外泌體分離技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作指南外泌體作為細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，承載蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物分子，在細(xì)胞通訊、疾病診斷與治療中展現(xiàn)出巨大潛力。高效、純凈的外泌體分離是后續(xù)功能研究、標(biāo)志物篩選的核心前提。不同分離技術(shù)基于外泌體的理化特性（如粒徑、密度、表面標(biāo)志物）設(shè)計(jì)，需結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、樣本類型與通量需求靈活選擇。本文系統(tǒng)梳理主流分離技術(shù)的操作細(xì)節(jié)、質(zhì)控要點(diǎn)與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，助力研究者優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程。一、實(shí)驗(yàn)原理概述外泌體直徑約____nm，密度介于1.13-1.19g/mL（蔗糖密度梯度中對(duì)應(yīng)10%-40%蔗糖層），表面富集CD9、CD63、TSG101等標(biāo)志物。主流分離技術(shù)的原理如下：超速離心法：利用外泌體與其他顆粒的沉降系數(shù)差異，通過逐級(jí)提高離心力去除細(xì)胞碎片、凋亡小體等雜質(zhì)，最終富集外泌體。密度梯度離心法：基于外泌體與污染物的密度差異，在連續(xù)/不連續(xù)密度梯度中，外泌體會(huì)在特定密度層富集，有效去除蛋白聚集體、雜囊泡。試劑盒法（聚合物沉淀/免疫親和）：聚合物（如PEG）通過空間位阻效應(yīng)促進(jìn)外泌體聚集沉淀；免疫親和法則利用抗體-抗原特異性結(jié)合，從復(fù)雜樣本中捕獲靶向外泌體。微流控法：通過微通道內(nèi)的流體動(dòng)力、電場(chǎng)或親和作用，基于粒徑、電荷或表面標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)外泌體的高通量、快速分離。二、材料準(zhǔn)備（一）超速離心法儀器：冷凍超速離心機(jī)（如BeckmanOptima系列，配備SW41Ti或Type70Ti轉(zhuǎn)子）、臺(tái)式高速離心機(jī)、電子天平、超凈工作臺(tái)、渦旋振蕩器、移液器。試劑：無外泌體胎牛血清（用于細(xì)胞培養(yǎng)上清制備）、PBS（pH7.4，無鈣鎂）、0.22μm濾膜、超速離心管（如Beckman____，需提前硅化以減少外泌體吸附）。（二）密度梯度離心法試劑：蔗糖（分析純，需用無外泌體水配置）、Tris-HCl（pH7.4）、EDTA、蛋白酶抑制劑（如PMSF）、0.22μm濾膜。（三）試劑盒法（以聚合物沉淀為例）儀器：臺(tái)式高速離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器。試劑：外泌體沉淀試劑盒（如InvitrogenTotalExosomeIsolationReagent）、PBS、蛋白酶抑制劑。（四）微流控法儀器：微流控泵系統(tǒng)（如ElveflowOB1MK3+）、熒光顯微鏡（可選，用于可視化）、微量紫外分光光度計(jì)（如NanoDrop）。試劑：微流控芯片（如ExoQuick微流控芯片，或定制化芯片）、PBS、熒光染料（如PKH67，可選）、洗脫緩沖液（按芯片說明書）。三、操作步驟詳解（一）超速離心法操作流程1.樣本預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)上清：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基（或含無外泌體血清的培養(yǎng)基），4℃下300g離心10min（去除細(xì)胞），取上清；2000g離心10min（去除細(xì)胞碎片），取上清；____g離心30min（去除大囊泡、蛋白聚集體），取上清過0.22μm濾膜，收集濾液。血清/血漿：室溫靜置30min后，4℃下3000g離心15min（去除血細(xì)胞），取上清過0.22μm濾膜（若樣本粘稠，可先____g離心10min）。*注：預(yù)處理的離心條件需根據(jù)樣本類型優(yōu)化，過度離心可能導(dǎo)致外泌體損失。*2.超速離心分離將預(yù)處理后的樣本轉(zhuǎn)移至硅化的超速離心管，4℃下____g離心70min（轉(zhuǎn)子需預(yù)冷至4℃）。離心結(jié)束后，棄上清，管底可見少量白色沉淀（外泌體）。若需去除蛋白污染，可加入1mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，再次4℃下____g離心70min，棄上清。3.外泌體重懸與保存加入適量PBS（或?qū)嶒?yàn)所需緩沖液），用寬口槍頭輕柔吹打沉淀（避免產(chǎn)生氣泡），渦旋振蕩1-2min使外泌體充分分散。分離的外泌體可立即用于實(shí)驗(yàn)，或分裝后-80℃保存（避免反復(fù)凍融）。（二）密度梯度離心法操作流程1.密度梯度制備配置不同濃度的蔗糖溶液（如10%、20%、30%、40%，w/v，溶于Tris-EDTA緩沖液），使用梯度生成器制備連續(xù)密度梯度（從10%到40%），緩慢注入超速離心管（避免分層）。