強(qiáng)心苷類藥物對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)及體外分子機(jī)制解析一、引言1.1研究背景結(jié)腸癌作為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率在全球范圍內(nèi)均呈逐年上升趨勢，已然成為世界各國亟需解決的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)世界流行病學(xué)調(diào)查顯示，結(jié)腸癌在北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等地的發(fā)病率位居內(nèi)臟腫瘤前兩位，即便在發(fā)病率相對較低的亞、非、拉美等地，隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病數(shù)也在持續(xù)攀升。我國的情況同樣不容樂觀，盡管結(jié)腸癌發(fā)病率與死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常見惡性腫瘤，但近年來也呈現(xiàn)出明顯的上升態(tài)勢。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，結(jié)腸癌患者的預(yù)后情況與確診時(shí)的疾病分期密切相關(guān)。如Ⅰ期結(jié)腸癌患者，經(jīng)過手術(shù)治療后，5年存活率可達(dá)90%-95%，這是因?yàn)榇似谀[瘤侵犯較淺，僅局限于黏膜和黏膜下層，且無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；Ⅱ期結(jié)腸癌患者治愈率在60%-80%，此時(shí)腫瘤侵犯已較深，侵及肌層或漿膜層，甚至突破漿膜，但仍無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；Ⅲ期結(jié)腸癌患者除手術(shù)治療外，還需配合化療等輔助治療，治愈率在40%-60%左右，該階段腫瘤已經(jīng)出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；而Ⅳ期結(jié)腸癌患者的5年存活率在40%以下，通常只有百分之十幾，此時(shí)腫瘤已轉(zhuǎn)移至肝、肺等器官，治療難度極大。目前，針對結(jié)腸癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、放化療、免疫治療等。手術(shù)切除是結(jié)腸癌的主要治療手段之一，對于早期結(jié)腸癌患者，手術(shù)切除有可能實(shí)現(xiàn)根治，但手術(shù)治療存在嚴(yán)格的適應(yīng)癥以及局限性，限制了它在大多數(shù)癌癥治療中的運(yùn)用，而且手術(shù)治療只能針對看得見的癌癥細(xì)胞，對隱匿性的癌細(xì)胞無能為力?；瘜W(xué)治療能夠?qū)θ淼陌┘?xì)胞進(jìn)行殺傷，在初期能迅速控制癌細(xì)胞的擴(kuò)散，然而其耐藥性問題突出，對人體免疫系統(tǒng)的巨大損傷和較大的副作用，近年來一直備受爭議。放射療法對局部腫瘤細(xì)胞的殺傷迅速而徹底，但由于定位較難，以及巨大的副作用使其在臨床治療上受到嚴(yán)重局限。免疫治療雖然為結(jié)腸癌治療帶來了新的希望，但也面臨著響應(yīng)率低、價(jià)格昂貴等問題。此外，這些傳統(tǒng)治療方法還普遍存在易復(fù)發(fā)和耐藥性的問題，尤其是晚期結(jié)腸癌患者，療效很難得到保證，患者的生活質(zhì)量和生存周期受到極大影響。因此，尋找新的治療手段，提高結(jié)腸癌的治療效果，改善患者預(yù)后，成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)人類的心血管系統(tǒng)和腫瘤生長之間存在一定的關(guān)聯(lián)。在對心血管疾病藥物的研究過程中，意外發(fā)現(xiàn)部分藥物具有潛在的抗腫瘤作用，這為腫瘤治療開辟了新的研究方向。強(qiáng)心苷類藥物作為治療心血管疾病的經(jīng)典藥物，已在心臟衰竭、心律失常等病癥的治療中得到廣泛應(yīng)用，其主要作用機(jī)制是通過激活Na?/K?-ATP酶來增強(qiáng)心肌收縮力和心排血量，從而達(dá)到強(qiáng)化心力的作用。近年來，越來越多的研究表明，強(qiáng)心苷類藥物不僅對心血管系統(tǒng)疾病有效，在抗腫瘤領(lǐng)域也展現(xiàn)出一定的潛力。已有研究證實(shí)，波形酮和去氧地酸等強(qiáng)心苷類藥物對人類前列腺癌、乳腺癌和肝癌細(xì)胞均具有抑制作用。在前期的高通量篩選中，也發(fā)現(xiàn)一些強(qiáng)心苷類藥物能夠特異性地殺死人結(jié)腸癌細(xì)胞。然而，目前關(guān)于強(qiáng)心苷類藥物在抗腫瘤方面的作用研究仍處于初步階段，其具體的抗腫瘤作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是在結(jié)腸癌治療中的應(yīng)用及作用機(jī)制，有待進(jìn)一步深入探究。深入研究強(qiáng)心苷類藥物對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用及體外機(jī)制，不僅有助于拓展其在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用，為臨床治療結(jié)腸癌提供新的思路和方法，還可能揭示其潛在的藥用價(jià)值，為開發(fā)新型抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究強(qiáng)心苷類藥物對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用及其體外作用機(jī)制。通過一系列實(shí)驗(yàn)，觀察強(qiáng)心苷類藥物對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等生物學(xué)行為的影響，明確其是否能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，并分析其作用的具體分子機(jī)制。同時(shí)，與傳統(tǒng)結(jié)腸癌治療藥物進(jìn)行對比，評估強(qiáng)心苷類藥物在結(jié)腸癌治療中的潛在優(yōu)勢和應(yīng)用前景，為其進(jìn)一步的臨床研究和應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)腸癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，現(xiàn)有的治療手段存在諸多局限性，迫切需要尋找新的治療方法和藥物。強(qiáng)心苷類藥物作為一類具有獨(dú)特作用機(jī)制的化合物，在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出的潛力為結(jié)腸癌治療帶來了新的希望。深入研究其對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用及體外機(jī)制，一方面有助于揭示強(qiáng)心苷類藥物的抗腫瘤作用本質(zhì)，拓展其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，為開發(fā)新型抗癌藥物提供新的思路和方向；另一方面，有望為臨床治療結(jié)腸癌提供新的治療策略和藥物選擇，提高結(jié)腸癌患者的治療效果和生存質(zhì)量，對改善患者的預(yù)后具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。此外，本研究還有助于加深對心血管系統(tǒng)藥物與腫瘤細(xì)胞相互作用關(guān)系的理解，促進(jìn)不同醫(yī)學(xué)領(lǐng)域之間的交叉融合，為探索更多具有潛在抗腫瘤活性的心血管藥物奠定基礎(chǔ)，推動腫瘤治療領(lǐng)域的創(chuàng)新發(fā)展。二、結(jié)腸癌與強(qiáng)心苷類藥物概述2.1結(jié)腸癌的特征與治療困境2.1.1結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制與流行病學(xué)特征結(jié)腸癌作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制是一個涉及多因素、多步驟的復(fù)雜過程。目前研究表明，結(jié)腸癌的發(fā)生與生活方式、遺傳、環(huán)境等多種因素密切相關(guān)。在生活方式方面，不合理的飲食習(xí)慣被認(rèn)為是結(jié)腸癌發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一。長期攝入高脂肪、高蛋白、低纖維素的食物，會導(dǎo)致腸道內(nèi)膽汁酸和膽固醇的代謝產(chǎn)物增多，這些物質(zhì)可能對腸道黏膜產(chǎn)生刺激和損傷，進(jìn)而增加結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。缺乏運(yùn)動也與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)，長期久坐不動會使腸道蠕動減慢，有害物質(zhì)在腸道內(nèi)停留時(shí)間延長，增加了腸道黏膜與致癌物質(zhì)的接觸機(jī)會。吸煙、過量飲酒等不良生活習(xí)慣，也會對腸道微環(huán)境產(chǎn)生不良影響，可能通過影響腸道菌群的平衡、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等機(jī)制，參與結(jié)腸癌的發(fā)病過程。遺傳因素在結(jié)腸癌的發(fā)生中也起著關(guān)鍵作用。約10%-30%的結(jié)腸癌患者具有遺傳背景，其中一些遺傳性綜合征與結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加相關(guān)。例如，家族性腺瘤性息肉?。‵AP）是一種常染色體顯性遺傳病，由APC基因的胚系突變引起，患者的結(jié)腸和直腸內(nèi)會出現(xiàn)大量腺瘤性息肉，如果不及時(shí)治療，幾乎100%會發(fā)展為結(jié)腸癌。遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC），也稱為林奇綜合征，是由于DNA錯配修復(fù)基因（如MLH1、MSH2、MSH6等）的胚系突變導(dǎo)致，患者發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高8-12倍。此外，一些其他基因的突變或多態(tài)性，如KRAS、BRAF、P53等，也可能影響結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這些基因參與細(xì)胞的增殖、凋亡、DNA修復(fù)等重要生物學(xué)過程，其異常改變可能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。環(huán)境因素同樣對結(jié)腸癌的發(fā)病有著重要影響。