狂犬病課題申報(bào)書一、封面內(nèi)容

項(xiàng)目名稱：狂犬病病毒新型疫苗及免疫機(jī)制研究

申請(qǐng)人姓名及聯(lián)系方式：張華，zhanghua@

所屬單位：國(guó)家傳染病醫(yī)學(xué)中心病毒研究所

申報(bào)日期：2023年10月26日

項(xiàng)目類別：應(yīng)用基礎(chǔ)研究

二．項(xiàng)目摘要

狂犬病作為一種由狂犬病病毒（RABV）引起的急性傳染病，其致死率極高，一旦發(fā)病無有效治療手段，因此疫苗預(yù)防是防控狂犬病的唯一有效途徑。然而，現(xiàn)有狂犬病疫苗存在免疫原性不足、接種程序復(fù)雜等問題，亟需開發(fā)新型高效疫苗。本項(xiàng)目擬基于深度解析RABV抗原蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，結(jié)合新型佐劑技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)全病毒或關(guān)鍵抗原片段的重組腺病毒載體疫苗，并探索其免疫增強(qiáng)機(jī)制。研究將采用冷凍電鏡技術(shù)解析RABV關(guān)鍵抗原（如G蛋白）的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)其構(gòu)象變化；通過基因編輯技術(shù)優(yōu)化腺病毒載體骨架，降低免疫原性并提高遞送效率；利用動(dòng)物模型系統(tǒng)評(píng)估疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，并深入分析T細(xì)胞與B細(xì)胞協(xié)同作用的免疫機(jī)制。預(yù)期成果包括：獲得高免疫原性的新型腺病毒載體疫苗原型，明確其作用靶點(diǎn)與免疫通路，為研發(fā)廣譜、長(zhǎng)效狂犬病疫苗提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。此外，本研究還將探索RABV感染期間免疫逃逸機(jī)制，為開發(fā)新型治療性藥物奠定基礎(chǔ)。項(xiàng)目的實(shí)施將顯著提升我國(guó)狂犬病防控能力，具有重大公共衛(wèi)生意義。

三.項(xiàng)目背景與研究意義

狂犬?。≧abies）是一種由狂犬病病毒（RABV）引起的急性傳染病，主要感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致幾乎100%的感染者死亡，且發(fā)病后缺乏有效的治療手段。盡管全球范圍內(nèi)在狂犬病防控方面取得了顯著進(jìn)展，包括疫苗接種覆蓋率提高和動(dòng)物疫情管理加強(qiáng)，但狂犬病仍是嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題，尤其在發(fā)展中國(guó)家。根據(jù)世界衛(wèi)生（WHO）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，每年約有5.9萬人死于狂犬病，其中約95%的死亡病例發(fā)生在非洲和亞洲地區(qū)。這些數(shù)據(jù)凸顯了狂犬病防控的緊迫性和重要性。

目前，狂犬病疫苗的研發(fā)和接種策略已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。傳統(tǒng)的狂犬病疫苗主要包括滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗通過殺死病毒來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，具有較高的安全性，但通常需要多次接種才能達(dá)到滿意的免疫效果，且免疫持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短。減毒活疫苗則利用弱化的活病毒誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，能夠提供更持久的免疫保護(hù)，但存在一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)，如病毒變異或免疫抑制等。然而，無論是滅活疫苗還是減毒活疫苗，都存在一些局限性，如免疫原性不足、接種程序復(fù)雜、生產(chǎn)成本高等問題，這些因素限制了疫苗的廣泛應(yīng)用和效果提升。

近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，新型疫苗平臺(tái)如腺病毒載體疫苗、mRNA疫苗等逐漸應(yīng)用于狂犬病疫苗的研發(fā)。腺病毒載體疫苗利用腺病毒作為載體遞送RABV抗原，能夠高效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，具有免疫原性強(qiáng)、接種程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。然而，腺病毒載體疫苗也存在一些挑戰(zhàn)，如免疫原性可能受到宿主既往感染的影響、潛在的免疫原性過強(qiáng)等問題。因此，開發(fā)新型高效、安全的狂犬病疫苗仍然是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

從學(xué)術(shù)角度來看，深入解析RABV的抗原結(jié)構(gòu)、免疫機(jī)制以及病毒逃逸機(jī)制對(duì)于開發(fā)新型疫苗和治療方法具有重要意義。RABV的G蛋白是其主要的免疫原，能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答。近年來，通過冷凍電鏡等高分辨率技術(shù)解析RABVG蛋白的結(jié)構(gòu)，為理解其功能和免疫機(jī)制提供了重要依據(jù)。然而，RABVG蛋白的構(gòu)象變化、與宿主蛋白的相互作用以及免疫逃逸機(jī)制等方面仍存在許多未知問題。此外，RABV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄機(jī)制、病毒與宿主細(xì)胞的相互作用等也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。深入解析這些機(jī)制不僅有助于開發(fā)新型疫苗，還為開發(fā)治療性藥物提供了理論基礎(chǔ)。

從社會(huì)和經(jīng)濟(jì)角度來看，狂犬病的防控對(duì)于保障公共衛(wèi)生安全、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。狂犬病不僅威脅人類健康，還嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)估計(jì)，全球每年因狂犬病導(dǎo)致的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元。因此，開發(fā)新型高效、經(jīng)濟(jì)的狂犬病疫苗具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，狂犬病的防控還有助于提高公眾的健康意識(shí)和自我保護(hù)能力，促進(jìn)社會(huì)和諧穩(wěn)定。

四.國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

狂犬病病毒（RABV）的研究歷史悠久，但在疫苗開發(fā)、免疫機(jī)制及病毒致病機(jī)理等方面仍面臨諸多挑戰(zhàn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在狂犬病領(lǐng)域已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，特別是在疫苗研制和基礎(chǔ)研究方面。然而，現(xiàn)有研究仍存在一些問題和空白，亟待進(jìn)一步探索。

在疫苗研制方面，傳統(tǒng)的滅活疫苗和減毒活疫苗是目前主要的狂犬病疫苗。滅活疫苗安全性高，但需要多次接種，免疫持續(xù)時(shí)間較短。例如，人用狂犬病疫苗（HRV）通常需要接種多次，且免疫保護(hù)期有限。減毒活疫苗免疫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，但存在一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)，如病毒變異或免疫抑制等。例如，貝格爾疫苗（Begleitervaccine）是一種常用的減毒活疫苗，但其免疫原性相對(duì)較低，且存在一定的免疫風(fēng)險(xiǎn)。近年來，隨著基因工程和生物技術(shù)的發(fā)展，新型疫苗平臺(tái)如腺病毒載體疫苗、mRNA疫苗等逐漸應(yīng)用于狂犬病疫苗的研發(fā)。腺病毒載體疫苗利用腺病毒作為載體遞送RABV抗原，能夠高效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，具有免疫原性強(qiáng)、接種程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。例如，以色列疫苗公司Inov-8開發(fā)的腺病毒載體狂犬病疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的免疫效果。mRNA疫苗則通過編碼RABV抗原的mRNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，直接翻譯產(chǎn)生抗原，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。例如，美國(guó)Moderna公司開發(fā)的mRNA狂犬病疫苗在臨床前研究中顯示出良好的免疫原性和安全性。

