引言南方紅豆杉又名美麗紅豆杉，屬紅豆杉科紅豆杉屬，常綠喬木，我國獨有樹種之一，零散分布于華南、華中、華東和西南地區(qū)，多數(shù)生長在海拔1200米以下地方[1]，是第四紀(jì)冰川運動殘留下來的古老植物，被稱為“植物界活化石”[2]。在經(jīng)濟(jì)、園林和藥用方面均有較高的價值，其木材結(jié)實耐用，曬干后很少開裂，可用作于建筑、家具、耕具、文具等方面[3]。在其樹皮提取的紫杉醇具有獨特的抗癌機理，使得南方紅豆杉具有更高的開發(fā)價值[4]。因其種子的生物學(xué)特性：種子產(chǎn)量少、自然萌發(fā)率低及種群的遺傳特性，南方紅豆杉自然繁殖率很低[5]。隨著癌癥發(fā)病率增高，對紫杉醇的需求量日益劇增，我國野生紅豆杉資源遭受到了嚴(yán)重的破壞，部分區(qū)域野生紅豆杉已經(jīng)瀕臨滅絕，南方紅豆杉現(xiàn)已被列入“國家級瀕危保護(hù)植物”[6]。近年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者致力于南方紅豆杉的生態(tài)學(xué)、分子學(xué)等研究。目前有關(guān)南方紅豆杉的研究主要集中在南方紅豆杉的人工繁殖、紫杉醇的化學(xué)提取合成、微生物、基因工程和種子休眠機制等方面[7-10]。而轉(zhuǎn)錄組分析方面主要集中在已公布的南方紅豆杉根莖葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[11]，南方紅豆杉種子解除休眠和萌發(fā)過程中的基因差異相關(guān)報道甚少。因此利用植物生物信息學(xué)技術(shù)研究南方紅豆杉的種胚萌發(fā)時的基因差異具有極為重要的意義和經(jīng)濟(jì)價值。文章利用第二代測序技術(shù)對南方紅豆杉種胚進(jìn)行測序，分析討論南方紅豆杉種胚解除休眠和萌發(fā)過程中基因表達(dá)差異。1.1離體胚培養(yǎng)研究綜述離體胚培養(yǎng)是一種廣泛應(yīng)用于植物育種的技術(shù)。該項技術(shù)可克服雜種胚敗育、遠(yuǎn)緣雜交不親和性的問題[12]。尚富德[13]通過對野生棉和栽培棉種間雜交胚珠離體培養(yǎng)研究結(jié)果表明，雜交胚在發(fā)育后期因為胚和胚乳、胚和母體組織發(fā)育的不協(xié)調(diào)會導(dǎo)致形成畸形胚或者死胚，在球形胚時期進(jìn)行離體培養(yǎng)，改變了這種不協(xié)調(diào)關(guān)系，因此會產(chǎn)生較多的雜種胚。張智英[14]對核桃進(jìn)行雜交胚的離體培養(yǎng)也得到相同結(jié)論。離體胚培養(yǎng)技術(shù)也能有效克服種子休眠問題，達(dá)到快速育苗的目的。趙沛基[15]對云南紅豆杉進(jìn)行離體胚培養(yǎng)，不僅改善了云南紅豆杉種子需經(jīng)兩年休眠期才能萌發(fā)的問題，還有效的縮短了成苗時間。1.2轉(zhuǎn)錄組研究綜述轉(zhuǎn)錄組分析是研究植物表型的最通常的方法，可以在較短的時間里了解細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用。董昂等[16]對山核桃種子生長發(fā)育過程進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組的初步分析，在山核桃種子的生長發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了21個參與脂類合成的途徑，571個相關(guān)基因。林萍等[17]對普通油茶種子的4個發(fā)育時期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，確定了21789條有編碼蛋白功能的unigene。李雨霖等[18]對亞麻芥處于不同發(fā)育時期的種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的測序及分析，并應(yīng)用生物信息學(xué)的原理及方法對亞麻薺種子發(fā)育過程中基因表達(dá)差異和功能注釋進(jìn)行分析。