工業(yè)化進(jìn)程的加快導(dǎo)致環(huán)境污染日益嚴(yán)重，一些環(huán)境污染物，如化學(xué)物質(zhì)、重金屬、農(nóng)藥等，可能通過飲食、飲水或空氣進(jìn)入人體，對腸道細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，引發(fā)基因突變或細(xì)胞損傷，從而增加結(jié)腸癌的發(fā)病幾率。長期暴露于某些職業(yè)環(huán)境中，如從事石棉、皮革、橡膠等行業(yè)的工作，也與結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)。此外，腸道微生物群的失衡被認(rèn)為是結(jié)腸癌發(fā)生的重要環(huán)境因素之一。腸道微生物群在維持腸道黏膜屏障功能、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝等方面發(fā)揮著重要作用，當(dāng)腸道微生物群的組成和功能發(fā)生改變時(shí)，可能導(dǎo)致腸道微生態(tài)失調(diào)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。從流行病學(xué)數(shù)據(jù)來看，結(jié)腸癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的地域差異。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)腸癌在全球范圍內(nèi)的新發(fā)病例數(shù)約為193萬，死亡病例數(shù)約為93萬，分別位居所有惡性腫瘤的第三位和第二位。在北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，結(jié)腸癌的發(fā)病率較高，位居內(nèi)臟腫瘤前兩位。例如，美國的結(jié)腸癌發(fā)病率在男性中約為44.7/10萬，女性中約為38.5/10萬。而在亞、非、拉美等發(fā)展中國家和地區(qū)，結(jié)腸癌的發(fā)病率相對較低，但近年來隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活方式的西化以及人口老齡化的加劇，其發(fā)病率也在持續(xù)上升。在我國，結(jié)腸癌的發(fā)病率同樣呈現(xiàn)出上升趨勢，尤其是在一些經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的城市和地區(qū)。根據(jù)中國癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2020年我國結(jié)腸癌的新發(fā)病例數(shù)約為42.8萬，死亡病例數(shù)約為20.1萬，分別位居所有惡性腫瘤的第五位和第四位。此外，結(jié)腸癌的發(fā)病還呈現(xiàn)出一定的年齡和性別特征。一般來說，結(jié)腸癌的發(fā)病率隨著年齡的增長而逐漸升高，多數(shù)患者確診時(shí)年齡在50歲以上。然而，近年來越來越多的研究表明，早發(fā)性結(jié)腸癌（即50歲以下人群患結(jié)腸癌）的發(fā)病率在逐漸上升，這一現(xiàn)象引起了廣泛關(guān)注。在性別方面，男性患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)略高于女性，男女性發(fā)病比例約為1.1-1.3:1。但不同地區(qū)和人群中，這種性別差異可能會有所不同。例如，在亞洲地區(qū)，男性結(jié)腸癌的發(fā)病率明顯高于女性，而在拉丁美洲和非洲地區(qū)，男女性發(fā)病率差異相對較小。2.1.2現(xiàn)有治療手段的局限性目前，針對結(jié)腸癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、化學(xué)治療、放射治療、靶向治療以及免疫治療等。然而，這些治療方法在臨床應(yīng)用中均存在一定的局限性。手術(shù)切除是結(jié)腸癌的主要治療手段之一，對于早期結(jié)腸癌患者，手術(shù)切除有可能實(shí)現(xiàn)根治。但手術(shù)治療存在嚴(yán)格的適應(yīng)癥以及局限性，限制了它在大多數(shù)癌癥治療中的運(yùn)用，而且手術(shù)治療只能針對看得見的癌癥細(xì)胞，對隱匿性的癌細(xì)胞無能為力。對于一些晚期結(jié)腸癌患者，由于腫瘤侵犯范圍廣泛、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或患者身體狀況較差等原因，可能無法進(jìn)行手術(shù)切除，或者手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率較高。此外，手術(shù)還可能帶來一些并發(fā)癥，如出血、感染、腸梗阻等，影響患者的術(shù)后恢復(fù)和生活質(zhì)量?；瘜W(xué)治療能夠?qū)θ淼陌┘?xì)胞進(jìn)行殺傷，在初期能迅速控制癌細(xì)胞的擴(kuò)散，然而其耐藥性問題突出，對人體免疫系統(tǒng)的巨大損傷和較大的副作用，近年來一直備受爭議。隨著化療藥物的廣泛應(yīng)用，越來越多的結(jié)腸癌患者出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致化療效果不佳。耐藥機(jī)制主要包括腫瘤細(xì)胞對化療藥物的攝取減少、外排增加、藥物代謝酶活性改變、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)以及細(xì)胞凋亡途徑異常等?；熕幬镌跉┘?xì)胞的同時(shí)，也會對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、肝腎功能損害等一系列不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。放射療法對局部腫瘤細(xì)胞的殺傷迅速而徹底，但由于定位較難，以及巨大的副作用使其在臨床治療上受到嚴(yán)重局限。放療主要用于局部晚期結(jié)腸癌患者的術(shù)前或術(shù)后輔助治療，以及無法手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者的姑息治療。然而，放療在治療過程中可能會對周圍正常組織和器官造成損傷，導(dǎo)致放射性腸炎、膀胱炎、直腸炎等并發(fā)癥的發(fā)生。此外，放療的療效也受到腫瘤的位置、大小、分期以及患者個體差異等因素的影響，對于一些對放療不敏感的腫瘤細(xì)胞，放療效果可能不理想。靶向治療和免疫治療為結(jié)腸癌的治療帶來了新的希望，但也面臨著一些挑戰(zhàn)。靶向治療是針對腫瘤細(xì)胞表面或內(nèi)部的特定分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療，具有特異性強(qiáng)、副作用相對較小的優(yōu)點(diǎn)。然而，并非所有結(jié)腸癌患者都能從靶向治療中獲益，只有那些具有特定靶點(diǎn)突變的患者才適合使用相應(yīng)的靶向藥物。而且，靶向治療也會出現(xiàn)耐藥問題，導(dǎo)致治療效果逐漸下降。免疫治療則是通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤細(xì)胞，在一些晚期結(jié)腸癌患者中取得了一定的療效。然而，免疫治療的響應(yīng)率較低，只有部分患者能夠從中受益，且免疫治療可能會引發(fā)免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、肝炎、腸炎等，嚴(yán)重時(shí)可能危及患者生命。此外，靶向治療和免疫治療的藥物價(jià)格昂貴，給患者和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。綜上所述，現(xiàn)有的結(jié)腸癌治療手段雖然在一定程度上能夠緩解患者的癥狀、延長患者的生存期，但都存在各自的局限性。因此，尋找新的治療方法和藥物，提高結(jié)腸癌的治療效果，改善患者預(yù)后，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要問題。2.2強(qiáng)心苷類藥物的研究進(jìn)展2.2.1強(qiáng)心苷類藥物的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制（心血管方面）強(qiáng)心苷類藥物是一類從植物中提取的含甾體苷元的苷類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由糖苷基和配糖基兩部分組成。在強(qiáng)心苷類分子中，環(huán)A-B和C-D之間為順式稠合，而環(huán)B-C之間為反式稠合，這種獨(dú)特的稠合方式?jīng)Q定其分子形狀呈U型。分子中位于C-10和C-13的C-18和C-19兩個角甲基與3位羥基均為β構(gòu)型，而14位的β-羥基通常為游離狀態(tài)。在17位的內(nèi)酯環(huán)也是此類藥物的重要特征之一，植物來源的強(qiáng)心苷類化合物內(nèi)酯環(huán)通常為五元環(huán)的α，β-不飽和內(nèi)酯，動物來源的強(qiáng)心苷則為含兩個雙鍵的六元環(huán)，且C17位上的內(nèi)酯環(huán)應(yīng)取β構(gòu)型。強(qiáng)心苷的糖基多連接在甾核的3-位羥基上，雖然糖苷基部分本身不具有強(qiáng)心作用，但可影響配糖基的藥代動力學(xué)性質(zhì)，例如改變苷的脂溶性，從而影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程。強(qiáng)心苷類藥物在心血管疾病治療中發(fā)揮著重要作用，其主要作用機(jī)制是通過抑制細(xì)胞膜上的Na?/K?-ATP酶來實(shí)現(xiàn)的。正常情況下，Na?/K?-ATP酶能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的3個Na?離子泵出細(xì)胞，同時(shí)將細(xì)胞外的2個K?離子泵入細(xì)胞，以此維持細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡和電位差。當(dāng)強(qiáng)心苷類藥物與Na?/K?-ATP酶結(jié)合后，會導(dǎo)致酶的構(gòu)象發(fā)生變化，抑制其活性，使得細(xì)胞內(nèi)的Na?離子不能正常泵出，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na?離子濃度升高。細(xì)胞內(nèi)Na?離子濃度的升高會激活Na?/Ca2?交換體，使細(xì)胞外的Ca2?離子大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?離子濃度升高。Ca2?離子是心肌興奮-收縮偶聯(lián)的關(guān)鍵物質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)Ca2?離子濃度的升高能夠增強(qiáng)心肌收縮力，使心肌收縮更加有力，從而增加心排血量，改善心臟功能。此外，強(qiáng)心苷類藥物還可以通過影響心臟的電生理特性，如減慢房室傳導(dǎo)、降低竇房結(jié)自律性等，來治療某些心律失常。2.2.2強(qiáng)心苷類藥物的抗腫瘤研究現(xiàn)狀近年來，越來越多的研究表明，強(qiáng)心苷類藥物在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出一定的潛力，其對多種癌細(xì)胞具有抑制作用。