盡管新型疫苗平臺(tái)在狂犬病疫苗研制方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。首先，腺病毒載體疫苗的免疫原性可能受到宿主既往感染的影響，因?yàn)橄俨《驹谧匀唤缰袕V泛存在，宿主可能已經(jīng)存在針對(duì)腺病毒的抗體，從而影響疫苗的免疫效果。其次，腺病毒載體疫苗的潛在免疫原性過強(qiáng)，可能導(dǎo)致宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，增加疫苗的安全性風(fēng)險(xiǎn)。mRNA疫苗雖然具有高效、安全等優(yōu)點(diǎn)，但在遞送和穩(wěn)定性方面仍面臨挑戰(zhàn)，例如mRNA易被核酸酶降解，需要特殊的遞送載體和保護(hù)策略。

在基礎(chǔ)研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)RABV的基因組、蛋白結(jié)構(gòu)、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄機(jī)制等方面進(jìn)行了深入研究。RABV的基因組為單股負(fù)鏈RNA，長(zhǎng)約11kb，編碼5個(gè)蛋白質(zhì)：N、P、M、G和L。其中，N蛋白為病毒衣殼蛋白，P和M蛋白組成病毒核衣殼，L蛋白為RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）復(fù)合物的組分，G蛋白為病毒表面的糖蛋白，負(fù)責(zé)病毒附著和侵入宿主細(xì)胞。近年來，通過冷凍電鏡等高分辨率技術(shù)解析RABV關(guān)鍵抗原（如G蛋白）的三維結(jié)構(gòu)，為理解其功能和免疫機(jī)制提供了重要依據(jù)。例如，2018年，中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的研究團(tuán)隊(duì)解析了RABVG蛋白的二聚體結(jié)構(gòu)，揭示了其與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合模式。此外，RABV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄機(jī)制也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。RABV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程高度保守，與逆轉(zhuǎn)錄病毒類似，但具體機(jī)制仍存在許多未知問題。例如，RABV的L蛋白如何識(shí)別RNA模板、如何合成正鏈RNA等機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

然而，在RABV免疫逃逸機(jī)制、病毒與宿主細(xì)胞的相互作用等方面仍存在一些研究空白。RABV在感染過程中能夠逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，其機(jī)制尚不明確。例如，RABVG蛋白如何避免被MHC-I途徑降解、如何抑制NK細(xì)胞活性等機(jī)制仍需深入研究。此外，RABV與宿主細(xì)胞的相互作用也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。RABV需要通過宿主細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。然而，RABV如何識(shí)別和利用宿主細(xì)胞膜、如何穿過核孔等機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

在治療方面，目前尚無有效的狂犬病治療方法。雖然有一些治療案例報(bào)道，但成功率極低。因此，開發(fā)新型治療性藥物是當(dāng)前研究的重要方向。例如，一些研究小組正在探索使用單克隆抗體、干擾素等藥物進(jìn)行治療。然而，這些藥物的治療效果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，國(guó)內(nèi)外在狂犬病領(lǐng)域已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，但在疫苗研制、免疫機(jī)制及病毒致病機(jī)理等方面仍面臨諸多挑戰(zhàn)。深入解析RABV的抗原結(jié)構(gòu)、免疫機(jī)制以及病毒逃逸機(jī)制對(duì)于開發(fā)新型疫苗和治療方法具有重要意義。因此，本項(xiàng)目擬基于深度解析RABV抗原蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，結(jié)合新型佐劑技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)全病毒或關(guān)鍵抗原片段的重組腺病毒載體疫苗，并探索其免疫增強(qiáng)機(jī)制，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

五.研究目標(biāo)與內(nèi)容

本項(xiàng)目旨在通過多學(xué)科交叉approach，深入解析狂犬病病毒（RABV）的致病機(jī)制與免疫應(yīng)答，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)新型高效、安全的狂犬病疫苗及闡明其作用機(jī)制，最終為狂犬病的防控提供創(chuàng)新性的策略和理論依據(jù)。研究目標(biāo)與內(nèi)容具體如下：

1.**研究目標(biāo)**

(1)**總體目標(biāo)**：構(gòu)建并評(píng)價(jià)一種基于重組腺病毒載體的新型狂犬病疫苗，闡明其誘導(dǎo)免疫保護(hù)的具體機(jī)制，揭示RABV關(guān)鍵抗原（尤其是G蛋白）的免疫原性及構(gòu)象變化規(guī)律，為開發(fā)廣譜、長(zhǎng)效、安全的狂犬病疫苗提供關(guān)鍵的理論支撐和技術(shù)平臺(tái)。

(2)**具體目標(biāo)**：

a.**結(jié)構(gòu)解析與抗原表位識(shí)別**：解析狂犬病病毒主要衣殼蛋白（N蛋白）和糖蛋白（G蛋白）的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，特別是G蛋白在天然感染或免疫應(yīng)答過程中可能存在的不同構(gòu)象狀態(tài)，并通過生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)方法（如肽段掃描、ELISA、細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)）精確定位關(guān)鍵的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位（包括MHC-I和MHC-II限制性表位）。

b.**新型疫苗構(gòu)建與優(yōu)化**：基于已識(shí)別的關(guān)鍵抗原表位，設(shè)計(jì)并構(gòu)建表達(dá)單一或組合抗原（如N-G雙表達(dá)、多表位融合蛋白）的重組腺病毒載體疫苗。同時(shí)，探索新型佐劑（如TLR激動(dòng)劑、CD40L激動(dòng)劑等）的應(yīng)用，優(yōu)化疫苗配方，以增強(qiáng)抗原遞送效率和免疫應(yīng)答強(qiáng)度，特別是細(xì)胞免疫。

c.**免疫機(jī)制研究**：通過建立完善的動(dòng)物模型（包括小鼠、犬等），系統(tǒng)評(píng)價(jià)新型腺病毒載體疫苗的免疫原性、安全性及保護(hù)力。利用流式細(xì)胞術(shù)、ELISPOT、免疫組化、免疫熒光等技術(shù)，深入分析疫苗誘導(dǎo)的體液免疫（抗體類型、滴度、中和活性）和細(xì)胞免疫（特異性T細(xì)胞亞群分化、細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性）的動(dòng)態(tài)變化，闡明不同免疫組分在提供保護(hù)性免疫中的作用及協(xié)同機(jī)制。

d.**結(jié)構(gòu)與功能關(guān)聯(lián)研究**：將解析的G蛋白等關(guān)鍵抗原的晶體結(jié)構(gòu)或計(jì)算模擬結(jié)構(gòu)，與疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證結(jié)構(gòu)特征（如表位構(gòu)象、柔性區(qū)域）與免疫原性、免疫逃逸能力之間的關(guān)系，為疫苗設(shè)計(jì)和改進(jìn)提供結(jié)構(gòu)生物學(xué)指導(dǎo)。

e.**免疫逃逸機(jī)制探索**：初步探究RABV在自然感染中可能存在的免疫逃逸策略，例如通過G蛋白等表面蛋白的構(gòu)象變化或與其他宿主蛋白的相互作用來躲避免疫監(jiān)視，為設(shè)計(jì)能夠克服逃逸機(jī)制的新型疫苗提供線索。

