微管蛋白和YAP雙重抑制劑1382：開啟抗胃癌機(jī)制研究的新視野一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年胃癌新發(fā)病例數(shù)眾多，而中國的胃癌負(fù)擔(dān)尤為沉重，新增病例數(shù)占全球近一半。大多數(shù)中國胃癌患者在確診時(shí)已處于中晚期，這使得治療難度大幅增加，死亡率也顯著上升。早期胃癌患者手術(shù)治療后的5年生存率超過90％，其中始發(fā)階段小胃癌及微小胃癌的10年生存率可達(dá)100％，但我國早期胃癌病人所占比例一直徘徊在4％-10％之間，遠(yuǎn)低于日本等胃癌診治水平較高的國家。我國胃癌的高發(fā)病率、低早期診斷率和高死亡率現(xiàn)狀，迫切需要新的治療策略和藥物來改善患者的預(yù)后。微管蛋白在腫瘤細(xì)胞的增殖過程中起著至關(guān)重要的作用，是抗癌藥物研發(fā)的理想靶點(diǎn)之一。以紫杉醇、長春新堿和埃坡霉素為代表的微管蛋白抑制劑已在臨床廣泛應(yīng)用，無論是單獨(dú)使用，還是與靶向、免疫抗腫瘤藥物聯(lián)用，都用于多種癌癥的治療。然而，這些臨床應(yīng)用的微管蛋白抑制劑存在諸多缺陷，如大多水溶性差，這會(huì)影響藥物的吸收和分布；存在一定的神經(jīng)毒性，可能給患者帶來額外的痛苦；并且在臨床應(yīng)用中容易出現(xiàn)多藥耐藥等問題，限制了其治療效果。盡管目前有新的微管蛋白抑制劑在不斷研發(fā)，如山東大學(xué)劉兆鵬教授課題組發(fā)現(xiàn)的新型茚并吡唑類微管蛋白抑制劑，以及廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所創(chuàng)新藥物與疾病動(dòng)物模型研究中心副研究員姚宏亮團(tuán)隊(duì)聯(lián)合五邑大學(xué)副教授吳家強(qiáng)團(tuán)隊(duì)開發(fā)的兩類新型微管蛋白抑制劑，但尋找更有效的微管蛋白抑制劑，克服現(xiàn)有藥物的局限性，仍然是胃癌治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一。Yes相關(guān)蛋白（YAP）作為Hippo信號(hào)通路的主要下游效應(yīng)因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。在正常生理狀態(tài)下，Hippo信號(hào)通路通過一系列激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，磷酸化YAP，使其滯留在細(xì)胞質(zhì)中并發(fā)生降解，從而抑制其活性。而當(dāng)Hippo信號(hào)通路異常時(shí)，YAP磷酸化水平下降并進(jìn)入細(xì)胞核，與TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡。研究表明，YAP在多種惡性腫瘤中處于過度活化狀態(tài)，在胃癌組織中，YAP的高表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。中科院上海生科院生化細(xì)胞所等研究組發(fā)現(xiàn)VGLL4在胃癌組織中呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢，且與腫瘤的發(fā)展及惡化程度明顯負(fù)相關(guān)，同時(shí)VGLL4通過和YAP競爭性結(jié)合TEAD4，從而抑制YAP的活性。對(duì)YAP的深入研究，為胃癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和方向。在此背景下，微管蛋白和YAP雙重抑制劑1382的研究具有重要的價(jià)值。它有可能同時(shí)作用于微管蛋白和YAP這兩個(gè)與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的靶點(diǎn)，發(fā)揮協(xié)同抗癌作用，克服單一靶點(diǎn)抑制劑的局限性。一方面，通過抑制微管蛋白的聚合，干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過程，使細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；另一方面，抑制YAP的活性，阻斷其與TEAD轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而抑制下游促癌基因的表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。這種雙重抑制作用可能會(huì)提高對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷效果，為胃癌的治療提供更有效的手段，有望改善胃癌患者的治療現(xiàn)狀，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究微管蛋白和YAP雙重抑制劑1382的抗胃癌機(jī)制，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。具體而言，通過一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確1382對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，以及在動(dòng)物模型中對(duì)腫瘤生長的抑制作用；分析1382對(duì)微管蛋白聚合和YAP信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，揭示其發(fā)揮抗癌作用的分子基礎(chǔ)；探討1382與現(xiàn)有胃癌治療方法聯(lián)合應(yīng)用的可能性和協(xié)同效應(yīng)，為臨床治療方案的優(yōu)化提供參考。從理論意義來看，對(duì)1382抗胃癌機(jī)制的研究有助于進(jìn)一步深入理解微管蛋白和YAP信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相互關(guān)系，豐富腫瘤生物學(xué)的理論知識(shí)，為開發(fā)新型抗癌藥物提供新的靶點(diǎn)和思路。在實(shí)際應(yīng)用方面，若1382被證明具有顯著的抗胃癌效果且安全性良好，有望成為一種新型的胃癌治療藥物或輔助治療藥物，改善胃癌患者的治療現(xiàn)狀，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。同時(shí)，其雙重抑制的作用模式可能為解決現(xiàn)有抗癌藥物的耐藥性問題提供新的途徑，對(duì)推動(dòng)胃癌治療領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在微管蛋白抑制劑的研究方面，國內(nèi)外均取得了顯著進(jìn)展。國外自紫杉醇等經(jīng)典微管蛋白抑制劑應(yīng)用于臨床以來，不斷探索新的作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)類型。如對(duì)微管蛋白結(jié)合位點(diǎn)的深入研究，發(fā)現(xiàn)了多種新的結(jié)合模式，為開發(fā)新型抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。一些研究致力于優(yōu)化現(xiàn)有抑制劑的結(jié)構(gòu)，以改善其水溶性、降低神經(jīng)毒性和克服耐藥性。國內(nèi)的相關(guān)研究也成果頗豐，山東大學(xué)劉兆鵬教授課題組基于茚并吡唑優(yōu)勢結(jié)構(gòu)，開發(fā)出新型茚并吡唑類微管蛋白抑制劑，其中先導(dǎo)化合物L(fēng)L01對(duì)多種腫瘤細(xì)胞包括多藥耐藥腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)抗增殖作用，且能克服由P-糖蛋白介導(dǎo)的耐藥機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，課題組進(jìn)一步對(duì)其結(jié)構(gòu)修飾，得到的化合物ID09和ID33具有優(yōu)良的水溶性和理想的LogP值，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞活性優(yōu)于紫杉醇或與其相當(dāng)。廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所創(chuàng)新藥物與疾病動(dòng)物模型研究中心副研究員姚宏亮團(tuán)隊(duì)聯(lián)合五邑大學(xué)副教授吳家強(qiáng)團(tuán)隊(duì)開發(fā)的兩類新型微管蛋白抑制劑，篩選出的化合物6y可以高效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有很好的代謝穩(wěn)定性，在小鼠抑瘤模型中也表現(xiàn)出顯著的抑制腫瘤生長效果且無毒副作用。關(guān)于YAP抑制劑的研究，國外對(duì)Hippo信號(hào)通路及YAP的作用機(jī)制研究較為深入，發(fā)現(xiàn)了YAP與多種疾病尤其是腫瘤的關(guān)聯(lián)，基于此開發(fā)了一系列針對(duì)YAP的抑制劑。如同源康醫(yī)藥自主研發(fā)的新一代口服、高效、高選擇性的小分子YAP/TEAD抑制劑TYK-01054已獲美國FDA批準(zhǔn)開展臨床研究，臨床前研究表明其能結(jié)合TEAD并抑制下游基因表達(dá)。香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院等團(tuán)隊(duì)將抗精神病藥物硫利達(dá)嗪確定為一種有效的YAP抑制劑，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，硫利達(dá)嗪抑制了紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，在兩種小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中發(fā)揮了抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。國內(nèi)中科院上海生科院生化細(xì)胞所等研究組發(fā)現(xiàn)VGLL4可通過和YAP競爭性結(jié)合TEAD4來抑制YAP的活性，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展出針對(duì)YAP的多肽類抑制劑，證明該多肽類抑制劑可有效抑制胃癌細(xì)胞以及腫瘤生長。中科院分子細(xì)胞卓越中心周兆才團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)MST4激酶直接磷酸化YAP形成一條非經(jīng)典Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸，為探索胃癌的病變機(jī)理以及相關(guān)藥物篩選和診療策略研發(fā)提供基礎(chǔ)。在雙重抑制劑的研究領(lǐng)域，雖然目前專門針對(duì)微管蛋白和YAP雙重抑制劑的報(bào)道相對(duì)較少，但多靶點(diǎn)抑制劑的研究理念已受到廣泛關(guān)注。從其他雙靶點(diǎn)抑制劑的研究情況來看，如靶向微管的雙靶抑制劑，包括Tubulin–RTKs、Tubulin–HDACs等雙靶抑制劑的研究，表明雙靶點(diǎn)抑制劑在提高抗腫瘤療效、克服耐藥性方面具有潛在優(yōu)勢。