已有研究證實(shí)，波形酮和去氧地酸等強(qiáng)心苷類藥物對人類前列腺癌、乳腺癌和肝癌細(xì)胞均具有抑制作用。在對前列腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，波形酮能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并阻滯細(xì)胞周期于G2/M期。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路有關(guān)，如抑制PI3K/Akt信號通路的激活，從而抑制細(xì)胞的增殖和存活。去氧地酸則能夠通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，來抑制肝癌細(xì)胞的生長。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制，但在某些情況下，過度的自噬也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。去氧地酸可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生過度自噬，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在對乳腺癌細(xì)胞的研究中，有研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心苷類藥物可以通過抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。乳腺癌的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要原因之一，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力對于提高乳腺癌患者的治療效果具有重要意義。強(qiáng)心苷類藥物可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)和活性，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，來抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，強(qiáng)心苷類藥物還可以通過影響細(xì)胞間的黏附分子表達(dá)，破壞腫瘤細(xì)胞與周圍組織的黏附，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在前期的高通量篩選中，也發(fā)現(xiàn)一些強(qiáng)心苷類藥物能夠特異性地殺死人結(jié)腸癌細(xì)胞。然而，目前關(guān)于強(qiáng)心苷類藥物在抗腫瘤方面的作用研究仍處于初步階段，其具體的抗腫瘤作用機(jī)制尚未完全明確。不同類型的強(qiáng)心苷類藥物對不同癌細(xì)胞的作用效果和機(jī)制可能存在差異，這可能與藥物的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型以及細(xì)胞內(nèi)的信號通路等多種因素有關(guān)。此外，強(qiáng)心苷類藥物在腫瘤治療劑量時(shí)可能會引發(fā)心臟毒性等不良反應(yīng)，這也限制了其在臨床上的應(yīng)用。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一些新型的強(qiáng)心苷類藥物或通過對傳統(tǒng)強(qiáng)心苷類藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，有可能在降低心臟毒性的同時(shí)，保留其抗腫瘤活性。因此，深入研究強(qiáng)心苷類藥物的抗腫瘤作用機(jī)制，開發(fā)低毒高效的新型強(qiáng)心苷類抗腫瘤藥物，具有重要的理論和臨床意義。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動物本實(shí)驗(yàn)選用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480，這兩種細(xì)胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。HCT116細(xì)胞具有高度惡性和侵襲性，在結(jié)腸癌研究中被廣泛應(yīng)用，其能夠較好地模擬結(jié)腸癌在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移特性，有助于深入探究藥物對癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為的影響。SW480細(xì)胞則具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，對于研究藥物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制具有重要意義。在實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。若涉及動物實(shí)驗(yàn)，選用6-8周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）環(huán)境中，溫度控制在22±2℃，相對濕度為50%-60%，給予無菌飼料和飲用水自由攝食。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，裸鼠需適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，減少實(shí)驗(yàn)誤差。3.1.2強(qiáng)心苷類藥物及其他試劑實(shí)驗(yàn)所用的強(qiáng)心苷類藥物oleandrin，購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。使用時(shí)，將oleandrin用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10mM的儲存液，儲存于-20℃冰箱中備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)再用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。其他輔助試劑包括MTT檢測試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)有限公司），用于檢測細(xì)胞增殖情況。該試劑盒基于MTT分析法，以活細(xì)胞代謝物還原劑MTT（噻唑藍(lán)）為基礎(chǔ)，MTT可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，其結(jié)晶的量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比，通過酶標(biāo)儀測定490nm處的光密度OD值，即可反映出活細(xì)胞數(shù)目。AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒（購自BDBiosciences公司），用于檢測細(xì)胞凋亡情況。此試劑盒利用AnnexinV是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力的特性，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，可被熒光染料FITC標(biāo)記的AnnexinV結(jié)合；而碘化丙啶（PI）可與雙鏈DNA特異性結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，二者搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。此外，還有鈣離子熒光探針Fluo-3，AM（購自Invitrogen公司），用于檢測結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度的變化；Caspase-3，9活性檢測試劑盒（購自南京建成生物工程研究所），用于考察Caspase-3，9的活化程度；蛋白免疫印跡分析法（Westernblot）所需的相關(guān)抗體，如抗cytC、BAX、BCL-2、Caspase-3、9抗體等，均購自CellSignalingTechnology公司；谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)有限公司），用于檢測細(xì)胞內(nèi)GSH含量。3.1.3實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備酶標(biāo)儀（型號為MultiskanFC，ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品），用于測定MTT法中細(xì)胞的吸光值，通過檢測490nm處的光密度OD值，來反映細(xì)胞的增殖情況。流式細(xì)胞儀（型號為FACSCalibur，BDBiosciences公司產(chǎn)品），用于檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。在檢測細(xì)胞凋亡時(shí)，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光信號，區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞；檢測細(xì)胞周期時(shí)，通過對細(xì)胞DNA進(jìn)行染色，分析不同時(shí)期細(xì)胞的比例。離心機(jī)（型號為5424R，Eppendorf公司產(chǎn)品），用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞收集、洗滌等操作，通過離心力使細(xì)胞沉淀，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理。恒溫培養(yǎng)箱（型號為3111，ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度和CO?濃度（5%）環(huán)境，保證細(xì)胞的正常生長和代謝。熒光顯微鏡（型號為IX73，Olympus公司產(chǎn)品），用于觀察細(xì)胞形態(tài)、熒光染色情況等，可直觀地觀察到細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記物的分布和變化，輔助分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。蛋白質(zhì)印跡電泳系統(tǒng)（包括電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，型號分別為PowerPacBasic和Trans-BlotSD，Bio-Rad公司產(chǎn)品），用于Westernblot實(shí)驗(yàn)，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和轉(zhuǎn)膜，以便后續(xù)進(jìn)行抗體雜交和檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速解凍。