細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作規(guī)程與注意事項(xiàng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（BacterialEndotoxinTest,BET）是藥品、醫(yī)療器械及生物制品質(zhì)量控制的核心環(huán)節(jié)，其結(jié)果直接關(guān)聯(lián)產(chǎn)品安全性與合規(guī)性。依據(jù)《中國藥典》《美國藥典》等權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)毒素（革蘭陰性菌細(xì)胞壁脂多糖）的限量需嚴(yán)格受控，以規(guī)避發(fā)熱、休克等臨床風(fēng)險(xiǎn)。本文結(jié)合行業(yè)實(shí)踐與法規(guī)要求，系統(tǒng)梳理檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化流程及實(shí)操要點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)室人員提供兼具合規(guī)性與實(shí)用性的技術(shù)指引。一、檢測(cè)工作的前期準(zhǔn)備（一）環(huán)境與器具的無熱原化處理檢測(cè)環(huán)境需達(dá)到萬級(jí)背景下的局部百級(jí)潔凈度，操作臺(tái)面鋪設(shè)無熱原一次性墊單。所有接觸供試品、鱟試劑的器具（移液槍頭、試管、稀釋瓶等）需經(jīng)干熱滅菌（250℃，30分鐘以上）或使用商品化無熱原耗材；玻璃器具滅菌后應(yīng)置于專用無熱原容器中，避免二次污染。（二）試劑與耗材的合規(guī)管理1.鱟試劑：需驗(yàn)證靈敏度（λ值），并在2-8℃避光保存；復(fù)溶前平衡至室溫（約30分鐘），不同廠家、批次的鱟試劑不可混用。復(fù)溶時(shí)用無熱原水（內(nèi)毒素含量＜0.015EU/ml）沿瓶壁緩慢加入，避免劇烈振蕩產(chǎn)生氣泡。2.對(duì)照品：細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品需按說明書稀釋，稀釋過程使用無熱原移液器與吸頭，稀釋液現(xiàn)用現(xiàn)配，剩余溶液不得重復(fù)使用。3.供試品：需評(píng)估pH值（應(yīng)在鱟試劑適用范圍：6.0-8.0）、滲透壓及化學(xué)組成。若含干擾物質(zhì)（螯合劑、表面活性劑等），需提前通過干擾試驗(yàn)確定有效稀釋倍數(shù)，或使用滅活劑（如Mg2?中和螯合劑）。二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（一）供試品的預(yù)處理1.稀釋與中和：根據(jù)供試品預(yù)期內(nèi)毒素限量，選擇適宜稀釋倍數(shù)（需滿足“預(yù)測(cè)內(nèi)毒素含量×稀釋倍數(shù)＜λ×2”，λ為鱟試劑靈敏度）。若供試品含酸、堿或有機(jī)溶劑，需用無熱原緩沖液（如TRIS-HCl）調(diào)節(jié)pH至6.0-8.0，避免影響鱟試劑活性。2.除菌處理：若供試品可能含菌，需經(jīng)0.22μm無熱原濾膜過濾（濾膜需提前驗(yàn)證無內(nèi)毒素釋放），過濾過程避免壓力過大導(dǎo)致濾膜破裂。（二）鱟試劑反應(yīng)體系的構(gòu)建1.加樣操作：在無熱原試管中，依次加入復(fù)溶后的鱟試劑（通常0.1ml/管）、供試品稀釋液（或陽性/陰性對(duì)照）。加樣時(shí)槍頭懸空，避免觸碰管壁或試劑液面，防止交叉污染。2.反應(yīng)條件控制：將反應(yīng)管置于37℃±1℃恒溫裝置（干式恒溫器或水浴鍋）中，嚴(yán)格計(jì)時(shí)（通常60分鐘±2分鐘），期間不得振蕩或移動(dòng)，避免反應(yīng)不均導(dǎo)致假陰性。（三）結(jié)果的判讀與記錄1.凝膠法判讀：反應(yīng)結(jié)束后，將試管緩緩倒轉(zhuǎn)180°。