2.**研究?jī)?nèi)容**

(1)**狂犬病病毒關(guān)鍵抗原的結(jié)構(gòu)與功能研究**：

***研究問題**：狂犬病病毒衣殼蛋白N和糖蛋白G的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及其在病毒感染、免疫逃逸中的作用是什么？這些蛋白的構(gòu)象變化如何影響其免疫原性？

***研究假設(shè)**：RABVN蛋白具有高度保守的構(gòu)象，是有效的T細(xì)胞抗原；G蛋白的N端和C端特定區(qū)域存在關(guān)鍵的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，其構(gòu)象狀態(tài)在感染早期和免疫應(yīng)答過程中發(fā)生改變，影響疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫。

***具體措施**：利用X射線晶體學(xué)或冷凍電鏡技術(shù)解析N蛋白和G蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)；通過分子動(dòng)力學(xué)模擬研究G蛋白在模擬生理環(huán)境下的動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化；利用定點(diǎn)突變和結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段驗(yàn)證關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗原性的影響。

(2)**新型重組腺病毒載體疫苗的構(gòu)建與表征**：

***研究問題**：如何選擇合適的腺病毒載體骨架和優(yōu)化抗原表達(dá)策略，以最大化疫苗的免疫原性和安全性？新型佐劑能否有效增強(qiáng)疫苗效果？

***研究假設(shè)**：通過基因工程手段改造腺病毒骨架，降低其免疫原性和潛在毒性；同時(shí)，將經(jīng)過表位優(yōu)化的N和/或G蛋白基因克隆至腺病毒表達(dá)載體中，聯(lián)合使用新型佐劑能夠顯著提升疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度和持久性。

***具體措施**：篩選并改造復(fù)制缺陷型腺病毒載體（如腺病毒5、chimpanzeeadenovirus71等）；設(shè)計(jì)合成包含關(guān)鍵免疫表位的N-G融合基因或多表位嵌合基因；構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體并進(jìn)行包裝、純化；對(duì)疫苗原液進(jìn)行生物學(xué)活性、純度、滴度及潛在毒性（如溶血試驗(yàn)、細(xì)胞毒性測(cè)試）的全面表征。

(3)**新型狂犬病疫苗的免疫原性、安全性與保護(hù)力評(píng)價(jià)**：

***研究問題**：新型腺病毒載體疫苗在不同動(dòng)物模型中能否誘導(dǎo)強(qiáng)烈的、持續(xù)的體液免疫和細(xì)胞免疫？其保護(hù)力如何？安全性如何？

***研究假設(shè)**：與現(xiàn)有疫苗相比，新型腺病毒載體疫苗能夠誘導(dǎo)更廣譜、更強(qiáng)、更持久的特異性抗體（特別是中和抗體）和T細(xì)胞應(yīng)答；在動(dòng)物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)中能提供更有效的保護(hù)；在規(guī)定劑量下具有良好的安全性，無明顯的免疫原性相關(guān)副作用。

***具體措施**：建立小鼠和犬狂犬病感染模型；將構(gòu)建的疫苗進(jìn)行不同劑量、不同途徑的免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，設(shè)立空白對(duì)照、陰性對(duì)照（如安慰劑或傳統(tǒng)疫苗）；定期采集血清和脾臟等樣本，檢測(cè)總抗體水平、中和抗體滴度、特異性抗體亞型；通過流式細(xì)胞術(shù)分析外周血和淋巴（如脾臟、淋巴結(jié)）中CD4+、CD8+T細(xì)胞的分群、增殖、細(xì)胞因子（如IFN-γ,IL-4,IL-10）分泌情況；進(jìn)行淋巴結(jié)和腦的免疫化學(xué)染色，觀察T細(xì)胞浸潤(rùn)情況；在完成免疫程序后，用強(qiáng)毒株進(jìn)行攻擊，觀察動(dòng)物的存活率、發(fā)病時(shí)間、臨床癥狀，評(píng)估疫苗的保護(hù)效果；密切監(jiān)測(cè)免疫動(dòng)物的體重變化、行為觀察、血液生化指標(biāo)，評(píng)估疫苗的安全性。

(4)**疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的機(jī)制研究**：

***研究問題**：疫苗誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫之間存在怎樣的協(xié)同關(guān)系？關(guān)鍵免疫細(xì)胞亞群（如CD8+T細(xì)胞）在保護(hù)性免疫中扮演什么角色？

***研究假設(shè)**：新型疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫是體液免疫和細(xì)胞免疫協(xié)同作用的結(jié)果，其中高滴度的中和抗體和有效的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答是關(guān)鍵；CD8+T細(xì)胞在清除病毒、抵抗感染中起核心作用。

***具體措施**：利用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)特異性細(xì)胞因子（如IFN-γ）的產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)；通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)（如LDH釋放試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)胞質(zhì)染色）評(píng)估效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)病毒靶細(xì)胞的殺傷能力；分析不同免疫階段淋巴結(jié)和脾臟中免疫細(xì)胞（B細(xì)胞、T細(xì)胞亞群、巨噬細(xì)胞等）的表型變化和功能狀態(tài)；采用相關(guān)基因芯片或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析疫苗刺激后免疫細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)譜變化，深入理解免疫應(yīng)答的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

(5)**狂犬病病毒免疫逃逸機(jī)制的初步探索**：

***研究問題**：RABV在感染過程中是否存在通過抗原變異或分子偽裝等策略逃避免疫監(jiān)視的現(xiàn)象？

***研究假設(shè)**：RABVG蛋白在感染過程中可能發(fā)生構(gòu)象變化或與宿主蛋白相互作用，從而影響其被MHC-I途徑提呈或被NK細(xì)胞識(shí)別，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。

***具體措施**：收集臨床分離的RABV毒株，比較其G蛋白基因序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株的差異；通過免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀察感染細(xì)胞中G蛋白與其他宿主蛋白（如MHC-I分子、TAP、NK細(xì)胞受體等）的共定位情況；利用體外細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，研究G蛋白不同變異體對(duì)免疫應(yīng)答的影響；探索抑制RABV免疫逃逸的策略，為疫苗設(shè)計(jì)提供新思路。

六.研究方法與技術(shù)路線

1.**研究方法與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)**

本項(xiàng)目將采用多學(xué)科交叉的研究方法，整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)及動(dòng)物模型技術(shù)，系統(tǒng)開展狂犬病病毒新型疫苗及免疫機(jī)制的研究。具體方法與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

(1)**結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法**：

***方法**：X射線晶體學(xué)、冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）、分子動(dòng)力學(xué)模擬（MD）。

***實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)**：針對(duì)RABV衣殼蛋白N和糖蛋白G，進(jìn)行基因克隆、表達(dá)純化、晶體篩選與培養(yǎng)；利用高通量晶體篩選技術(shù)獲得高質(zhì)量晶體；使用同步輻射或旋轉(zhuǎn)陽(yáng)極X射線源收集衍射數(shù)據(jù)；解析N蛋白和G蛋白的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)（分辨率目標(biāo)3.0?或更高）；對(duì)G蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行MD模擬，研究其在生理?xiàng)l件下的動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化和多態(tài)性；結(jié)合結(jié)構(gòu)信息，利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)并驗(yàn)證B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。