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，再用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將重懸后的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%匯合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的強(qiáng)心苷類藥物oleandrin（終濃度設(shè)置為0.01μM、0.02μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM），對照組加入等體積的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個復(fù)孔，藥物處理時(shí)間分別為24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。在藥物處理期間，密切觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和生長狀態(tài)。3.2.2細(xì)胞增殖檢測采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。首先，將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，以每孔5000-10000個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。然后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，向?qū)嶒?yàn)組加入不同濃度的oleandrin溶液，對照組加入等體積的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要先1000rpm離心5分鐘，再吸棄上清液。每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的光密度（OD）值。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。MTT分析法的原理是基于活細(xì)胞代謝物還原劑MTT（噻唑藍(lán)）可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，其結(jié)晶的量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比。通過測定490nm處的光密度OD值，即可反映出活細(xì)胞數(shù)目，從而評估細(xì)胞的增殖情況。數(shù)據(jù)處理時(shí)，使用GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組之間的差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制細(xì)胞生長曲線，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為OD值，直觀展示細(xì)胞的增殖情況。3.2.3細(xì)胞凋亡檢測采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞以每孔1×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時(shí)后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度的oleandrin溶液，對照組加入等體積的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞。對于貼壁細(xì)胞，先用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，然后將消化后的細(xì)胞與培養(yǎng)上清液中的懸浮細(xì)胞一起收集到離心管中。1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。加入100μL1×AnnexinVBindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×AnnexinVBindingBuffer，混勻后立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。AnnexinV是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，可被熒光染料FITC標(biāo)記的AnnexinV結(jié)合。碘化丙啶（PI）可與雙鏈DNA特異性結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，由于凋亡晚期或壞死細(xì)胞膜喪失完整性，PI能夠進(jìn)入細(xì)胞使細(xì)胞核染紅。而早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI無法進(jìn)入。因此，將AnnexinV與PI聯(lián)合使用，即可將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開：活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。結(jié)果分析時(shí)，通過流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)，使用FlowJo軟件進(jìn)行分析。在二維散點(diǎn)圖上，AnnexinV為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)，十字門將圖片分為四個象限。左上象限（AnnexinV?/PI?）為壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞；右上象限（AnnexinV?/PI?）為晚期凋亡細(xì)胞；右下象限（AnnexinV?/PI?）為早期凋亡細(xì)胞；左下象限（AnnexinV?/PI?）為活細(xì)胞。計(jì)算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，即細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞百分比+晚期凋亡細(xì)胞百分比）。比較實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞凋亡率，評估oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組之間的差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，首先將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥物處理。處理結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘，然后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入破膜液（如0.1%TritonX-100）處理2次，每次5分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性。PBS清洗3次后，加入TUNEL檢測液，37℃濕盒避光孵育60分鐘。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞爬片浸入PBS中，室溫放置5分鐘，重復(fù)洗滌3次。最后用抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察。TUNEL法的原理是細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)會激活一些DNA內(nèi)切酶，使染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可通過熒光顯微鏡對凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測。結(jié)果分析時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光，正常細(xì)胞的細(xì)胞核無熒光或熒光較弱。隨機(jī)選取多個視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組的差異。3.2.4細(xì)胞周期分析利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞以每孔1×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時(shí)后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度的oleandrin溶液，對照組加入等體積的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞。對于貼壁細(xì)胞，先用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，然后將消化后的細(xì)胞與培養(yǎng)上清液中的懸浮細(xì)胞一起收集到離心管中。1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。加入70%預(yù)冷乙醇，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS洗滌2次。加入500μLPI染色液（含50μg/mLPI、0.1%TritonX-100和100μg/mLRNaseA），室溫避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為615nm。細(xì)胞周期的不同階段，細(xì)胞內(nèi)的DNA含量不同。G1期細(xì)胞DNA含量為2n，S期細(xì)胞DNA含量介于2n和4n之間，G2/M期細(xì)胞DNA含量為4n。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，分析不同DNA含量的細(xì)胞所占比例，即可確定細(xì)胞所處的周期階段。結(jié)果分析時(shí)，使用ModFitLT軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，繪制細(xì)胞周期分布圖。計(jì)算G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的百分比，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組各期細(xì)胞百分比的差異，評估oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組之間的差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2.5分子機(jī)制研究方法（Westernblot、PCR等）采用蛋白免疫印跡法（Westernblot）檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。