張琳[19]對擬南芥種子發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組深度測序數(shù)據(jù)結(jié)果的分析成功構(gòu)建擬南芥種子成熟的關(guān)鍵基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。張彥[20]對江南卷柏抱子發(fā)育進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并將其與擬南芥種子成熟發(fā)育中的轉(zhuǎn)錄組特征進(jìn)行比較，篩選得到在種子成熟發(fā)育時期有654個特異上調(diào)表達(dá)的基因和850個下調(diào)表達(dá)的基因。陶濤[21]對萌發(fā)期澳洲棉與亞洲棉種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及其差異表達(dá)分析。而對于南方紅豆杉，相應(yīng)的研究較少，Hao等[22]首次采用IlluminaHiseq2000(Illumina,SanDiego,CA,USA)測序和生物信息學(xué)方法，對紅豆杉已知和新的小RNA進(jìn)行了鑒定、鑒定和描述，確定了一些高度保守和已知的非保守微RNA的預(yù)測靶點。李炎林[11,23]以現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝和分析，并以此為基礎(chǔ)對紅豆杉的進(jìn)行大規(guī)模的SSR分子標(biāo)記挖掘，成功構(gòu)建紅豆杉屬植物的Unigenes數(shù)據(jù)庫。1.3南方紅豆杉研究進(jìn)展自然條件下，南方紅豆杉種子需要經(jīng)過兩冬一夏才能萌發(fā)[7]。近年來，諸多學(xué)者致力于研究南方紅豆杉種子萌發(fā)時的一些生理變化以尋求提高種子萌發(fā)率的方法。史忠禮等[24]通過對南方紅豆杉種子體眠機理的研究，得出結(jié)論：南方紅豆杉的種皮堅硬透性差，以及胚發(fā)育過程需要生理后熟，屬于綜合型體眠。而譚一凡[25]通過對南方紅豆衫種子后熟生理的研究結(jié)果表明，在南方紅豆杉種子發(fā)育到形態(tài)成熟時，最初不能萌發(fā)的根本原因是種胚發(fā)育不夠完全。而種皮透性的不良以及存在種內(nèi)抑制物，是種胚在后熟過程中發(fā)育緩慢的主要因素，而經(jīng)過層積處理后，可以明顯提高種子的發(fā)芽率和成苗率。朱念德[26]通過對南方紅豆杉種胚的發(fā)育現(xiàn)象、外種皮的結(jié)構(gòu)以及種子各部分抑制物質(zhì)相對活性的研究認(rèn)為，種子形態(tài)成熟時，種胚處于基本成熟階段，離體培養(yǎng)可以快速生長成苗。在胚乳存在的抑制物質(zhì)和外種皮的相對不透氣性可能是抑制南方紅豆杉種子萌發(fā)的因素，但ABA的存在不是萌發(fā)的抑制因素。黃儒珠等[27]通過實驗表明，脫除外被蠟質(zhì)層的南方紅豆杉種子，經(jīng)低-暖-低變溫層積和經(jīng)過植物生長調(diào)節(jié)劑及微量元素處理，120d后休眠解除。而且變溫層積處理后，種子胚的發(fā)育逐漸完善，種子內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸和可溶性糖含量都明顯有所提高，因此認(rèn)為脂肪等貯藏物質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化和利用可能是解除南方紅豆杉種子休眠的關(guān)鍵所在。這與吉前華等[28]所做結(jié)論類似。張艷杰等[4]對南方紅豆杉種子的各部分甲醇浸提液進(jìn)行了生物檢測，并通過GC-MS聯(lián)用儀鑒定。得出結(jié)論：南方紅豆杉的種子中種皮、內(nèi)種皮和胚乳的浸提液對白菜種子的發(fā)芽率及幼苗的高生長、根生長均有抑制作用，并且抑制作用的程度隨浸提液濃度的增大而增強。同時，從南方紅豆杉種子的胚乳和中種皮、內(nèi)種皮中鑒定得出多種有機化合物，并明確了它們的種類和相對含量，其中包括已經(jīng)報道的正庚酸、壬酸、乙酸等發(fā)芽抑制物質(zhì)。表明南方紅豆杉種子的中種皮、內(nèi)種皮和胚乳中都含有種子萌發(fā)抑制物和抑制幼苗生長的物質(zhì)。