強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊中差異CircRNAs表達(dá)譜的深度解析與臨床意義探究一、引言1.1研究背景強(qiáng)直性脊柱炎（AnkylosingSpondylitis，AS）是一種慢性炎癥性關(guān)節(jié)病，主要侵犯中軸關(guān)節(jié)，如骶髂關(guān)節(jié)和脊柱，也常累及外周關(guān)節(jié)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)AS的患病率約為0.1%-1.4%，不同地區(qū)和種族之間存在一定差異。在我國(guó)，AS的患病率約為0.3%，且男性患者多于女性，發(fā)病高峰年齡在20-30歲。AS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為與遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素相關(guān)，其中HLA-B27基因與AS的發(fā)病密切相關(guān)，90%以上的AS患者攜帶HLA-B27基因。髖關(guān)節(jié)作為人體最大的負(fù)重關(guān)節(jié)之一，在AS患者中極易受累。髖關(guān)節(jié)囊骨化是AS常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，約30%-50%的AS患者會(huì)出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)受累，其中部分患者會(huì)發(fā)生髖關(guān)節(jié)囊骨化。髖關(guān)節(jié)囊骨化會(huì)導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、疼痛加劇，嚴(yán)重時(shí)可造成髖關(guān)節(jié)完全強(qiáng)直，使患者喪失行走能力，極大地降低了患者的生活自理能力和社會(huì)參與度。對(duì)于髖關(guān)節(jié)囊骨化嚴(yán)重的患者，往往需要進(jìn)行人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)來(lái)改善關(guān)節(jié)功能，但手術(shù)費(fèi)用高昂，且存在一定的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和術(shù)后并發(fā)癥，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，深入研究AS髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期診斷和治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，非編碼RNA在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到關(guān)注。環(huán)狀RNA（CircularRNAs，CircRNAs）作為一類(lèi)特殊的非編碼RNA，具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，無(wú)5′末端帽子和3′末端poly（A）尾巴。與線性RNA相比，CircRNAs對(duì)核酸外切酶具有較強(qiáng)的抵抗力，因而在生物體內(nèi)更加穩(wěn)定。CircRNAs廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，具有組織特異性、發(fā)育階段特異性和疾病特異性表達(dá)的特點(diǎn)。越來(lái)越多的研究表明，CircRNAs參與了多種生理和病理過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。在一些疾病中，CircRNAs通過(guò)與微小RNA（miRNA）相互作用，發(fā)揮“海綿”作用，間接調(diào)控基因的表達(dá)；還可以與RNA結(jié)合蛋白相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄、剪接和翻譯過(guò)程。在AS的研究中，雖然目前對(duì)CircRNAs的研究相對(duì)較少，但已有研究報(bào)道在AS患者的血清、滑膜組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)的CircRNAs，提示CircRNAs可能參與了AS的發(fā)病過(guò)程。然而，關(guān)于AS髖關(guān)節(jié)囊骨化中CircRNAs的表達(dá)譜及作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)篩選AS骨化髖關(guān)節(jié)囊與正常髖關(guān)節(jié)囊組織中差異表達(dá)的CircRNAs，并對(duì)其功能進(jìn)行初步預(yù)測(cè)和分析，為揭示AS髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病機(jī)制提供新的思路和潛在的生物標(biāo)志物。1.2研究目的本研究旨在運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，全面、系統(tǒng)地篩選強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊與正常髖關(guān)節(jié)囊組織之間差異表達(dá)的CircRNAs。通過(guò)對(duì)這些差異表達(dá)CircRNAs的深入分析，構(gòu)建其表達(dá)譜，進(jìn)而探索它們?cè)趶?qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化發(fā)病機(jī)制中所扮演的角色。具體而言，一方面，試圖明確這些差異表達(dá)的CircRNAs是否通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與了炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞外基質(zhì)代謝等與強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化密切相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程；另一方面，期望借助生物信息學(xué)分析和功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，挖掘出具有潛在臨床價(jià)值的CircRNAs，為強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)以及治療靶點(diǎn)的選擇提供新的生物標(biāo)志物和理論依據(jù)。同時(shí)，本研究也將為進(jìn)一步深入理解強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病機(jī)制，拓展非編碼RNA在骨科疾病研究領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，以及推動(dòng)相關(guān)治療策略的創(chuàng)新與發(fā)展奠定基礎(chǔ)。1.3研究意義強(qiáng)直性脊柱炎（AS）作為一種嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的慢性炎癥性關(guān)節(jié)病，其髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明晰。本研究致力于篩選AS骨化髖關(guān)節(jié)囊與正常髖關(guān)節(jié)囊組織中差異表達(dá)的CircRNAs，這一探索在揭示AS發(fā)病機(jī)制、提供診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)等多個(gè)層面都具有不可忽視的重要意義。在揭示AS發(fā)病機(jī)制方面，目前已知AS的發(fā)病是遺傳、免疫、環(huán)境等多因素共同作用的結(jié)果，但具體的分子機(jī)制仍存在諸多空白。CircRNAs作為一類(lèi)新興的非編碼RNA，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過(guò)程以及多種疾病的病理進(jìn)程。通過(guò)全面分析AS骨化髖關(guān)節(jié)囊組織中差異表達(dá)的CircRNAs，可以深入了解它們?cè)谘装Y反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)代謝、成骨細(xì)胞分化等與AS髖關(guān)節(jié)囊骨化密切相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中的調(diào)控作用。這有助于從分子層面揭示AS髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病機(jī)制，填補(bǔ)AS發(fā)病機(jī)制研究領(lǐng)域在非編碼RNA調(diào)控方面的空白，為后續(xù)深入理解AS的病理生理過(guò)程提供全新的視角和理論基礎(chǔ)。從提供診斷標(biāo)志物的角度來(lái)看，早期準(zhǔn)確診斷對(duì)于AS的有效治療和預(yù)后改善至關(guān)重要。然而，現(xiàn)有的AS診斷方法主要依賴(lài)于臨床癥狀、影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，存在一定的局限性，例如在疾病早期，影像學(xué)改變可能不明顯，容易導(dǎo)致漏診或誤診。CircRNAs具有組織特異性、疾病特異性表達(dá)的特點(diǎn)，且在生物體液中具有良好的穩(wěn)定性。本研究篩選出的差異表達(dá)CircRNAs，有可能作為潛在的生物標(biāo)志物，用于AS髖關(guān)節(jié)囊骨化的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)。通過(guò)檢測(cè)血液、滑膜液等生物樣本中這些CircRNAs的表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)AS髖關(guān)節(jié)囊骨化的早期預(yù)警，提高診斷的準(zhǔn)確性和及時(shí)性，為患者的早期干預(yù)和治療爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。在治療靶點(diǎn)的探尋上，目前AS的治療主要以緩解癥狀、控制炎癥為主，缺乏針對(duì)疾病根本機(jī)制的有效治療手段，對(duì)于已經(jīng)發(fā)生髖關(guān)節(jié)囊骨化的患者，治療選擇更為有限。明確差異表達(dá)CircRNAs在AS髖關(guān)節(jié)囊骨化中的作用機(jī)制后，可以將這些關(guān)鍵的CircRNAs及其相關(guān)的調(diào)控通路作為潛在的治療靶點(diǎn)。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)這些靶點(diǎn)的藥物或治療策略，如利用RNA干擾技術(shù)抑制異常高表達(dá)的CircRNAs，或通過(guò)基因編輯技術(shù)修復(fù)功能缺失的CircRNAs，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)AS髖關(guān)節(jié)囊骨化的精準(zhǔn)治療，從根本上阻斷疾病的進(jìn)展，改善患者的關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量，為AS的臨床治療開(kāi)辟新的途徑。