室溫靜置30min使梯度穩(wěn)定，或4℃過夜。2.樣本加載與離心將預(yù)處理后的樣本（約1mL）緩慢鋪在梯度液上方（避免擾動(dòng)梯度），4℃下____g離心16h（或根據(jù)樣本調(diào)整時(shí)間，如12h）。3.外泌體收集與純化離心結(jié)束后，用1mL注射器從管底向上穿刺，每0.5mL收集一個(gè)組分（共8-10管）。通過NTA或Westernblot檢測(cè)各組分的外泌體標(biāo)志物，確定目標(biāo)層（通常在30%-40%蔗糖層附近）。收集目標(biāo)組分，用PBS稀釋后，4℃下____g離心70min，棄上清，重懸沉淀（同超速離心法）。（三）試劑盒法操作流程1.樣本預(yù)處理同超速離心法的樣本預(yù)處理步驟，確保樣本無細(xì)胞碎片和大顆粒。2.沉淀反應(yīng)與離心按試劑盒說明書比例混合樣本與沉淀試劑（如1:5體積比），4℃孵育過夜（或室溫30min，根據(jù)試劑調(diào)整）。4℃下____g離心1h，棄上清，管底可見白色沉淀（外泌體及少量蛋白）。3.外泌體重懸與洗滌加入____μLPBS重懸沉淀，若需去除蛋白污染，可加入1mLPBS，4℃下____g離心30min，棄上清，再次重懸。（四）微流控法操作流程1.芯片準(zhǔn)備與樣本預(yù)處理用PBS沖洗微流控芯片通道（流速10μL/min，持續(xù)5min），確保通道無氣泡。樣本經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，加入熒光染料（如PKH67）孵育30min（可選，用于追蹤），或直接上樣。2.上樣與分離將樣本注入芯片進(jìn)樣口，設(shè)置流速（如5-10μL/min），利用芯片內(nèi)的尺寸排阻或親和捕獲結(jié)構(gòu)分離外泌體。若為免疫捕獲芯片，需提前用抗體包被通道（按說明書操作）；若為尺寸排阻芯片，外泌體會(huì)在特定通道出口富集。3.外泌體收集與洗脫從目標(biāo)出口收集外泌體組分，若為親和捕獲，需用洗脫緩沖液（如含甘氨酸的低pH緩沖液）洗脫，立即用中性緩沖液中和。四、質(zhì)量控制策略（一）形態(tài)學(xué)驗(yàn)證（透射電鏡，TEM）取10μL外泌體懸液，滴加至銅網(wǎng)上，靜置5min后吸去多余液體；滴加2%磷鎢酸染色5min，自然干燥后電鏡觀察。合格外泌體應(yīng)呈現(xiàn)典型杯狀或圓形結(jié)構(gòu)，粒徑____nm。（二）粒徑與濃度分析（納米顆粒跟蹤分析，NTA）稀釋外泌體懸液至合適濃度（如1×10^8particles/mL），注入NTA儀器，檢測(cè)粒徑分布（主峰應(yīng)在____nm）和濃度（與理論值無數(shù)量級(jí)差異）。（三）標(biāo)志物檢測(cè)（Westernblot）提取外泌體蛋白，進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜后用CD63、CD9、TSG101抗體孵育，陽性條帶表明外泌體富集；同時(shí)檢測(cè)Calnexin（細(xì)胞內(nèi)膜標(biāo)志物），若條帶微弱則說明純度較高。（四）蛋白定量（BCA法）取20μL外泌體懸液，按BCA試劑盒說明書操作，蛋白濃度應(yīng)與NTA濃度趨勢(shì)一致（通常1×10^9particles對(duì)應(yīng)10-50μg蛋白）。五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)1.樣本處理：避免反復(fù)凍融樣本，采集后盡快處理；細(xì)胞培養(yǎng)上清需用無外泌體血清，防止外源囊泡干擾。2.離心操作：超速離心管需嚴(yán)格平衡（誤差<0.1g），離心結(jié)束后盡快取出樣本，防止外泌體重新溶解。3.耗材選擇：硅化離心管、低蛋白吸附槍頭可減少外泌體損失；微流控芯片需定期清洗，防止通道堵塞。4.試劑新鮮度：蔗糖溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免細(xì)菌污染；試劑盒試劑需按說明書保存，過期后棄用。六、常見問題及解決策略（一）外泌體濃度低原因：樣本量不足、離心時(shí)間過短、重懸不充分。解決：增加樣本量（如細(xì)胞上清收集24h以上）；延長(zhǎng)超速離心時(shí)間（如從70min增至90min）；用寬口槍頭反復(fù)輕柔吹打沉淀。（二）純度差（蛋白污染嚴(yán)重）原因：預(yù)處理離心不充分、密度梯度濃度不當(dāng)。解決：增加預(yù)處理離心步驟（如____g離心時(shí)間從30min增至60min）；調(diào)整蔗糖梯度濃度（如增加40%蔗糖層比例）。（三）外泌體破裂原因：離心力過大、重懸時(shí)機(jī)械力過強(qiáng)。解決：降低超速離心速度（如從____g降至____g，需驗(yàn)證分離效果）；用剪切力小的槍頭（如寬口或剪去尖端的槍頭）重懸。七、應(yīng)用場(chǎng)景與技術(shù)選擇建議基礎(chǔ)研究/大量樣本：優(yōu)先選擇超速離心法或密度梯度離心法，成本低、分離效果穩(wěn)定，但耗時(shí)較長(zhǎng)。臨床樣本/快速分離：推薦試劑盒法（如聚合物沉淀），操作簡(jiǎn)便、通量高，但純度略低，需結(jié)合質(zhì)控優(yōu)化。單細(xì)胞分析/高通量篩選：選擇微