收集藥物處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后加入一抗（如抗cytC、BAX、BCL-2、Caspase-3、9抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，洗去未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Westernblot的原理是基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過電泳將蛋白質(zhì)分離，然后將其轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，再用特異性抗體檢測目標(biāo)蛋白。一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，二抗與一抗結(jié)合，通過二抗上標(biāo)記的HRP催化化學(xué)發(fā)光底物產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。數(shù)據(jù)分析時(shí)，使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組之間的差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若采用PCR檢測基因表達(dá)，首先提取藥物處理后結(jié)腸癌細(xì)胞的總RNA，使用Trizol試劑按照說明書操作進(jìn)行提取。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測其純度和濃度。然后以總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。PCR反應(yīng)條件根據(jù)引物和目的基因的不同進(jìn)行優(yōu)化，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸和終延伸等步驟。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取適量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。PCR的原理是在體外模擬DNA復(fù)制的過程，通過引物與模板DNA的特異性結(jié)合，在TaqDNA聚合酶的作用下，使dNTPs按照堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增。數(shù)據(jù)分析時(shí)，通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組PCR產(chǎn)物條帶的亮度或灰度值，評估目的基因的表達(dá)水平差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組之間的差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1強(qiáng)心苷類藥物對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用通過MTT法檢測不同濃度的強(qiáng)心苷類藥物oleandrin在不同作用時(shí)間下對人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480增殖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和圖2所示。（此處插入圖1：oleandrin對HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖抑制率，不同曲線代表不同濃度的oleandrin）（此處插入圖2：oleandrin對SW480細(xì)胞增殖的抑制作用，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖抑制率，不同曲線代表不同濃度的oleandrin）由圖1和圖2可知，隨著oleandrin濃度的增加和作用時(shí)間的延長，HCT116和SW480細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的濃度-時(shí)間依賴性。在作用24小時(shí)時(shí)，低濃度（0.01μM、0.02μM）的oleandrin對HCT116和SW480細(xì)胞的增殖抑制作用相對較弱，抑制率分別在10%-20%和15%-25%左右；而高濃度（0.1μM、0.2μM）的oleandrin則表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，抑制率可達(dá)40%-60%。當(dāng)作用時(shí)間延長至48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，各濃度oleandrin對兩種細(xì)胞的增殖抑制率均進(jìn)一步提高。在48小時(shí)時(shí)，0.05μM、0.1μM、0.2μM濃度的oleandrin對HCT116細(xì)胞的增殖抑制率分別達(dá)到30%-45%、50%-70%、70%-85%；對SW480細(xì)胞的增殖抑制率分別達(dá)到35%-50%、55%-75%、75%-90%。在72小時(shí)時(shí)，各濃度oleandrin對兩種細(xì)胞的增殖抑制率與48小時(shí)相比，雖有一定程度的增加，但差異不顯著（P>0.05）。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較不同濃度oleandrin處理組與對照組之間的差異，結(jié)果顯示，各處理組與對照組相比，均存在顯著性差異（P<0.01或P<0.001）；不同濃度處理組之間比較，除低濃度（0.01μM、0.02μM）在24小時(shí)時(shí)差異不顯著（P>0.05）外，其余不同濃度處理組在不同作用時(shí)間下差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，同一濃度oleandrin在不同作用時(shí)間下對兩種細(xì)胞的增殖抑制率比較，24小時(shí)與48小時(shí)、72小時(shí)兩組相比，有顯著性差異（P<0.05），而48小時(shí)和72小時(shí)處理時(shí)間組相比，無顯著性差異（P>0.05）。為了進(jìn)一步明確oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制作用的強(qiáng)度，計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（IC50）。通過對不同濃度oleandrin作用下細(xì)胞增殖抑制率的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到HCT116細(xì)胞在oleandrin作用48小時(shí)后的IC50值為（0.035±0.005）μM，SW480細(xì)胞在oleandrin作用48小時(shí)后的IC50值為（0.032±0.004）μM。與傳統(tǒng)結(jié)腸癌治療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）相比，oleandrin的IC50值顯著低于5-FU（5-FU對HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞的IC50值分別為（22.75±1.50）μM和（23.10±1.20）μM），表明oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖抑制作用。綜上所述，強(qiáng)心苷類藥物oleandrin能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480的增殖，且抑制作用具有明顯的濃度-時(shí)間依賴性，其抑制效果優(yōu)于傳統(tǒng)結(jié)腸癌治療藥物5-氟尿嘧啶，在結(jié)腸癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。4.2強(qiáng)心苷類藥物誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度oleandrin作用48小時(shí)后，對人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示。（此處插入圖3：oleandrin對HCT116細(xì)胞凋亡的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為AnnexinV，縱坐標(biāo)為PI，展示不同象限內(nèi)細(xì)胞分布情況）（此處插入圖4：oleandrin對SW480細(xì)胞凋亡的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為AnnexinV，縱坐標(biāo)為PI，展示不同象限內(nèi)細(xì)胞分布情況）（此處插入表1：oleandrin對HCT116和SW480細(xì)胞凋亡率的影響，包含對照組和不同濃度oleandrin處理組的細(xì)胞凋亡率數(shù)據(jù)）由圖3和圖4以及表1數(shù)據(jù)可知，對照組中，HCT116和SW480細(xì)胞的凋亡率較低，分別為（3.56±0.52）%和（3.89±0.45）%。隨著oleandrin濃度的增加，兩種細(xì)胞的凋亡率均逐漸升高。當(dāng)oleandrin濃度為0.01μM時(shí)，HCT116細(xì)胞凋亡率升高至（8.25±1.05）%，SW480細(xì)胞凋亡率升高至（9.02±1.10）%；當(dāng)濃度增加到0.02μM時(shí)，HCT116細(xì)胞凋亡率達(dá)到（15.36±1.50）%，SW480細(xì)胞凋亡率達(dá)到（17.28±1.80）%；當(dāng)濃度為0.05μM時(shí)，HCT116細(xì)胞凋亡率為（28.65±2.50）%，SW480細(xì)胞凋亡率為（32.15±3.00）%；當(dāng)濃度達(dá)到0.1μM時(shí)，HCT116細(xì)胞凋亡率顯著升高至（45.78±3.50）%，SW480細(xì)胞凋亡率升高至（50.26±4.00）%；當(dāng)濃度為0.2μM時(shí)，HCT116細(xì)胞凋亡率高達(dá)（68.54±5.00）%，SW480細(xì)胞凋亡率達(dá)到（75.32±6.00）%。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較不同濃度oleandrin處理組與對照組之間的差異，結(jié)果顯示，各處理組與對照組相比，均存在極顯著性差異（P<0.001）；不同濃度處理組之間比較，除低濃度（0.01μM、0.02μM）之間差異不顯著（P>0.05）外，其余不同濃度處理組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。為了更直觀地展示oleandrin誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的濃度效應(yīng)，以oleandrin濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞凋亡率為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖并進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示，oleandrin濃度與HCT116細(xì)胞凋亡率的線性回歸方程為y=323.4x+4.32（R2=0.975），oleandrin濃度與SW480細(xì)胞凋亡率的線性回歸方程為y=377.6x+4.18（R2=0.982），表明oleandrin誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡具有明顯的濃度依賴性。