年慧慧[29]將所提取種子浸提液作用于油菜種子，得到同樣的趨勢規(guī)律。李曉琳等[10]根據(jù)前人所做研究得出南方紅豆杉種子生理休眠的主要原因是萌發(fā)抑制物的存在，而種子成熟時種胚是否發(fā)育完全以及種皮透性對種子的萌發(fā)是否有影響仍存在很大爭議，有待進(jìn)一步研究。1.3.1南方紅豆杉種胚離體培養(yǎng)研究現(xiàn)狀為了滿足紫杉醇大量需求，對紅豆杉屬植物的大規(guī)?？焖俜敝尺M(jìn)行了大量的探索，包括扦插、胚培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等。而越來越多的實驗證明，離體胚培養(yǎng)有潛力成為快速、大量繁殖南方紅豆杉的最有效的方法之一。梅興國[30]對紅豆杉離體胚培養(yǎng)快速育苗的實驗研究表明，離體胚培養(yǎng)技術(shù)打破南方紅豆杉種子休眠機制，使休眠期較長的紅豆杉種子在短期內(nèi)迅速成苗，且萌發(fā)率較高。目前，學(xué)者通過研究培養(yǎng)基和條件來進(jìn)一步提高種子萌發(fā)率。曾余力[31]的實驗表明南方紅豆杉最優(yōu)滅菌處理為2.5%的NaClO真空滅菌l0min，其污染率僅為6%，而出苗率可高達(dá)86%。基本培養(yǎng)基對南方紅豆杉離體胚生長影響較大，WPM培養(yǎng)基是南方紅豆杉胚培養(yǎng)的最佳基本培養(yǎng)基。其中在南方紅豆杉離體種胚培養(yǎng)中，不加細(xì)胞分裂素時試管苗生長最好，添加細(xì)胞分裂素可分化產(chǎn)生不定芽，在同樣培養(yǎng)基中，南方紅豆杉萌動種胚較未萌動的種胚更易誘導(dǎo)不定芽的分化。臧新等[32]將南方紅豆杉種子低溫處理一個月，再用流水沖洗之后，利用B5培養(yǎng)基對南方紅豆杉離體胚進(jìn)行25℃散光培養(yǎng)，南方紅豆杉種胚的萌發(fā)率和成苗率分別可達(dá)66.7%和50%。Tafreshi等[33]對紅豆杉也進(jìn)行了胚培養(yǎng)試驗，采用1/2培養(yǎng)基+0.8g/LPVP或5g/L活性炭+3%蔗糖+5.8g/L瓊脂，pH為5.7±0.05，在種子用流水沖洗7d后進(jìn)行胚培養(yǎng)，14d后可獲得100%萌發(fā)率；而沒有經(jīng)過流水沖洗的種子，胚培養(yǎng)的萌發(fā)率為85%；將萌發(fā)后的幼苗移至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)，可獲得90%的成苗率。1.3.2南方紅豆杉分子研究進(jìn)展紅豆杉的研究主要集中于快速繁殖、紫杉醇提取等方面，其分子學(xué)的研究卻相對滯后[34]。分子標(biāo)記方面，武星彤[35]利用RFLP-PCR技術(shù)，從植物葉綠體的通用引物數(shù)據(jù)庫中篩選得到了48個適合用于南方紅豆杉的標(biāo)記位點，發(fā)現(xiàn)有兩個具有特殊用途的位點，線粒體SSR位點(Taxus-mtB01)可用于檢測不同地域(群體)南方紅豆杉種子的來源和擴(kuò)散路徑；核基因組插入一缺失位點(Taxus-indel)可用于作為DNA條形碼，可以對大部分紅豆杉屬的物種有效地進(jìn)行鑒別。鄭超[36]采用RAPD標(biāo)記研究了4種紅豆杉屬植物的68個單株的遺傳多樣性，并采用UPGMA方法對68個單株的遺傳關(guān)系分析，結(jié)果表明南方紅豆杉和須彌紅豆杉遺傳距離最近。Hao[37]使用數(shù)字基因表達(dá)系統(tǒng)研究了三種紅豆杉組織的轉(zhuǎn)錄組差異并鑒定了大量與組織特異性功能和紫杉烷生物合成途徑相關(guān)的基因。其中紫杉烷生物合成基因在根中的表達(dá)明顯高于在葉和莖中的表達(dá)，而代謝組學(xué)分析同樣也揭示了紫杉烷生產(chǎn)途徑在根中具有高活性。Lun等[38]從南方紅豆杉中新提取了一種命名為taxiwallinine的紫杉烷二萜類化合物并篩選用于對人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的細(xì)胞毒性作用，他們認(rèn)為這種新的紫杉烷二萜類化合物可能是一個潛在的抗腫瘤產(chǎn)品。