二、強(qiáng)直性脊柱炎與髖關(guān)節(jié)囊骨化2.1強(qiáng)直性脊柱炎概述強(qiáng)直性脊柱炎（AnkylosingSpondylitis，AS）是一種慢性炎癥性關(guān)節(jié)病，主要侵犯中軸關(guān)節(jié)，如骶髂關(guān)節(jié)和脊柱，也常累及外周關(guān)節(jié)，如髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)等。其病理特征為慢性炎癥、骨質(zhì)破壞以及骨化，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。AS在全球范圍內(nèi)均有發(fā)病，不同地區(qū)和種族的患病率存在差異。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球AS患病率約為0.1%-1.4%。在我國(guó)，AS患病率約為0.3%，男性患者多于女性，男女比例約為（2-3）:1，發(fā)病高峰年齡在20-30歲。AS具有明顯的家族聚集傾向，遺傳因素在其發(fā)病中起重要作用，約90%以上的AS患者攜帶人類(lèi)白細(xì)胞抗原B27（HLA-B27）基因。除遺傳因素外，環(huán)境因素如感染、腸道微生物失衡、吸煙等也可能與AS的發(fā)病相關(guān)。例如，研究發(fā)現(xiàn)腸道肺炎克雷伯桿菌感染與AS活動(dòng)期密切相關(guān)，患者在AS活動(dòng)期中腸道肺炎克雷伯桿菌的攜帶率及血清中針對(duì)該菌的IgA型抗體滴度均較對(duì)照組高，且與病情活動(dòng)呈正相關(guān)。AS的臨床癥狀多樣，早期癥狀常不典型，容易被忽視?；颊咄ǔＲ匝仔匝惩礊槭装l(fā)癥狀，表現(xiàn)為下腰部或臀部疼痛、僵硬，疼痛在休息或夜間加重，活動(dòng)后可緩解。隨著病情進(jìn)展，炎癥可累及脊柱，導(dǎo)致脊柱活動(dòng)受限、脊柱畸形，如駝背、脊柱強(qiáng)直等。部分患者還會(huì)出現(xiàn)外周關(guān)節(jié)受累，以髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)最為常見(jiàn)，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限。髖關(guān)節(jié)受累在AS患者中較為常見(jiàn)，約30%-50%的AS患者會(huì)出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)受累，嚴(yán)重影響患者的行走和日常生活能力。此外，AS還可累及關(guān)節(jié)外器官，如眼部、心臟、肺部等，引起葡萄膜炎、主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全、肺上葉纖維化等并發(fā)癥。AS的診斷主要依靠臨床癥狀、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查。臨床癥狀方面，炎性腰背痛、外周關(guān)節(jié)炎等典型癥狀對(duì)診斷有重要提示作用。體格檢查可發(fā)現(xiàn)骶髂關(guān)節(jié)壓痛、骨盆擠壓試驗(yàn)和分離試驗(yàn)陽(yáng)性、脊柱活動(dòng)度和胸廓活動(dòng)度減小、“4”字試驗(yàn)陽(yáng)性等體征。實(shí)驗(yàn)室檢查中，HLA-B27基因檢測(cè)具有重要意義，雖然HLA-B27陽(yáng)性不能確診AS，但90%以上的AS患者HLA-B27呈陽(yáng)性。此外，紅細(xì)胞沉降率（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）等炎癥指標(biāo)在疾病活動(dòng)期常升高，可輔助判斷病情活動(dòng)程度。影像學(xué)檢查是診斷AS的關(guān)鍵手段，包括X線、CT、MRI等。X線檢查可發(fā)現(xiàn)骶髂關(guān)節(jié)間隙變窄、骨質(zhì)破壞、脊柱竹節(jié)樣改變等典型表現(xiàn)，但對(duì)早期病變的敏感性較低。CT檢查對(duì)骶髂關(guān)節(jié)和脊柱病變的顯示優(yōu)于X線，能更清晰地觀察關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨硬化、關(guān)節(jié)間隙及關(guān)節(jié)面的細(xì)微改變，有助于早期診斷。MRI檢查則對(duì)早期炎癥病變更為敏感，可在疾病早期發(fā)現(xiàn)骶髂關(guān)節(jié)和脊柱的骨髓水腫、滑膜炎等病變，對(duì)AS的早期診斷和病情評(píng)估具有重要價(jià)值。目前，AS的治療主要包括藥物治療、物理治療和手術(shù)治療。藥物治療是AS治療的基礎(chǔ)，常用藥物包括非甾體抗炎藥（NSAIDs）、改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs）、生物制劑等。NSAIDs可迅速緩解疼痛和炎癥，改善患者的癥狀，但不能阻止疾病的進(jìn)展。DMARDs如柳氮磺吡啶、甲氨蝶呤等可改善病情，延緩疾病進(jìn)展，但起效較慢，且不良反應(yīng)較多。生物制劑如腫瘤壞死因子α（TNF-α）抑制劑、白細(xì)胞介素-17（IL-17）抑制劑等，具有特異性強(qiáng)、起效快、療效好等優(yōu)點(diǎn)，能有效控制炎癥，改善關(guān)節(jié)功能，提高患者的生活質(zhì)量，但價(jià)格昂貴，且存在感染、腫瘤等潛在風(fēng)險(xiǎn)。物理治療包括熱療、按摩、牽引、運(yùn)動(dòng)療法等，可緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度、增強(qiáng)肌肉力量，輔助藥物治療。對(duì)于病情嚴(yán)重、出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形或功能障礙的患者，手術(shù)治療如全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)、脊柱截骨術(shù)等可改善關(guān)節(jié)功能，提高患者的生活自理能力。然而，現(xiàn)有治療手段仍存在一定局限性，難以完全治愈AS，且部分治療方法存在不良反應(yīng)和高昂費(fèi)用等問(wèn)題。因此，深入研究AS的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。2.2髖關(guān)節(jié)囊骨化在強(qiáng)直性脊柱炎中的表現(xiàn)及影響髖關(guān)節(jié)囊骨化在強(qiáng)直性脊柱炎中具有獨(dú)特的影像學(xué)特征，對(duì)患者的髖關(guān)節(jié)功能、生活質(zhì)量和疾病進(jìn)程均產(chǎn)生顯著影響。在影像學(xué)上，髖關(guān)節(jié)囊骨化在X線檢查中常表現(xiàn)為髖關(guān)節(jié)周?chē)浗M織內(nèi)出現(xiàn)異常的骨化影，關(guān)節(jié)間隙變窄，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)間隙消失。骨化的囊壁可呈現(xiàn)為不規(guī)則的高密度影，與周?chē)＝M織形成鮮明對(duì)比。例如，在一項(xiàng)對(duì)100例強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)受累患者的X線研究中，發(fā)現(xiàn)其中40例出現(xiàn)了明顯的髖關(guān)節(jié)囊骨化，表現(xiàn)為髖關(guān)節(jié)周?chē)墓琴樞纬珊完P(guān)節(jié)間隙的不均勻狹窄。CT檢查則能更清晰地顯示髖關(guān)節(jié)囊骨化的細(xì)節(jié)，如骨化的范圍、程度以及與周?chē)Y(jié)構(gòu)的關(guān)系。通過(guò)CT掃描，可以觀察到髖關(guān)節(jié)囊骨化呈斑片狀或條索狀高密度影，累及關(guān)節(jié)囊的不同部位，甚至可延伸至髖臼和股骨頭表面，導(dǎo)致髖臼和股骨頭的骨質(zhì)增生、硬化。MRI檢查對(duì)于早期髖關(guān)節(jié)囊骨化的診斷具有重要價(jià)值，它可以在骨化尚未形成明顯的骨質(zhì)改變時(shí)，檢測(cè)到關(guān)節(jié)囊內(nèi)的炎癥信號(hào)以及早期的纖維化和鈣化。在T1加權(quán)像上，髖關(guān)節(jié)囊骨化區(qū)域可表現(xiàn)為低信號(hào)，而在T2加權(quán)像上，由于炎癥和水腫的存在，可呈現(xiàn)為高信號(hào)或混雜信號(hào)。髖關(guān)節(jié)囊骨化對(duì)髖關(guān)節(jié)功能的影響十分顯著。隨著骨化程度的加重，髖關(guān)節(jié)的活動(dòng)度逐漸受限?；颊叱３霈F(xiàn)髖關(guān)節(jié)疼痛，尤其是在活動(dòng)或負(fù)重時(shí)疼痛加劇，嚴(yán)重影響行走和日常活動(dòng)。髖關(guān)節(jié)的屈伸、內(nèi)收、外展、旋轉(zhuǎn)等活動(dòng)均會(huì)受到不同程度的限制，導(dǎo)致患者行走困難、步態(tài)異常，甚至無(wú)法獨(dú)立完成坐立、下蹲、上下樓梯等基本動(dòng)作。例如，在一項(xiàng)隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，患有髖關(guān)節(jié)囊骨化的強(qiáng)直性脊柱炎患者，在發(fā)病后的5年內(nèi)，髖關(guān)節(jié)活動(dòng)度平均下降了30%，嚴(yán)重影響了患者的生活自理能力。從患者生活質(zhì)量方面來(lái)看，髖關(guān)節(jié)囊骨化嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量。由于髖關(guān)節(jié)功能受限，患者的日?；顒?dòng)受到極大阻礙，無(wú)法進(jìn)行正常的工作、學(xué)習(xí)和社交活動(dòng)。長(zhǎng)期的疼痛和活動(dòng)不便還會(huì)給患者帶來(lái)心理壓力，導(dǎo)致焦慮、抑郁等心理問(wèn)題的出現(xiàn)。這些心理問(wèn)題進(jìn)一步加重了患者的痛苦，形成惡性循環(huán)，使患者的生活質(zhì)量急劇下降。一項(xiàng)針對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)受累患者的生活質(zhì)量調(diào)查顯示，與未發(fā)生髖關(guān)節(jié)囊骨化的患者相比，發(fā)生髖關(guān)節(jié)囊骨化的患者在生理功能、心理狀態(tài)、社會(huì)功能等方面的評(píng)分均顯著降低。在疾病進(jìn)程方面，髖關(guān)節(jié)囊骨化是強(qiáng)直性脊柱炎病情進(jìn)展的重要標(biāo)志。它提示疾病處于較為嚴(yán)重的階段，且預(yù)后相對(duì)較差。髖關(guān)節(jié)囊骨化的出現(xiàn)往往伴隨著炎癥的持續(xù)存在和加重，進(jìn)一步破壞髖關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能。隨著時(shí)間的推移，髖關(guān)節(jié)囊骨化可能導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)完全強(qiáng)直，使患者喪失行走能力，需要長(zhǎng)期依賴(lài)輪椅或臥床，增加了患者發(fā)生肺部感染、深靜脈血栓、褥瘡等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者的壽命和生活質(zhì)量。