ICS65.020.20DB14DB14/T1177—2016大田轉(zhuǎn)基因棉花外源序列PCR檢測規(guī)程2016-03-30發(fā)布2016-05-30實施山西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB14/T1177—2016前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14試劑儀器材料 25樣品DNA提取 26PCR檢測基因 47PCR反應(yīng)程序及電泳檢測 48樣品分析結(jié)果 59檢測檔案記錄 5附錄A（規(guī)范性附錄）檢測引物 6附錄B（資料性附錄）轉(zhuǎn)基因棉花檢測鑒定結(jié)果 7DB14/T1177—2016前□□言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所、運城學(xué)院、山西三聯(lián)現(xiàn)代種業(yè)科技有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：馬燕斌、張樹偉、王霞、王新勝、吳霞、李燕娥、張相斌、楊帆、邵新勝、韓青龍、馬紀(jì)農(nóng)。DB14/T1177—20161大田轉(zhuǎn)基因棉花外源序列PCR檢測規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大田轉(zhuǎn)基因棉花外源序列PCR檢測的術(shù)語和定義、試劑儀器材料、樣品DNA提取、PCR檢測基因及序列、PCR反應(yīng)程序及電泳檢測、樣品分析結(jié)果以及檢測檔案記錄。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大田種植的山西省審定棉花品種中轉(zhuǎn)外源序列相關(guān)成份的檢測鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4407.1經(jīng)濟作物種子第1部分：纖維類NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求NY/T673轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣NY/T1297農(nóng)作物品種審定規(guī)范棉花NY/T2162棉花抗棉鈴蟲性鑒定方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1轉(zhuǎn)基因棉花棉花自然遺傳存在的基因組序列除外，另包含有經(jīng)人工分離或修飾的基因序列，該序列是通過生物技術(shù)手段導(dǎo)入并整合到棉花基因組中，以控制某一功能或性狀發(fā)生為目的，最終導(dǎo)致棉花基因組序列發(fā)生變化的棉花植株、棉花種子及作為親本遺傳產(chǎn)生的后代。3.2外源基因在轉(zhuǎn)基因棉花中，棉花自然遺傳進化存在的基因除外，包含有經(jīng)過生物技術(shù)手段導(dǎo)入的、人工分離修飾得到的基因序列，統(tǒng)稱為外源基因。經(jīng)人工分離修飾基因來源可包括棉花在內(nèi)的任何生物，該基因通常以控制某一功能或性狀發(fā)生。3.3外源序列DB14/T1177—20162在轉(zhuǎn)基因棉花中，棉花自然遺傳進化存在的基因組核苷酸序列除外，包含有經(jīng)過生物技術(shù)手段導(dǎo)入的、人工分離修飾得到的基因組核苷酸序列，統(tǒng)稱為外源序列，該人工分離修飾基因組核苷酸序列可包括棉花在內(nèi)的任何生物。通常包括有基因、調(diào)控基因表達的啟動子、終止子、相關(guān)的常規(guī)調(diào)控序列區(qū)域以及非功能序列組成等。3.4內(nèi)標(biāo)基因Sad1Stearoyl-acylcarrierproteindesaturase英文的縮寫，指棉花自然遺傳存在的基因序列，編碼棉花硬脂-酰基載體蛋白脫飽和酶的基因。3.5PCRPolymeraseChainReaction英文的縮寫，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；是一種基于DNA雙螺旋分子的特點，利用核苷酸擴增儀通過一個包括DNA序列變性、退火引物與模板鏈結(jié)合、目標(biāo)序列延伸的不斷循環(huán)的過程來特定擴增目標(biāo)DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。4試劑儀器材料4.1試劑4.1.1DNA提取及電泳常規(guī)用試劑葡萄糖、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巰基乙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、鹽酸（Hcl）、瓊脂糖4.1.2PCR擴增常規(guī)試劑Taq酶、dNTP、loadingbuffer4.2儀器電子稱、移液槍、高速離心機、水浴鍋、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、振蕩器4.3材料待檢測的棉花材料；陰性對照非轉(zhuǎn)基因棉花樣本，陽性對照為轉(zhuǎn)基因棉花樣本。