第第頁(yè)共26頁(yè)耐受重金屬的海洋微生物的篩選及相應(yīng)性質(zhì)研究ScreeningofMarinemicroorganismtoleranttoheavymetalsandstudyofcorrespondingcharacteristics摘要:近幾年來(lái)，伴隨著農(nóng)業(yè)，尤其是工業(yè)的快速發(fā)展，導(dǎo)致我國(guó)重金屬污染愈加嚴(yán)重，不僅嚴(yán)重?fù)p害我國(guó)的經(jīng)濟(jì)，而且會(huì)危及動(dòng)植物正常生長(zhǎng)和人類健康，解決此類問(wèn)題迫在眉睫。常見(jiàn)的處理重金屬污染的方法有物理修復(fù)法和化學(xué)修復(fù)法。近幾年來(lái)，生物修復(fù)技術(shù)，尤其是微生物修復(fù)技術(shù)越來(lái)越受到大家的關(guān)注。本文首先從海泥中分離培養(yǎng)微生物，然后從所分離培養(yǎng)的微生物中篩選耐受重金屬能力較高的菌株。經(jīng)過(guò)系列篩選，其中9號(hào)菌株耐受重金屬能力最強(qiáng)，隨后對(duì)9號(hào)菌株提取總DNA進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增，并根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行菌株鑒定。根據(jù)16SrDNA的序列測(cè)定結(jié)果，通過(guò)序列比對(duì)及聚類分析表明，9號(hào)菌株與蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）具有很高同源性，并將其命名為BacilluscereusWSM-9。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)此菌株對(duì)不同重金屬的耐受性進(jìn)行了相關(guān)測(cè)定。關(guān)鍵詞：Bacilluscereus耐受重金屬生物修復(fù)技術(shù)PCR擴(kuò)增序列測(cè)定Abstract:Inrecentyears,alongwithagriculture,especiallytherapidindustrialdevelopment,leadstoheavymetalpollutionincreasinglyseriousinourcountry,notonlyseriouslydamageourcountry'seconomy,andthreatenanimalandplantnormalgrowthandhumanhealth,andsolvesuchproblemsisimminent.Thecommonmethodsofdealingwithheavymetalpollutionincludephysicalandchemicalrepairmethods.Inrecentyears,bioremediationtechnology,especiallymicrobialrepairtechnology,hasattractedmoreandmoreattention.Inthispaper,microorganismswereisolatedfromseamud,andthestrainswithhighresistancetoheavymetalswerescreenedfromthemicroorganismsisolatedandcultured.Afteraseriesofscreening,no.9strainwasthemostresistanttoheavymetals,andthenthetotalDNAwasextractedbythe9straintocarryoutthePCRamplificationof16SrDNA,andthebacterialstrainwasidentifiedaccordingtothesequencingresults.Accordingtothesequencingresultsof16SrDNA,thesequencealignmentandclusteranalysisshowedthatthestrain9wasveryhomologouswithBacilluscereus,andwasnamedBacilluscereusWSM-9.Atthesametime,thetoleranceofdifferentheavymetalsinthisstrainwasdetermined.