若凝膠保持完整、無流動(dòng)，判為陽性（內(nèi)毒素存在）；若凝膠破碎或流動(dòng)，判為陰性。需同步觀察陽性對(duì)照（應(yīng)形成凝膠）、陰性對(duì)照（無凝膠），確保試驗(yàn)有效。2.光度法判讀：根據(jù)儀器操作規(guī)程讀取吸光度/濁度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算內(nèi)毒素濃度。需驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（r≥0.98），并記錄供試品稀釋倍數(shù)、反應(yīng)時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)。三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（一）污染防控的全流程管理1.人員操作：檢測(cè)人員需穿戴無熱原潔凈服、手套，操作前用無熱原水洗手，避免皮膚接觸試劑/供試品（汗液、皮脂含內(nèi)毒素類似物）。2.環(huán)境監(jiān)控：定期對(duì)操作臺(tái)、空氣、水系統(tǒng)進(jìn)行內(nèi)毒素監(jiān)測(cè)（如每周檢測(cè)無熱原水），發(fā)現(xiàn)超標(biāo)時(shí)需徹底清潔并更換耗材。（二）試劑活性的維持1.鱟試劑復(fù)溶后穩(wěn)定性：復(fù)溶后的鱟試劑應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)使用完畢，剩余試劑不得冷藏后復(fù)用，避免活性降低。2.對(duì)照品溯源性：細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品需從法定機(jī)構(gòu)獲取，稀釋過程嚴(yán)格遵循“倍比稀釋、現(xiàn)用現(xiàn)配”原則；廢棄稀釋液需經(jīng)高壓滅菌（121℃，30分鐘）后處理。（三）干擾因素的識(shí)別與排除1.干擾試驗(yàn)的必要性：新供試品或配方變更后，需通過干擾試驗(yàn)確定“供試品不抑制/增強(qiáng)鱟試劑反應(yīng)的稀釋倍數(shù)”。若稀釋倍數(shù)超100倍仍有干擾，需考慮固相萃取、超濾等方法去除干擾物。2.溫度與時(shí)間的精準(zhǔn)控制：反應(yīng)溫度偏離37℃±1℃或時(shí)間誤差超±2分鐘，會(huì)顯著影響凝膠形成。需使用經(jīng)校準(zhǔn)的恒溫設(shè)備，并設(shè)置多重計(jì)時(shí)提醒。四、異常情況的分析與處置（一）假陽性結(jié)果的排查1.污染來源：檢查器具是否未徹底滅菌、無熱原水是否受污染、操作過程是否引入外源內(nèi)毒素（如臺(tái)面未清潔）?？赏ㄟ^更換耗材、重新制備無熱原水后重復(fù)試驗(yàn)。2.試劑問題：鱟試劑可能因儲(chǔ)存不當(dāng)（反復(fù)凍融）導(dǎo)致非特異性凝膠，需更換新批次試劑并驗(yàn)證靈敏度。（二）假陰性結(jié)果的處置1.操作失誤：確認(rèn)反應(yīng)時(shí)間是否不足、加樣量是否準(zhǔn)確（如供試品未充分混勻?qū)е聺舛炔痪??？芍匦屡渲乒┰嚻?，?yán)格控制反應(yīng)參數(shù)。2.干擾抑制：若供試品存在強(qiáng)抑制作用，需進(jìn)一步提高稀釋倍數(shù)，或采用“加標(biāo)回收法”（向供試品中加入已知量?jī)?nèi)毒素，計(jì)算回收率是否在50%-200%范圍內(nèi)）驗(yàn)證干擾是否消除。（三）試驗(yàn)無效的應(yīng)對(duì)當(dāng)陽性對(duì)照無凝膠或陰性對(duì)照出現(xiàn)凝膠時(shí)，試驗(yàn)無效。需排查試劑失效（更換試劑）、操作污染（徹底清潔環(huán)境）、溫度失控（校準(zhǔn)設(shè)備）等因素，重新開展試驗(yàn)。結(jié)語細(xì)菌內(nèi)毒素