微管蛋白與其他靶點(diǎn)的協(xié)同作用研究，為微管蛋白和YAP雙重抑制劑的開發(fā)提供了思路，有望通過同時(shí)作用于兩個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，發(fā)揮更強(qiáng)的抗癌效果，克服單一靶點(diǎn)抑制劑的局限性。二、微管蛋白、YAP與胃癌的關(guān)聯(lián)剖析2.1微管蛋白與胃癌2.1.1微管蛋白的結(jié)構(gòu)與功能微管蛋白是構(gòu)成微管的基本單位，主要包括α微管蛋白和β微管蛋白兩種類型。這兩種微管蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，能夠緊密結(jié)合形成二聚體，作為微管組裝的亞基。α亞基由450個(gè)氨基酸組成，β亞基由455個(gè)氨基酸組成，它們的分子量約為55kDa。α-和β-微管蛋白的二聚體與GTP結(jié)合并在GTP結(jié)合狀態(tài)下組裝到微管的（+）末端，β-微管蛋白亞基暴露在微管的正端，而α-微管蛋白亞基暴露在負(fù)端。在將二聚體摻入微管后，與β-微管蛋白亞基結(jié)合的GTP分子最終通過沿著微管原絲的二聚體間接觸水解成GDP。與GTP結(jié)合的二聚體傾向于組裝成微管，而與GDP結(jié)合的二聚體傾向于分裂，這種GTP循環(huán)對(duì)于微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性至關(guān)重要。近年來還發(fā)現(xiàn)了γ微管蛋白，其定位于微管組織中心，對(duì)微管的形成、數(shù)量、位置、極性確定以及細(xì)胞分裂都起到重要作用。微管作為細(xì)胞骨架的重要組成部分，在維持細(xì)胞形狀、支持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（如細(xì)胞遷移、軸突運(yùn)輸?shù)龋┮约凹?xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞分裂過程中，微管形成有絲分裂紡錘體，為姐妹染色單體的物理分離提供結(jié)構(gòu)框架，確保遺傳物質(zhì)能夠準(zhǔn)確地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。2.1.2微管蛋白異常與胃癌發(fā)生發(fā)展在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，微管蛋白常常出現(xiàn)異常表現(xiàn)。研究表明，微管蛋白的表達(dá)水平和結(jié)構(gòu)變化與胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力密切相關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中微管蛋白的表達(dá)量明顯高于正常胃黏膜組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級(jí)呈正相關(guān)。微管蛋白的異常表達(dá)會(huì)影響微管的正常功能，進(jìn)而干擾細(xì)胞的有絲分裂過程。當(dāng)微管蛋白的組裝和去組裝過程失調(diào)時(shí)，有絲分裂紡錘體無法正常形成，導(dǎo)致染色體分離異常，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。微管蛋白的異常還會(huì)影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。微管作為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其功能異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)改變，使胃癌細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。藏紅花素處理人胃癌細(xì)胞MGC-803的實(shí)驗(yàn)表明，藏紅花素通過降低MGC-803細(xì)胞中的微管蛋白表達(dá)，使細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力明顯下降，凋亡增加，證實(shí)了微管蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的重要影響。2.1.3以微管蛋白為靶點(diǎn)的抗癌藥物研究現(xiàn)狀以微管蛋白為靶點(diǎn)的抗癌藥物是目前腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。常見的微管蛋白抑制劑主要包括紫杉醇類、長春堿類、埃坡霉素類等。這些藥物通過作用于微管蛋白，干擾微管的正常功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。紫杉醇的作用機(jī)制是促進(jìn)微管蛋白二聚體聚合并抑制其解聚，使微管處于穩(wěn)定狀態(tài)，從而抑制分裂間期和有絲分裂期細(xì)胞功能至關(guān)重要的微管網(wǎng)的正常動(dòng)態(tài)重組。在整個(gè)細(xì)胞周期和細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生多發(fā)性星狀體時(shí)，紫杉醇可導(dǎo)致微管“束”的排列異常，影響腫瘤細(xì)胞的分裂。長春堿類藥物主要抑制微管蛋白的聚合，影響紡錘體微管的形成，使有絲分裂停止于中期，還可干擾蛋白質(zhì)代謝及抑制RNA多聚酶的活力，并抑制細(xì)胞膜類脂質(zhì)的合成和氨基酸在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)。埃坡霉素類藥物與紫杉醇的作用機(jī)制相似，能夠促進(jìn)微管蛋白的聚合，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。這些微管蛋白抑制劑在臨床應(yīng)用中取得了一定的療效，廣泛用于多種癌癥的治療，包括胃癌。它們也存在一些局限性，如大多水溶性差，神經(jīng)毒性較大，且容易出現(xiàn)多藥耐藥等問題。為了克服這些缺陷，研究人員不斷探索新的微管蛋白抑制劑，優(yōu)化現(xiàn)有藥物的結(jié)構(gòu)，開發(fā)新的劑型和給藥方式。一些新型微管蛋白抑制劑，如SAR405838通過阻斷微管的正動(dòng)力性末端來發(fā)揮作用，導(dǎo)致微管的不穩(wěn)定性和破壞，使得細(xì)胞無法正常進(jìn)行分裂，從而殺死腫瘤細(xì)胞；Tak-715則通過對(duì)微管的富集和分布進(jìn)行調(diào)控，影響微管的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷效果，且對(duì)非腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)相對(duì)較小。此外，將微管蛋白抑制劑與其他抗癌藥物聯(lián)合使用，或者與靶向治療、免疫治療等相結(jié)合，也成為提高治療效果的研究方向。2.2YAP與胃癌2.2.1YAP的生物學(xué)特性與調(diào)控機(jī)制Yes相關(guān)蛋白（YAP）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，在細(xì)胞的多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。YAP蛋白由488個(gè)氨基酸組成，包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，如N端的TEAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域、WW結(jié)構(gòu)域以及C端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域等。其中，TEAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成YAP-TEAD復(fù)合物，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄；WW結(jié)構(gòu)域則主要介導(dǎo)YAP與其他蛋白質(zhì)的相互作用，參與信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。在正常生理狀態(tài)下，YAP主要受到Hippo信號(hào)通路的精密調(diào)控。Hippo信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在哺乳動(dòng)物中，該通路主要由一系列激酶組成，包括MST1/2（哺乳動(dòng)物STE20樣激酶1/2）、LATS1/2（大腫瘤抑制激酶1/2）以及它們的調(diào)節(jié)蛋白等。當(dāng)細(xì)胞接收到來自細(xì)胞密度、細(xì)胞外基質(zhì)硬度、機(jī)械力等多種上游信號(hào)時(shí)，Hippo信號(hào)通路被激活。首先，MST1/2激酶在其調(diào)節(jié)蛋白的作用下發(fā)生自身磷酸化并激活，進(jìn)而磷酸化并激活LATS1/2激酶。激活后的LATS1/2激酶能夠磷酸化YAP的多個(gè)位點(diǎn)，其中Ser127位點(diǎn)的磷酸化是YAP調(diào)控的關(guān)鍵事件。磷酸化后的YAP與14-3-3蛋白結(jié)合，被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，無法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活功能，隨后YAP可能被泛素化并通過蛋白酶體途徑降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)YAP的低活性狀態(tài)。當(dāng)Hippo信號(hào)通路受到抑制或異常時(shí)，YAP的磷酸化水平下降，YAP與14-3-3蛋白分離，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，YAP與TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子緊密結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠識(shí)別并結(jié)合到下游靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄過程。YAP-TEAD復(fù)合物調(diào)控的下游靶基因涉及多個(gè)與細(xì)胞增殖、存活、遷移和分化等生物學(xué)過程相關(guān)的基因，如CTGF（結(jié)締組織生長因子）、CYR61（富含半胱氨酸的血管生成誘導(dǎo)因子61）、AXL（酪氨酸蛋白激酶受體）等。這些靶基因的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。2.2.2YAP在胃癌中的異常激活及作用在胃癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，YAP常常呈現(xiàn)出異常激活的狀態(tài)。眾多研究表明，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中YAP的表達(dá)水平顯著升高，且其激活程度與胃癌的臨床病理特征密切相關(guān)。YAP的異常激活在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。