Keywords:BacilluscereusheavymentalbioremediationPCRamplificationSequencedetermination目錄任務(wù)書(shū) 1學(xué)術(shù)聲明 4摘要 56872第一章引言 8107121.1微生物的吸附作用 87391.2微生物對(duì)重金屬離子的轉(zhuǎn)化作用 8TOC\o"1-3"\h\u6872第二章材料與方法 10107122.1實(shí)驗(yàn)材料 10107122.1.1實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 102.7391.2實(shí)驗(yàn)試劑及藥品 102.35341.3實(shí)驗(yàn)菌株 112.292741.4主要溶液和培養(yǎng)基及其配制 1178042.2實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1240252.2.1實(shí)驗(yàn)流程 1246762.2.2海洋微生物的分離培養(yǎng)與篩選 1287762.2.2.1海洋微生物的分離培養(yǎng) 1271682.2.2.2海洋微生物的篩選 13146462.2.316SRNA序列測(cè)定進(jìn)行菌種鑒定 13237722.2.3.1菌落PCR擴(kuò)增 13182472.2.3.21%瓊脂糖凝膠電泳 14160632.2.4不同重金屬條件對(duì)菌株的影響 1426004第三章結(jié)果與討論 17118823.1結(jié)果與分析 17122493.1.1海洋微生物的分離培養(yǎng) 1771393.1.2對(duì)重金屬耐受性較強(qiáng)的菌株的篩選 17148983.1.39號(hào)菌株的鑒定 18239823.1.4不同重金屬條件對(duì)9號(hào)菌株的生長(zhǎng)條件的影響 19181633.2討論 2225379參考文獻(xiàn) 2419718致謝 26第一章引言自20世紀(jì)以來(lái)工業(yè)技術(shù)迅猛發(fā)展，人類越來(lái)越大范圍的利用重金屬，招致環(huán)境中的各種污染物也就越來(lái)越多。其中重金屬是環(huán)境污染的重要污染物之一，因?yàn)樗哂袦魰r(shí)間很長(zhǎng)、毒性較大、不容易分解等特點(diǎn)，所以一旦出現(xiàn)環(huán)境中的重金屬的濃度超標(biāo)，就會(huì)引起極大的不適，影響周邊的動(dòng)植物正常生長(zhǎng)，而且一旦環(huán)境遭到破壞極難緩解嚴(yán)肅的情況。 海洋生物資源不僅可以如傳統(tǒng)般作為人類食物的重要來(lái)源，而且可以提供重要的醫(yī)藥原料和工業(yè)原料。所以面對(duì)如此豐富的大自然資源，應(yīng)該合理妥善的利用，以期為人類發(fā)展拓展方向。 近幾年來(lái)，伴隨著工農(nóng)業(yè)的開(kāi)展，我國(guó)重金屬污染情況愈加嚴(yán)重重金屬污染不僅嚴(yán)重污染環(huán)境，還可對(duì)人類身體健康造成巨大的危害。微生物修復(fù)技術(shù)，已成為當(dāng)今世界乃至全球的研討熱點(diǎn)。微生物可以通過(guò)吸收、沉淀、共價(jià)轉(zhuǎn)化等多種方式，降低重金屬毒性[1]。1.1微生物的吸附作用：王瑞興等發(fā)現(xiàn)鈣離子和鎘離子能通過(guò)微生物的共沉淀作用析出[2]，從而降低了重金屬的濃度。劉建英等發(fā)現(xiàn)有機(jī)陰離子能使螺旋藍(lán)細(xì)菌把重金屬進(jìn)行富集，乙酸根有解吸附作用而檸檬酸根卻有促進(jìn)吸附的作用[3]。此外，微生物對(duì)重金屬的吸附固定作用可能會(huì)受到環(huán)境的pH、溫度、吸附劑種類、吸附劑使用等多種因素的影響。微生物的吸附作用是指微生物本身經(jīng)過(guò)多種辦法吸附廢水中的重金屬離子，最終通過(guò)固液分離去除廢水中的重金屬離子。微生物復(fù)雜的結(jié)構(gòu)以及和不同金屬間親和力的差異決定了微生物吸附重金屬原理的復(fù)雜性。2.微生物對(duì)重金屬離子的轉(zhuǎn)化作用：通過(guò)微生物的金屬轉(zhuǎn)化作用，如大多數(shù)的氧化還原或烷基取代作用等，能夠?qū)⒅亟饘購(gòu)囊环N化合價(jià)轉(zhuǎn)化為另一種化合價(jià)或者一種形態(tài)變成另一種形態(tài)。除了通過(guò)氧化金屬離子外，微生物還可以還原一些重金屬，例如不溶性的Pu還原成可溶性的Pu。