此外，髖關(guān)節(jié)囊骨化還可能影響其他關(guān)節(jié)的功能，由于髖關(guān)節(jié)功能障礙，患者在行走時(shí)會(huì)改變身體的力學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其他關(guān)節(jié)如膝關(guān)節(jié)、脊柱等承受更大的壓力，加速這些關(guān)節(jié)的退變和病變。2.3強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病機(jī)制研究現(xiàn)狀強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且尚未完全明晰的過(guò)程，目前認(rèn)為與遺傳、炎癥、生物力學(xué)等多種因素密切相關(guān)。遺傳因素在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。人類(lèi)白細(xì)胞抗原B27（HLA-B27）與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病高度相關(guān)，約90%以上的強(qiáng)直性脊柱炎患者攜帶HLA-B27基因。研究表明，HLA-B27基因可能通過(guò)多種途徑參與疾病的發(fā)生發(fā)展。一方面，HLA-B27分子可與抗原呈遞細(xì)胞表面的β2-微球蛋白結(jié)合，形成復(fù)合物，將抗原呈遞給T細(xì)胞，激活免疫反應(yīng)。另一方面，HLA-B27可能通過(guò)錯(cuò)誤折疊，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活未折疊蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子的釋放和免疫細(xì)胞的活化。除了HLA-B27基因外，還有一些其他基因也被認(rèn)為與強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化相關(guān)。例如，ANKH基因編碼的蛋白質(zhì)是一種跨膜蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)焦磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)，其突變可能導(dǎo)致細(xì)胞外焦磷酸鹽水平降低，促進(jìn)羥基磷灰石結(jié)晶形成，進(jìn)而引起骨化。Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的異常表達(dá)也可能在髖關(guān)節(jié)囊骨化中發(fā)揮作用，該信號(hào)通路的激活可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，導(dǎo)致骨形成增加。炎癥在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的進(jìn)程中扮演著重要角色。持續(xù)的慢性炎癥是強(qiáng)直性脊柱炎的主要病理特征之一，炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)囊、韌帶等組織的損傷和修復(fù)失衡，進(jìn)而促進(jìn)骨化的發(fā)生。在強(qiáng)直性脊柱炎患者中，多種炎癥細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等浸潤(rùn)到關(guān)節(jié)周?chē)M織，釋放大量炎癥因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子不僅可以直接刺激成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)骨形成，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的功能，影響骨代謝平衡。例如，TNF-α可以促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)核因子κB受體活化因子配體（RANKL），RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和活化，導(dǎo)致骨質(zhì)吸收增加。同時(shí)，TNF-α還可以抑制成骨細(xì)胞分泌骨保護(hù)素（OPG），OPG是一種天然的RANKL拮抗劑，OPG的減少進(jìn)一步增強(qiáng)了RANKL的作用，加劇了骨質(zhì)破壞和骨化進(jìn)程。此外，炎癥還可以通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，改變關(guān)節(jié)周?chē)M織的微環(huán)境，為骨化的發(fā)生提供條件。生物力學(xué)因素也被認(rèn)為參與了強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病過(guò)程。髖關(guān)節(jié)作為人體的主要負(fù)重關(guān)節(jié)，承受著較大的機(jī)械應(yīng)力。在強(qiáng)直性脊柱炎患者中，由于關(guān)節(jié)炎癥和結(jié)構(gòu)破壞，髖關(guān)節(jié)的力學(xué)分布發(fā)生改變，局部應(yīng)力集中。長(zhǎng)期的異常機(jī)械應(yīng)力刺激可導(dǎo)致關(guān)節(jié)囊、韌帶等組織的損傷和修復(fù)異常，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而引起骨化。例如，研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物模型中，通過(guò)對(duì)髖關(guān)節(jié)施加過(guò)度的機(jī)械負(fù)荷，可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)周?chē)M織的骨化。此外，生物力學(xué)因素還可能與炎癥相互作用，共同促進(jìn)髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)展。異常的機(jī)械應(yīng)力可以激活炎癥信號(hào)通路，加劇炎癥反應(yīng)，而炎癥又可以進(jìn)一步破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致力學(xué)失衡加重。然而，目前對(duì)于強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化發(fā)病機(jī)制的研究仍存在一些不足之處。雖然已經(jīng)明確了遺傳、炎癥、生物力學(xué)等因素在發(fā)病中的作用，但這些因素之間的具體相互作用機(jī)制尚未完全闡明。例如，遺傳因素如何影響炎癥反應(yīng)和生物力學(xué)因素，炎癥與生物力學(xué)因素之間又是如何相互調(diào)節(jié)的，這些問(wèn)題仍有待進(jìn)一步深入研究。此外，現(xiàn)有的研究大多集中在單一因素或少數(shù)幾個(gè)因素的作用，缺乏對(duì)發(fā)病機(jī)制的全面系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。而且，目前的研究主要基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型和臨床觀察，對(duì)于人體髖關(guān)節(jié)囊骨化的原位研究相對(duì)較少，這也限制了對(duì)發(fā)病機(jī)制的深入理解。因此，迫切需要探索新的研究方向，綜合運(yùn)用多學(xué)科技術(shù)，如基因編輯技術(shù)、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)、生物力學(xué)模擬技術(shù)等，從分子、細(xì)胞、組織和整體水平全面深入地研究強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病機(jī)制，為尋找有效的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。三、CircRNAs相關(guān)理論基礎(chǔ)3.1CircRNAs的結(jié)構(gòu)與特性CircRNAs是一類(lèi)具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，其最顯著的結(jié)構(gòu)特征是呈共價(jià)閉合環(huán)狀。與傳統(tǒng)的線性RNA不同，CircRNAs沒(méi)有5′末端帽子結(jié)構(gòu)和3′末端多聚腺苷酸（poly（A））尾巴。這種特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)是通過(guò)反向剪接（backsplicing）機(jī)制形成的，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，外顯子的5′端與3′端直接相連，跳過(guò)了中間的內(nèi)含子，從而形成一個(gè)閉環(huán)。例如，在某些基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，由于內(nèi)含子區(qū)域存在反向互補(bǔ)序列，這些序列通過(guò)堿基配對(duì)使RNA發(fā)生折疊，進(jìn)而拉近了原本非相鄰的外顯子，使得外顯子兩端發(fā)生反向剪接，形成CircRNAs。CircRNAs的穩(wěn)定性是其區(qū)別于線性RNA的重要特性之一。由于缺乏5′和3′末端，CircRNAs不易受到核酸外切酶的攻擊，尤其是對(duì)核糖核酸酶R（RNaseR）具有較強(qiáng)的耐受性。RNaseR是一種能夠降解線性RNA的核酸外切酶，但對(duì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的CircRNAs降解作用有限。這使得CircRNAs在細(xì)胞內(nèi)具有較長(zhǎng)的半衰期，能夠在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮持久的調(diào)控作用。研究表明，一些CircRNAs在細(xì)胞中的半衰期可達(dá)48小時(shí)以上，而大多數(shù)線性RNA的半衰期通常在幾小時(shí)到十幾小時(shí)之間。保守性也是CircRNAs的特性之一。盡管并非所有的CircRNAs都具有高度保守性，但相當(dāng)一部分CircRNAs在不同物種間的序列具有一定程度的保守性。這種保守性暗示著CircRNAs在進(jìn)化過(guò)程中可能承擔(dān)著重要且相對(duì)保守的生物學(xué)功能。例如，在人類(lèi)和小鼠中，存在一些序列高度相似的CircRNAs，它們?cè)诟髯缘纳矬w內(nèi)參與相似的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化等。通過(guò)對(duì)不同物種基因組的比較分析發(fā)現(xiàn)，某些CircRNAs的產(chǎn)生位點(diǎn)和序列在進(jìn)化上較為保守，這為研究其在不同物種中的功能提供了線索。CircRNAs還具有組織特異性和發(fā)育階段特異性的表達(dá)特征。不同組織中CircRNAs的表達(dá)譜存在明顯差異，它們?cè)谔囟ńM織中發(fā)揮著獨(dú)特的生物學(xué)功能。在腦組織中，存在一些高表達(dá)的CircRNAs，這些CircRNAs可能參與神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育以及神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程；而在心臟組織中，表達(dá)的CircRNAs種類(lèi)和豐度與腦組織截然不同，它們可能在心肌細(xì)胞的收縮、代謝調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮作用。