1.3研究目的及意義本實驗通過對南方紅豆杉離體胚培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，找到南方紅豆杉種胚解除休眠和萌發(fā)過程中基因表達(dá)差異，此研究結(jié)果拓寬了南方紅豆杉的分子遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，為更深層次地研究南方紅豆杉種子萌發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。2材料與方法2.1離體胚的獲取將南方紅豆杉種子置于蒸餾水中浸泡，使種仁吸脹，種子浸泡48h后去除種殼。種仁以75%酒精消毒2min，2.5%NaClO溶液消毒10min之后用無菌水沖洗4次，在無菌濾紙上剝離種胚接種于B5培養(yǎng)基（蔗糖20g/L，瓊脂8g/L，活性炭3g/L，PH=5.8）上，以上操作于超凈工作臺進(jìn)行。將種胚置于25℃恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)7d（B）、14d（C）、21d（D），沒有進(jìn)行培養(yǎng)的胚作為對照，0d（A）。測量不同時期的離體胚的長度與重量，并對胚超顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。2.2RNA提取與質(zhì)量檢測每個時期樣品做3個重復(fù)，從組織樣品中提取總RNA，四個時期共12個RNA樣品。對提取的RNA樣品用Nanodrop2000進(jìn)行濃度和純度檢測，RNA完整性用瓊脂糖凝膠電泳檢測，RIN值利用Agilent2100進(jìn)行測定。2.3測序數(shù)據(jù)分析（1）原始數(shù)據(jù)的處理先將Illumina測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)通過BaseCalling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，得到最原始的測序數(shù)據(jù)。將原始數(shù)據(jù)中的測序接頭序列、低質(zhì)量讀段、N率較高序列及長度過短序列進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)(cleandata)以保證后續(xù)分析的順利進(jìn)行。（2）序列的組裝獲得RNA-seq高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)后用Trinity軟件對所有cleandata進(jìn)行從頭組裝，需要將所有測序讀段通過從頭組裝生成重疊群(contig)和單一序列(singleton)。（3）Unigene的功能注釋、Go分類和Pathway富集性分析將拼接所得所有核苷酸序列，使用BlastX分別與NR、String、Swissprot、KEGG、Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對獲得相應(yīng)的注釋信息。3結(jié)果與分析3.1RNA質(zhì)量檢測每個時期3個樣品共12個樣品，對12個樣品提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。12個樣品RNA條帶清晰，無色素、蛋白、糖類等雜質(zhì)污染，28/23S亮度大于18/16S。樣品RNA的OD260/280均大于1.8，OD260/230均大于1.5，RIN值均大于8.0，RNA濃度及總量滿足兩次建庫需求，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。3.2轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果4個采樣時間點12個樣品測序共得到原始讀長667915734個，清潔讀長（Cleanreads）653544514個，后者占97.85%。對測序結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)錯誤率低，質(zhì)量可信，可用于后續(xù)分析。