此外，微生物還能產(chǎn)生影響重金屬活性的物質(zhì)，比如微生物可以產(chǎn)生簡(jiǎn)單有機(jī)物、腐殖酸和富里酸或其它物質(zhì)，都能絡(luò)合環(huán)境中的重金屬離子，實(shí)現(xiàn)重金屬離子形態(tài)間的轉(zhuǎn)化。Chanmugathas和Bollag報(bào)道，土壤微生物新陳代謝比較活躍,增加了對(duì)鎘的轉(zhuǎn)化[4]。Kurek和Bollag比較了碳源條件發(fā)生改變后，微生物并不促進(jìn)鉛、鎘、鋅、銅等重金屬的溶解，但假如同時(shí)加入葡萄糖作為碳源，一段時(shí)間后，不滅菌處理的淋洗液中重金屬離子濃度比滅菌處理的更高[5]。原核微生物主要通過(guò)減少重金屬的排放來(lái)減少重金屬離子的攝取，增加重金屬的排放控制胞內(nèi)金屬離子的濃度[6]。細(xì)菌通過(guò)改變重金屬的形態(tài)而改變毒性。真核微生物減少活性游離態(tài)重金屬離子，主要原因是其體內(nèi)的金屬硫蛋白可以鰲合重金屬離子。根據(jù)微生物耐受重金屬污染能力，一般認(rèn)為：真菌>細(xì)菌>放線菌[7]。用一些物理、化學(xué)的方法處理（如用酸、堿浸泡或加熱等方法）微生物，可以改變微生物的吸附能力。Murugesan等將一種從茶樹(shù)上分離得到的真菌(Teafungus)用化學(xué)方法處理后，發(fā)現(xiàn)對(duì)砷的生物吸附大大增加，幾乎完全去除，較對(duì)照組高出40%[8]。李清彪等的研究也發(fā)現(xiàn)，用0.2mol/L的NaOH溶液處理白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)的菌絲球后，發(fā)現(xiàn)它對(duì)一定濃度的鉛溶液的吸附率達(dá)到了95%以上，明顯大于未經(jīng)堿處理的白腐真菌的吸附量(66.64%)[9]。深海微生物生活在較為極端的生態(tài)環(huán)境中，在長(zhǎng)期的自然選擇情況下，從而形成了極為特殊的生理生化結(jié)構(gòu)和環(huán)境適應(yīng)機(jī)制就這樣形成了[10]，同時(shí)也可能會(huì)產(chǎn)生許多具有特殊性質(zhì)的生物活性物質(zhì)[11]。由于深海微生物培養(yǎng)條件具有比較特殊、培養(yǎng)的比較困難等多種特點(diǎn)[12]，并且在這種影響下國(guó)內(nèi)外關(guān)于深海微生物的探究還處于比較初級(jí)階段[13]。近幾年表明，海洋生物種類繁多，部分微生物的耐受重金屬的能力較強(qiáng)。本文從海泥中分離培養(yǎng)對(duì)重金屬耐受性較高的微生物，并對(duì)篩選出的對(duì)所篩選的耐受性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增，根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行菌種鑒定，并測(cè)定其對(duì)不同重金屬的耐受性，以期為重金屬污染的生物修復(fù)提供素材和相應(yīng)理論依據(jù)。材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備UPY-111-103型純水機(jī)四川優(yōu)普超純科技有限公司HC-100恒溫混勻儀 杭州佑寧儀器有限公司SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司生物安全柜上海力申科學(xué)儀器有限公司超低溫冰箱上海力申科學(xué)儀器有限公司恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海力申科學(xué)儀器有限公司恒溫振蕩器上海力申科學(xué)儀器有限公司ZHWY-1102C型雙層恒溫?fù)u床上海智城分析儀器制造有限公司XP基因擴(kuò)增儀杭州博日科技有限公司多功能水平電泳槽（DNA）美國(guó)Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司微波爐合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司高壓滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠臺(tái)式高速離心機(jī)上海力申科學(xué)儀器有限公司小型臺(tái)式離心機(jī)上海力申科學(xué)儀器有限公司酶標(biāo)儀杭州博日科技有限公司電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司722N可見(jiàn)分光光度計(jì)上海佑科儀器有限公司Cary50UV-VIS紫外分光光度計(jì)美國(guó)Varian公司2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及藥品氯化鈉分析純蛋白胨生物試劑酵母膏生物試劑氯化鋅 