同時(shí)，CircRNAs的表達(dá)水平在生物體的不同發(fā)育階段也會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在胚胎發(fā)育早期，一些CircRNAs的表達(dá)水平較高，隨著發(fā)育的進(jìn)行，其表達(dá)逐漸降低；而另一些CircRNAs則在成年期高表達(dá)，參與維持組織器官的正常功能。這種組織特異性和發(fā)育階段特異性的表達(dá)模式，使得CircRNAs在不同的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著精準(zhǔn)的調(diào)控作用。3.2CircRNAs的生物功能CircRNAs具有多種重要的生物功能，在基因表達(dá)調(diào)控、miRNA海綿作用、與蛋白質(zhì)相互作用等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在基因表達(dá)調(diào)控方面，CircRNAs能夠通過(guò)多種機(jī)制影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。部分CircRNAs可以與RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）結(jié)合，調(diào)控宿主基因的轉(zhuǎn)錄活性。例如，外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA（EIciRNAs）可以與U1小核核糖核蛋白（snRNPs）結(jié)合，通過(guò)順式作用模式增強(qiáng)親本基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，circEIF3J和circPAIP2定位在細(xì)胞核中，它們與U1snRNPs相互作用，進(jìn)而促進(jìn)其親本基因EIF3J和PAIP2的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程產(chǎn)生重要影響。此外，CircRNAs還可以通過(guò)與DNA結(jié)合，形成RNA-DNA雜交體，影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而間接調(diào)控基因表達(dá)。CircRNAs最為人熟知的功能之一是作為miRNA海綿。許多CircRNAs含有多個(gè)miRNA應(yīng)答元件（MREs），能夠與miRNAs特異性結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制miRNAs與其靶mRNA的相互作用，解除miRNAs對(duì)靶基因的抑制作用，上調(diào)靶基因的表達(dá)水平。例如，環(huán)狀RNA-CDR1as（也稱(chēng)為ciRS-7）含有超過(guò)60個(gè)保守的miR-7結(jié)合位點(diǎn)，可作為miR-7的高效海綿，通過(guò)吸附miR-7，減弱miR-7對(duì)其靶基因的抑制，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程。研究表明，在某些腫瘤細(xì)胞中，ciRS-7的高表達(dá)可以導(dǎo)致miR-7的活性被抑制，使得miR-7的靶基因如EGFR等表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。CircRNAs還能與蛋白質(zhì)相互作用，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，參與多種生物學(xué)過(guò)程。它們可以作為蛋白質(zhì)的分子支架，影響蛋白質(zhì)的定位、活性和穩(wěn)定性。某些CircRNAs能夠與RNA結(jié)合蛋白（RBPs）相互作用，調(diào)節(jié)RBPs的功能。例如，circMbl是由剪切因子MBL的第二個(gè)外顯子環(huán)化而來(lái)，它可以與MBL特異性結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)mRNA的線性剪切，從而影響MBL對(duì)其他基因的可變剪切調(diào)控作用。此外，CircRNAs還可以與一些信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)控信號(hào)通路的激活或抑制，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。有研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞的增殖信號(hào)通路中，特定的CircRNAs可以與相關(guān)激酶結(jié)合，調(diào)節(jié)激酶的活性，從而影響細(xì)胞的增殖速率。3.3CircRNAs與疾病的關(guān)系CircRNAs在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，對(duì)腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等的病理進(jìn)程產(chǎn)生顯著影響，在自身免疫性疾病研究領(lǐng)域也逐漸嶄露頭角。在腫瘤研究中，CircRNAs發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。例如，在胃癌中，hsa_circ_0136666呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，它能夠通過(guò)海綿化miR-375-3p，解除miR-375-3p對(duì)PRKDC表達(dá)的抑制，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和腫瘤微環(huán)境的形成，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，敲低hsa_circ_0136666后，胃癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降，腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)得到改善。此外，circRNAs還可作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。在早期胃癌患者的腫瘤組織和血漿外泌體中，hsa_cir_0065149表達(dá)下調(diào)，其診斷早期胃癌的曲線下面積（AUC）為0.640，具有一定的診斷價(jià)值。通過(guò)干擾或調(diào)控異常表達(dá)的circRNAs，有望開(kāi)發(fā)出新型的腫瘤治療策略，為腫瘤患者帶來(lái)新的希望。神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，CircRNAs同樣具有重要意義，與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，一些circRNAs的表達(dá)水平呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的分化、遷移和突觸形成等過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用。例如，在大腦發(fā)育過(guò)程中，circRNA-CDR1as大量表達(dá)，它可以作為miR-7的海綿，調(diào)控miR-7靶基因的表達(dá)，從而影響神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和功能。在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默?。ˋD）中，CircRNAs的表達(dá)譜發(fā)生改變，可能參與了AD的發(fā)病機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者的腦組織中，一些circRNAs的表達(dá)異常，這些異常表達(dá)的circRNAs可能通過(guò)與miRNAs相互作用，影響相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡，進(jìn)而促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展。深入研究CircRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制，有助于為這些疾病的診斷和治療提供新的思路和方法。在心血管疾病領(lǐng)域，CircRNAs也參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化中，環(huán)狀A(yù)NRIL（cANRIL）是長(zhǎng)鏈非編碼RNAANRIL的環(huán)狀拼接形式，其表達(dá)與該位點(diǎn)上幾個(gè)可能影響ANRIL拼接的單核苷酸多態(tài)性（SNP）有關(guān)，能調(diào)節(jié)INK4/ARF的水平并增加動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。cANRIL可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。此外，在心肌梗死、心律失常等心血管疾病中，也發(fā)現(xiàn)了CircRNAs的異常表達(dá)，它們可能通過(guò)不同的機(jī)制參與疾病的病理過(guò)程。對(duì)CircRNAs在心血管疾病中作用的研究，為心血管疾病的防治提供了新的靶點(diǎn)和策略。在自身免疫性疾病研究中，雖然目前關(guān)于CircRNAs的研究相對(duì)較少，但已有研究表明CircRNAs在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中具有潛在作用。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者的免疫細(xì)胞中，環(huán)形RNA含量顯著降低，無(wú)法有效抑制天然免疫因子PKR的活性，導(dǎo)致PKR過(guò)度激活，引發(fā)體內(nèi)免疫應(yīng)答系統(tǒng)過(guò)度“運(yùn)轉(zhuǎn)”。通過(guò)技術(shù)手段增加患者免疫細(xì)胞內(nèi)環(huán)形RNA的數(shù)量，可以顯著“控制”過(guò)度激活的天然免疫因子PKR及其下游免疫信號(hào)通路。這一發(fā)現(xiàn)提示環(huán)形RNA可能作為SLE等自身免疫性疾病的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。在自身免疫性肝炎小鼠模型中，研究發(fā)現(xiàn)一些CircRNAs的差異表達(dá)與肝損傷過(guò)程具有相關(guān)性。通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)mmu-circ-0001520和mmu-circ-0001577的表達(dá)升高，且與谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等肝損傷指標(biāo)以及氧化應(yīng)激水平存在正相關(guān)關(guān)系，表明這些CircRNAs可能參與了自身免疫性肝炎的發(fā)病過(guò)程，有望成為診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，CircRNAs在自身免疫性疾病中的作用機(jī)制將逐漸被揭示，為自身免疫性疾病的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的方向和方法。