取樣標(biāo)準(zhǔn)為新生頂端幼嫩新葉0.2g～0.4g，取樣后按名稱標(biāo)記，冰上保存，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?樣品DNA提取5.1棉花DNA提取液配制5.1.11mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（pH8.0）稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷溶解于800mL純凈水中，用濃鹽酸溶液調(diào)pH值至8.0，用純凈水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃條件下，滅菌15min，常溫儲存?zhèn)溆?。DB14/T1177—201635.1.20.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）稱取18.61g乙二胺四乙酸二鈉溶解于800mL純凈水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，用純凈水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃條件下，滅菌15min，常溫儲存?zhèn)溆谩?.1.310%聚乙烯吡咯烷酮溶液稱取100g聚乙烯吡咯烷酮溶解于800mL純凈水中，定容至1000mL，在103.4kPa、121℃條件下，滅菌15min，常溫儲存?zhèn)溆谩?.1.4DNA提取緩沖液稱取69.36g葡萄糖于1L燒杯，加500mL純凈水，充分溶解后，加入100mL1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液，10mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液，200mL10%聚乙烯吡咯烷酮溶液，10mLβ-巰基乙醇，充分混勻，用純凈水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃條件下，滅菌15min，常溫儲存?zhèn)溆谩?.2棉花裂解緩沖液配方5.2.11mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（pH8.0）稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL純凈水中，用濃鹽酸溶液調(diào)pH值至8.0，用純凈水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃條件下，滅菌15min，常溫儲存?zhèn)溆谩?.2.20.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）稱取18.61g乙二胺四乙酸二鈉溶解于800mL純凈水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，用純凈水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃條件下，滅菌15min，常溫儲存?zhèn)溆谩?.2.310%十六烷基三甲基溴化銨溶液稱取100g十六烷基三甲基溴化銨，溶解于800mL純凈水，加熱促進溶解，加純凈水定容到1000mL，室溫保存。5.2.410%聚乙烯吡咯烷酮溶液稱取100g聚乙烯吡咯烷酮溶解于800mL純凈水中，定容至1000mL，在103.4kPa、121℃條件下，滅菌15min，常溫儲存?zhèn)溆谩?.2.5裂解緩沖液稱取81.8g氯化鈉于1L燒杯，加300mL純凈水，充分溶解后，加入1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液100mL，0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液40mL，10%十六烷基三甲基溴化銨溶液200mL，10%聚乙烯吡咯烷酮溶液200mL，β-巰基乙醇10mL，充分混勻，用純凈水定容至1000mL，在103.4kPa、121℃條件下，滅菌15min，常溫儲存?zhèn)溆?。使用前?:100加入β-巰基乙醇。5.3DNA提取5.3.1取樣取植株嫩葉0.1g～0.2g，加入預(yù)冷的新鮮配制的提取緩沖液300μL，研磨。4℃5000rpm離心20min，棄上清液。DB14/T1177—201645.3.2裂解沉淀中加入300μL65℃預(yù)熱裂解緩沖液，65℃水浴30min，期間翻轉(zhuǎn)混勻2～3次。5.3.3去除蛋白加入24:1的氯仿∶異戊醇混合液400μL，緩慢翻轉(zhuǎn)30次以上，泛白即可，8000rpm離心15min～20min，將上清液轉(zhuǎn)入1.5mL的干凈離心管中，加0.6體積的預(yù)冷的異丙醇，翻轉(zhuǎn)20次以上，混勻，靜置10min左右，8000rpm轉(zhuǎn)速，室溫離心10分鐘，棄上清液。5.3.4洗滌在沉淀中加入1mL70%的乙醇，輕微振蕩，1,000rpm離心2min。