(2)**重組腺病毒載體構(gòu)建與表達(dá)調(diào)控**：

***方法**：基因克隆、載體構(gòu)建（基于pShuttle等腺病毒穿梭載體系統(tǒng)）、酶切鑒定、PCR驗(yàn)證、質(zhì)粒提取、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增、腺病毒包裝、純化。

***實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)**：根據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)確定的抗原表位信息，設(shè)計(jì)合成編碼表位優(yōu)化或融合的多表位抗原的基因序列；將目的基因亞克隆入腺病毒穿梭載體，經(jīng)酶切和PCR驗(yàn)證后轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞；在輔助病毒系統(tǒng)支持下包裝產(chǎn)生重組腺病毒；通過滴定實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度，并進(jìn)行純化；對(duì)純化后的疫苗進(jìn)行質(zhì)量鑒定（如空殼病毒比例、結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)分析等）。

(3)**免疫學(xué)評(píng)價(jià)方法**：

***方法**：細(xì)胞培養(yǎng)、ELISA（檢測(cè)總抗體、特異性抗體、細(xì)胞因子）、流式細(xì)胞術(shù)（FACS）、ELISPOT、WesternBlot、免疫熒光（IF）、免疫組化（IHC）。

***實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)**：

***抗體檢測(cè)**：免疫動(dòng)物后，收集血清，采用ELISA檢測(cè)總抗體水平（如IgG、IgM、IgA）；利用重組RABV抗原或合成肽段包被ELISA板，檢測(cè)特異性中和抗體滴度；通過ELISA或WesternBlot檢測(cè)特異性抗體亞型（如IgG1/IgG2a比例）。

***細(xì)胞免疫檢測(cè)**：分離免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞，利用FACS檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞的分群（如CD8α、CD27、CD127等標(biāo)志物），分析T細(xì)胞亞群比例變化；通過ELISPOT檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞分泌的特異性細(xì)胞因子（如IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-4,IL-10）；進(jìn)行體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)（如LDH釋放法、細(xì)胞穿孔素/顆粒酶染色）；通過IF和IHC檢測(cè)脾臟、淋巴結(jié)、肝臟等中T細(xì)胞的浸潤(rùn)定位和活化狀態(tài)。

(4)**動(dòng)物模型研究方法**：

***方法**：SPF級(jí)小鼠、犬模型飼養(yǎng)管理、免疫程序設(shè)計(jì)、病毒攻擊、臨床癥狀觀察、樣本采集、病理學(xué)檢查。

***實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)**：

***免疫學(xué)評(píng)價(jià)模型**：選擇C57BL/6小鼠（用于快速評(píng)價(jià)疫苗免疫原性）和Beagle犬（作為更接近人類的largeanimal模型，用于評(píng)估疫苗的保護(hù)力和安全性，并模擬臨床接種程序）。設(shè)計(jì)分組免疫方案（不同劑量疫苗、不同佐劑、對(duì)照組），按預(yù)定程序（如肌肉注射、皮下注射）接種；定期采血、采脾臟等樣本，采用上述免疫學(xué)方法檢測(cè)免疫應(yīng)答。

***保護(hù)力評(píng)價(jià)模型**：在完成免疫程序后，將免疫動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物用高致病性狂犬病病毒株（如ChallengeStrn）進(jìn)行攻擊；密切觀察記錄動(dòng)物的體重變化、行為異常（如流涎、癱瘓、攻擊性增強(qiáng)）、體溫等臨床癥狀；設(shè)定攻擊后觀察期，記錄動(dòng)物存活情況及死亡時(shí)間；存活動(dòng)物在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死，采集腦進(jìn)行病理學(xué)檢查（如染色觀察是否存在神經(jīng)元炎癥、嗜神經(jīng)細(xì)胞包涵體）和病毒學(xué)檢測(cè)（如RT-PCR、印跡）；計(jì)算保護(hù)率。

***安全性評(píng)價(jià)模型**：密切監(jiān)測(cè)免疫期間動(dòng)物的體重、飲食、行為、糞便性狀；定期檢測(cè)血液生化指標(biāo)（肝功能、腎功能、血常規(guī)等）；必要時(shí)進(jìn)行尸檢，觀察主要臟器病理變化。

(5)**數(shù)據(jù)分析方法**：

***方法**：統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（如GraphPadPrism,SPSS）、生物信息學(xué)工具、結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析軟件。

***實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)**：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將采用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行檢驗(yàn)（如t檢驗(yàn)、ANOVA等），以評(píng)估差異的顯著性?？贵w滴度、細(xì)胞頻率等數(shù)據(jù)將進(jìn)行非參數(shù)轉(zhuǎn)換或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換以滿足統(tǒng)計(jì)要求。結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)將使用Phylosophic等軟件進(jìn)行分析。免疫細(xì)胞表型、細(xì)胞因子分泌等數(shù)據(jù)將采用多因素分析或相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將以表形式清晰展示。

2.**技術(shù)路線**

本項(xiàng)目的技術(shù)路線遵循“基礎(chǔ)研究-應(yīng)用開發(fā)-機(jī)制驗(yàn)證”的邏輯順序，分為以下幾個(gè)關(guān)鍵階段，各階段環(huán)環(huán)相扣，相互支撐：

(1)**階段一：關(guān)鍵抗原結(jié)構(gòu)與功能解析(約6個(gè)月)**

***步驟1.1**：獲取并純化RABVN蛋白和G蛋白。

***步驟1.2**：利用X射線晶體學(xué)或Cryo-EM解析N蛋白和G蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)。

***步驟1.3**：通過分子動(dòng)力學(xué)模擬研究G蛋白的動(dòng)態(tài)構(gòu)象。

***步驟1.4**：結(jié)合生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)方法（如肽段掃描、ELISA、細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)）確定N蛋白和G蛋白的關(guān)鍵B細(xì)胞和T細(xì)胞表位。

(2)**階段二：新型疫苗構(gòu)建與優(yōu)化(約9個(gè)月)**

***步驟2.1**：根據(jù)表位信息，設(shè)計(jì)合成編碼表位優(yōu)化抗原或多表位融合蛋白的基因序列。

***步驟2.2**：將基因序列克隆入腺病毒穿梭載體，并進(jìn)行驗(yàn)證。

***步驟2.3**：在腺病毒包裝系統(tǒng)中包裝產(chǎn)生重組腺病毒疫苗原液。

***步驟2.4**：對(duì)疫苗原液進(jìn)行純化和質(zhì)量鑒定。

***步驟2.5**：探索并篩選新型佐劑，優(yōu)化疫苗配方（如與佐劑混合）。

(3)**階段三：疫苗免疫原性、安全性與保護(hù)力初步評(píng)價(jià)(約12個(gè)月)**

***步驟3.1**：在C57BL/6小鼠模型中，通過皮下或肌肉注射等方式進(jìn)行初步免疫評(píng)價(jià)，檢測(cè)體液免疫（抗體）和細(xì)胞免疫（脾細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌）應(yīng)答。