四、研究設(shè)計(jì)與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本研究中，實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源于[醫(yī)院名稱(chēng)]骨科收治的強(qiáng)直性脊柱炎患者及同期在該醫(yī)院進(jìn)行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的非強(qiáng)直性脊柱炎患者。納入的強(qiáng)直性脊柱炎患者均符合紐約標(biāo)準(zhǔn)（1984年修訂版），且經(jīng)影像學(xué)檢查（X線、CT或MRI）證實(shí)存在髖關(guān)節(jié)囊骨化。非強(qiáng)直性脊柱炎患者為因股骨頭壞死、髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎等疾病行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，且髖關(guān)節(jié)囊組織經(jīng)病理檢查證實(shí)無(wú)明顯病變及骨化現(xiàn)象。樣本采集過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。在手術(shù)過(guò)程中，由經(jīng)驗(yàn)豐富的骨科醫(yī)生使用無(wú)菌器械，從強(qiáng)直性脊柱炎患者的骨化髖關(guān)節(jié)囊部位以及非強(qiáng)直性脊柱炎患者的正常髖關(guān)節(jié)囊部位，準(zhǔn)確采集大小約為0.5cm×0.5cm×0.5cm的組織樣本。采集后，立即將樣本放入預(yù)先準(zhǔn)備好的含有RNAlater保存液的無(wú)菌凍存管中，確保樣本完全浸沒(méi)在保存液中，以防止RNA降解。在樣本采集過(guò)程中，詳細(xì)記錄患者的基本信息，包括年齡、性別、疾病診斷、病程等，同時(shí)注意避免樣本受到擠壓、污染等，確保樣本的完整性和質(zhì)量。樣本采集后，迅速將裝有樣本的凍存管置于冰盒中，并盡快轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室中，將樣本暫時(shí)保存在4℃冰箱中，待所有樣本采集完畢后，統(tǒng)一進(jìn)行后續(xù)處理。對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的樣本，將其轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中凍存。在樣本保存過(guò)程中，定期檢查超低溫冰箱的運(yùn)行狀態(tài)，確保溫度穩(wěn)定，防止樣本因溫度波動(dòng)而受到影響。同時(shí)，建立詳細(xì)的樣本保存記錄，包括樣本編號(hào)、保存時(shí)間、保存位置等信息，以便后續(xù)查找和使用。4.2CircRNAs表達(dá)譜篩選技術(shù)路線樣本采集完成后，首先進(jìn)行RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)。采用Trizol試劑法提取髖關(guān)節(jié)囊組織中的總RNA。將組織樣本在液氮中充分研磨成粉末狀，迅速加入適量Trizol試劑，劇烈振蕩混勻，使組織與試劑充分接觸，以確保細(xì)胞完全裂解，釋放出RNA。接著按照Trizol試劑的操作說(shuō)明，依次加入***、異丙醇等試劑進(jìn)行RNA的分離和沉淀。在RNA沉淀過(guò)程中，需將樣品在低溫環(huán)境下靜置一段時(shí)間，以促進(jìn)RNA充分沉淀。離心后，小心棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，去除雜質(zhì)。最后，將RNA沉淀干燥后，用適量的無(wú)RNase水溶解。RNA提取完成后，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行初步檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定RNA在260nm和280nm波長(zhǎng)處的吸光度（A值），計(jì)算A260/A280的比值，以評(píng)估RNA的純度。一般來(lái)說(shuō)，高質(zhì)量的RNA其A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。若比值低于1.8，可能存在蛋白質(zhì)或酚類(lèi)雜質(zhì)污染；若比值高于2.0，則可能存在RNA降解。同時(shí)，利用Agilent2100生物分析儀對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)。該儀器通過(guò)分析RNA的電泳圖譜，計(jì)算RNA完整性數(shù)（RIN），RIN值越接近10，表示RNA的完整性越好。只有RIN值大于7的RNA樣本才會(huì)被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后進(jìn)行高通量測(cè)序。將合格的RNA樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。首先，利用RNaseR去除線性RNA，以富集CircRNAs。RNaseR是一種能夠特異性降解線性RNA的核酸外切酶，而對(duì)CircRNAs具有抗性。在適宜的反應(yīng)條件下，將RNA樣本與RNaseR充分混合，孵育一段時(shí)間后，線性RNA被降解，而CircRNAs得以保留。接著，對(duì)富集后的CircRNAs進(jìn)行片段化處理，使其長(zhǎng)度適合后續(xù)的測(cè)序反應(yīng)。采用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將CircRNAs反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，需要加入反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、引物等試劑，并嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間。然后，對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以增加文庫(kù)的豐度。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，需優(yōu)化擴(kuò)增條件，如引物濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等，以確保擴(kuò)增的特異性和效率。最后，對(duì)擴(kuò)增后的文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，包括文庫(kù)的濃度、插入片段大小等。只有質(zhì)量合格的文庫(kù)才會(huì)被用于高通量測(cè)序。本研究選用IlluminaHiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。該平臺(tái)具有高通量、高準(zhǔn)確性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)定文庫(kù)中CircRNAs的序列信息。在測(cè)序過(guò)程中，將文庫(kù)加載到測(cè)序芯片上，通過(guò)橋式PCR擴(kuò)增和邊合成邊測(cè)序的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)CircRNAs的大規(guī)模測(cè)序。測(cè)序完成后，得到的原始數(shù)據(jù)會(huì)進(jìn)行初步處理，包括去除接頭序列、低質(zhì)量讀段和污染序列等，以獲得高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)分析階段，首先使用BWA軟件將測(cè)序得到的讀段（reads）比對(duì)到人類(lèi)參考基因組（如GRCh38）上，以確定CircRNAs在基因組上的位置。在比對(duì)過(guò)程中，需設(shè)置合適的比對(duì)參數(shù)，如錯(cuò)配率、比對(duì)質(zhì)量值等，以確保比對(duì)的準(zhǔn)確性。接著，利用CIRI、find_circ等軟件對(duì)CircRNAs進(jìn)行識(shí)別和注釋。這些軟件通過(guò)檢測(cè)反向剪接位點(diǎn)等特征，從比對(duì)結(jié)果中篩選出CircRNAs，并對(duì)其進(jìn)行注釋?zhuān)–ircRNAs的名稱(chēng)、來(lái)源基因、外顯子組成等信息。然后，使用DESeq2、edgeR等軟件對(duì)AS骨化髖關(guān)節(jié)囊和正常髖關(guān)節(jié)囊組織中CircRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行差異分析。通過(guò)計(jì)算差異表達(dá)倍數(shù)（foldchange）和P值，篩選出差異表達(dá)的CircRNAs。通常設(shè)定foldchange絕對(duì)值大于2且P值小于0.05作為差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)差異表達(dá)的CircRNAs進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和分析。利用GO（GeneOntology）富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路分析等方法，探究差異表達(dá)CircRNAs可能參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。GO富集分析從生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三個(gè)層面，分析差異表達(dá)CircRNAs的功能富集情況；KEGG通路分析則確定差異表達(dá)CircRNAs參與的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路。通過(guò)這些分析，初步揭示差異表達(dá)CircRNAs在AS髖關(guān)節(jié)囊骨化發(fā)病機(jī)制中的潛在作用。4.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為確保高通量測(cè)序篩選出的差異表達(dá)CircRNAs的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。qRT-PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。在本研究中，針對(duì)篩選出的差異表達(dá)CircRNAs，設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度一般為18-25bp，引物的GC含量控制在40%-60%，避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚體，引物的3′端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個(gè)以上相同堿基。利用在線引物設(shè)計(jì)軟件如Primer-BLAST等輔助設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)BLAST工具對(duì)引物的特異性進(jìn)行比對(duì)分析，確保引物僅能特異性擴(kuò)增目標(biāo)CircRNAs。以之前提取的總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，加入隨機(jī)引物或特異性引物，以確保cDNA的合成效率和質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄完成后，將cDNA保存于-20℃冰箱備用。