分析純硫酸銅分析純硝酸鉛分析純氯化鉻分析純氯化鎘分析純TaqDNA聚合酶康為世紀(jì)生產(chǎn)Agarose生物試劑Trans2KDNAMarker生物試劑溴化乙錠核酸染料索萊寶生產(chǎn)Tris索萊寶生產(chǎn)2.1.3實(shí)驗(yàn)菌株本實(shí)驗(yàn)所用菌株均分離于海泥樣品中，分離培養(yǎng)后由實(shí)驗(yàn)室保存2.1.4主要溶液和培養(yǎng)基及其配制①2216E液體培養(yǎng)基：蛋白胨Tryptone(1%)5g，酵母膏YeastExtract(0.5%)1g，500mL海水溶解，定容至1000mL，115℃高壓滅菌30min。②2216E固體培養(yǎng)基：蛋白胨Tryptone(1%)5g，酵母膏YeastExtract(0.5%)1g，瓊脂粉15g，500mL海水溶解，定容至1000mL，115℃高壓滅菌30min。③CdCl2溶液(0.5mol/L):取1.14gCdCl2溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。用5mL注射器進(jìn)行0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝于1.5mLEP管(1mL/管）中，4℃保存，等待下一步實(shí)驗(yàn)所需。④CuSO4溶液(0.1mol/L):取0.16gCuSO4溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。同種方式濾菌分裝，4℃保存，等待下一步實(shí)驗(yàn)所需。⑤CrCl3溶液(0.1mol/L):取0.1583gCrCl3溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。同種方式濾菌分裝，4℃保存，等待下一步實(shí)驗(yàn)所需。⑥Pb(NO3)2溶液(0.1mol/L):取0.3312gPb(NO3)2溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。同種方式濾菌分裝，4℃保存，等待下一步實(shí)驗(yàn)所需。⑦ZnCl2溶液(0.1mol/L):取0.1615gZnCl2溶解在ddH2O中，然后定容至10mL。同種方式濾菌分裝，4℃保存，等待下一步實(shí)驗(yàn)所需。⑧PCR擴(kuò)增20ul擴(kuò)增體系：模板1ul引物10.5ul引物20.5ul2XTaqmix10ulddH2O8ul⑨瓊脂糖凝膠：瓊脂粉0.2g1×TAE20mL微波爐中加熱反復(fù)加熱，至瓊脂粉溶解并無(wú)氣泡核酸染料＜1ul冷卻至不燙手時(shí)加入核酸染料，混勻，輕輕倒入膠板內(nèi)，大約20min后，輕輕拔掉梳子。2.2實(shí)驗(yàn)方法與步驟2.2.1實(shí)驗(yàn)流程海泥采集樣品→海洋微生物的分離與培養(yǎng)→菌種篩選并優(yōu)化培養(yǎng)→提取DNA進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增→16SrDNA序列測(cè)定→菌種鑒定→不同重金屬耐受性的測(cè)定2.2.2海洋微生物的分離培養(yǎng)與篩選2.2.2.1海洋微生物的分離培養(yǎng)①配制2216E固體培養(yǎng)基200ml，高溫滅菌后，在超凈工作臺(tái)中待其溫度降至不燙手時(shí)，分別倒入平板中，降溫凝固后，無(wú)菌密封保存②中國(guó)科學(xué)院海洋研究所現(xiàn)保存的深海海泥，取出定量放置錐形瓶中，加入些許無(wú)菌水，用玻璃棒多次攪拌搖晃③靜置，分層后，用微量移液槍取上層10ul，用滅菌后的三角玻璃棒均勻涂抹到2216E固體培養(yǎng)基平板上，封口后，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h④培養(yǎng)過(guò)后，培養(yǎng)基中出現(xiàn)多種不同菌落，再次用接種環(huán)將不同形態(tài)的菌種轉(zhuǎn)接到另一個(gè)2216E固體培養(yǎng)基平板上，同樣是在28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h⑤經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接后，菌種得到有效分離并培養(yǎng)，最終將獲得的菌種標(biāo)號(hào)保存。