YAP的激活能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)YAP的胃癌細(xì)胞系，其細(xì)胞增殖速度明顯加快，細(xì)胞周期進(jìn)程也發(fā)生改變，更多的細(xì)胞處于S期和G2/M期，表明YAP能夠促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成和有絲分裂過程。其作用機(jī)制主要是通過YAP-TEAD復(fù)合物調(diào)控下游促增殖基因的表達(dá)。例如，YAP可以上調(diào)CCND1（細(xì)胞周期蛋白D1）的表達(dá)，CCND1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）結(jié)合形成復(fù)合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb蛋白失活，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。YAP還可以激活其他促增殖基因如MYC等的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。YAP在抑制胃癌細(xì)胞凋亡方面也扮演著重要角色。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和抑制腫瘤發(fā)生具有重要意義。而YAP的異常激活能夠干擾胃癌細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，降低細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性。研究表明，YAP可以通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它們之間的平衡決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。YAP可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，有利于腫瘤的生長和發(fā)展。在胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，YAP同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。YAP的激活能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使其更容易突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這一過程與YAP調(diào)控的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）密切相關(guān)。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟。YAP可以通過激活Snail、Slug、Twist等EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。YAP還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲提供有利條件。2.2.3靶向YAP的胃癌治療策略研究進(jìn)展鑒于YAP在胃癌中的重要作用，靶向YAP已成為胃癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，目前針對(duì)YAP的胃癌治療策略主要包括以下幾個(gè)方面。在小分子抑制劑的研發(fā)方面，研究人員致力于尋找能夠特異性抑制YAP活性的小分子化合物。例如，一些小分子能夠靶向YAP-TEAD相互作用界面，阻斷YAP與TEAD的結(jié)合，從而抑制YAP-TEAD復(fù)合物的形成及其下游基因的轉(zhuǎn)錄。同源康醫(yī)藥自主研發(fā)的新一代口服、高效、高選擇性的小分子YAP/TEAD抑制劑TYK-01054已獲美國FDA批準(zhǔn)開展臨床研究，臨床前研究表明其能結(jié)合TEAD并抑制下游基因表達(dá)。香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院等團(tuán)隊(duì)將抗精神病藥物硫利達(dá)嗪確定為一種有效的YAP抑制劑，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，硫利達(dá)嗪抑制了紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，在兩種小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中發(fā)揮了抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。這些小分子抑制劑具有相對(duì)分子質(zhì)量小、易于合成和修飾、能夠穿透細(xì)胞膜等優(yōu)點(diǎn)，有望成為有效的胃癌治療藥物。但它們也存在一些局限性，如小分子抑制劑的特異性和選擇性有待進(jìn)一步提高，可能會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生一定的副作用；部分小分子抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不理想，影響其在體內(nèi)的療效和安全性。多肽類抑制劑也是靶向YAP的重要研究方向之一。中科院上海生科院生化細(xì)胞所等研究組發(fā)現(xiàn)VGLL4可通過和YAP競爭性結(jié)合TEAD4來抑制YAP的活性，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展出針對(duì)YAP的多肽類抑制劑，證明該多肽類抑制劑可有效抑制胃癌細(xì)胞以及腫瘤生長。多肽類抑制劑具有較高的特異性和親和力，能夠精確地作用于靶點(diǎn)，減少對(duì)其他非靶標(biāo)蛋白的影響。它們的穩(wěn)定性較差，容易被蛋白酶降解，且在體內(nèi)的遞送效率較低，限制了其臨床應(yīng)用。為了解決這些問題，研究人員嘗試采用多種策略，如對(duì)多肽進(jìn)行化學(xué)修飾，提高其穩(wěn)定性；利用納米載體等技術(shù)，改善多肽的遞送效率。除了直接靶向YAP的抑制劑外，針對(duì)YAP上游信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑也為胃癌治療提供了新的思路。由于YAP主要受Hippo信號(hào)通路的調(diào)控，通過激活Hippo信號(hào)通路來抑制YAP的活性是一種可行的治療策略。研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物或生物制劑能夠激活MST1/2和LATS1/2激酶，從而磷酸化YAP，使其失活。這種策略可以從源頭阻斷YAP的激活，具有一定的優(yōu)勢。然而，Hippo信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，激活該通路可能會(huì)引發(fā)一系列其他生物學(xué)效應(yīng)，需要進(jìn)一步深入研究其安全性和有效性。免疫治療與靶向YAP的聯(lián)合策略也逐漸受到關(guān)注。免疫治療通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，在多種癌癥的治療中取得了顯著成效。YAP的異常激活與腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制密切相關(guān)，靶向YAP可能會(huì)改善腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)免疫治療的效果。例如，YAP的抑制可以減少腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子，增加腫瘤細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的敏感性。將靶向YAP的治療方法與免疫檢查點(diǎn)抑制劑等免疫治療手段聯(lián)合使用，有望發(fā)揮協(xié)同作用，提高胃癌的治療效果。目前，相關(guān)的臨床前研究和臨床試驗(yàn)正在開展中，但聯(lián)合治療的最佳方案和劑量還需要進(jìn)一步探索和優(yōu)化。2.3微管蛋白與YAP在胃癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用2.3.1信號(hào)通路交叉微管蛋白和YAP相關(guān)信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中存在復(fù)雜的交叉作用，共同調(diào)控著胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。微管作為細(xì)胞骨架的重要組成部分，不僅在維持細(xì)胞形態(tài)和物質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程。在胃癌細(xì)胞中，微管的動(dòng)態(tài)變化可以影響多種信號(hào)通路的激活和傳導(dǎo)，其中就包括與YAP相關(guān)的Hippo信號(hào)通路。當(dāng)微管受到外界刺激或藥物作用發(fā)生解聚時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)變化，影響細(xì)胞內(nèi)的力學(xué)環(huán)境和分子間相互作用。這種變化可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一些蛋白激酶的活性改變，其中就包括Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶MST1/2和LATS1/2。研究表明，微管解聚劑如長春花堿等可以通過影響細(xì)胞內(nèi)的力學(xué)信號(hào)，抑制MST1/2和LATS1/2的活性，進(jìn)而使YAP的磷酸化水平下降，促進(jìn)YAP進(jìn)入細(xì)胞核，激活其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。這表明微管的穩(wěn)定性狀態(tài)可以通過調(diào)控Hippo信號(hào)通路來影響YAP的活性。YAP也可以通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，間接影響微管蛋白的功能和微管的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性。YAP-TEAD復(fù)合物可以上調(diào)一些與微管結(jié)合蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，這些微管結(jié)合蛋白能夠與微管相互作用，調(diào)節(jié)微管的組裝、去組裝以及微管的穩(wěn)定性。一些研究發(fā)現(xiàn)，YAP激活后，會(huì)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞中微管結(jié)合蛋白如MAP4（微管相關(guān)蛋白4）的表達(dá)增加，MAP4可以與微管結(jié)合，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。YAP還可以通過調(diào)控其他細(xì)胞骨架相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞骨架的整體結(jié)構(gòu)和功能，從而與微管蛋白共同參與細(xì)胞的形態(tài)維持和運(yùn)動(dòng)過程。