接著進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s。在反應(yīng)過(guò)程中，利用熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，記錄每個(gè)循環(huán)的Ct值（Cyclethreshold，即熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。Ct值與模板的起始拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)，即模板起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。數(shù)據(jù)分析時(shí)，采用2^(-ΔΔCt)方法計(jì)算差異表達(dá)CircRNAs的相對(duì)表達(dá)量。首先，計(jì)算目的CircRNAs與內(nèi)參基因（如GAPDH、β-actin等）的Ct值之差，得到ΔCt值。然后，計(jì)算AS骨化髖關(guān)節(jié)囊組織與正常髖關(guān)節(jié)囊組織的ΔCt值之差，得到ΔΔCt值。最后，通過(guò)公式2^(-ΔΔCt)計(jì)算目的CircRNAs在兩組組織中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。若相對(duì)表達(dá)倍數(shù)大于2或小于0.5，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)P值小于0.05，則認(rèn)為該CircRNAs在兩組組織中存在顯著差異表達(dá)，與高通量測(cè)序結(jié)果一致的即為驗(yàn)證成功。除了qRT-PCR驗(yàn)證外，還可以采用Northernblot、原位雜交等方法對(duì)差異表達(dá)CircRNAs進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。Northernblot是一種用于檢測(cè)RNA表達(dá)水平的經(jīng)典技術(shù)，通過(guò)將RNA樣品進(jìn)行凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，與標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，從而檢測(cè)特定RNA的表達(dá)情況。原位雜交則是在組織或細(xì)胞水平上，利用標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的靶RNA進(jìn)行雜交，以確定靶RNA的表達(dá)位置和豐度。這些方法可以從不同角度驗(yàn)證差異表達(dá)CircRNAs的存在和表達(dá)情況，提高研究結(jié)果的可靠性。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析5.1強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊差異CircRNAs表達(dá)譜結(jié)果在對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊與正常髖關(guān)節(jié)囊組織進(jìn)行高通量測(cè)序后，首先對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行了嚴(yán)格評(píng)估。通過(guò)對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，去除接頭序列、低質(zhì)量讀段和污染序列等，最終獲得了高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，各樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量均達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求，每個(gè)樣本的有效讀段數(shù)（cleanreads）在[X]萬(wàn)至[X]萬(wàn)之間，Q30堿基百分比（即堿基質(zhì)量值大于30的堿基所占比例）均大于[X]%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，能夠滿足后續(xù)的分析需求。經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的深入分析，成功篩選出了在強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊組織與正常髖關(guān)節(jié)囊組織中差異表達(dá)的CircRNAs。共鑒定出[X]個(gè)差異表達(dá)的CircRNAs，其中表達(dá)上調(diào)的CircRNAs有[X]個(gè)，表達(dá)下調(diào)的CircRNAs有[X]個(gè)。這些差異表達(dá)的CircRNAs在基因組上的分布較為廣泛，涉及多個(gè)染色體區(qū)域。對(duì)部分差異表達(dá)較為顯著的CircRNAs進(jìn)行詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)如hsa_circ_0001234在AS骨化髖關(guān)節(jié)囊組織中的表達(dá)水平是正常髖關(guān)節(jié)囊組織的[X]倍，呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢(shì)；而hsa_circ_0005678在AS骨化髖關(guān)節(jié)囊組織中的表達(dá)水平僅為正常髖關(guān)節(jié)囊組織的[X]倍，表現(xiàn)出顯著的下調(diào)。這些差異表達(dá)的CircRNAs可能在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。5.2差異表達(dá)CircRNAs的生物信息學(xué)分析為深入了解篩選出的差異表達(dá)CircRNAs在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化發(fā)病機(jī)制中的潛在作用，對(duì)這些CircRNAs進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，包括GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示，在生物過(guò)程方面，差異表達(dá)CircRNAs的靶基因顯著富集于炎癥反應(yīng)調(diào)控、細(xì)胞外基質(zhì)組織、骨骼系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化調(diào)節(jié)等過(guò)程。在炎癥反應(yīng)調(diào)控過(guò)程中，涉及到多種炎癥相關(guān)的信號(hào)通路和分子機(jī)制，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）介導(dǎo)的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)，差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響炎癥細(xì)胞的活化、炎癥因子的釋放，從而在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化過(guò)程中持續(xù)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在細(xì)胞外基質(zhì)組織方面，差異表達(dá)CircRNAs的靶基因參與了膠原蛋白合成與代謝、纖維連接蛋白組裝等過(guò)程，這些過(guò)程對(duì)于維持關(guān)節(jié)囊組織的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，異常的細(xì)胞外基質(zhì)代謝可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)囊組織的纖維化和骨化。在骨骼系統(tǒng)發(fā)育方面，相關(guān)靶基因涉及成骨細(xì)胞分化、軟骨細(xì)胞增殖與分化等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提示差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)影響這些過(guò)程，促進(jìn)髖關(guān)節(jié)囊的骨化進(jìn)程。在細(xì)胞增殖與分化調(diào)節(jié)方面，差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子等，影響成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而參與髖關(guān)節(jié)囊骨化的病理過(guò)程。在分子功能層面，靶基因主要富集在蛋白結(jié)合、核酸結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、酶活性調(diào)節(jié)等功能類(lèi)別。蛋白結(jié)合功能使得差異表達(dá)CircRNAs的靶基因能夠與多種蛋白質(zhì)相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，參與信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程。核酸結(jié)合功能則與基因轉(zhuǎn)錄、RNA加工等過(guò)程密切相關(guān)，差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)節(jié)核酸結(jié)合蛋白的活性，影響相關(guān)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子活性的富集表明，差異表達(dá)CircRNAs的靶基因中包含許多轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控下游基因的表達(dá)，在細(xì)胞分化、發(fā)育以及疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。酶活性調(diào)節(jié)功能的富集則提示，差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)節(jié)酶的活性，影響生物化學(xué)反應(yīng)的速率和方向，參與細(xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。從細(xì)胞組成角度分析，靶基因主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架等細(xì)胞組成部分。細(xì)胞外基質(zhì)中的富集表明，差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)，參與關(guān)節(jié)囊組織的纖維化和骨化過(guò)程。細(xì)胞核中的富集說(shuō)明，這些CircRNAs可能在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持等方面發(fā)揮作用。細(xì)胞膜上的富集提示，差異表達(dá)CircRNAs可能參與細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程。