尼帕病毒實驗室檢測技術方案

（2021版）演講人：醫(yī)學生文獻學習概述01一、病毒基礎信息分類：副粘病毒科

亨尼帕病毒屬，單血清型，分M亞型（馬來西亞亞型）、B亞型（孟加拉亞型）。形態(tài)結構：病毒顆粒多形性，直徑150-300nm外層為脂蛋白包膜，核衣殼螺旋對稱?；蚪M：單股負鏈RNA，全長約18.2kb。二、實驗室檢測方法及生物安全要求實驗室檢測方法包括病毒核酸檢測、抗體檢測（IgM、IgG、中和抗體等）、病毒分離。生物安全要求病毒分離培養(yǎng)：需在生物安全四級（BSL-4）實驗室進行。樣本檢測：采集的病毒相關樣本，需在生物安全三級（BSL-3）實驗室滅活后，方可開展檢測。檢測對象02檢測對象疑似病例、確診病例及其密切接觸者。涉疫地區(qū)的媒介生物（果蝠、豬等）和食品（豬肉制品、水果蔬菜等）；原產(chǎn)地近期涉疫的進口食品（豬肉制品、水果蔬菜等）。技術人員基本要求03一、采樣人員需經(jīng)生物安全培訓并合格。熟悉標本種類、采集方法，熟練掌握采集操作流程及注意事項。規(guī)范記錄標本信息，確保標本質(zhì)量達標、標本及相關信息可追溯。二、檢測人員需經(jīng)生物安全培訓并合格。熟悉標本種類、標本處理流程及對應檢測技術。能及時、熟練完成實驗及結果報告，保障結果準確性。標本采集、保存和運輸04一、病例標本采集腦脊液標本采集：臨床醫(yī)師無菌腰椎穿刺抽取，留取于3支無菌試管，每管1～2ml。保存與用途：裝入帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的凍存管，標記清晰后低溫保存1管用于本地/本省BSL-3實驗室檢測，2管供上級疾控機構復核。一、病例標本采集血液標本采集：臨床醫(yī)師用無菌真空干燥管，采集3管非抗凝血（每管5ml）盡可能采集雙份，間隔14天為宜，住院病例可于入院當天和出院前1天各采1份。保存與用途：標記后立即4～8℃暫存，血清析出后轉(zhuǎn)入-20～-80℃凍存1管用于本地/本省BSL-3實驗室檢測，2管供上級疾控機構復核。一、病例標本采集鼻拭子、咽拭子采集：采樣人員按標準操作，為被采集者采集3份樣本。保存與用途：分別放入帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈且含2～3ml病毒保存液的采集管1管用于本地/本省BSL-3實驗室檢測，2管供上級疾控機構復核。一、病例標本采集尿液標本采集：采集15ml尿液，分裝3管（每管5ml）。保存與用途：裝入帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的無菌15ml離心管1管用于本地/本省BSL-3實驗室檢測，2管供上級疾控機構復核。二、果蝠、豬、進口食品標本采集采集對象及樣本：疫區(qū)果蝠的唾液、尿液疫區(qū)養(yǎng)殖場生豬的鼻-咽拭子、血清疫區(qū)進口冷凍豬肉制品、水果蔬菜的表面。記錄與分裝：填寫媒介標本采集信息表，按采集地點、種類分裝。三、標本保存、運送保存：24小時內(nèi)可檢測的標本置于2～8℃冰箱無法及時檢測的盡快放入-20～-80℃冰箱。運送：低溫冷藏運輸，避免凍融，嚴格遵守國家一類病原體生物安全運輸規(guī)定。實驗室資質(zhì)要求05一、實驗室資質(zhì)要求酸檢測實驗室需符合《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務院令第424號）、《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）規(guī)定。具備衛(wèi)生健康行政部門審核備案的BSL-3及以上實驗室條件，同時滿足臨床基因擴增檢驗實驗室條件。獨立設置的醫(yī)學檢驗實驗室，還需符合《醫(yī)學檢驗實驗室基本標準（試行）》《醫(yī)學檢驗實驗室管理規(guī)范（試行）》等要求。