***步驟3.2**：在Beagle犬模型中，按照接近臨床應(yīng)用的程序進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)，包括免疫原性（血清學(xué)、細(xì)胞學(xué)）、初步安全性（短期觀察、血液學(xué)指標(biāo)）。

***步驟3.3**：選擇免疫效果較好的疫苗候選株，在C57BL/6小鼠或犬模型中進(jìn)行保護(hù)力評(píng)價(jià)，確定最佳免疫程序和劑量。

(4)**階段四：免疫機(jī)制深入研究(約9個(gè)月)**

***步驟4.1**：在完成免疫程序的小鼠或犬模型中，深入分析疫苗誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞亞群分化、遷移、功能激活情況。

***步驟4.2**：通過免疫化學(xué)等方法，觀察免疫細(xì)胞在淋巴結(jié)、脾臟、肝臟等關(guān)鍵免疫器官的浸潤(rùn)定位。

***步驟4.3**：結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)果，分析免疫應(yīng)答與抗原結(jié)構(gòu)、表位暴露之間的關(guān)系。

(5)**階段五：總結(jié)與深化(約6個(gè)月)**

***步驟5.1**：整理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和結(jié)果解釋。

***步驟5.2**：撰寫研究論文，提交項(xiàng)目結(jié)題報(bào)告。

***步驟5.3**：根據(jù)研究初步結(jié)果，探討進(jìn)一步優(yōu)化的方向，如針對(duì)免疫逃逸機(jī)制的干預(yù)策略等。

整個(gè)技術(shù)路線強(qiáng)調(diào)結(jié)構(gòu)功能結(jié)合、體外體內(nèi)印證、宏觀微觀并重，旨在系統(tǒng)、深入地解決狂犬病疫苗研發(fā)中的關(guān)鍵科學(xué)問題，并為最終開發(fā)出高效安全的狂犬病疫苗奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

七．創(chuàng)新點(diǎn)

本項(xiàng)目在狂犬病病毒研究及疫苗開發(fā)領(lǐng)域擬開展一系列工作，具有以下顯著的創(chuàng)新性：

(1)**在結(jié)構(gòu)生物學(xué)層面，深度融合高分辨率結(jié)構(gòu)與免疫表位分析**：

***創(chuàng)新性**：本項(xiàng)目不僅致力于解析狂犬病病毒衣殼蛋白N和糖蛋白G的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，更關(guān)鍵的是，將結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息與免疫表位鑒定緊密結(jié)合。通過冷凍電鏡等先進(jìn)技術(shù)獲取精確的結(jié)構(gòu)，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)抗原分子的動(dòng)態(tài)變化，并利用這些結(jié)構(gòu)信息指導(dǎo)關(guān)鍵B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位（包括MHC-I和MHC-II限制性表位）的精確定位和驗(yàn)證。這超越了以往僅依賴序列分析或粗略結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)來尋找表位的方法，能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別在天然感染或免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用的免疫決定簇，特別是那些可能處于易接觸構(gòu)象或發(fā)生變性的表位，為后續(xù)疫苗設(shè)計(jì)提供更精準(zhǔn)的靶點(diǎn)。

***意義**：這種結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的方法有望發(fā)現(xiàn)新的、更有效的免疫原表位，優(yōu)化疫苗抗原設(shè)計(jì)，提高疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的特異性和廣度，為開發(fā)廣譜保護(hù)性疫苗奠定堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

(2)**在疫苗構(gòu)建層面，采用腺病毒載體并整合新型佐劑策略**：

***創(chuàng)新性**：雖然腺病毒載體疫苗已有應(yīng)用，但本項(xiàng)目在載體選擇、抗原表達(dá)優(yōu)化和佐劑應(yīng)用上尋求創(chuàng)新。首先，將針對(duì)現(xiàn)有腺病毒載體的局限性（如免疫原性、潛在免疫干擾），考慮使用新型腺病毒載體（如人源化腺病毒、或來自低免疫背景的腺病毒如ChAd71）或?qū)ΜF(xiàn)有腺病毒進(jìn)行基因工程改造（如降低E1區(qū)表達(dá)、優(yōu)化衣殼蛋白），以增強(qiáng)疫苗的安全性、免疫原性和遞送效率。其次，在抗原表達(dá)上，將不僅限于表達(dá)單一蛋白，更會(huì)探索表達(dá)抗原多表位融合體或經(jīng)過構(gòu)象優(yōu)化的抗原形式，以同時(shí)激活B細(xì)胞和T細(xì)胞，構(gòu)建更強(qiáng)大的免疫記憶。最重要的是，本項(xiàng)目將系統(tǒng)性地引入并評(píng)估新型佐劑（如TLR激動(dòng)劑、CD40L激動(dòng)劑、新型TLI等）與腺病毒載體疫苗的聯(lián)合應(yīng)用，旨在通過協(xié)同激活先天免疫和適應(yīng)性免疫通路，顯著提升疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答強(qiáng)度和持久性。這種載體-抗原-佐劑系統(tǒng)的優(yōu)化組合是本項(xiàng)目的重要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)。

***意義**：有望開發(fā)出免疫原性更強(qiáng)、接種程序更簡(jiǎn)便（可能減少接種次數(shù)）、保護(hù)效果更持久的狂犬病疫苗，提升疫苗的可及性和使用意愿，尤其對(duì)于資源有限的地區(qū)。

(3)**在免疫機(jī)制研究層面，系統(tǒng)解析新型疫苗誘導(dǎo)的復(fù)雜免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)**：

***創(chuàng)新性**：本項(xiàng)目不僅關(guān)注疫苗誘導(dǎo)的抗體水平和細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性，更強(qiáng)調(diào)對(duì)整個(gè)免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)解析。將利用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)、ELISPOT、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（如適用）等多種高維技術(shù)手段，深入探究疫苗誘導(dǎo)的體液免疫與細(xì)胞免疫之間的動(dòng)態(tài)協(xié)同關(guān)系，特別是CD4+輔助T細(xì)胞（Th1,Th2,Tfh等亞群）在B細(xì)胞活化、抗體類別轉(zhuǎn)換、以及CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化和功能維持中的作用。此外，還將結(jié)合前期結(jié)構(gòu)生物學(xué)獲得的抗原信息，嘗試解析不同免疫細(xì)胞亞群識(shí)別特定抗原表位的機(jī)制，以及疫苗誘導(dǎo)的免疫記憶形成的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)。

***意義**：全面深入的理解疫苗誘導(dǎo)的免疫機(jī)制，不僅有助于解釋疫苗為何有效，更能為未來根據(jù)特定需求（如增強(qiáng)黏膜免疫、誘導(dǎo)特定細(xì)胞應(yīng)答）對(duì)疫苗進(jìn)行個(gè)性化設(shè)計(jì)和改進(jìn)提供理論指導(dǎo)。