2.2.2.2海洋微生物的篩選不同濃度CdCl2溶液對(duì)多種菌種的影響分別取150ul、300ul、450ul、600ul、1200ulCdCl2溶液(0.5mol/L)分別配成100mL含量為0.5mmol、1.0mmol、1.5mmol、2.0mmol、4.0mmol重金屬的2216E固體培養(yǎng)基，混勻，滅菌后待其溫度冷卻至50℃左右，在超凈工作臺(tái)中分裝倒入平板，冷卻凝固，倒置并進(jìn)行標(biāo)簽標(biāo)識(shí)。將從海泥中分離獲得的多種菌種分別轉(zhuǎn)至含不同濃度的2216E固體培養(yǎng)基平板中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h注意事項(xiàng)：用接種環(huán)接不同菌種時(shí)，應(yīng)將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒至紅色，自然降溫至室溫，再將菌種從原始培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)到含有重金屬的固體平板上，結(jié)束后再次灼燒準(zhǔn)備轉(zhuǎn)接另一種菌，這樣可以有效防止染菌。觀察菌種生長(zhǎng)情況，篩選出耐受重金屬能力最強(qiáng)的菌種，并進(jìn)行培養(yǎng)保存。2.2.316SRNA序列測(cè)定進(jìn)行菌種鑒定2.2.3.1菌落PCR擴(kuò)增表120ul擴(kuò)增體系及用量PCR反應(yīng)體系用量（ul）模板1ul引物10.5ul引物20.5ul2XTaqmix10ulddH2O8ul待測(cè)菌株模板的制備：①在1.5mL離心管中加入100ul無(wú)菌水②從2216E固體培養(yǎng)基中挑取篩選出的菌種1~2環(huán)，放入離心管中并混勻③然后放入100℃的沸水中煮3min，待溫度降到室溫④進(jìn)行12000rpm離心，10min，4℃，取上清，便是模板本實(shí)驗(yàn)所用PCR參數(shù)設(shè)置：97℃預(yù)變性5min，然后開(kāi)始PCR循環(huán)：94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，總共25個(gè)循環(huán)。然后72℃終延伸10min，4℃保存。PCR擴(kuò)增終止后，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳分析，以鑒定PCR擴(kuò)增結(jié)果。2.2.3.21.0%瓊脂糖凝膠電泳（1）稱0.2g瓊脂粉，再量取20mL1×TAE緩沖溶液倒入小錐形瓶中，并在微波爐中加熱1min左右直到瓊脂粉充分溶解，然后在空氣中稍微放置數(shù)分鐘到手可以握住瓶身不燙手時(shí)加0.3ul溴化乙錠核酸染料，充分混勻后緩慢倒入電泳模型中，待冷卻完全凝固成型后小心地拔出電泳梳。（2）將凝固好的凝膠連同模具一起放至電泳槽（注意區(qū)分正負(fù)極），使電泳槽中的TAE緩沖溶液完全浸沒(méi)凝膠表面。取2ulPCR產(chǎn)物與1ulDNALoadingBuffer用移液器打勻后，垂直加到點(diǎn)樣孔中，同時(shí)在另一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入2ulMark作為對(duì)照。注意事項(xiàng)：將液態(tài)凝膠倒入模具時(shí)，切記電泳模型不能傾斜，而且凝膠中不能產(chǎn)生氣泡，否則影響瓊脂糖凝膠的質(zhì)量。（3）打開(kāi)電泳儀，90V恒壓電泳15-20min，停止電泳。（4）取出凝膠置于紫外分析儀下觀察并記錄電泳結(jié)果。