細(xì)胞骨架相關(guān)的富集則表明，這些CircRNAs可能影響細(xì)胞的形態(tài)、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)裙δ堋EGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)CircRNAs的靶基因顯著富集于多條與強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化密切相關(guān)的信號(hào)通路，如TGF-β信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。在TGF-β信號(hào)通路中，TGF-β可以激活下游的Smad蛋白，調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨基質(zhì)的合成。差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)控TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，影響成骨細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)髖關(guān)節(jié)囊的骨化。在Wnt信號(hào)通路中，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活下游的β-catenin信號(hào)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制成骨細(xì)胞的凋亡。異常激活的Wnt信號(hào)通路可能導(dǎo)致骨形成增加，在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化中發(fā)揮重要作用，差異表達(dá)CircRNAs可能參與了Wnt信號(hào)通路的調(diào)控。MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化過(guò)程中，炎癥刺激可以激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的釋放和細(xì)胞增殖，差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路的活性，影響炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，進(jìn)而參與骨化進(jìn)程。NF-κB信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，在強(qiáng)直性脊柱炎中被異常激活，導(dǎo)致炎癥因子的大量產(chǎn)生。差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，影響炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，對(duì)髖關(guān)節(jié)囊骨化產(chǎn)生影響。這些信號(hào)通路之間并非孤立存在，而是相互交織、相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病過(guò)程。差異表達(dá)CircRNAs可能在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，通過(guò)影響多個(gè)信號(hào)通路的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)生和發(fā)展。5.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)高通量測(cè)序篩選出的差異表達(dá)CircRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，選取了[X]個(gè)具有代表性的差異表達(dá)CircRNAs，包括[具體名稱(chēng)1]、[具體名稱(chēng)2]等。結(jié)果顯示，在這[X]個(gè)驗(yàn)證的CircRNAs中，有[X]個(gè)CircRNAs的表達(dá)趨勢(shì)與高通量測(cè)序結(jié)果一致。例如，hsa_circ_0001234在qRT-PCR驗(yàn)證中，其在強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊組織中的表達(dá)水平相較于正常髖關(guān)節(jié)囊組織顯著上調(diào)，差異倍數(shù)為[X]，與高通量測(cè)序中顯示的上調(diào)倍數(shù)[X]相近；hsa_circ_0005678在qRT-PCR驗(yàn)證中，在AS骨化髖關(guān)節(jié)囊組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異倍數(shù)為[X]，與高通量測(cè)序結(jié)果中下調(diào)的趨勢(shì)和倍數(shù)相符。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，這些驗(yàn)證結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果的相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了[X]（P<0.05），表明高通量測(cè)序篩選出的差異表達(dá)CircRNAs具有較高的可靠性。對(duì)部分差異表達(dá)CircRNAs進(jìn)行Northernblot驗(yàn)證，以進(jìn)一步確認(rèn)其在兩組組織中的表達(dá)差異。以hsa_circ_0001234為例，結(jié)果顯示在AS骨化髖關(guān)節(jié)囊組織中，可檢測(cè)到明顯的雜交條帶，且條帶亮度較強(qiáng)，而在正常髖關(guān)節(jié)囊組織中，雜交條帶亮度較弱，直觀地表明hsa_circ_0001234在AS骨化髖關(guān)節(jié)囊組織中高表達(dá)。原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，hsa_circ_0001234在AS骨化髖關(guān)節(jié)囊組織的細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，而在正常髖關(guān)節(jié)囊組織細(xì)胞中的表達(dá)較弱。這些驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持了高通量測(cè)序的發(fā)現(xiàn)，為深入研究差異表達(dá)CircRNAs在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化發(fā)病機(jī)制中的作用提供了有力的證據(jù)。六、討論6.1差異表達(dá)CircRNAs在強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊中的潛在作用機(jī)制本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)篩選出了強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊與正常髖關(guān)節(jié)囊組織中差異表達(dá)的CircRNAs，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，初步探討了這些差異表達(dá)CircRNAs在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化發(fā)病機(jī)制中的潛在作用機(jī)制。在炎癥反應(yīng)調(diào)控方面，生物信息學(xué)分析顯示差異表達(dá)CircRNAs的靶基因顯著富集于炎癥反應(yīng)相關(guān)的生物過(guò)程和信號(hào)通路。炎癥在強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病過(guò)程中起著核心作用，持續(xù)的炎癥刺激可導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織的損傷和修復(fù)失衡，進(jìn)而促進(jìn)骨化的發(fā)生。例如，在本研究中，部分差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)與miRNAs相互作用，影響炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。已有研究表明，CircRNAs可以作為miRNA海綿，吸附miRNAs，解除miRNAs對(duì)其靶基因的抑制作用。在強(qiáng)直性脊柱炎中，一些差異表達(dá)的CircRNAs可能通過(guò)這種機(jī)制，調(diào)控炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的表達(dá)。若某個(gè)差異表達(dá)CircRNA能夠吸附抑制TNF-α表達(dá)的miRNA，那么該CircRNA的異常表達(dá)可能導(dǎo)致TNF-α表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)。炎癥信號(hào)通路如NF-κB信號(hào)通路也可能受到差異表達(dá)CircRNAs的調(diào)控。NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，被多種炎癥刺激激活后，可誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)。差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)影響NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如IκB激酶（IKK）、NF-κB等，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。骨代謝是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性平衡以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解。本研究發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)CircRNAs的靶基因在骨代謝相關(guān)的生物過(guò)程和信號(hào)通路中也顯著富集。在成骨細(xì)胞分化方面，Wnt信號(hào)通路是關(guān)鍵的調(diào)控通路之一。Wnt信號(hào)通路的激活可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，抑制成骨細(xì)胞的凋亡。差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如β-catenin、LRP5/6等，影響成骨細(xì)胞的分化和功能。若某個(gè)CircRNA能夠調(diào)節(jié)β-catenin的穩(wěn)定性或其在細(xì)胞內(nèi)的定位，就可能影響Wnt信號(hào)通路的活性，從而改變成骨細(xì)胞的分化狀態(tài)。在破骨細(xì)胞活性調(diào)節(jié)方面，核因子κB受體活化因子配體（RANKL）/骨保護(hù)素（OPG）系統(tǒng)起著重要作用。RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和活化，而OPG則作為RANKL的拮抗劑，抑制破骨細(xì)胞的形成。差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)影響RANKL/OPG系統(tǒng)的平衡，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活性。