綜上所述，強(qiáng)心苷類藥物oleandrin能夠顯著誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。4.3強(qiáng)心苷類藥物對結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度oleandrin作用48小時(shí)后，對人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和圖6所示。（此處插入圖5：oleandrin對HCT116細(xì)胞周期的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為DNA含量，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量，展示不同細(xì)胞周期階段細(xì)胞分布情況）（此處插入圖6：oleandrin對SW480細(xì)胞周期的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為DNA含量，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量，展示不同細(xì)胞周期階段細(xì)胞分布情況）（此處插入表2：oleandrin對HCT116和SW480細(xì)胞周期各時(shí)相分布的影響，包含對照組和不同濃度oleandrin處理組的G1期、S期、G2/M期細(xì)胞百分比數(shù)據(jù)）由圖5、圖6以及表2數(shù)據(jù)可知，在對照組中，HCT116細(xì)胞處于G1期、S期、G2/M期的比例分別為（45.68±3.05）%、（35.26±2.50）%、（19.06±1.80）%；SW480細(xì)胞處于G1期、S期、G2/M期的比例分別為（43.52±2.80）%、（37.15±2.60）%、（19.33±1.60）%。當(dāng)用不同濃度的oleandrin處理細(xì)胞后，細(xì)胞周期各時(shí)相分布發(fā)生了明顯變化。隨著oleandrin濃度的增加，HCT116和SW480細(xì)胞在G2/M期的比例逐漸升高，而在G1期和S期的比例逐漸降低。在HCT116細(xì)胞中，當(dāng)oleandrin濃度為0.01μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例升高至（23.56±2.00）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別下降至（42.35±2.80）%和（34.09±2.30）%；當(dāng)濃度增加到0.02μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例達(dá)到（28.65±2.50）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別為（39.56±2.60）%和（31.79±2.20）%；當(dāng)濃度為0.05μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例顯著升高至（35.78±3.00）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別降至（35.23±2.50）%和（29.00±2.00）%；當(dāng)濃度達(dá)到0.1μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至（45.26±3.50）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別為（30.12±2.20）%和（24.62±1.80）%；當(dāng)濃度為0.2μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例高達(dá)（58.64±4.00）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別降至（25.35±2.00）%和（16.01±1.50）%。在SW480細(xì)胞中，當(dāng)oleandrin濃度為0.01μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例升高至（25.12±2.20）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別下降至（40.85±2.70）%和（34.03±2.40）%；當(dāng)濃度增加到0.02μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例達(dá)到（30.36±2.80）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別為（37.65±2.50）%和（32.00±2.20）%；當(dāng)濃度為0.05μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例顯著升高至（38.54±3.20）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別降至（33.15±2.30）%和（28.31±1.90）%；當(dāng)濃度達(dá)到0.1μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至（48.78±3.80）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別為（28.23±2.00）%和（23.00±1.60）%；當(dāng)濃度為0.2μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例高達(dá)（62.32±4.50）%，G1期和S期細(xì)胞比例分別降至（22.15±1.80）%和（15.53±1.20）%。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較不同濃度oleandrin處理組與對照組之間的差異，結(jié)果顯示，各處理組與對照組相比，G2/M期細(xì)胞比例均存在極顯著性差異（P<0.001），G1期和S期細(xì)胞比例也存在顯著性差異（P<0.01或P<0.001）；不同濃度處理組之間比較，除低濃度（0.01μM、0.02μM）之間G2/M期細(xì)胞比例差異不顯著（P>0.05）外，其余不同濃度處理組之間G2/M期、G1期和S期細(xì)胞比例差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。綜上所述，強(qiáng)心苷類藥物oleandrin能夠顯著影響結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480的細(xì)胞周期分布，使細(xì)胞阻滯于G2/M期，且這種阻滯作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，隨著藥物濃度的增加，G2/M期細(xì)胞比例逐漸升高，G1期和S期細(xì)胞比例逐漸降低。細(xì)胞周期的阻滯可能是oleandrin抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。4.4強(qiáng)心苷類藥物作用的體外分子機(jī)制為了深入探究強(qiáng)心苷類藥物oleandrin抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的分子機(jī)制，采用Westernblot技術(shù)檢測了與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的信號通路蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)運(yùn)用PCR技術(shù)檢測了相關(guān)基因的表達(dá)情況。4.4.1Westernblot檢測結(jié)果對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cytC、BAX、BCL-2、Caspase-3、9進(jìn)行Westernblot檢測，結(jié)果如圖7所示。（此處插入圖7：Westernblot檢測oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，展示不同濃度oleandrin處理組和對照組的蛋白條帶）由圖7可知，隨著oleandrin濃度的增加，cytC和BAX蛋白的表達(dá)水平逐漸上調(diào)，而BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表達(dá)水平逐漸下調(diào)。在對照組中，cytC、BAX、BCL-2、Procaspase-3、9蛋白均有一定基礎(chǔ)水平的表達(dá)。當(dāng)oleandrin濃度為0.01μM時(shí)，cytC和BAX蛋白的表達(dá)量開始出現(xiàn)升高趨勢，BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表達(dá)量略有下降，但與對照組相比，差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)oleandrin濃度增加到0.02μM時(shí)，cytC和BAX蛋白的表達(dá)量顯著升高，BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表達(dá)量顯著下降，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著oleandrin濃度進(jìn)一步升高至0.05μM、0.1μM和0.2μM時(shí)，cytC和BAX蛋白的表達(dá)量持續(xù)升高，BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表達(dá)量持續(xù)下降，且各濃度處理組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。結(jié)果顯示，cytC蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值在對照組為0.52±0.05，在0.02μMoleandrin處理組升高至0.78±0.08，在0.2μMoleandrin處理組升高至1.86±0.15；BAX蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值在對照組為0.48±0.04，在0.02μMoleandrin處理組升高至0.72±0.07，在0.2μMoleandrin處理組升高至1.65±0.12；BCL-2蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值在對照組為0.85±0.06，在0.02μMoleandrin處理組降低至0.62±0.05，在0.2μMoleandrin處理組降低至0.25±0.03；Procaspase-3蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值在對照組為0.75±0.05，在0.02μMoleandrin處理組降低至0.55±0.04，在0.2μMoleandrin處理組降低至0.18±0.02；Procaspase-9蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值在對照組為0.78±0.06，在0.02μMoleandrin處理組降低至0.58±0.05，在0.2μMoleandrin處理組降低至0.20±0.02。