2.2.4不同重金屬條件對(duì)菌株的影響查找文獻(xiàn)資料，確認(rèn)本實(shí)驗(yàn)所擬重金屬種類，并分別配制母液濃度如表2：不同重金屬溶液的母液濃度不同重金屬溶液母液濃度（mol/L）CuSO40.1mol/LCrCl30.1mol/LPb(NO3)20.1mol/LZnCl20.1mol/LCdCl20.5mol/L（2）分別按照表3-7取不同重金屬母液加入到含5mL2216E液體培養(yǎng)基的試管中，混勻表3：CuSO4母液配不同終濃度溶液終濃度（mmol）母液用量（ul）1.0mmol502.0mmol1004.0mmol2006.0mmol300表4：取CrCl3母液配不同終濃度溶液終濃度（mmol）母液用量（ul）1.0mmol502.0mmol1004.0mmol2006.0mmol300表5：取Pb(NO3)2母液配不同終濃度溶液終濃度（mmol）母液用量（ul）1.0mmol502.0mmol1004.0mmol2006.0mmol300表6：取ZnCl2母液配不同終濃度溶液終濃度（mmol）母液用量（ul）1.0mmol502.0mmol1004.0mmol2006.0mmol300表7：取CdCl2母液配不同終濃度溶液終濃度（mmol）母液用量（ul）0.5mmol7.51.0mmol151.5mmol22.52.0mmol30設(shè)置對(duì)照組——不含有任何重金屬溶液的2216E培養(yǎng)基在無(wú)菌操作下，從培養(yǎng)菌株的2216E固體培養(yǎng)基平板中挑取一環(huán)菌體分別加到試管中，做好標(biāo)簽，28℃，搖床恒溫培養(yǎng)72h觀察，含有重金屬的培養(yǎng)基需要每隔12小時(shí)將試管取出，搖勻，在超凈工作臺(tái)中分別取出兩組150ul打到96孔板中，操作酶標(biāo)儀，求平均值，分別記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值，72h后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并繪制生長(zhǎng)曲線圖。不含有重金屬溶液的對(duì)照組培養(yǎng)基，則需要每隔2小時(shí)從試管中取出兩組150ul打到96孔板中，使用酶標(biāo)儀測(cè)得OD600值，24h后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并繪制生長(zhǎng)曲線圖。注意事項(xiàng)：將9號(hào)菌種從2216E固體培養(yǎng)基平板上用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到5ml2216E液體培養(yǎng)基試管過(guò)程中，一定不要感染雜菌，否則后期每隔一定時(shí)間段測(cè)量一次的OD600值將會(huì)產(chǎn)生極大誤差，影響實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)。（2）每次測(cè)量時(shí)，也要單獨(dú)用微量移液槍取出兩組150ul2216E培養(yǎng)基，使用酶標(biāo)儀測(cè)得OD600值，并求得平均值，與其作差得到的數(shù)據(jù)是菌株的生長(zhǎng)數(shù)值。第三章結(jié)果與討論3.1結(jié)果與分析3.1.1海洋微生物的分離培養(yǎng)取定量海泥與無(wú)菌水混合，靜置后取上清液，涂布2216E培養(yǎng)基平板上，多次優(yōu)化培養(yǎng)，共得到99株，并相應(yīng)依次編號(hào)1~99，將分離純化的菌株標(biāo)簽4℃保存。3.1.2對(duì)重金屬耐受性較強(qiáng)的菌株的篩選利用多種菌種對(duì)重金屬的耐受能力的差異，配制不同CdCl2濃度梯度，從而篩選出耐受重金屬能力最強(qiáng)的菌種。不同的CdCl2濃度，實(shí)驗(yàn)菌種生長(zhǎng)狀況良好的結(jié)果如下表：表8對(duì)重金屬的耐受性較強(qiáng)的菌株的篩選不同重金屬濃度情況下生長(zhǎng)狀況良好的菌種0.5mmol3、5、7、9、11、15、17、19、21、24、26、28、30、34、42、49、50、52、53、54、55、56、60、61、68、69、70、71、74、76、78、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、95、97、98、991.0mmol9、17、19、21、24、26、53、55、56、60、61、68、69、70、71、74、76、78、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、95、97、98、992.0mmol9、17、19、24、26、53、61、69、74、76、78、84、85、88、91、93、95、98、994.0mmol9、24、26、61、69、84、85、91、98由上面的圖表可知，對(duì)于海洋微生物而言，大部分具有耐受較低濃度的重金屬的能力，但是隨著重金屬濃度的不斷增大，具有較強(qiáng)耐受重金屬能力的菌株逐漸減少，當(dāng)濃度達(dá)到4.0mmol時(shí)，具有較好的生長(zhǎng)狀況的菌株僅僅剩下9株。