(4)**在研究模型與應(yīng)用結(jié)合方面，兼顧小鼠快速評(píng)價(jià)與大動(dòng)物（犬）模擬**：

***創(chuàng)新性**：本項(xiàng)目同時(shí)采用小鼠和犬作為評(píng)價(jià)模型。小鼠模型能夠快速、經(jīng)濟(jì)地篩選疫苗候選株、評(píng)估免疫原性和初步安全性，加速研發(fā)進(jìn)程。而犬作為大型哺乳動(dòng)物，其生理和免疫反應(yīng)與人類更為接近，使用狂犬病病毒進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋鎸?shí)地模擬自然感染和疫苗的保護(hù)效果，為疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)前提供關(guān)鍵的安全性（尤其是免疫原性相關(guān)副作用）和有效性數(shù)據(jù)支持。在狂犬病疫苗研發(fā)領(lǐng)域，充分利用不同層次模型的優(yōu)勢(shì)，形成互補(bǔ)，是一種高效的研究策略。

***意義**：提高了研究效率和結(jié)果的可靠性，縮短了從基礎(chǔ)研究到潛在應(yīng)用的時(shí)間，為開發(fā)出真正適用于人類且安全有效的狂犬病疫苗提供了有力支撐。

綜上所述，本項(xiàng)目在結(jié)構(gòu)解析精度、疫苗設(shè)計(jì)理念、免疫機(jī)制研究深度以及模型應(yīng)用策略上均體現(xiàn)了創(chuàng)新性，有望在狂犬病基礎(chǔ)研究和疫苗開發(fā)方面取得突破性進(jìn)展，具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

八．預(yù)期成果

本項(xiàng)目通過系統(tǒng)深入的研究，預(yù)期在理論層面和實(shí)踐應(yīng)用層面均取得一系列重要成果：

(1)**理論成果**：

***預(yù)期獲得RABV關(guān)鍵抗原的高分辨率結(jié)構(gòu)信息**：成功解析狂犬病病毒衣殼蛋白N和糖蛋白G的高分辨率三維結(jié)構(gòu)（預(yù)期分辨率達(dá)到3.0?或更高），并可能揭示G蛋白在不同生理狀態(tài)下的構(gòu)象變化。這些結(jié)構(gòu)信息將首次在原子水平上揭示RABV主要抗原分子的空間結(jié)構(gòu)特征、抗原表位的精確位置和空間排布，為理解病毒與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用機(jī)制提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

***闡明RABV免疫逃逸的分子機(jī)制**：通過結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、免疫學(xué)和病毒學(xué)方法，初步探索RABV在感染過程中可能存在的免疫逃逸策略，例如G蛋白表面關(guān)鍵抗原表位的構(gòu)象變化如何影響其被MHC-I途徑提呈或被NK細(xì)胞識(shí)別。預(yù)期揭示病毒逃避宿主免疫監(jiān)視的關(guān)鍵分子事件，為開發(fā)能夠克服免疫逃逸的新型疫苗提供重要理論依據(jù)。

***深化對(duì)狂犬病免疫應(yīng)答機(jī)制的認(rèn)識(shí)**：系統(tǒng)闡明新型腺病毒載體疫苗誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，特別是CD4+T細(xì)胞在B細(xì)胞活化、抗體類別轉(zhuǎn)換和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答中的調(diào)控作用。預(yù)期闡明疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫所依賴的核心免疫細(xì)胞亞群和功能網(wǎng)絡(luò)，以及不同免疫應(yīng)答組分之間的協(xié)同機(jī)制，為優(yōu)化疫苗設(shè)計(jì)提供理論指導(dǎo)。

***建立結(jié)構(gòu)-功能-免疫表位關(guān)聯(lián)**：預(yù)期將解析的抗原結(jié)構(gòu)信息與實(shí)驗(yàn)確定的免疫表位數(shù)據(jù)相結(jié)合，建立關(guān)鍵抗原表位的空間構(gòu)象與其免疫原性、免疫逃逸能力之間的關(guān)聯(lián)，為疫苗抗原的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供結(jié)構(gòu)生物學(xué)指導(dǎo)原則。

(2)**實(shí)踐應(yīng)用成果**：

***開發(fā)新型高效狂犬病疫苗原型**：基于結(jié)構(gòu)解析結(jié)果和免疫機(jī)制研究，成功構(gòu)建并優(yōu)化表達(dá)關(guān)鍵抗原（單一或組合）的重組腺病毒載體疫苗，并輔以新型佐劑。預(yù)期獲得的疫苗原型在動(dòng)物模型中展現(xiàn)出比現(xiàn)有疫苗更強(qiáng)的免疫原性、更廣的免疫譜和更長(zhǎng)的免疫保護(hù)期。

***獲得疫苗安全性數(shù)據(jù)**：通過在犬模型中的安全性評(píng)價(jià)，預(yù)期獲得關(guān)于新型疫苗安全性（包括急性毒性、免疫原性相關(guān)副作用等）的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，為后續(xù)的臨床試驗(yàn)研究和疫苗注冊(cè)提供重要依據(jù)。

***形成疫苗研發(fā)的技術(shù)儲(chǔ)備**：項(xiàng)目執(zhí)行過程中，將建立一套完整的從抗原設(shè)計(jì)、載體構(gòu)建、佐劑篩選到動(dòng)物評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)化研發(fā)流程和技術(shù)平臺(tái)。掌握新型腺病毒載體疫苗開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)，為后續(xù)針對(duì)其他傳染病開發(fā)類似疫苗奠定基礎(chǔ)。

***推動(dòng)狂犬病防控策略的改進(jìn)**：項(xiàng)目成果有望為開發(fā)出更安全、更有效、更易推廣的狂犬病疫苗提供支撐，從而提升全球特別是發(fā)展中國(guó)家的狂犬病防控水平，減少狂犬病相關(guān)死亡和發(fā)病，保障公眾健康安全。同時(shí)，對(duì)免疫逃逸機(jī)制的研究也可能為開發(fā)新的治療性干預(yù)措施提供線索。

綜上所述，本項(xiàng)目預(yù)期在狂犬病病毒結(jié)構(gòu)與免疫機(jī)制研究方面取得重要理論突破，并成功開發(fā)出具有臨床應(yīng)用前景的新型疫苗原型，為全球狂犬病防治事業(yè)貢獻(xiàn)關(guān)鍵性的科學(xué)成果和技術(shù)支撐。

九.項(xiàng)目實(shí)施計(jì)劃

本項(xiàng)目實(shí)施周期預(yù)計(jì)為5年，將按照研究目標(biāo)和內(nèi)容，分階段、有步驟地推進(jìn)各項(xiàng)研究任務(wù)。項(xiàng)目時(shí)間規(guī)劃和風(fēng)險(xiǎn)管理策略如下：

(1)**項(xiàng)目時(shí)間規(guī)劃**

**第一階段：關(guān)鍵抗原結(jié)構(gòu)與功能解析(第1-12個(gè)月)**

***任務(wù)分配**：

*第1-3個(gè)月：文獻(xiàn)調(diào)研，優(yōu)化N蛋白和G蛋白的表達(dá)純化方案。

*第4-6個(gè)月：開展N蛋白晶體篩選與培養(yǎng)，開始G蛋白結(jié)構(gòu)解析準(zhǔn)備工作。

*第7-9個(gè)月：解析N蛋白晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)分析。

*第10-12個(gè)月：解析G蛋白晶體結(jié)構(gòu)，利用MD模擬研究其動(dòng)態(tài)構(gòu)象，結(jié)合生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)方法（肽段掃描、ELISA、細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)）初步鑒定N蛋白和G蛋白的免疫表位。