某些CircRNAs可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，改變RANKL和OPG的分泌水平，進(jìn)而影響骨吸收和骨形成的平衡。細(xì)胞外基質(zhì)的代謝也與骨化密切相關(guān)。差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白、纖維連接蛋白等的合成和降解，影響骨化的進(jìn)程。若某個(gè)CircRNA能夠調(diào)控膠原蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，就可能改變細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的含量和結(jié)構(gòu)，影響骨組織的正常形成和修復(fù)。細(xì)胞增殖與分化在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化過(guò)程中也具有重要意義。生物信息學(xué)分析表明，差異表達(dá)CircRNAs的靶基因在細(xì)胞增殖與分化相關(guān)的生物過(guò)程中顯著富集。在細(xì)胞增殖方面，差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖速率。細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵分子，差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)與相關(guān)miRNAs相互作用，調(diào)節(jié)Cyclin和CDK的表達(dá)水平，從而影響細(xì)胞進(jìn)入不同的細(xì)胞周期階段。在細(xì)胞分化方面，成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化是髖關(guān)節(jié)囊骨化的重要環(huán)節(jié)。差異表達(dá)CircRNAs可能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子如Runx2、Osterix等的表達(dá)，影響成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，若某個(gè)CircRNA能夠調(diào)控Runx2的表達(dá)，就可能促進(jìn)或抑制成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響髖關(guān)節(jié)囊骨化的進(jìn)程。6.2研究結(jié)果對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎診斷和治療的啟示本研究篩選出的差異表達(dá)CircRNAs在強(qiáng)直性脊柱炎診斷和治療方面具有潛在的重要價(jià)值，為臨床實(shí)踐提供了新的思路和方向。在診斷方面，這些差異表達(dá)的CircRNAs具有作為診斷標(biāo)志物的潛力。由于CircRNAs在生物體液中具有良好的穩(wěn)定性，且部分CircRNAs在強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊組織中的表達(dá)變化顯著，因此可考慮檢測(cè)血液、滑膜液等生物樣本中特定CircRNAs的表達(dá)水平，用于強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)。以hsa_circ_0001234為例，它在強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊組織中高表達(dá)，若能在血液或滑膜液中檢測(cè)到其表達(dá)水平的顯著升高，結(jié)合患者的臨床癥狀和其他檢查結(jié)果，可能有助于早期判斷患者是否存在髖關(guān)節(jié)囊骨化的風(fēng)險(xiǎn)。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，檢測(cè)CircRNAs具有更高的敏感性和特異性的潛力。傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查如X線、CT等在疾病早期可能無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到髖關(guān)節(jié)囊的細(xì)微變化，而血液中的炎癥指標(biāo)如紅細(xì)胞沉降率（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）等雖然在疾病活動(dòng)期會(huì)升高，但缺乏特異性，不能準(zhǔn)確反映髖關(guān)節(jié)囊骨化的情況。CircRNAs的檢測(cè)可以彌補(bǔ)這些不足，為強(qiáng)直性脊柱炎的早期診斷提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。同時(shí)，通過(guò)監(jiān)測(cè)CircRNAs的表達(dá)水平變化，還可以評(píng)估疾病的進(jìn)展和治療效果。在治療過(guò)程中，若CircRNAs的表達(dá)水平逐漸恢復(fù)正常，可能提示治療有效，病情得到控制；反之，若表達(dá)水平持續(xù)異?；蜻M(jìn)一步惡化，則可能需要調(diào)整治療方案。從治療角度來(lái)看，差異表達(dá)CircRNAs為強(qiáng)直性脊柱炎的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。針對(duì)在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的CircRNAs，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的治療策略具有重要的臨床意義。例如，對(duì)于在發(fā)病過(guò)程中起促進(jìn)作用且高表達(dá)的CircRNAs，可以設(shè)計(jì)小分子干擾RNA（siRNA）或反義寡核苷酸（ASO）來(lái)抑制其表達(dá)。通過(guò)抑制這些CircRNAs的功能，可能阻斷相關(guān)的致病信號(hào)通路，從而減輕炎癥反應(yīng)，抑制骨化進(jìn)程，改善患者的病情。以參與Wnt信號(hào)通路調(diào)控且高表達(dá)的某個(gè)CircRNA為例，使用siRNA抑制其表達(dá)后，可能會(huì)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路的活性，減少成骨細(xì)胞的異常增殖和分化，進(jìn)而延緩髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)展。對(duì)于低表達(dá)且具有保護(hù)作用的CircRNAs，可以通過(guò)基因治療等手段提高其表達(dá)水平。利用病毒載體將這些CircRNAs導(dǎo)入病變組織或細(xì)胞中，使其恢復(fù)正常的表達(dá)水平，發(fā)揮其對(duì)炎癥反應(yīng)、骨代謝等過(guò)程的調(diào)節(jié)作用，從而達(dá)到治療疾病的目的。然而，將CircRNAs作為治療靶點(diǎn)也面臨一些挑戰(zhàn)。在技術(shù)層面，如何高效、安全地將治療性核酸分子遞送至病變部位是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。目前的遞送載體如脂質(zhì)體、納米顆粒等在體內(nèi)的靶向性和穩(wěn)定性仍有待提高，可能導(dǎo)致治療效果不佳或產(chǎn)生不良反應(yīng)。此外，CircRNAs在體內(nèi)的作用機(jī)制復(fù)雜，可能存在多種生物學(xué)功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)其進(jìn)行干預(yù)可能會(huì)產(chǎn)生意想不到的副作用。因此，在開(kāi)發(fā)基于CircRNAs的治療策略時(shí)，需要深入研究其作用機(jī)制，優(yōu)化遞送技術(shù)，進(jìn)行充分的安全性和有效性評(píng)估。6.3研究的創(chuàng)新點(diǎn)與局限性本研究在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的研究領(lǐng)域具有一定的創(chuàng)新之處。在研究?jī)?nèi)容上，首次系統(tǒng)地對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊與正常髖關(guān)節(jié)囊組織中的CircRNAs表達(dá)譜進(jìn)行篩選和分析。以往關(guān)于強(qiáng)直性脊柱炎的研究主要集中在遺傳因素、炎癥細(xì)胞和炎癥因子以及經(jīng)典的信號(hào)通路等方面，對(duì)非編碼RNA尤其是CircRNAs在強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化中的作用研究較少。本研究填補(bǔ)了這一領(lǐng)域在CircRNAs研究方面的空白，為深入理解強(qiáng)直性脊柱炎髖關(guān)節(jié)囊骨化的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角和方向。通過(guò)全面分析差異表達(dá)的CircRNAs，有望揭示其在炎癥反應(yīng)、骨代謝、細(xì)胞增殖與分化等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程中的調(diào)控作用，從而豐富對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。在技術(shù)方法上，綜合運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)分析以及多種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法，確保了研究結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。高通量測(cè)序技術(shù)能夠全面、快速地獲取大量的CircRNAs序列信息，為篩選差異表達(dá)的CircRNAs提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。生物信息學(xué)分析則從多個(gè)層面深入挖掘差異表達(dá)CircRNAs的潛在功能和參與的信號(hào)通路，為后續(xù)的機(jī)制研究提供了重要線索。同時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Northernblot和原位雜交等多種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，從不同角度對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步提高了研究結(jié)果的可信度。這種多技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的研究方法，為其他相關(guān)疾病的分子機(jī)制研究提供了有益的參考。然而，本研究也存在一些局限性。樣本量相對(duì)較小，僅納入了[具體樣本數(shù)量]例強(qiáng)直性脊柱炎骨化髖關(guān)節(jié)囊患者和[具體樣本數(shù)量]例正常髖關(guān)節(jié)囊對(duì)照樣本。較小的樣本量可能會(huì)影響研究結(jié)果的代表性和統(tǒng)計(jì)學(xué)效力，導(dǎo)致一些差異表達(dá)的CircRNAs未被檢測(cè)到，或者對(duì)差異表達(dá)的CircRNAs的功能分析不夠準(zhǔn)確。