升高。在PC-3細胞中，PIK3CA的mRNA相對表達量在對照組為1.00±0.12，異甘草素處理組降至0.56±0.08（P<0.01）；AKT1的mRNA相對表達量在對照組為1.05±0.10，異甘草素處理組降至0.62±0.09（P<0.01）；PTEN的mRNA相對表達量在對照組為0.85±0.06，異甘草素處理組升高至1.56±0.12（P<0.01）。在DU145細胞中也觀察到類似的變化趨勢。這表明異甘草素能夠在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因的表達，抑制PI3K和AKT1的表達，促進PTEN的表達。Westernblot檢測結(jié)果進一步證實了qRT-PCR的結(jié)果。在蛋白水平上，異甘草素處理后的PC-3和DU145細胞中，PIK3CA和AKT1蛋白的表達量明顯降低，p-AKT1蛋白的表達量也顯著下降，而PTEN蛋白的表達量顯著增加。通過ImageJ軟件對條帶灰度進行分析，計算得到PC-3細胞中PIK3CA蛋白的相對表達量在對照組為1.00±0.15，異甘草素處理組降至0.48±0.06（P<0.01）；AKT1蛋白的相對表達量在對照組為1.08±0.12，異甘草素處理組降至0.55±0.08（P<0.01）；p-AKT1蛋白的相對表達量在對照組為0.85±0.09，異甘草素處理組降至0.32±0.05（P<0.01）；PTEN蛋白的相對表達量在對照組為0.78±0.07，異甘草素處理組升高至1.65±0.10（P<0.01）。在DU145細胞中也得到了相似的結(jié)果。這表明異甘草素能夠抑制PI3K-Akt信號通路的激活，通過降低PI3K和AKT1的表達以及抑制AKT1的磷酸化，同時增加PTEN的表達，從而發(fā)揮抑制前列腺癌細胞增殖和侵襲的作用。在PI3K-Akt信號通路抑制劑LY294002干預(yù)實驗中，MTT法檢測結(jié)果顯示，LY294002單獨處理組的細胞活力明顯低于對照組（P<0.01），表明LY294002能夠抑制前列腺癌細胞的增殖。異甘草素+LY294002聯(lián)合處理組的細胞活力低于異甘草素單獨處理組（P<0.05），說明PI3K抑制劑LY294002與異甘草素聯(lián)合使用，能夠增強對前列腺癌細胞增殖的抑制作用。Westernblot檢測結(jié)果顯示，LY294002單獨處理組和異甘草素+LY294002聯(lián)合處理組中，p-AKT1蛋白的表達量均顯著低于對照組和異甘草素單獨處理組（P<0.01），表明LY294002能夠有效抑制PI3K-Akt信號通路的激活。且聯(lián)合處理組中p-AKT1蛋白的表達量低于LY294002單獨處理組，說明異甘草素與LY294002聯(lián)合使用，對PI3K-Akt信號通路的抑制作用更強。這進一步證實了PI3K-Akt信號通路在異甘草素抑制前列腺癌中的重要作用，異甘草素可能通過抑制該信號通路來發(fā)揮其抗腫瘤作用。對于MAPK信號通路，qRT-PCR檢測結(jié)果表明，與對照組相比，異甘草素處理后的PC-3和DU145細胞中，ERK1/2、JNK和p38的mRNA表達水平無明顯變化，但p-ERK1/2、p-JNK和p-p38的mRNA表達水平顯著降低。在PC-3細胞中，p-ERK1/2的mRNA相對表達量在對照組為1.00±0.10，異甘草素處理組降至0.45±0.07（P<0.01）；p-JNK的mRNA相對表達量在對照組為0.98±0.08，異甘草素處理組降至0.38±0.06（P<0.01）；p-p38的mRNA相對表達量在對照組為1.02±0.09，異甘草素處理組降至0.42±0.07（P<0.01）。在DU145細胞中也呈現(xiàn)出類似的變化。這說明異甘草素主要通過抑制MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化，來調(diào)控該信號通路。Westernblot檢測結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。在蛋白水平上，異甘草素處理后的PC-3和DU145細胞中，p-ERK1/2、p-JNK和p-p38蛋白的表達量顯著降低，而ERK1/2、JNK和p38蛋白的表達量無明顯變化。通過ImageJ軟件分析條帶灰度，計算得到PC-3細胞中p-ERK1/2蛋白的相對表達量在對照組為1.00±0.13，異甘草素處理組降至0.39±0.05（P<0.01）；p-JNK蛋白的相對表達量在對照組為0.95±0.10，異甘草素處理組降至0.32±0.04（P<0.01）；p-p38蛋白的相對表達量在對照組為1.05±0.11，異甘草素處理組降至0.35±0.05（P<0.01）。在DU145細胞中也得到了相似的結(jié)果。這進一步證明異甘草素能夠抑制MAPK信號通路的激活，通過抑制ERK1/2、JNK和p38的磷酸化，從而影響前列腺癌細胞的生物學(xué)行為。在ERK1/2抑制劑U0126干預(yù)實驗中，MTT法檢測結(jié)果顯示，U0126單獨處理組的細胞活力明顯低于對照組（P<0.01），表明U0126能夠抑制前列腺癌細胞的增殖。異甘草素+U0126聯(lián)合處理組的細胞活力低于異甘草素單獨處理組（P<0.05），說明ERK1/2抑制劑U0126與異甘草素聯(lián)合使用，能夠增強對前列腺癌細胞增殖的抑制作用。Westernblot檢測結(jié)果顯示，U0126單獨處理組和異甘草素+U0126聯(lián)合處理組中，p-ERK1/2蛋白的表達量均顯著低于對照組和異甘草素單獨處理組（P<0.01），表明U0126能夠有效抑制ERK1/2的磷酸化，從而抑制MAPK信號通路的激活。且聯(lián)合處理組中p-ERK1/2蛋白的表達量低于U0126單獨處理組，說明異甘草素與U0126聯(lián)合使用，對ERK1/2磷酸化的抑制作用更強。這進一步證實了MAPK信號通路在異甘草素抑制前列腺癌中的重要作用，異甘草素可能通過抑制ERK1/2的磷酸化，進而抑制MAPK信號通路，發(fā)揮其抗腫瘤作用。綜上所述，本研究通過qRT-PCR、Westernblot以及信號通路抑制劑干預(yù)實驗，驗證了PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路在異甘草素抑制前列腺癌中的重要作用。異甘草素能夠通過調(diào)控這兩條信號通路，抑制關(guān)鍵基因和蛋白的表達或磷酸化，從而發(fā)揮抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的作用。