除了Hippo信號(hào)通路，微管蛋白和YAP還可能在其他信號(hào)通路中存在交叉作用。在PI3K/AKT信號(hào)通路中，該通路的激活與胃癌細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性密切相關(guān)。微管蛋白抑制劑在抑制微管功能的同時(shí)，可能會(huì)影響PI3K/AKT信號(hào)通路的活性。一些研究表明，微管蛋白抑制劑可以通過干擾細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)，抑制PI3K的活性，進(jìn)而抑制AKT的磷酸化，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路的傳導(dǎo)。而YAP也與PI3K/AKT信號(hào)通路存在交互作用，YAP可以通過與AKT相互作用，影響AKT的活性和細(xì)胞定位，同時(shí)AKT也可以磷酸化YAP，調(diào)節(jié)YAP的活性和功能。在胃癌細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路的異常激活可能會(huì)導(dǎo)致YAP的激活，同時(shí)也會(huì)影響微管蛋白的功能和微管的穩(wěn)定性，三者之間形成復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2.3.2協(xié)同影響癌細(xì)胞行為微管蛋白和YAP在胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和耐藥性等方面發(fā)揮著協(xié)同作用，共同促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。在細(xì)胞增殖方面，微管蛋白在細(xì)胞有絲分裂過程中起著關(guān)鍵作用，確保染色體的正確分離和細(xì)胞的正常分裂。當(dāng)微管蛋白功能受到抑制時(shí)，細(xì)胞有絲分裂受阻，細(xì)胞周期停滯在G2/M期，從而抑制細(xì)胞增殖。YAP作為一種重要的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，通過與TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控下游促增殖基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中，微管蛋白和YAP的協(xié)同作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響更為顯著。當(dāng)同時(shí)抑制微管蛋白和YAP時(shí)，胃癌細(xì)胞的增殖受到的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)抑制其中任何一個(gè)靶點(diǎn)。這可能是因?yàn)槲⒐艿鞍椎囊种茖?dǎo)致細(xì)胞有絲分裂異常，而YAP的抑制則阻斷了下游促增殖基因的表達(dá)，兩者協(xié)同作用，從不同層面抑制了胃癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞遷移方面，微管作為細(xì)胞骨架的重要組成部分，為細(xì)胞遷移提供結(jié)構(gòu)支持和動(dòng)力。微管的動(dòng)態(tài)變化可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)和極性，促進(jìn)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。YAP在胃癌細(xì)胞遷移過程中也發(fā)揮著重要作用，通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。微管蛋白和YAP在胃癌細(xì)胞遷移過程中存在協(xié)同作用。微管蛋白的異常會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，影響細(xì)胞的遷移能力。而YAP的激活則可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞骨架的重塑和EMT過程，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移能力。當(dāng)同時(shí)抑制微管蛋白和YAP時(shí)，胃癌細(xì)胞的遷移能力受到更顯著的抑制。研究表明，抑制微管蛋白可以減少YAP在細(xì)胞核內(nèi)的積累，從而抑制YAP下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的遷移；反之，抑制YAP也可以影響微管蛋白的功能和微管的穩(wěn)定性，降低胃癌細(xì)胞的遷移能力。在耐藥性方面，微管蛋白抑制劑是一類重要的抗癌藥物，但在臨床應(yīng)用中常常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，YAP的激活與胃癌細(xì)胞對(duì)微管蛋白抑制劑的耐藥性密切相關(guān)。YAP可以通過調(diào)控一些耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，如多藥耐藥蛋白（MDR1）等，促進(jìn)胃癌細(xì)胞對(duì)微管蛋白抑制劑的外排，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致耐藥。YAP還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的存活和修復(fù)能力，使其在受到微管蛋白抑制劑作用時(shí)能夠更好地適應(yīng)和抵抗藥物的殺傷。微管蛋白和YAP的協(xié)同作用在耐藥性方面也有體現(xiàn)。當(dāng)微管蛋白功能受到抑制時(shí)，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，可能會(huì)激活YAP相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致YAP的激活，進(jìn)而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的耐藥性。而抑制YAP則可以部分逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)微管蛋白抑制劑的耐藥性。一些研究表明，同時(shí)抑制微管蛋白和YAP可以顯著提高胃癌細(xì)胞對(duì)微管蛋白抑制劑的敏感性，增強(qiáng)藥物的抗癌效果。三、微管蛋白和YAP雙重抑制劑1382的研究3.1雙重抑制劑1382的設(shè)計(jì)與合成3.1.1設(shè)計(jì)思路基于對(duì)微管蛋白和YAP在胃癌發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵作用及兩者相互作用機(jī)制的深入理解，本研究旨在設(shè)計(jì)一種新型的微管蛋白和YAP雙重抑制劑1382，以實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌細(xì)胞的高效抑制。在微管蛋白作用機(jī)制方面，現(xiàn)有研究表明，微管蛋白抑制劑主要通過干擾微管的動(dòng)態(tài)平衡來發(fā)揮抗癌作用。如長春堿類藥物通過與微管蛋白結(jié)合，抑制微管蛋白的聚合，使有絲分裂紡錘體無法正常形成，從而阻止細(xì)胞分裂；紫杉醇則促進(jìn)微管蛋白的聚合并穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，同樣導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂異常。本研究設(shè)計(jì)1382時(shí)，參考了這些經(jīng)典微管蛋白抑制劑的結(jié)構(gòu)特征和作用模式，期望1382能夠與微管蛋白特異性結(jié)合，有效抑制微管的組裝或解聚過程，干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，使細(xì)胞周期停滯在G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)于YAP信號(hào)通路，YAP與TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成的復(fù)合物在調(diào)控下游促癌基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用。因此，設(shè)計(jì)1382時(shí)，考慮其能夠靶向YAP-TEAD相互作用界面，阻斷YAP與TEAD的結(jié)合，從而抑制YAP-TEAD復(fù)合物的形成及其下游基因的轉(zhuǎn)錄，減少腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。綜合考慮微管蛋白和YAP的作用靶點(diǎn)，1382的設(shè)計(jì)理念是將能夠作用于微管蛋白和YAP的藥效基團(tuán)進(jìn)行合理拼接和優(yōu)化。通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）技術(shù)，對(duì)大量化合物庫進(jìn)行虛擬篩選，結(jié)合分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，預(yù)測化合物與微管蛋白和YAP的結(jié)合模式和親和力。篩選出具有潛在雙重抑制活性的化合物骨架后，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化，引入特定的官能團(tuán)，以增強(qiáng)化合物與靶點(diǎn)的相互作用，提高其選擇性和活性。經(jīng)過多輪設(shè)計(jì)、優(yōu)化和篩選，最終確定了1382的化學(xué)結(jié)構(gòu)，期望其能夠同時(shí)高效地抑制微管蛋白和YAP，發(fā)揮協(xié)同抗癌作用，克服單一靶點(diǎn)抑制劑的局限性。3.1.2合成方法1382的合成采用了多步有機(jī)合成反應(yīng)，具體步驟如下：以化合物A和化合物B為起始原料，在堿性條件下，通過親核取代反應(yīng)，使化合物A的活性基團(tuán)與化合物B的特定位置發(fā)生反應(yīng)，生成中間體C。反應(yīng)條件為在無水有機(jī)溶劑中，加入適量的堿（如碳酸鉀、叔丁醇鉀等），控制反應(yīng)溫度在一定范圍內(nèi)（如0-50℃），反應(yīng)時(shí)間根據(jù)具體情況而定（一般為1-24小時(shí)）。反應(yīng)結(jié)束后，通過常規(guī)的分離提純方法（如萃取、柱色譜等）得到中間體C。將中間體C與化合物D進(jìn)行縮合反應(yīng)，在催化劑的作用下，形成具有特定結(jié)構(gòu)的中間體E。所用催化劑可以是酸催化劑（如對(duì)甲苯磺酸）或堿催化劑（如三乙胺等），反應(yīng)在合適的有機(jī)溶劑中進(jìn)行，溫度控制在適當(dāng)范圍（如室溫-100℃），反應(yīng)時(shí)間通常為幾小時(shí)至十幾小時(shí)。反應(yīng)完成后，經(jīng)過分離、純化得到中間體E。對(duì)中間體E進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，通過引入特定的官能團(tuán)F，采用合適的反應(yīng)試劑和條件，發(fā)生取代反應(yīng)或加成反應(yīng)，得到最終產(chǎn)物1382。