***進(jìn)度安排**：此階段重點(diǎn)在于獲得關(guān)鍵抗原的結(jié)構(gòu)信息并初步定位免疫表位。預(yù)期在第12個(gè)月末完成主要結(jié)構(gòu)解析和初步表位鑒定，為后續(xù)疫苗設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)。

**第二階段：新型疫苗構(gòu)建與優(yōu)化(第13-24個(gè)月)**

***任務(wù)分配**：

*第13-15個(gè)月：根據(jù)表位信息，設(shè)計(jì)合成編碼表位優(yōu)化抗原或多表位融合蛋白的基因序列，完成載體構(gòu)建與初步驗(yàn)證。

*第16-18個(gè)月：在腺病毒包裝系統(tǒng)中進(jìn)行重組腺病毒疫苗的包裝、純化，并進(jìn)行初步質(zhì)量鑒定。

*第19-21個(gè)月：篩選和評(píng)估新型佐劑，優(yōu)化疫苗配方（如佐劑聯(lián)合、接種途徑優(yōu)化）。

*第22-24個(gè)月：完成疫苗原液的大規(guī)模制備和質(zhì)控，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

***進(jìn)度安排**：此階段核心任務(wù)是疫苗的構(gòu)建和初步優(yōu)化。預(yù)期在第24個(gè)月末完成疫苗原液的制備和質(zhì)控，進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。

**第三階段：疫苗免疫原性、安全性與保護(hù)力初步評(píng)價(jià)(第25-42個(gè)月)**

***任務(wù)分配**：

*第25-30個(gè)月：在C57BL/6小鼠模型中開展初步免疫評(píng)價(jià)（免疫原性、初步安全性），檢測(cè)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

*第31-36個(gè)月：在Beagle犬模型中開展免疫評(píng)價(jià)（免疫原性、初步安全性），確定最佳免疫程序和劑量。

*第37-42個(gè)月：選擇候選疫苗株，在C57BL/6小鼠或犬模型中進(jìn)行保護(hù)力評(píng)價(jià)，確定最佳方案。

***進(jìn)度安排**：此階段是項(xiàng)目應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵體現(xiàn)。預(yù)期在第42個(gè)月末完成初步的免疫、安全性和保護(hù)力評(píng)價(jià)，篩選出有前景的疫苗候選株。

**第四階段：免疫機(jī)制深入研究(第43-54個(gè)月)**

***任務(wù)分配**：

*第43-48個(gè)月：在完成免疫程序的小鼠或犬模型中，深入分析疫苗誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞亞群分化、遷移、功能激活情況。

*第49-51個(gè)月：通過免疫化學(xué)等方法，觀察免疫細(xì)胞在淋巴結(jié)、脾臟、肝臟等關(guān)鍵免疫器官的浸潤(rùn)定位。

*第52-54個(gè)月：結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)果，分析免疫應(yīng)答與抗原結(jié)構(gòu)、表位暴露之間的關(guān)系，系統(tǒng)總結(jié)免疫機(jī)制。

***進(jìn)度安排**：此階段旨在深化對(duì)疫苗作用機(jī)制的理解。預(yù)期在第54個(gè)月末完成免疫機(jī)制的深入研究，為疫苗優(yōu)化和未來應(yīng)用提供理論支持。

**第五階段：總結(jié)與深化(第55-60個(gè)月)**

***任務(wù)分配**：

*第55-57個(gè)月：整理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和結(jié)果解釋，撰寫研究論文。

*第58-59個(gè)月：提交項(xiàng)目結(jié)題報(bào)告，準(zhǔn)備成果匯報(bào)。

*第60個(gè)月：根據(jù)研究初步結(jié)果，探討進(jìn)一步優(yōu)化的方向，形成未來研究建議。

***進(jìn)度安排**：此階段為項(xiàng)目收尾和成果轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備階段。預(yù)期在第60個(gè)月末完成項(xiàng)目所有研究任務(wù)，提交結(jié)題報(bào)告，并形成未來研究展望。

(2)**風(fēng)險(xiǎn)管理策略**

本項(xiàng)目在實(shí)施過程中可能面臨以下風(fēng)險(xiǎn)，將采取相應(yīng)的管理策略：

***結(jié)構(gòu)解析風(fēng)險(xiǎn)**：

***風(fēng)險(xiǎn)描述**：目標(biāo)蛋白難以表達(dá)純化、晶體質(zhì)量不佳導(dǎo)致結(jié)構(gòu)解析失敗。

***應(yīng)對(duì)策略**：提前進(jìn)行大量的表達(dá)條件優(yōu)化和純化條件摸索；采用高通量晶體篩選技術(shù)提高獲得高質(zhì)量晶體的概率；若初期解析失敗，及時(shí)調(diào)整方案，嘗試不同的表達(dá)系統(tǒng)（如昆蟲細(xì)胞、酵母）或結(jié)構(gòu)生物技術(shù)（如Cryo-EM）。

***疫苗構(gòu)建與表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)**：

***風(fēng)險(xiǎn)描述**：基因克隆失敗、腺病毒包裝效率低、疫苗免疫原性不足。

***應(yīng)對(duì)策略**：嚴(yán)格把控基因合成質(zhì)量和載體構(gòu)建環(huán)節(jié)，建立標(biāo)準(zhǔn)化的包裝流程；通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)指導(dǎo)抗原設(shè)計(jì)，優(yōu)化抗原序列；同時(shí)備選多種抗原設(shè)計(jì)和佐劑組合，進(jìn)行并行研究。

***動(dòng)物實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)**：

***風(fēng)險(xiǎn)描述**：動(dòng)物模型反應(yīng)個(gè)體差異大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定；疫苗在動(dòng)物模型中未顯示預(yù)期的免疫原性或保護(hù)力；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批延誤。

***應(yīng)對(duì)策略**：選擇經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作人員；設(shè)置足夠數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和對(duì)照組，增加樣本量以減少隨機(jī)誤差；在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段進(jìn)行充分的預(yù)實(shí)驗(yàn)，預(yù)估可能的免疫效果；提前完成倫理委員會(huì)的申請(qǐng)流程，確保實(shí)驗(yàn)合規(guī)性。

***經(jīng)費(fèi)與資源風(fēng)險(xiǎn)**：

***風(fēng)險(xiǎn)描述**：項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)撥付延遲或不足；關(guān)鍵儀器設(shè)備故障或共享平臺(tái)使用沖突。

***應(yīng)對(duì)策略**：制定詳細(xì)的經(jīng)費(fèi)預(yù)算，并積極與資助方溝通，爭(zhēng)取穩(wěn)定的經(jīng)費(fèi)支持；建立儀器設(shè)備定期維護(hù)制度，并探索共享平臺(tái)的高效預(yù)約機(jī)制；在項(xiàng)目申請(qǐng)階段就充分評(píng)估資源需求，確保關(guān)鍵資源到位。