倒掉上清液，通風(fēng)干燥約10min5.3.5溶解加30μLTE緩沖液，溶解DNA，并保存。5.4電泳緩沖液的配制TAE電泳緩沖液配制：稱取242.2gTris，用300mL蒸餾水加熱攪拌溶解，加100mLNa2EDTA·2H2O(pH8.0，500mmol/L)，用冰乙酸調(diào)至pH8.0，加水定容至1000mL。使用時用蒸餾水稀釋成50倍體積的TAE。6PCR檢測基因6.2NPTII基因的檢測NPTII基因為抗抗卡納霉素基因。引物見附錄A。6.3抗蟲基因的檢測抗蟲基因檢測是對編碼Bt蛋白的外源cry1Ac基因或cry1Ab基因,或者是由cry1Ac和cry1Ab融合的基因進行PCR檢測。引物見附錄A。6.4調(diào)控元件的檢測包括CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、NOS啟動子、NOS終止子和CaMV35S終止子等植物轉(zhuǎn)化載體中必要組成型序列的檢測。引物見附錄A。7PCR反應(yīng)程序及電泳檢測7.1PCR對照設(shè)置在試樣PCR反應(yīng)的同時，應(yīng)設(shè)置空白對照、陰性對照和陽性對照。根據(jù)檢測目的，以非轉(zhuǎn)基因棉花組織提取的DNA作為陰性對照，已檢測的轉(zhuǎn)基因棉花為陽性對照、以去離子水作為空白對照。DB14/T1177—201657.2PCR反應(yīng)程序在PCR反應(yīng)管中配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系30μL:2×GCbuffer15μL（使用10×buffer3μL，調(diào)整ddH2O補足30μL）、dNTPMix0.5μL、引物各0.5μL、ExTaq酶0.1μL、模板DNA0.5μL、去離子水補足30μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸45s；循環(huán)5次；94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸45s，循環(huán)25次；最后72℃延伸10min，12℃保存。每個樣品PCR反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。7.3電泳檢測7.3.1凝膠配制配制0.8%～1%瓊脂糖凝膠。稱取0.8g～1g的瓊脂糖，放入三角瓶中，微波加熱溶化后，制成凝膠板待用。7.3.2加樣PCR擴增完成后，每一PCR管中加入3.3μL～4μLloadingbuffer,移液槍吸取加樣，220V電壓，電泳8min～10min。操作過程戴一次性PE手套防護,預(yù)防EB污染。7.3.3凝膠成像分析電泳結(jié)束后，取出凝膠，在凝膠成像儀中觀測。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估計擴增條帶大小，將電泳結(jié)果拍照形成電子文件存檔。如需通過序列分析確認(rèn)PCR擴增片段是否為目標(biāo)DNA片段，可通過凝膠回收片段克隆測序后與序列進行比對。凝膠回收按試劑盒說明進行。8樣品分析結(jié)果PCR擴增結(jié)果條帶大小與引物擴增目標(biāo)大小一致，表明可檢測到目標(biāo)條帶；PCR擴增結(jié)果條帶大小與引物擴增目標(biāo)大小不一致，表明不能檢測到目標(biāo)條帶。結(jié)果記錄參見附錄B。9檢測檔案記錄應(yīng)詳細(xì)記錄植株名稱、田間檢測、DNA檢測、凝膠電泳等檢測結(jié)果，并建立檔案。檢測記錄格式及參見附錄B。DB14/T1177—20166 檢測引物表A.1給出了PCR檢測引物。表A.1引物列表擴增目標(biāo)序列擴增片段大小棉花內(nèi)標(biāo)基因Sad1正向引物Sad-F15’-TGGCCTCTAATCATTGTTATGATG-3’282bpSadt-R15’-TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC-3’NptII基因Npt-F685’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’289bpNpt-R3565’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’Bt基因正向引物Bt-F15’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’301bp反向引物Bt-R15’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’CaMV35S啟動子正向引物35S-F15’-GCTCCYACAAATGCCATCATTGC-3’反向引物35S-R15’-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3’FMV35S啟動子FMVS-F15’-AAGACATCCACCGAAGACTTA-3’210bpFMV-R15’-AGGACAGCTCTTTTCCACGTT-3’NOS啟動子PNOS-F15’-GCCGTTTTACGTTTGGAACTG-3’PNOS-R15’-TTATGGAACGTCAGTGGAGC-3’NOS終止