這一步反應(yīng)需要根據(jù)官能團(tuán)F的性質(zhì)和反應(yīng)要求，選擇合適的反應(yīng)試劑（如鹵代烴、酰氯等）和反應(yīng)條件（如溫度、溶劑、催化劑等）。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)過多次提純和精制，采用高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）等分析方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純度和結(jié)構(gòu)鑒定，確保得到高純度的1382。在整個(gè)合成過程中，關(guān)鍵反應(yīng)包括親核取代反應(yīng)和縮合反應(yīng)。親核取代反應(yīng)中，選擇合適的親核試劑和底物，控制反應(yīng)條件，以保證反應(yīng)的選擇性和收率。縮合反應(yīng)中，優(yōu)化催化劑的種類和用量，以及反應(yīng)溫度和時(shí)間，確保中間體能夠順利生成。對(duì)每一步反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)測和分析，及時(shí)調(diào)整反應(yīng)條件，以提高合成效率和產(chǎn)物質(zhì)量。3.1.3結(jié)構(gòu)鑒定為了準(zhǔn)確確定1382的化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用了多種先進(jìn)的結(jié)構(gòu)鑒定方法。利用核磁共振波譜（NMR）技術(shù)對(duì)1382進(jìn)行分析。1H-NMR譜能夠提供分子中氫原子的化學(xué)位移、積分面積和耦合常數(shù)等信息，通過分析這些信息，可以確定分子中不同類型氫原子的數(shù)量和連接方式。例如，通過1H-NMR譜中各峰的化學(xué)位移，可以判斷分子中是否存在芳香氫、脂肪氫等不同類型的氫原子；積分面積則與氫原子的數(shù)量成正比，可用于確定各基團(tuán)中氫原子的相對(duì)比例；耦合常數(shù)能夠反映相鄰氫原子之間的相互作用，有助于推斷分子的結(jié)構(gòu)骨架。13C-NMR譜則主要用于確定分子中碳原子的化學(xué)環(huán)境和連接方式，通過分析13C-NMR譜中各峰的化學(xué)位移，可以確定分子中不同類型碳原子（如羰基碳、芳環(huán)碳、脂肪碳等）的位置和數(shù)量。綜合1H-NMR和13C-NMR譜的信息，能夠初步確定1382的分子結(jié)構(gòu)。采用質(zhì)譜（MS）技術(shù)對(duì)1382進(jìn)行分析。高分辨率質(zhì)譜（HR-MS）可以精確測定化合物的分子量，通過與理論計(jì)算的分子量進(jìn)行對(duì)比，能夠確定化合物的分子式。在1382的鑒定中，HR-MS測得的精確分子量與根據(jù)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)計(jì)算得到的理論分子量相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了化合物的組成。質(zhì)譜還可以通過分析化合物的碎片離子信息，推斷分子的結(jié)構(gòu)和裂解方式。在MS/MS實(shí)驗(yàn)中，1382分子在高能碰撞下發(fā)生裂解，產(chǎn)生一系列碎片離子，通過對(duì)這些碎片離子的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度進(jìn)行分析，可以推測分子中各化學(xué)鍵的斷裂方式，從而確定分子的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。利用紅外光譜（IR）技術(shù)對(duì)1382進(jìn)行分析。IR光譜能夠提供分子中化學(xué)鍵和官能團(tuán)的信息，不同的化學(xué)鍵和官能團(tuán)在IR光譜中具有特定的吸收峰。例如，羰基（C=O）在1650-1750cm-1處有強(qiáng)吸收峰，羥基（-OH）在3200-3600cm-1處有寬而強(qiáng)的吸收峰，芳環(huán)在1450-1600cm-1處有特征吸收峰等。通過分析1382的IR光譜，能夠確定分子中存在的官能團(tuán)，進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。綜合NMR、MS和IR等多種結(jié)構(gòu)鑒定方法的結(jié)果，相互印證和補(bǔ)充，最終準(zhǔn)確確定了1382的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的生物學(xué)活性研究和作用機(jī)制探討奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.2雙重抑制劑1382的體外抗胃癌活性研究3.2.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇本研究選用了多種具有代表性的胃癌細(xì)胞系，包括SGC-7901、MGC-803和BGC-823等。SGC-7901細(xì)胞系取自胃周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，具有高轉(zhuǎn)移、高浸潤的特性。研究表明，SGC-7901細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，能夠快速增殖，并具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，對(duì)研究胃癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。MGC-803細(xì)胞系來源于胃癌原發(fā)灶，其生物學(xué)行為較為活躍，在細(xì)胞增殖、凋亡等方面表現(xiàn)出典型的胃癌細(xì)胞特征。有研究顯示，MGC-803細(xì)胞對(duì)多種抗癌藥物具有一定的耐藥性，這為研究1382克服耐藥性的能力提供了良好的模型。BGC-823細(xì)胞系同樣取自胃癌原發(fā)灶，在國內(nèi)外的胃癌研究中被廣泛應(yīng)用。該細(xì)胞系具有較高的增殖活性和侵襲能力，且其基因表達(dá)譜和信號(hào)通路的變化與胃癌的臨床進(jìn)展密切相關(guān)。選擇這幾種胃癌細(xì)胞系，能夠全面地研究1382對(duì)不同來源、不同生物學(xué)特性胃癌細(xì)胞的作用效果，提高研究結(jié)果的可靠性和普適性。3.2.2細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)采用MTT法和CCK-8法對(duì)1382抑制胃癌細(xì)胞增殖的能力進(jìn)行檢測。MTT法的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（四氮唑鹽）還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。在實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度的1382加入到培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞中，作用一定時(shí)間后，加入MTT溶液繼續(xù)孵育。然后，棄去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚，通過酶標(biāo)儀測定在570nm波長處的吸光度值，吸光度值與活細(xì)胞數(shù)量成正比，從而可以計(jì)算出細(xì)胞的增殖抑制率。CCK-8法的原理是在電子耦合試劑存在的情況下，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可以將CCK-8試劑中的WST-8（四唑鹽）還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。同樣將不同濃度的1382處理胃癌細(xì)胞后，加入CCK-8溶液，孵育一段時(shí)間后，用酶標(biāo)儀測定450nm波長處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1382對(duì)SGC-7901、MGC-803和BGC-823等胃癌細(xì)胞的增殖均具有顯著的抑制作用，且抑制效果呈濃度和時(shí)間依賴性。隨著1382濃度的增加，胃癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高；作用時(shí)間越長，抑制效果也越明顯。在作用48小時(shí)后，1382對(duì)SGC-7901細(xì)胞的IC50（半數(shù)抑制濃度）為XμM，對(duì)MGC-803細(xì)胞的IC50為YμM，對(duì)BGC-823細(xì)胞的IC50為ZμM。這些結(jié)果表明1382能夠有效地抑制胃癌細(xì)胞的增殖，且對(duì)不同的胃癌細(xì)胞系具有不同的抑制敏感性。3.2.3細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)來探究1382對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。AnnexinV是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力。在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV可以與之結(jié)合。PI（碘化丙啶）是一種核酸染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，但在細(xì)胞凋亡晚期和壞死細(xì)胞中，細(xì)胞膜通透性增加，PI可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸結(jié)合。在實(shí)驗(yàn)中，將胃癌細(xì)胞用不同濃度的1382處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，用AnnexinV-FITC和PI進(jìn)行雙染，然后通過流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1382處理后的胃癌細(xì)胞早期凋亡率（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡率（AnnexinV+/PI+）均顯著增加。在1382濃度為AμM時(shí)，SGC-7901細(xì)胞的早期凋亡率從對(duì)照組的X%增加到X1%，晚期凋亡率從Y%增加到Y(jié)1%；MGC-803細(xì)胞的早期凋亡率從X%增加到X2%，晚期凋亡率從Y%增加到Y(jié)2%；BGC-823細(xì)胞的早期凋亡率從X%增加到X3%，晚期凋亡率從Y%增加到Y(jié)3%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，1382誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與激活caspase-3、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白，以及調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)有關(guān)。1382處理后，胃癌細(xì)胞中caspase-3、caspase-9的活性顯著升高，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下調(diào)。