***知識(shí)產(chǎn)權(quán)風(fēng)險(xiǎn)**：

***風(fēng)險(xiǎn)描述**：研究成果可能存在潛在的知識(shí)產(chǎn)權(quán)糾紛，特別是在結(jié)構(gòu)新穎性或疫苗組合物方面。

***應(yīng)對(duì)策略**：在項(xiàng)目初期就進(jìn)行知識(shí)產(chǎn)權(quán)檢索，評(píng)估研究成果的獨(dú)創(chuàng)性和保護(hù)價(jià)值；建立嚴(yán)格的成果保密制度，及時(shí)申請(qǐng)專利保護(hù)；明確項(xiàng)目組成員的知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬，避免后續(xù)糾紛。

通過上述風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和應(yīng)對(duì)策略的制定，將努力保障項(xiàng)目的順利實(shí)施，提高研究成功的可能性，確保項(xiàng)目目標(biāo)的達(dá)成。

十.項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)

本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)由來自國(guó)家傳染病醫(yī)學(xué)中心病毒研究所、國(guó)內(nèi)頂尖高校及研究機(jī)構(gòu)的資深研究人員組成，團(tuán)隊(duì)成員在病毒學(xué)、免疫學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)和動(dòng)物模型等領(lǐng)域具有豐富的科研經(jīng)驗(yàn)和深厚的專業(yè)積累，能夠覆蓋本項(xiàng)目所需的各項(xiàng)研究?jī)?nèi)容，確保項(xiàng)目研究的科學(xué)性、系統(tǒng)性和高效性。

(1)**團(tuán)隊(duì)成員專業(yè)背景與研究經(jīng)驗(yàn)**：

***項(xiàng)目負(fù)責(zé)人（張華）**：病毒學(xué)研究員，博士，主要研究方向?yàn)榭袢〔《镜闹虏C(jī)制與疫苗研發(fā)。在國(guó)內(nèi)外知名期刊發(fā)表高水平論文20余篇，主持國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目3項(xiàng)，擅長(zhǎng)病毒結(jié)構(gòu)解析、抗原設(shè)計(jì)、疫苗開發(fā)及免疫機(jī)制研究。具有10年狂犬病相關(guān)研究經(jīng)驗(yàn)，熟悉RABV全基因組結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)疫苗免疫策略有深入理解。

***結(jié)構(gòu)生物學(xué)課題組負(fù)責(zé)人（李強(qiáng)）**：結(jié)構(gòu)生物學(xué)家，教授，博士，專注于病毒結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。在Nature、Science等頂級(jí)期刊發(fā)表論文15篇，擅長(zhǎng)X射線晶體學(xué)和Cryo-EM技術(shù)，曾解析多種病毒及蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。在RABV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)解析方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)，為項(xiàng)目提供關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

***免疫學(xué)研究組組長(zhǎng)（王芳）**：免疫學(xué)家，副教授，博士，主要研究方向?yàn)橐呙缑庖邫C(jī)制與免疫調(diào)控。在Immunity、NatureImmunology等權(quán)威期刊發(fā)表論文10余篇，精通細(xì)胞免疫與體液免疫研究技術(shù)，在疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制方面有突出貢獻(xiàn)。負(fù)責(zé)項(xiàng)目免疫學(xué)評(píng)價(jià)體系的建立和實(shí)施，包括動(dòng)物模型免疫學(xué)檢測(cè)、免疫細(xì)胞分選與分析、免疫機(jī)制研究等。

***分子生物學(xué)與病毒學(xué)組負(fù)責(zé)人（劉偉）**：分子病毒學(xué)家，研究員，博士，長(zhǎng)期從事狂犬病病毒基因工程疫苗的研發(fā)。在PLOSPathogens、Vaccine等期刊發(fā)表論文18篇，擅長(zhǎng)腺病毒載體構(gòu)建、基因編輯技術(shù)、病毒表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化。成功構(gòu)建了多種重組腺病毒載體疫苗原型，為項(xiàng)目疫苗平臺(tái)的搭建提供了核心技術(shù)支撐。

***動(dòng)物模型研究組負(fù)責(zé)人（趙明）**：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)家，教授，博士，專注于傳染病動(dòng)物模型構(gòu)建與評(píng)價(jià)。在VeterinaryResearch、JournalofVirology等期刊發(fā)表論文12篇，在多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型（小鼠、犬）的病原感染與免疫學(xué)研究方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)，擅長(zhǎng)動(dòng)物模型行為學(xué)觀察、病理學(xué)檢測(cè)及生物樣本分析。負(fù)責(zé)項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案的制定和實(shí)施，包括免疫程序設(shè)計(jì)、保護(hù)力評(píng)價(jià)模型建立、免疫病理學(xué)分析等。

***生物信息學(xué)與數(shù)據(jù)分析師（孫磊）**：生物信息學(xué)專家，研究員，博士，擅長(zhǎng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、分子動(dòng)力學(xué)模擬、免疫數(shù)據(jù)整合分析。在Bioinformatics、PLOSComputationalBiology等期刊發(fā)表論文9篇，熟練掌握各類生物信息學(xué)分析工具和統(tǒng)計(jì)方法。負(fù)責(zé)項(xiàng)目結(jié)構(gòu)生物學(xué)數(shù)據(jù)的解析、抗原表位預(yù)測(cè)、免疫應(yīng)答數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析和機(jī)制解讀。

(2)**團(tuán)隊(duì)成員角色分配與合作模式**：

**項(xiàng)目負(fù)責(zé)人（張華）**：全面負(fù)責(zé)項(xiàng)目總體規(guī)劃、資源協(xié)調(diào)、經(jīng)費(fèi)管理及對(duì)外合作，主持項(xiàng)目關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)，統(tǒng)籌各研究組工作，確保項(xiàng)目按計(jì)劃推進(jìn)，并負(fù)責(zé)項(xiàng)目成果的整理、撰寫及申報(bào)。

**結(jié)構(gòu)生物學(xué)課題組（李強(qiáng)）**：負(fù)責(zé)RABVN蛋白和G蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)解析，通過結(jié)構(gòu)信息指導(dǎo)抗原表位設(shè)計(jì)，為疫苗開發(fā)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并參與免疫機(jī)制研究中的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)聯(lián)分析。

**免疫學(xué)研究組（王芳）**：負(fù)責(zé)建立完善的免疫學(xué)評(píng)價(jià)體系，包括體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性T細(xì)胞檢測(cè)、細(xì)胞因子分析）和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（如抗體檢測(cè)、細(xì)胞浸潤(rùn)分析），系統(tǒng)評(píng)價(jià)疫苗誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，深入解析疫苗作用機(jī)制，為疫苗優(yōu)化提供理論依據(jù)。

**分子生物學(xué)與病毒學(xué)組（劉偉）**：負(fù)責(zé)新型腺病毒載體疫苗的構(gòu)建、表達(dá)優(yōu)化及佐劑篩選，建立標(biāo)準(zhǔn)化疫苗制備流程，確保疫苗原型的高效