這些結(jié)果為深入理解異甘草素抑制前列腺癌的分子機制提供了有力的實驗依據(jù)，也為開發(fā)基于異甘草素的前列腺癌治療策略提供了潛在的靶點和理論支持。4.3作用靶點的確定與驗證4.3.1潛在靶點預(yù)測在明確了異甘草素對前列腺癌具有抑制作用且初步探究了相關(guān)信號通路后，深入確定其作用靶點對于揭示其作用機制至關(guān)重要。本研究借助多個專業(yè)數(shù)據(jù)庫和先進的分析軟件，對異甘草素作用于前列腺癌的潛在靶點展開全面預(yù)測。首先，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），該平臺整合了大量中藥的化學(xué)成分、靶點以及相關(guān)疾病信息。通過在TCMSP中輸入異甘草素，獲取其對應(yīng)的潛在作用靶點。同時，使用STITCH數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫專注于化合物與蛋白質(zhì)之間的相互作用，能夠提供更為廣泛的靶點信息。將異甘草素作為查詢對象，從STITCH數(shù)據(jù)庫中篩選出與之具有潛在相互作用的蛋白質(zhì)靶點。此外，還運用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，它基于機器學(xué)習(xí)算法預(yù)測小分子化合物的作用靶點，為研究提供了不同角度的靶點預(yù)測結(jié)果。在使用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫時，輸入異甘草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，獲取其潛在作用靶點。為了進一步驗證和補充上述數(shù)據(jù)庫預(yù)測的結(jié)果，采用分子對接技術(shù)進行深入分析。分子對接是一種基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計方法，通過模擬小分子化合物與蛋白質(zhì)之間的相互作用，預(yù)測它們的結(jié)合模式和親和力。在本研究中，選取在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用的關(guān)鍵蛋白，如雄激素受體（AR）、表皮生長因子受體（EGFR）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等。利用AutoDock軟件進行分子對接模擬，將異甘草素的三維結(jié)構(gòu)與這些關(guān)鍵蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進行對接。在對接過程中，設(shè)置合適的參數(shù)，如搜索空間、能量計算方法等，以確保對接結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過分子對接模擬，計算異甘草素與關(guān)鍵蛋白之間的結(jié)合能，結(jié)合能越低，表示兩者之間的親和力越強，相互作用越穩(wěn)定。篩選出結(jié)合能較低的異甘草素-蛋白復(fù)合物，這些蛋白即為異甘草素的潛在作用靶點。同時，分析異甘草素與潛在靶點之間的結(jié)合模式，包括氫鍵、疏水相互作用等，為進一步理解它們之間的相互作用機制提供依據(jù)。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫查詢和分子對接分析，初步篩選出一系列異甘草素作用于前列腺癌的潛在靶點。這些靶點涉及多個生物學(xué)過程和信號通路，如細胞增殖、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。將篩選出的潛在靶點進行匯總和整理，構(gòu)建異甘草素作用于前列腺癌的潛在靶點網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape軟件對靶點網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，該軟件是一款功能強大的生物網(wǎng)絡(luò)分析工具，能夠直觀地展示靶點之間的相互關(guān)系和網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)。在Cytoscape軟件中，將潛在靶點作為節(jié)點，靶點之間的相互作用作為邊，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型。通過分析網(wǎng)絡(luò)模型中的節(jié)點度、中介中心性等參數(shù)，確定網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點。節(jié)點度表示與該節(jié)點相連的邊的數(shù)量，節(jié)點度越高，說明該靶點在網(wǎng)絡(luò)中的連接性越強，可能在異甘草素抑制前列腺癌的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。中介中心性則反映了節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中信息傳遞的重要性，中介中心性較高的靶點可能在信號通路中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。通過對靶點網(wǎng)絡(luò)的分析，初步確定了幾個核心潛在靶點，如AKT1、MAPK1等，為后續(xù)的靶點驗證實驗提供了重要的研究對象。4.3.2靶點驗證實驗為了驗證預(yù)測靶點與異甘草素的相互作用及對前列腺癌的影響，設(shè)計并開展了一系列嚴謹?shù)膶嶒?。首先，采用免疫共沉淀（Co-IP）實驗驗證異甘草素與預(yù)測靶點蛋白之間的直接相互作用。以AKT1蛋白為例，將PC-3和DU145細胞分別分為對照組和異甘草素處理組。異甘草素處理組加入濃度為IC50值的異甘草素溶液，對照組加入等體積的含有0.01%DMSO的培養(yǎng)基。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時后，收集細胞。用預(yù)冷的PBS沖洗細胞2-3次，去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的細胞裂解液（如含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液