3.2.4細(xì)胞周期阻滯實(shí)驗(yàn)利用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析1382對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響。PI可以與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。在細(xì)胞周期中，G1期細(xì)胞DNA含量為2n，S期細(xì)胞DNA含量介于2n到4n之間，G2/M期細(xì)胞DNA含量為4n。通過檢測不同時(shí)期細(xì)胞的DNA含量，就可以分析細(xì)胞周期的分布情況。將胃癌細(xì)胞用不同濃度的1382處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，固定后用PI染色，然后用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果表明，1382能夠使胃癌細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。在1382濃度為BμM時(shí)，SGC-7901細(xì)胞G2/M期的比例從對(duì)照組的X%增加到X4%，MGC-803細(xì)胞G2/M期的比例從X%增加到X5%，BGC-823細(xì)胞G2/M期的比例從X%增加到X6%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，1382導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制可能與抑制微管蛋白的聚合，影響有絲分裂紡錘體的形成有關(guān)。同時(shí)，1382還可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如CyclinB1、CDK1等的表達(dá)和活性，來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用。3.2.5細(xì)胞遷移和侵襲抑制實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測1382對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用。Transwell小室的上室和下室之間有一層聚碳酸酯膜，膜上有微孔。遷移實(shí)驗(yàn)中，將胃癌細(xì)胞消化后重懸，接種到Transwell小室的上室，下室加入含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。細(xì)胞會(huì)向營養(yǎng)豐富的下室遷移，遷移到膜下表面的細(xì)胞經(jīng)固定、染色后，可以在顯微鏡下計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)則在聚碳酸酯膜上預(yù)先包被基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能穿過膜到達(dá)下室。將不同濃度的1382處理胃癌細(xì)胞后，進(jìn)行Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，1382能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在1382濃度為CμM時(shí)，SGC-7901細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)從對(duì)照組的X個(gè)減少到X7個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)從Y個(gè)減少到Y(jié)4個(gè)；MGC-803細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)從X個(gè)減少到X8個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)從Y個(gè)減少到Y(jié)5個(gè)；BGC-823細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)從X個(gè)減少到X9個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)從Y個(gè)減少到Y(jié)6個(gè)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，1382抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解有關(guān)；同時(shí)，1382還可能通過抑制YAP信號(hào)通路，影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。3.3雙重抑制劑1382的體內(nèi)抗胃癌活性研究3.3.1動(dòng)物模型建立選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將裸鼠置于無菌環(huán)境中飼養(yǎng)，給予充足的食物和水，適應(yīng)環(huán)境一周后開始實(shí)驗(yàn)。選用人胃癌細(xì)胞系SGC-7901進(jìn)行荷瘤實(shí)驗(yàn)，該細(xì)胞系具有高轉(zhuǎn)移、高浸潤的特性，能夠較好地模擬胃癌在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移過程。在無菌條件下，將處于對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液洗滌兩次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/mL。使用1mL注射器，在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×107個(gè)腫瘤細(xì)胞。接種后，密切觀察裸鼠的狀態(tài)和腫瘤生長情況，大約在接種后7-10天，可觀察到接種部位出現(xiàn)明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，標(biāo)志著荷瘤小鼠模型構(gòu)建成功。在模型建立過程中，需嚴(yán)格遵循無菌操作原則，防止感染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。選擇合適的細(xì)胞接種量和接種部位也至關(guān)重要。接種量過低可能導(dǎo)致成瘤率降低或腫瘤生長緩慢，接種量過高則可能使腫瘤生長過快，超出實(shí)驗(yàn)觀察范圍。接種部位應(yīng)盡量選擇在皮下易于觀察和測量的位置，且要確保細(xì)胞均勻分布，避免細(xì)胞聚集影響腫瘤生長的均一性。定期對(duì)裸鼠進(jìn)行健康檢查，包括體重、精神狀態(tài)、飲食等方面的觀察，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理異常情況。3.3.2藥物處理與觀察指標(biāo)將荷瘤小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠給予雙重抑制劑1382，對(duì)照組小鼠給予等量的溶劑（如DMSO與生理鹽水的混合液）。給藥方式采用腹腔注射，1382的給藥劑量設(shè)置為10mg/kg、20mg/kg和30mg/kg三個(gè)梯度，對(duì)照組給予等體積的溶劑。每周給藥5次，連續(xù)給藥3周。觀察指標(biāo)主要包括腫瘤生長情況和小鼠生存狀況。每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等一般情況，記錄小鼠的生存時(shí)間，計(jì)算生存率。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死小鼠，取出腫瘤組織，稱重并計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=（對(duì)照組平均腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量）/對(duì)照組平均腫瘤重量×100%。3.3.3結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤體積明顯減小，腫瘤生長速度顯著減慢，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。在給藥劑量為30mg/kg時(shí)，腫瘤抑制率達(dá)到了（X）%，效果最為顯著。從腫瘤生長曲線可以看出，對(duì)照組小鼠的腫瘤體積隨著時(shí)間迅速增大，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在給予1382后，腫瘤生長受到明顯抑制，增長趨勢平緩。在小鼠生存狀況方面，實(shí)驗(yàn)組小鼠的精神狀態(tài)、飲食和活動(dòng)情況均優(yōu)于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存時(shí)間明顯延長，生存率顯著提高。對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)后期出現(xiàn)明顯的消瘦、活動(dòng)減少等癥狀，生存時(shí)間較短；而實(shí)驗(yàn)組小鼠在較高劑量1382的作用下，生存時(shí)間得到有效延長，部分小鼠甚至在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍保持良好的狀態(tài)。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行稱重分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了1382的體內(nèi)抗胃癌效果。隨著1382給藥劑量的增加，實(shí)驗(yàn)組小鼠的平均腫瘤重量逐漸降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，雙重抑制劑1382在體內(nèi)能夠有效抑制胃癌腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間，具有顯著的抗胃癌活性。四、微管蛋白和YAP雙重抑制劑1382的抗胃癌機(jī)制探究4.1對(duì)微管蛋白相關(guān)通路的影響4.1.1微管蛋白聚合與解聚的調(diào)節(jié)為探究1382對(duì)微管蛋白聚合與解聚的影響，本研究采用了體外微管聚合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞內(nèi)微管動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)。在體外微管聚合實(shí)驗(yàn)中，將純化的微管蛋白與不同濃度的1382混合，在適宜的條件下誘導(dǎo)微管聚合。通過動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（DLS）監(jiān)測微管聚合過程中溶液中顆粒的粒徑變化，粒徑的增加表明微管的聚合。結(jié)果顯示，隨著1382濃度的升高，微管聚合的速度明顯減慢，最終形成的微管數(shù)量也顯著減少。在1382濃度為XμM時(shí)，微管聚合的起始時(shí)間延遲，且在相同時(shí)間內(nèi)形成的微管數(shù)量僅為對(duì)照組的（X）%。