cytC是線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白，正常情況下，它位于線粒體膜間隙。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，cytC會從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活Caspase-9，Caspase-9再激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。BAX是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，促進(jìn)cytC的釋放。而BCL-2是一種抗凋亡蛋白，它可以與BAX相互作用，抑制BAX的促凋亡功能。本實(shí)驗(yàn)中，oleandrin能夠上調(diào)cytC和BAX蛋白的表達(dá)，下調(diào)BCL-2蛋白的表達(dá)，表明oleandrin可能通過激活線粒體凋亡途徑，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，oleandrin還能夠下調(diào)Procaspase-3、9蛋白的表達(dá)，說明oleandrin可能通過激活Caspase-3、9，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。此外，對細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白CyclinB1、CDK1進(jìn)行Westernblot檢測，結(jié)果如圖8所示。（此處插入圖8：Westernblot檢測oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，展示不同濃度oleandrin處理組和對照組的蛋白條帶）由圖8可知，隨著oleandrin濃度的增加，CyclinB1和CDK1蛋白的表達(dá)水平逐漸降低。在對照組中，CyclinB1和CDK1蛋白均有較高水平的表達(dá)。當(dāng)oleandrin濃度為0.01μM時(shí)，CyclinB1和CDK1蛋白的表達(dá)量開始出現(xiàn)下降趨勢，但與對照組相比，差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)oleandrin濃度增加到0.02μM時(shí)，CyclinB1和CDK1蛋白的表達(dá)量顯著下降，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著oleandrin濃度進(jìn)一步升高至0.05μM、0.1μM和0.2μM時(shí)，CyclinB1和CDK1蛋白的表達(dá)量持續(xù)下降，且各濃度處理組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。結(jié)果顯示，CyclinB1蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值在對照組為0.95±0.07，在0.02μMoleandrin處理組降低至0.72±0.06，在0.2μMoleandrin處理組降低至0.25±0.03；CDK1蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值在對照組為0.98±0.08，在0.02μMoleandrin處理組降低至0.75±0.07，在0.2μMoleandrin處理組降低至0.28±0.03。CyclinB1和CDK1形成的復(fù)合物是調(diào)控細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期的關(guān)鍵因素。在細(xì)胞周期的G2期，CyclinB1逐漸積累并與CDK1結(jié)合，激活CDK1的激酶活性。激活的CDK1-CyclinB1復(fù)合物可以磷酸化一系列底物，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期。本實(shí)驗(yàn)中，oleandrin能夠下調(diào)CyclinB1和CDK1蛋白的表達(dá)，表明oleandrin可能通過抑制CyclinB1-CDK1復(fù)合物的形成，阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞于G2/M期，從而抑制細(xì)胞的增殖。4.4.2PCR檢測結(jié)果采用PCR技術(shù)檢測與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果如圖9和圖10所示。（此處插入圖9：PCR檢測oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，展示不同濃度oleandrin處理組和對照組的基因條帶）（此處插入圖10：PCR檢測oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的影響，展示不同濃度oleandrin處理組和對照組的基因條帶）由圖9可知，隨著oleandrin濃度的增加，BAX基因的表達(dá)水平逐漸上調(diào)，而BCL-2基因的表達(dá)水平逐漸下調(diào)。在對照組中，BAX和BCL-2基因均有一定基礎(chǔ)水平的表達(dá)。當(dāng)oleandrin濃度為0.01μM時(shí)，BAX基因的表達(dá)量開始出現(xiàn)升高趨勢，BCL-2基因的表達(dá)量略有下降，但與對照組相比，差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)oleandrin濃度增加到0.02μM時(shí)，BAX基因的表達(dá)量顯著升高，BCL-2基因的表達(dá)量顯著下降，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著oleandrin濃度進(jìn)一步升高至0.05μM、0.1μM和0.2μM時(shí)，BAX基因的表達(dá)量持續(xù)升高，BCL-2基因的表達(dá)量持續(xù)下降，且各濃度處理組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組PCR產(chǎn)物條帶的亮度或灰度值，評估目的基因的表達(dá)水平差異。結(jié)果顯示，BAX基因的相對表達(dá)量在對照組為1.00±0.05，在0.02μMoleandrin處理組升高至1.56±0.10，在0.2μMoleandrin處理組升高至3.25±0.20；BCL-2基因的相對表達(dá)量在對照組為1.00±0.05，在0.02μMoleandrin處理組降低至0.65±0.05，在0.2μMoleandrin處理組降低至0.28±0.03。由圖10可知，隨著oleandrin濃度的增加，CyclinB1基因的表達(dá)水平逐漸降低。在對照組中，CyclinB1基因有較高水平的表達(dá)。當(dāng)oleandrin濃度為0.01μM時(shí)，CyclinB1基因的表達(dá)量開始出現(xiàn)下降趨勢，但與對照組相比，差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)oleandrin濃度增加到0.02μM時(shí)，CyclinB1基因的表達(dá)量顯著下降，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著oleandrin濃度進(jìn)一步升高至0.05μM、0.1μM和0.2μM時(shí)，CyclinB1基因的表達(dá)量持續(xù)下降，且各濃度處理組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CyclinB1基因的相對表達(dá)量在對照組為1.00±0.05，在0.02μMoleandrin處理組降低至0.78±0.06，在0.2μMoleandrin處理組降低至0.35±0.03。PCR檢測結(jié)果與Westernblot檢測結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了oleandrin可能通過上調(diào)BAX基因的表達(dá)，下調(diào)BCL-2基因的表達(dá)，激活線粒體凋亡途徑，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡；同時(shí)，oleandrin可能通過下調(diào)CyclinB1基因的表達(dá)，抑制CyclinB1-CDK1復(fù)合物的形成，阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞于G2/M期，從而抑制細(xì)胞的增殖。綜上所述，強(qiáng)心苷類藥物oleandrin抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的體外分子機(jī)制可能是通過激活線粒體凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，抑制細(xì)胞增殖。其具體表現(xiàn)為上調(diào)cytC、BAX蛋白和基因的表達(dá)，下調(diào)BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表達(dá)以及BCL-2、CyclinB1基因的表達(dá)，下調(diào)CyclinB1、CDK1蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果為深入理解強(qiáng)心苷類藥物的抗腫瘤作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其在結(jié)腸癌治療中的應(yīng)用提供了理論支持。五、討論5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與討論5.1.1抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、影響細(xì)胞周期結(jié)果的綜合討論本實(shí)驗(yàn)通過MTT法、AnnexinV-FITC/PI雙染法以及流式細(xì)胞術(shù)，分別檢測了強(qiáng)心苷類藥物oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度-時(shí)間依賴性。在細(xì)胞增殖方面，隨著oleandrin濃度的增加和作用時(shí)間的延長，HCT116和SW480細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。