南方水稻黑條矮縮病毒檢測方法2014-10-21發(fā)布2014-11-20實施湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I Ⅱ 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 15檢測方法 2 25.2儀器設(shè)備 25.3操作程序 26檢測后樣品的處理 4附錄A(規(guī)范性附錄)相關(guān)試劑配制 5附錄B(資料性附錄)南方水稻黑條矮縮病毒侵染水稻典型癥狀 6附錄C(規(guī)范性附錄)RT-PCR電泳圖 7Ⅱ本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省植物保護(hù)研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省植物保護(hù)研究所起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張松柏、劉勇、張德詠、羅香文、彭靜。1本規(guī)程規(guī)定了南方水稻黑條矮縮病毒檢測方法RT-PCR法的術(shù)語和定義、RT-PCR檢測方定、檢測后樣品處理等技術(shù)要求。本規(guī)程適用于侵染水稻的南方水稻黑條矮縮病毒的室內(nèi)檢測。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。下列術(shù)語和定義適用于本文件。由白背飛虱傳播的一種水稻病毒，主要危害水稻、玉米等禾本科作物，其危害水稻的典型反轉(zhuǎn)錄酶的作用合成cDNA,然后以cDNA為模板，利用特異性引物擴增得到目的片段。4縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。bp:堿基對dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DEPC:焦碳酸二乙酯2除另有規(guī)定外，所有實驗用試劑均為分析純；實驗用水均為超純水，規(guī)格符合GB6682-2008的相關(guān)規(guī)定。5.1試劑5.1.2AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)。5.1.51.5%瓊脂糖凝膠：見附錄A.2。5.1.650×TAE緩沖液：見附錄A.3。5.1.7SYBRGreenI染色液(100×)5.1.8上樣緩沖液：見附錄A.4。5.1.9DEPC處理的滅菌雙蒸水：見附錄A.5。5.1.10異丙醇。5.1.11DEPC處理的滅菌雙蒸水配置的75%乙醇：見附錄A.6。5.1.125×AMV緩沖液5.1.1410×PCR緩沖液5.1.15DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。5.1.16引物：見附錄A.7。5.1.17氯仿。5.2儀器設(shè)備5.2.1高速冷凍離心機：最高轉(zhuǎn)速應(yīng)大于12000rpm。5.2.2PCR擴增儀。5.2.3核酸電泳儀和水平電泳槽。5.2.4超低溫冰箱(-80℃)。5.2.5凝膠成像系統(tǒng)。5.2.6通風(fēng)櫥。5.3操作程序5.3.1樣品的采集和處理選擇典型病癥的水稻葉片，或者需要檢測的水稻樣品的葉片，用吸水紙吸干水檢測，或在-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩２杉陌妆筹w虱，用無水乙醇浸泡，或者40℃烘干，送至實驗室檢測，或在-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?.3.2.1每100mg水稻葉片或白背飛虱，加入少量液氮研磨，然后加入1mL變性液，渦旋混勻，室溫放置(5～10)min;5.3.2.2加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15sec,室溫放置3min;12000rpm4℃離心10min。35.3.2.5沉淀用1mL75%乙醇洗滌2次；12000rpm4℃離心3min,棄上清，室溫干燥(5～10)min。5.3.3RT-PCR檢測總RNA提取液RT溶液(5×)隨機六聚體引物(0.1μg/μ1)dNTP溶液(2.5mM/each)RNA酶抑制劑(50U/μ1)反轉(zhuǎn)錄酶(5U/μ1)DEPC處理ddH?0取一干凈離心管(DEPC水處理),按表1依次加入檢測試劑，42℃孵育30min,85℃加熱5min正向引物：5’>AGAGAA正向引物(10Pmol/L)PCR緩沖液(10×)Taq酶(5U/μL)滅菌ddH?045.3.3.4PCR擴增1.5%瓊脂糖凝膠的點樣孔內(nèi)，同時設(shè)置DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA作為片段大小標(biāo)準(zhǔn)，80V電壓電泳約30min。將電泳后的瓊脂糖凝膠放置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，打開紫外燈，在凝膠成像系統(tǒng)控制軟件上觀察PCR擴增條帶。5.3.5結(jié)果判定在凝膠成像系統(tǒng)觀察，電泳后的瓊脂糖凝膠上，陽性對照出現(xiàn)一條1087bp大小的特異性條帶，陰性對照沒有該特異性條帶。供試樣品出現(xiàn)與陽性對照大小一致的特異性條帶南方水稻黑條矮縮病毒；供試樣品沒有出現(xiàn)與陽性對照大小一致的特異性條帶，判定為陰性，即該樣品不帶南方水稻黑條矮縮病毒(電泳圖參見附錄C)。6檢測后樣品的處理樣品應(yīng)保存于-80℃冰箱或集中銷毀，用具應(yīng)進(jìn)行滅活處理。5附錄A(規(guī)范性附錄)相關(guān)試劑的配制A.1變性液將250g異硫氰酸胍、17.6mL0.75molL(pH7.0)檸檬酸鈉和26.4mL10%(m/V)十二烷基肌酸鈉溶293mL水中。65℃條件下攪拌、混勻，直至完全溶解。室溫條件下可保存3個月，每次使用前按每50mL變性液加入0.35mL的14.4molL的β-巰基乙醇。變性液可在室溫下避光保存1個月。A.21.5%瓊脂糖凝膠的配制用瓊脂糖1.5g,0.5×TAE電泳緩沖液100mL,混勻后在微波爐中完全融化，待冷至50~60℃時，搖勻倒入電泳板上，凝固后取下梳子，備用。242gTris堿、57.1mL冰醋酸、37.2gNa?EDTA2H2O,加ddH?O定容至1L。A.4上樣緩沖液(5×)TrisC1(pH8.0),在800mLdH?O中溶解121gTris堿，用濃HCI調(diào)節(jié)pH至8.0。DEPC100μL,加超純水至100mL,室溫過夜，121℃高壓15min,分裝到1.5mLDEPC處理過A.6DEPC水75%乙醇用75mL無水乙醇，加DEPC水至100mL,混勻，4℃保存?zhèn)溆?。檢測引物序列如下。正向引物：5'>AGAGAATGGCAGACCTAGAGCG<3'反向引物：53>TACAATGAAATTGACCAAGA引物合成后凍存于-20℃。待用時應(yīng)稀釋至10μmol/L濃度。擴增時2條引物在同一體系中，擴增結(jié)束后出現(xiàn)大小為1087bp的目的片段。6附錄B(資料性附錄)南方水稻黑條矮縮病毒侵染水稻的典型癥狀特點秧苗期感病的稻株，嚴(yán)重矮縮(不及正常株高1/3),不能拔節(jié)；本田初期感病的稻株，明顯矮縮(約為正常株高1/2),不抽穗或僅抽包頸穗；分蘗期和拔節(jié)期感病稻株，矮縮不明顯，能抽穗，但穗小、不實粒多、粒重輕；發(fā)病稻株葉色深綠，上部葉的葉面可見凹凸不平的皺褶，皺褶多發(fā)生于葉片近基部；拔節(jié)期的病株，地上數(shù)節(jié)節(jié)部有氣生須根及高節(jié)位分枝；病株莖稈表面有乳白色大小約1-2mm的瘤狀突起(手摸有明顯粗糙感),瘤