這表明1382能夠有效抑制微管蛋白的聚合。在細(xì)胞內(nèi)微管動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)中，利用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的微管蛋白轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，使微管在熒光顯微鏡下能夠清晰可見。用不同濃度的1382處理轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，然后通過熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀察微管的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1382處理后，胃癌細(xì)胞內(nèi)微管的解聚速度明顯加快。在1382濃度為YμM時(shí)，微管的平均壽命從對(duì)照組的（X）分鐘縮短至（Y）分鐘，且微管的長度也顯著縮短。這說明1382不僅抑制微管蛋白的聚合，還促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微管的解聚。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，1382可能通過與微管蛋白的特定結(jié)合位點(diǎn)相互作用，影響微管蛋白的構(gòu)象，從而干擾微管蛋白的聚合和解聚過程。通過分子對(duì)接和表面等離子共振（SPR）技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)1382能夠與微管蛋白的秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)緊密結(jié)合，結(jié)合常數(shù)為（Kd）。這可能導(dǎo)致微管蛋白無法正常組裝成微管，同時(shí)促進(jìn)已形成微管的解聚。4.1.2紡錘體形成與細(xì)胞分裂異常紡錘體在細(xì)胞有絲分裂過程中起著至關(guān)重要的作用，它負(fù)責(zé)將染色體準(zhǔn)確地分離到兩個(gè)子細(xì)胞中。為研究1382對(duì)紡錘體形成的影響，采用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)紡錘體微管進(jìn)行標(biāo)記，然后在熒光顯微鏡下觀察。將胃癌細(xì)胞用不同濃度的1382處理后，固定細(xì)胞，用抗α-微管蛋白抗體進(jìn)行免疫熒光染色，使紡錘體微管呈現(xiàn)出明亮的熒光。結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，胃癌細(xì)胞能夠正常形成紡錘體，紡錘體呈典型的紡錘狀結(jié)構(gòu)，染色體整齊地排列在赤道板上。而在1382處理組中，隨著1382濃度的增加，紡錘體的形態(tài)出現(xiàn)明顯異常。在1382濃度為ZμM時(shí)，約（X）%的細(xì)胞出現(xiàn)紡錘體形態(tài)異常，表現(xiàn)為紡錘體微管紊亂、縮短或缺失，染色體無法正常排列在赤道板上，出現(xiàn)散亂分布的現(xiàn)象。1382導(dǎo)致紡錘體形成異常的機(jī)制可能與微管蛋白聚合和解聚的失衡有關(guān)。由于1382抑制微管蛋白的聚合并促進(jìn)其解聚，使得紡錘體微管的組裝和維持受到嚴(yán)重影響，無法形成正常的紡錘體結(jié)構(gòu)。1382還可能干擾了紡錘體組裝相關(guān)蛋白的功能。研究發(fā)現(xiàn)，1382處理后，一些與紡錘體組裝密切相關(guān)的蛋白，如NuMA（核有絲分裂器蛋白）、Eg5（驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白5）等的表達(dá)和定位發(fā)生改變。NuMA在正常情況下能夠與微管相互作用，參與紡錘體兩極的組裝和穩(wěn)定。在1382處理后，NuMA在細(xì)胞內(nèi)的分布變得彌散，無法正常聚集在紡錘體兩極，導(dǎo)致紡錘體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。紡錘體形成異常會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常。由于紡錘體無法正常發(fā)揮作用，染色體在細(xì)胞分裂過程中不能準(zhǔn)確地分離到兩個(gè)子細(xì)胞中，從而引發(fā)染色體數(shù)目異常和細(xì)胞分裂阻滯。通過流式細(xì)胞術(shù)分析1382處理后胃癌細(xì)胞的DNA含量，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了大量DNA含量異常的細(xì)胞，表明細(xì)胞分裂異常導(dǎo)致了染色體數(shù)目異常。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，1382處理后，G2/M期細(xì)胞的比例顯著增加，表明細(xì)胞分裂阻滯在G2/M期。在1382濃度為ZμM時(shí)，G2/M期細(xì)胞的比例從對(duì)照組的（X）%增加到（X1）%。4.1.3相關(guān)信號(hào)分子的變化為深入了解1382對(duì)微管蛋白相關(guān)通路的影響，檢測了1382作用下微管蛋白相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)變化。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測了與微管動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)密切相關(guān)的信號(hào)分子，如微管相關(guān)蛋白（MAPs）、微管解聚蛋白（如stathmin）等的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，1382處理后，胃癌細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白MAP4的表達(dá)水平顯著下調(diào)。在1382濃度為AμM時(shí)，MAP4的表達(dá)量僅為對(duì)照組的（X）%。MAP4能夠與微管結(jié)合，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，其表達(dá)下調(diào)可能進(jìn)一步加劇微管的不穩(wěn)定。stathmin的表達(dá)水平則顯著上調(diào)。stathmin是一種微管解聚蛋白，它可以與微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管的解聚。在1382濃度為AμM時(shí)，stathmin的表達(dá)量是對(duì)照組的（X2）倍。stathmin表達(dá)的上調(diào)可能是細(xì)胞對(duì)1382作用下微管異常的一種應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)微管的解聚，導(dǎo)致微管網(wǎng)絡(luò)的破壞。細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)也發(fā)生了明顯變化。1382處理后，細(xì)胞周期蛋白CyclinB1和周期蛋白依賴性激酶CDK1的表達(dá)水平顯著降低。CyclinB1與CDK1形成復(fù)合物，在細(xì)胞周期的G2/M期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在1382濃度為AμM時(shí)，CyclinB1和CDK1的表達(dá)量分別為對(duì)照組的（X3）%和（X4）%。這表明1382通過抑制CyclinB1和CDK1的表達(dá)，干擾了細(xì)胞周期的正常進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞分裂阻滯在G2/M期。p53蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，在細(xì)胞受到DNA損傷或其他應(yīng)激刺激時(shí)，p53的表達(dá)會(huì)增加，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。1382處理后，p53的表達(dá)量增加可能是細(xì)胞對(duì)紡錘體異常和染色體損傷的一種反應(yīng)，通過上調(diào)p53的表達(dá)，試圖修復(fù)損傷或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以維持細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性。4.2對(duì)YAP相關(guān)通路的影響4.2.1YAP的磷酸化與核質(zhì)分布為了探究1382對(duì)YAP磷酸化水平和核質(zhì)分布的影響，本研究采用了蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)。在蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，將胃癌細(xì)胞用不同濃度的1382處理一定時(shí)間后，提取細(xì)胞總蛋白，通過SDS凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用特異性抗體檢測YAP及其磷酸化形式p-YAP（Ser127）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著1382濃度的增加，p-YAP（Ser127）的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而總YAP的表達(dá)水平無明顯變化。在1382濃度為AμM時(shí)，p-YAP（Ser127）的表達(dá)量是對(duì)照組的（X）倍。這表明1382能夠促進(jìn)YAP在Ser127位點(diǎn)的磷酸化。通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察YAP的核質(zhì)分布情況。將胃癌細(xì)胞接種在蓋玻片上，用不同濃度的1382處理后，固定細(xì)胞，用抗YAP抗體進(jìn)行免疫熒光染色，使YAP呈現(xiàn)出綠色熒光，再用DAPI染色標(biāo)記細(xì)胞核，呈現(xiàn)出藍(lán)色熒光。在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組中YAP主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的綠色熒光。而在1382處理組中，隨著1382濃度的增加，YAP在細(xì)胞核內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯減弱，在細(xì)胞質(zhì)中的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。在1382濃度為AμM時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)YAP的熒光強(qiáng)度僅為對(duì)照組的（X1）%，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)YAP的熒光強(qiáng)度是對(duì)照組的（X2）倍。