組裝后共獲得轉(zhuǎn)錄本213274條，Unigene為每個基因中最長的轉(zhuǎn)錄本；從所有轉(zhuǎn)錄本中共獲得78154個不同長度的Unigene，占總轉(zhuǎn)錄本數(shù)的36.64%，N50為1894bp（表1）。表1組裝結(jié)果統(tǒng)計表Table1Statisticaltableofassemblyresults3.3基因功能注釋結(jié)果將所得的Unigenes對比到5大功能數(shù)據(jù)庫中，分別注釋到各數(shù)據(jù)庫的個數(shù)及占總Unigenes比例為：NR:29650（37.94%）、Swissprot:20853（26.68%）、String：8495（10.87%）、KEGG:9794（12.53%）、Pfam:17550（22.46%）最終有3327個Unigenes同時標(biāo)注到5大數(shù)據(jù)庫中，占Unigenes總數(shù)的4.26%（圖1）。圖1Unigene注釋信息Venn圖Fig.1VennAnnotationinformationofunigenes3.3.1GO功能注釋結(jié)果利用GO(GeneOntology)數(shù)據(jù)庫對基因按照其參與的生物過程BP(BiologicalProcess)、分子功能MF(MolecularFunction)及細(xì)胞組分CC(CellularComponent)三個方面進(jìn)行分類注釋。14201個unigenes注釋到56個GO通路中，其中Unigenes注釋數(shù)目最多的是生物過程（圖2）。由圖可見，注釋到生物過程的基因中，最多的是代謝過程(metabolicprocess)8539條、細(xì)胞途徑(cellularprocess)7244條、單一的生物過程(single-organismprocess)5588條、對刺激的反應(yīng)(responsetostimulus)1830條、生物過程調(diào)節(jié)(biologicalregulation)1583條，代謝過程中關(guān)于有機物代謝過程、初級代謝過程與細(xì)胞代謝過程的基因最多；注釋到細(xì)胞組分的基因中，最多的是細(xì)胞(cell)4881條、細(xì)胞原件(cellpart)4881條和細(xì)胞器(organelle)3638條；注釋分子功能的基因中，最多的是催化活性(catalyticactivity)7508條、結(jié)合(binding)7252條和轉(zhuǎn)運子活性(transporteractivity)2954條。圖2GO功能注釋結(jié)果Fig.2GOFunctionalAnnotationResult3.3.2KEGGPathway功能注釋結(jié)果將基因根據(jù)參與的KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)代謝通路分為5個分支：代謝(A，Metabolism)，遺傳信息處理(B，GeneticInformationProcessing)，環(huán)境信息處理(C，EnvironmentalInformationProcessing)，細(xì)胞過程(D，CellularProcesses)，有機系統(tǒng)(E，OrganismalSystems)。從圖3中可以看出Unigenes分到最多的是代謝，占總基因數(shù)的66.92%；其次是與遺傳信息處理有關(guān)的通路，占基因總數(shù)的20.25%，在南方紅豆杉種胚萌發(fā)過程中基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和能量消耗及其重要。圖3KEGGPathway功能注釋結(jié)果Fig.3KEGGPathwayFunctionalAnnotationResults3.4差異表達(dá)基因分析3.4.1差異表達(dá)基因數(shù)量變化南方紅豆杉種胚在萌發(fā)各階段基因調(diào)控有很大的差別，對不同階段的基因表達(dá)情況進(jìn)行比較，上調(diào)和下調(diào)的Unigenes數(shù)目變化較大，萌發(fā)期間，B期與A期比較(AvsB)上調(diào)基因9358個，下調(diào)基因11411，C期與B期比較(BvsC)上調(diào)基因4282圖4差異表達(dá)基因比較圖Fig.4Mapofdifferentiallyexpressedunigenes個，下調(diào)基因1774個，D期與C期比較(CvsD)上調(diào)基因1333個，下調(diào)基因287（圖4），種胚萌發(fā)前期基因表達(dá)變化較大，而反觀萌發(fā)后期，A期與C期(AvsC)、A期與D期比較(AvsD)基因表達(dá)變化都較小。