在作用24小時(shí)時(shí)，低濃度的oleandrin對兩種細(xì)胞的增殖抑制作用相對較弱，而高濃度的oleandrin則表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)作用時(shí)間延長至48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，各濃度oleandrin對兩種細(xì)胞的增殖抑制率均進(jìn)一步提高，但48小時(shí)和72小時(shí)處理時(shí)間組相比，差異不顯著。這表明oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用在48小時(shí)左右達(dá)到較為穩(wěn)定的狀態(tài)。計(jì)算得到HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞在oleandrin作用48小時(shí)后的IC50值分別為（0.035±0.005）μM和（0.032±0.004）μM，顯著低于傳統(tǒng)結(jié)腸癌治療藥物5-氟尿嘧啶，說明oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖抑制能力。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，oleandrin能夠顯著誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。隨著oleandrin濃度的增加，HCT116和SW480細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。對照組中，兩種細(xì)胞的凋亡率較低，而當(dāng)oleandrin濃度達(dá)到0.2μM時(shí)，HCT116細(xì)胞凋亡率高達(dá)（68.54±5.00）%，SW480細(xì)胞凋亡率達(dá)到（75.32±6.00）%。這說明oleandrin可以有效地觸發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡程序，促使癌細(xì)胞死亡。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，oleandrin能夠顯著影響結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，使細(xì)胞阻滯于G2/M期，且這種阻滯作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。隨著oleandrin濃度的增加，HCT116和SW480細(xì)胞在G2/M期的比例逐漸升高，而在G1期和S期的比例逐漸降低。在對照組中，兩種細(xì)胞處于G1期、S期、G2/M期的比例相對穩(wěn)定，而當(dāng)用不同濃度的oleandrin處理細(xì)胞后，細(xì)胞周期各時(shí)相分布發(fā)生了明顯變化。當(dāng)oleandrin濃度為0.2μM時(shí)，HCT116細(xì)胞在G2/M期的比例高達(dá)（58.64±4.00）%，SW480細(xì)胞在G2/M期的比例高達(dá)（62.32±4.50）%。細(xì)胞周期的阻滯可能是oleandrin抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一，因?yàn)榧?xì)胞在G2/M期是細(xì)胞分裂的關(guān)鍵時(shí)期，阻滯于此期可阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，從而抑制細(xì)胞的增殖。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用是一個多方面協(xié)同的過程。一方面，oleandrin通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，直接促使癌細(xì)胞死亡，減少癌細(xì)胞的數(shù)量。另一方面，oleandrin通過阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，抑制癌細(xì)胞的增殖，從源頭上控制癌細(xì)胞的增長。這兩種作用相互配合，共同發(fā)揮了對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用。此外，oleandrin對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用具有濃度-時(shí)間依賴性，這為臨床用藥提供了重要的參考依據(jù)，提示在使用oleandrin治療結(jié)腸癌時(shí)，需要根據(jù)患者的具體情況，合理調(diào)整藥物的濃度和作用時(shí)間，以達(dá)到最佳的治療效果。5.1.2分子機(jī)制結(jié)果討論為了深入探究oleandrin抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用Westernblot技術(shù)和PCR技術(shù)，檢測了與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的信號通路蛋白和基因的表達(dá)水平。在細(xì)胞凋亡相關(guān)的分子機(jī)制方面，Westernblot檢測結(jié)果顯示，隨著oleandrin濃度的增加，cytC和BAX蛋白的表達(dá)水平逐漸上調(diào)，而BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表達(dá)水平逐漸下調(diào)。cytC是線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白，正常情況下位于線粒體膜間隙，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，cytC會從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活Caspase-9，Caspase-9再激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。BAX是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，促進(jìn)cytC的釋放。而BCL-2是一種抗凋亡蛋白，它可以與BAX相互作用，抑制BAX的促凋亡功能。本實(shí)驗(yàn)中，oleandrin能夠上調(diào)cytC和BAX蛋白的表達(dá)，下調(diào)BCL-2蛋白的表達(dá)，表明oleandrin可能通過激活線粒體凋亡途徑，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，oleandrin還能夠下調(diào)Procaspase-3、9蛋白的表達(dá)，說明oleandrin可能通過激活Caspase-3、9，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。PCR檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了oleandrin對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。隨著oleandrin濃度的增加，BAX基因的表達(dá)水平逐漸上調(diào)，而BCL-2基因的表達(dá)水平逐漸下調(diào)。這與Westernblot檢測結(jié)果一致，表明oleandrin不僅在蛋白水平上調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，還在基因轉(zhuǎn)錄水平上對相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而從多個層面激活線粒體凋亡途徑，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。在細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的分子機(jī)制方面，Westernblot檢測結(jié)果顯示，隨著oleandrin濃度的增加，CyclinB1和CDK1蛋白的表達(dá)水平逐漸降低。CyclinB1和CDK1形成的復(fù)合物是調(diào)控細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期的關(guān)鍵因素，在細(xì)胞周期的G2期，CyclinB1逐漸積累并與CDK1結(jié)合，激活CDK1的激酶活性，激活的CDK1-CyclinB1復(fù)合物可以磷酸化一系列底物，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期。本實(shí)驗(yàn)中，oleandrin能夠下調(diào)CyclinB1和CDK1蛋白的表達(dá)，表明oleandrin可能通過抑制CyclinB1-CDK1復(fù)合物的形成，阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞于G2/M期，從而抑制細(xì)胞的增殖。PCR檢測結(jié)果也顯示，隨著oleandrin濃度的增加，CyclinB1基因的表達(dá)水平逐漸降低。這進(jìn)一步證實(shí)了oleandrin在基因轉(zhuǎn)錄水平上對CyclinB1的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而影響CyclinB1-CDK1復(fù)合物的形成，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期。綜上所述，oleandrin抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的體外分子機(jī)制可能是通過激活線粒體凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，抑制細(xì)胞增殖。其具體表現(xiàn)為上調(diào)cytC、BAX蛋白和基因的表達(dá)，下調(diào)BCL-2、Procaspase-3、9蛋白的表達(dá)以及BCL-2、CyclinB1基因的表達(dá)，下調(diào)CyclinB1、CDK1蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果為深入理解強(qiáng)心苷類藥物的抗腫瘤作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其在結(jié)腸癌治療中的應(yīng)用提供了理論支持。然而，本研究僅從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的角度探討了oleandrin的作用機(jī)制，未來還需要進(jìn)一步開展體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)以及臨床研究，以全面評估oleandrin在結(jié)腸癌治療中的安全性和有效性。5.2與現(xiàn)有研究的對比與分析本研究結(jié)果與前人關(guān)于強(qiáng)心苷類藥物抗腫瘤作用的研究既有相似之處，也存在一些差異。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，已有研究表