二、實驗室分區(qū)要求核心分區(qū)（物理空間完全獨立、無空氣直接相通）及功能試劑儲存和準備區(qū)：試劑制備、分裝，擴增反應混合液制備，離心管、吸頭等消耗品貯存與準備。標本制備區(qū)：轉(zhuǎn)運桶開啟、標本滅活、核酸提取及加入擴增反應管。擴增和產(chǎn)物分析區(qū)：核酸擴增、產(chǎn)物分析。區(qū)域合并原則：使用標本處理、核酸提取及擴增檢測一體化自動化分析儀時，可合并標本制備區(qū)與擴增和產(chǎn)物分析區(qū)。三、主要儀器設備需配備與檢驗項目適配的設備，包括核酸提取儀、醫(yī)用PCR擴增儀、生物安全柜、病毒滅活設備（如水浴鍋）、試劑及標本保存用冰箱/冰柜、離心機等。實驗室檢測方法06一、核酸檢測試劑準備試劑盒選擇：優(yōu)先選用國家藥品監(jiān)督管理部門批準試劑盒（國內(nèi)暫無），或參考國際通用尼帕病毒實驗室檢測方法配套要求：標本保存液、核酸提取試劑，需使用試劑盒說明書建議的配套試劑關鍵注意事項：核酸提取方法與標本保存液、滅活方式相關磁珠法、一步法提取試劑易受胍鹽或保存液特殊成分影響，其中一步法需搭配試劑廠家配套標本保存液一、核酸檢測標本前處理含胍鹽滅活型標本保存液：無需額外滅活，直接開展核酸提取非滅活型標本保存液：需進行滅活處理，可選56℃孵育30分鐘熱滅活，或采用化學滅活方式核酸提取操作環(huán)境：全程在生物安全柜內(nèi)進行操作步驟：取出滅活后標本，打開標本采集管加樣核酸提取完成后，立即對提取物封蓋隨后將提取核酸加入核酸檢測反應體系一、核酸檢測適用范圍：各類臨床標本、環(huán)境標本推薦機構：世界動物衛(wèi)生組織（WorldOrganisationforAnimalHealth，OIE）；檢測原理：TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法靶基因：尼帕病毒N基因核酸檢測方法一（實時熒光定量RT-PCR方法）一、核酸檢測引物、探針序列核酸檢測方法一（實時熒光定量RT-PCR方法）表1尼帕病毒實時熒光定量RT-PCR引物及探針信息檢測名稱引物/探針類型序列（5'—3'）NiV_TQM_N上游引物TCA-GCA-GGA-AGG-CAA-GAG-AGT-AA下游引物CCC-CTT-CAT-CGA-TAT-CTT-GAT-CA熒光探針FAM-CCT-CCA-ATG-AGC-ACA-CCT-CCT-GCA-G-TAMRA一、核酸檢測反應條件以QIAGEN公司OneStepRT-PCR試劑盒為例，反應體系與反應程序如下，每次檢測需同步配制陽性對照、陰性對照作為質(zhì)控核酸檢測方法一（實時熒光定量RT-PCR方法）尼帕病毒實時熒光定量RT-PCR反應體系（1）試劑類型工作濃度體積5×OneStepRT-PCRBuffer5×5μLdNTPMix每種dNTP各10mM1μLOneStepRT-PCREnzymeMix------1μL上游引物10μM1μL下游引物10μM1μL探針5μM1μL待測樣本核酸/陽性對照/陰性對照------1～5μL無核酶水------補至25μL總體積25μL一、核酸檢測反應條件以QIAGEN公司OneStepRT-PCR試劑盒為例，反應體系與反應程序如下，每次檢測需同步配制陽性對照、陰性對照作為質(zhì)控核酸檢測方法一（實時熒光定量RT-PCR方法）尼帕病毒實時熒光定量RT-PCR反應程序（1）步驟反應條件循環(huán)數(shù)1.反轉(zhuǎn)錄階段（ReverseTranscription）50℃,30分鐘；95℃,15分鐘無循環(huán)2.擴增階段（PolymeraseChainReaction）95℃,30秒；55℃,30秒；72℃,60秒（讀取熒光信號）40循環(huán)一、核酸檢測檢測結果判讀檢測有效性判讀（需同時滿足）：①