3.4.2差異表達(dá)基因GO分析將差異基因進(jìn)行GO功能注釋分析，差異基因集中最多的前18個通路，屬于生物過程的最多，分子功能的最少。其中生物過程集中的較多的依次是代謝過程、細(xì)胞過程、單一有機體過程、對刺激的反應(yīng)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、生物調(diào)劑、定位、生物調(diào)節(jié)、定位的建立以及生物過程調(diào)控；細(xì)胞組分中基因差異較大的是細(xì)胞與細(xì)胞器；分子功能中催化活性差異和結(jié)合通路基因差異較大（圖5）。在南方紅豆杉種子萌發(fā)過程中，基因表達(dá)差異較大的18個通路中的上調(diào)基因高于下調(diào)基因，比較不同時期的差異基因可知，南方紅豆杉種胚萌發(fā)時前期的差異基因多于后期的差異基因，萌發(fā)前期代謝過程活躍。圖5差異表達(dá)基因GO分類統(tǒng)計Fig.5GOclassificationstatisticsofDEGs4結(jié)論利用第二代測序技術(shù)對培養(yǎng)0d、7d、14d、21d的南方紅豆杉種胚進(jìn)行測序，分析討論南方紅豆杉種胚解除休眠和萌發(fā)過程中基因表達(dá)差異。通過測序，共得到78154個Unigenes，N50為1894bp。NR注釋結(jié)果顯示，與南方紅豆杉基因最相似的是北美云杉(Piceasitchensis)。GO、COG、KEGGPathway功能注釋結(jié)果顯示，注釋到最多Unigenes的是代謝過程。5討論種子在萌發(fā)過程中不同階段基因表達(dá)存在較大差異，這些基因主要與DNA合成、激素代謝等過程相關(guān)，種胚在種子萌發(fā)過程中主要是發(fā)生細(xì)胞分裂過程，而且萌發(fā)前期比后期活躍。種子休眠解除后萌發(fā)前，必須完成一系列生理過程，包括種子內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)（包括淀粉、蛋白和脂類等）的供給，它們在酶的作用下可被種胚利用[39]。在種子萌發(fā)前期，與細(xì)胞壁代謝有關(guān)的基因表達(dá)較高，在種子萌發(fā)中期，參與氨基酸合成、蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運和酸合成的基因顯著增加，并在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)出與光合代謝相關(guān)的基因，萌發(fā)后期光合作用光合作用相關(guān)基因的表達(dá)變化顯著，總之，種子萌發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝調(diào)控涉及到不同代謝組織水平上的多種反應(yīng)和復(fù)雜的調(diào)控[40]。隨著對南方紅豆杉的深入研究，目前關(guān)于種子休眠機制的研究己進(jìn)入分子水平階段，種子休眠狀態(tài)的解除與種子基因差異表達(dá)變化緊密關(guān)聯(lián)。此次試驗初步分析了種胚萌發(fā)過程中的基因表達(dá)差異，為后續(xù)更深層次研究南方紅豆杉種子解除休眠和萌發(fā)的分子機理研究奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)賀善安.中國珍稀植物[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2001.梁瑞龍,熊曉慶.從遠(yuǎn)古走來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