鑒于綜合比較，9號(hào)菌的耐受重金屬的能力更強(qiáng)，而且菌株形態(tài)良好、生長(zhǎng)狀況較為穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)以9號(hào)菌為實(shí)驗(yàn)研究菌種，進(jìn)一步對(duì)相應(yīng)性質(zhì)進(jìn)行研究。3.1.39號(hào)菌株的鑒定將活化的菌株在2216E固體平板上培養(yǎng)，取出一環(huán)于無(wú)菌水中，加熱處理使細(xì)胞破裂，DNA釋放到液體中，然后離心，取上清液作為模板進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增完成后，再取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。如圖1所示，在1500bp左右出有一條明顯的泳帶，且無(wú)非特異性泳帶出現(xiàn)。隨后將PCR產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。bpMPCR產(chǎn)物1500200500800120020003000450015002005008001200200030004500圖116SrDNA電泳圖圖29號(hào)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)根據(jù)16SrDNA的序列測(cè)定結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明9號(hào)菌與已報(bào)到的的同源性高達(dá)99%。且根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，如圖2，結(jié)果表明9號(hào)菌與蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）在聚類關(guān)系比較近，因此將9號(hào)菌株命名為BacilluscereusWSM-9.3.1.4不同重金屬條件對(duì)9號(hào)菌株的生長(zhǎng)條件的影響對(duì)不同含重金屬CdCl2、ZnCl2、Pb(NO3)2、CrCl3、CuSO4溶液進(jìn)行配制，稱量、溶解、定容，過(guò)濾除菌，分別得到不同濃度的重金屬母液。為測(cè)定9號(hào)菌對(duì)不同重金屬的耐受性，本實(shí)驗(yàn)首先測(cè)定9號(hào)菌的生長(zhǎng)曲線，即在不加重金屬的情況下9號(hào)菌的生長(zhǎng)情況。在試管中加入5ml的2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)9號(hào)菌種，每隔倆小時(shí)取出兩組150ul測(cè)OD600值，24h后整理數(shù)據(jù)得到9號(hào)菌生長(zhǎng)曲線圖。圖3不含重金屬的培養(yǎng)基中菌種的生長(zhǎng)情況如圖3所示，大約培養(yǎng)6小時(shí)左右，9號(hào)菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)旺盛，當(dāng)培養(yǎng)14小時(shí)后，菌株便進(jìn)入穩(wěn)定期，菌株生長(zhǎng)情況幾乎不變，且略有下降，整體表現(xiàn)為典型的“S”型生長(zhǎng)曲線。為了測(cè)定9號(hào)菌對(duì)不同重金屬的耐受性，將9號(hào)菌接種至對(duì)含有不同重金屬的2216E培養(yǎng)基進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，每隔12小時(shí)取樣一次，測(cè)定OD600值，從而確定其生長(zhǎng)情況。