陽性對照Ct值<35②

陰性對照無Ct值（無擴增曲線）任一條件不滿足，結果無效待測標本結果判讀：①Ct值<35→尼帕病毒陽性②Ct值>38→尼帕病毒陰性③35≤Ct值≤38→重新提取核酸復核核酸檢測方法一（實時熒光定量RT-PCR方法）一、核酸檢測適用范圍：各類臨床標本、環(huán)境標本推薦機構：中國疾病預防控制中心檢測原理：TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法靶基因：尼帕病毒N基因核酸檢測方法二（實時熒光定量RT-PCR方法）一、核酸檢測引物、探針序列核酸檢測方法二（實時熒光定量RT-PCR方法）表1尼帕病毒實時熒光定量RT-PCR引物及探針信息檢測名稱引物/探針類型序列（5'—3'）NiV_TQM_N上游引物GAACTAACATTRTTTGCACTTGATGTG下游引物GTGTAAAAGCAGCTCCAACTTTC熒光探針HEX-ATCTCCGAGTGCWGCCGAGTCAA-BHQ1一、核酸檢測反應條件以Thermo公司TaqPath?1-StepMultiplexMasterMix試劑盒為例，反應體系與反應程序如下，每次檢測需同步配制陽性對照、陰性對照作為質(zhì)控核酸檢測方法二（實時熒光定量RT-PCR方法）尼帕病毒實時熒光定量RT-PCR反應體系（2）試劑類型工作濃度體積4×TaqPath?1-StepMultiplexMasterMix4×5μL上游引物10μM1μL下游引物10μM1μL探針5μM1μL待測樣本核酸/陽性對照/陰性對照------1～5μL無核酶水------補至20μL總體積20μL一、核酸檢測反應條件以Thermo公司TaqPath?1-StepMultiplexMasterMix試劑盒為例，反應體系與反應程序如下，每次檢測需同步配制陽性對照、陰性對照作為質(zhì)控核酸檢測方法二（實時熒光定量RT-PCR方法）尼帕病毒實時熒光定量RT-PCR反應程序（2）步驟反應條件循環(huán)數(shù)1.反轉(zhuǎn)錄階段（ReverseTranscription）25℃,2分鐘50℃,10分鐘95℃,2分鐘無循環(huán)2.擴增階段（PolymeraseChainReaction）95℃,15秒60℃,60秒（讀取熒光信號）40循環(huán)一、核酸檢測檢測結果判讀檢測有效性判讀（需同時滿足）：①

陽性對照Ct值<35②

陰性對照無Ct值（無擴增曲線）任一條件不滿足，結果無效待測標本結果判讀：①Ct值<35→

尼帕病毒陽性②Ct值>38→

尼帕病毒陰性③35≤Ct值≤38→

重新提取核酸復核核酸檢測方法二（實時熒光定量RT-PCR方法）二、血清學檢測方法核心問題：尼帕病毒與亨尼帕毒屬其他病毒（如亨德拉病毒）存在血清學交叉反應，易導致假陽性結果試劑盒現(xiàn)狀：目前無商業(yè)化血清學檢測試劑盒三、病毒分離核心地位：病毒核酸陽性標本需做病毒分離分離出尼帕病毒是本病感染的確證性指標適用標本（包括但不限于）人體標本：血清、腦脊液、鼻拭子、咽拭子、尿液、腦組織病豬標本：肺、腎等組織三、病毒分離標本前處理（按標本類型區(qū)分）組織標本：稱重后，按重量/體積比（W/V）=10，加10倍體積磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻，組織研磨器勻漿破碎血清標本：加10倍體積磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋其他體液標本：無需特殊處理三、病毒分離分離培養(yǎng)流程標本過濾：處理后標本經(jīng)0.22μm無菌濾器過濾接種培養(yǎng)：常規(guī)接種至Vero細胞培養(yǎng)病毒獲取：細胞發(fā)生病變形成合胞體時，即可獲得病毒三、病毒分離病毒分離相關補充已成功分離部位：腦脊液、尿液、鼻咽腔分泌物；不同部位分離病毒基因組特征一致生物安全要求：尼帕病毒毒力高、傳染性強，所有病毒培養(yǎng)及擴增相關實驗，均需在生物安全4級實驗室（BSL-4）

內(nèi)開展生物安全07生物安全病毒危害程度分類：依據(jù)我國《人間傳染的病原微生物名錄》，尼帕病毒危害程度屬第一類實驗室操作生物安全級別要求（按操作材料分類）病毒分離、培養(yǎng)等涉及活病毒的操作：生物安全四級實驗室（BSL-4）未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料操作：生物安全三級實驗室（BSL-3）滅活材料操作：生物安全二級實驗室（BSL-2）無感染性材料操作：生物安全一級實驗室（BSL-1）活病毒動物實驗：動物生物安全四級