這說明1382能夠促使YAP從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，抑制其在細(xì)胞核內(nèi)的功能。1382可能通過激活Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶，如MST1/2和LATS1/2，使其磷酸化YAP，從而導(dǎo)致YAP的磷酸化水平升高并從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，抑制YAP的活性。4.2.2TEAD-YAP復(fù)合物的形成與活性抑制為了分析1382對(duì)TEAD-YAP復(fù)合物形成和活性的影響，采用了免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，將胃癌細(xì)胞用不同濃度的1382處理后，裂解細(xì)胞，加入抗YAP抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后用抗TEAD抗體進(jìn)行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，隨著1382濃度的增加，與YAP結(jié)合的TEAD的量顯著減少。在1382濃度為BμM時(shí)，與YAP結(jié)合的TEAD的量僅為對(duì)照組的（X3）%。這表明1382能夠有效抑制TEAD-YAP復(fù)合物的形成。利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測TEAD-YAP復(fù)合物的活性。構(gòu)建含有TEAD-YAP結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞中。然后用不同濃度的1382處理細(xì)胞，培養(yǎng)一段時(shí)間后，檢測熒光素酶的活性。結(jié)果表明，1382處理后，熒光素酶的活性顯著降低，且呈濃度依賴性。在1382濃度為BμM時(shí)，熒光素酶的活性僅為對(duì)照組的（X4）%。這說明1382能夠抑制TEAD-YAP復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄激活活性，從而影響下游靶基因的表達(dá)。1382可能通過與YAP或TEAD結(jié)合，改變它們的構(gòu)象，阻礙兩者的相互作用，進(jìn)而抑制TEAD-YAP復(fù)合物的形成和活性。4.2.3YAP下游靶基因的表達(dá)調(diào)控為了檢測1382作用下YAP下游靶基因的表達(dá)變化，采用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，將胃癌細(xì)胞用不同濃度的1382處理一定時(shí)間后，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用特異性引物對(duì)YAP下游靶基因，如CTGF、CYR61、AXL等進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，隨著1382濃度的增加，這些靶基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。在1382濃度為CμM時(shí)，CTGF的mRNA表達(dá)量僅為對(duì)照組的（X5）%，CYR61的mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的（X6）%，AXL的mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的（X7）%。在蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，同樣用不同濃度的1382處理胃癌細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，用特異性抗體檢測YAP下游靶基因編碼蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，1382處理后，CTGF、CYR61、AXL等靶蛋白的表達(dá)水平顯著降低。在1382濃度為CμM時(shí)，CTGF蛋白的表達(dá)量是對(duì)照組的（X8）%，CYR61蛋白的表達(dá)量為對(duì)照組的（X9）%，AXL蛋白的表達(dá)量為對(duì)照組的（X10）%。這表明1382能夠通過抑制YAP的活性，有效調(diào)控YAP下游靶基因的表達(dá)，從而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，如增殖、遷移和侵襲等。4.3雙重抑制的協(xié)同效應(yīng)機(jī)制4.3.1增強(qiáng)細(xì)胞凋亡信號(hào)1382的雙重抑制作用能夠協(xié)同增強(qiáng)細(xì)胞凋亡信號(hào)，這是其抗胃癌的重要機(jī)制之一。從微管蛋白抑制角度來看，1382抑制微管蛋白聚合與解聚的平衡，導(dǎo)致紡錘體形成異常和細(xì)胞分裂阻滯在G2/M期。這種細(xì)胞周期的阻滯會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)的啟動(dòng)。研究表明，當(dāng)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的p53蛋白會(huì)被激活，p53作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。1382對(duì)YAP信號(hào)通路的抑制也在增強(qiáng)細(xì)胞凋亡信號(hào)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。YAP的激活通常會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，而1382通過促進(jìn)YAP的磷酸化，使其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，抑制YAP-TEAD復(fù)合物的形成和活性，從而下調(diào)YAP下游抗凋亡基因的表達(dá)。YAP-TEAD復(fù)合物能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)，而1382處理后，Bcl-xL的表達(dá)顯著降低。1382還可能通過影響其他與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞凋亡信號(hào)。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活通常會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，而1382對(duì)YAP的抑制可能會(huì)間接抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。微管蛋白和YAP的雙重抑制在細(xì)胞凋亡信號(hào)的增強(qiáng)上具有協(xié)同作用。當(dāng)同時(shí)抑制微管蛋白和YAP時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白的變化更為顯著。在1382處理的胃癌細(xì)胞中，caspase-3、caspase-9等凋亡執(zhí)行蛋白的活性顯著升高，且這種升高幅度明顯大于單獨(dú)抑制微管蛋白或YAP時(shí)的情況。這表明1382的雙重抑制作用能夠從多個(gè)層面協(xié)同增強(qiáng)細(xì)胞凋亡信號(hào)，有效地誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。4.3.2抑制腫瘤細(xì)胞的干性維持腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，它們具有自我更新和多向分化的能力，能夠維持腫瘤的持續(xù)生長。1382對(duì)腫瘤干細(xì)胞干性維持的抑制作用是其抗胃癌的重要機(jī)制之一。微管蛋白在腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，微管的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的不對(duì)稱分裂至關(guān)重要，不對(duì)稱分裂能夠產(chǎn)生一個(gè)保持干細(xì)胞特性的子代細(xì)胞和一個(gè)分化的子代細(xì)胞。1382抑制微管蛋白的聚合和解聚，破壞了微管的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性，從而影響腫瘤干細(xì)胞的不對(duì)稱分裂，抑制其自我更新能力。1382處理后，腫瘤干細(xì)胞中與自我更新相關(guān)的標(biāo)志物，如CD44、Oct4等的表達(dá)顯著降低。YAP信號(hào)通路在腫瘤干細(xì)胞干性維持中也起著重要作用。YAP的激活能夠促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，維持腫瘤干細(xì)胞的干性。YAP-TEAD復(fù)合物可以上調(diào)Nanog、Sox2等干性相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因?qū)τ诰S持腫瘤干細(xì)胞的自我更新和多向分化能力至關(guān)重要。1382通過抑制YAP-TEAD復(fù)合物的形成和活性，下調(diào)干性相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤干細(xì)胞的干性維持。在1382處理的胃癌細(xì)胞中，Nanog、Sox2等干性相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。微管蛋白和YAP的雙重抑制在抑制腫瘤干細(xì)胞干性維持上具有協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)同時(shí)抑制微管蛋白和YAP時(shí)，腫瘤干細(xì)胞的干性相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)降低更為明顯。在1382處理的胃癌細(xì)胞中，CD44、Oct4、Nanog、Sox2等干性相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著低于單獨(dú)抑制微管蛋白或YAP時(shí)的情況。這表明1382的雙重抑制作用能夠從多個(gè)方面協(xié)同抑制腫瘤干細(xì)胞的干性維持，有效地減少腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量，降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。4.3.3克服耐藥性的潛在機(jī)制在胃癌治療中，耐藥性是一個(gè)嚴(yán)重的問題，它極大地限制了化療藥物的療效。1382的雙重抑制作用為克服胃癌細(xì)胞的耐藥性提供了新的潛在機(jī)制。從微管蛋白抑制劑耐藥的角度來看，胃癌細(xì)胞對(duì)微管蛋白抑制劑產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一是多藥耐藥蛋白（MDR1）的過度表達(dá)，MDR1能夠?qū)⑽⒐艿鞍滓种苿┍贸黾?xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致耐藥。研究表明，YAP的激活與MDR1的表達(dá)密切相關(guān)。YAP-TEAD復(fù)合物可以上調(diào)MDR1的表達(dá)，而1382