圖4含Pb(NO3)2重金屬溶液的培養(yǎng)基中9號(hào)菌的生長(zhǎng)曲線圖圖5含CuSO4重金屬溶液的培養(yǎng)基中9號(hào)菌的生長(zhǎng)曲線圖圖6含CrCl3重金屬溶液的培養(yǎng)基中9號(hào)菌的生長(zhǎng)曲線圖圖7含ZnCl2重金屬溶液的培養(yǎng)基中9號(hào)菌的生長(zhǎng)曲線圖圖8含CdCl2重金屬溶液的培養(yǎng)基中9號(hào)菌的生長(zhǎng)曲線圖如圖4-8所示，9號(hào)菌在較低濃度（0.5mM）的CdCl2、CuSO4、CrCl3、Pb(NO3)2、ZnCl2溶液中培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)雖然緩慢，但仍然符合“S”型生長(zhǎng)曲線的生長(zhǎng)趨勢(shì)，但當(dāng)在濃度較高時(shí)重金屬溶液中培養(yǎng)時(shí)，9號(hào)菌種的生長(zhǎng)極其緩慢。根據(jù)測(cè)定結(jié)果表明，9號(hào)菌對(duì)鉛離子和銅離子的耐受能力最強(qiáng)，高達(dá)2mM。3.2討論本實(shí)驗(yàn)是從中國(guó)科學(xué)院海洋研究所保存的海泥中分離篩選出具有較強(qiáng)耐受重金屬能力的菌株，并對(duì)耐受性較強(qiáng)的9號(hào)菌株進(jìn)行初步的鑒定。根據(jù)16SrDNA的測(cè)序結(jié)果，通過(guò)同源比對(duì)和聚類分析表明，9號(hào)菌株與蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）在進(jìn)化關(guān)系上比較近，因此將9號(hào)菌株命名為BacilluscereusWSM-9。在探究不同濃度的的不同重金屬對(duì)菌種的生長(zhǎng)情況的影響的實(shí)驗(yàn)中，確定篩選出的9號(hào)菌種確實(shí)具有較強(qiáng)的耐受重金屬的能力，為重金屬污染的生物修復(fù)提供素材和相應(yīng)理論依據(jù)。在微生物修復(fù)技術(shù)中，微生物耐受重金屬的作用機(jī)理，大致有三個(gè)原理：一是微生物將重金屬吸附或是轉(zhuǎn)移到體內(nèi)進(jìn)行隔離，降低重金屬的危害；二是微生物將有毒重金屬轉(zhuǎn)化為無(wú)毒金屬離子或其他離子，再排到環(huán)境中，使環(huán)境條件改善；三是微生物的共沉淀作用，微生物使環(huán)境發(fā)生了酸堿pH微變化或是微生物自身釋放的離子與重金屬發(fā)生共沉淀，從而降低環(huán)境中的重金屬污染。查閱資料文獻(xiàn)可知，劉愛(ài)民、黃為一等人曾通過(guò)梯度濃度馴化篩選出一株假單胞菌屬[14]，可以高度耐鎘和富集鎘，其原理是：該菌株能在Cd2+濃度極高的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中存活；Cd2+濃度較低時(shí)菌株主要是起積累作用，其中濃度為100mg/L時(shí)，積累率接近為100%，而當(dāng)Cd2+濃度過(guò)高，菌體也會(huì)出現(xiàn)外排現(xiàn)象。并且當(dāng)pH值為6-8有利于極大提高該假單胞菌株的耐鎘能力。紅外分析和電鏡觀察表明，該假單胞菌株的細(xì)胞壁起了重要的吸附作用，大約過(guò)半的Cd2+吸附在細(xì)胞壁上。為確定9號(hào)菌株對(duì)重金屬污染的生物修能力，其耐受重金屬的機(jī)制可設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的探討。參考文獻(xiàn)SingS,KangSH,MulchandaniA,etal.Bioremediation:environmentalclean-upthroughpathwayengineering(J)CurrOpinBiotechnol,2008,19：437-444PavelK,MartinaM,TomasM.MicrobialBiosorptionofMetals(M).SpringerScience:BusinessMediaBV,2011:320王瑞興，錢春香，吳淼等微生物礦化固結(jié)土壤中重金屬研究（J）功能材料，2007,9(38):1523-1530劉建英，徐英賢有機(jī)陰離子對(duì)螺旋藍(lán)細(xì)菌富集重金屬的影響研究（J）環(huán)境科技，2010,23（3）：23-26ChanmugathasPushparany,BollagJM.AcolumnstudyofthebiologicalmobilizationandspeciationofCadmiuminsoil[J].ArchivesofEnvironmentalContaminationandToxicology,1988,17(2):229-237EwaKurek,FrancisandAJ,BollagJM.Immobilizationofcadmiumbymicrobialextracellul