成團(tuán)泛菌脂多糖（LPSp）對(duì)狂犬病毒抗原免疫效果影響的深度探究一、引言1.1研究背景狂犬?。≧abies）是一種由狂犬病病毒（Rabiesvirus）感染引起的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，主要通過攜帶病毒的動(dòng)物咬傷或抓傷傳播給人類和其他動(dòng)物。一旦發(fā)病，狂犬病的死亡率幾乎為100%，臨床表現(xiàn)為恐水、怕風(fēng)、咽肌痙攣、進(jìn)行性癱瘓等，給患者及其家庭帶來巨大的痛苦和損失，也對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)告，全球每年約有5.9萬人死于狂犬病，其中亞洲和非洲是狂犬病的高發(fā)地區(qū)，這些地區(qū)由于動(dòng)物管理不善、疫苗可及性低等原因，狂犬病疫情較為嚴(yán)重。在我國，狂犬病也是重點(diǎn)防控的傳染病之一，雖然近年來隨著狂犬病疫苗的廣泛應(yīng)用，發(fā)病人數(shù)有所下降，但每年仍有一定數(shù)量的病例發(fā)生，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)?？袢∫呙缡穷A(yù)防狂犬病的最有效手段之一。目前，市場(chǎng)上的狂犬病疫苗主要包括滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗通過將狂犬病毒滅活后制成，安全性較高，但免疫原性相對(duì)較弱，需要多次接種才能獲得有效的免疫保護(hù)；減毒活疫苗則利用弱化或減少毒性的病毒制成，免疫原性較強(qiáng)，但安全性略低，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。無論是哪種類型的疫苗，其抗原性都有待進(jìn)一步提高，以減少接種次數(shù)、提高免疫效果和降低成本。目前，常規(guī)的狂犬病疫苗接種程序較為復(fù)雜，一般需要多次接種，例如暴露后預(yù)防通常需要在0、3、7、14和28天各接種一劑疫苗。頻繁的接種不僅給受種者帶來不便，增加了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可能導(dǎo)致部分人群因未能按時(shí)完成接種程序而影響免疫效果，無法有效預(yù)防狂犬病的發(fā)生。因此，提高狂犬病疫苗的抗原性和免疫效果，減少接種次數(shù)，成為狂犬病預(yù)防領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。免疫佐劑作為一類能夠增強(qiáng)抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)，在疫苗研發(fā)中發(fā)揮著重要作用。通過添加合適的佐劑，可以提高疫苗的免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)，從而減少疫苗的接種劑量和次數(shù)，提高疫苗的效果和安全性。LPSp（LPS結(jié)構(gòu)中的核心脂多糖部分）作為一種潛在的免疫佐劑，具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，其能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，從而有可能提高狂犬病毒抗原的免疫效果。研究LPSp對(duì)狂犬病毒抗原免疫效果的增強(qiáng)作用，對(duì)于開發(fā)新型、高效的狂犬病疫苗具有重要的理論和實(shí)際意義。1.2研究目的本研究旨在深入探究LPSp作為免疫佐劑對(duì)狂犬病毒抗原免疫效果的增強(qiáng)作用。具體而言，主要包含以下幾個(gè)關(guān)鍵方面：評(píng)估增強(qiáng)效果：通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（ELISA）等技術(shù)，精準(zhǔn)測(cè)定和細(xì)致比較單獨(dú)使用狂犬病毒抗原以及將LPSp與狂犬病毒抗原聯(lián)合使用時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗狂犬病毒抗體滴度和免疫細(xì)胞活性的差異。以此明確LPSp是否能夠切實(shí)增強(qiáng)狂犬病毒抗原引發(fā)的免疫應(yīng)答，提升機(jī)體對(duì)狂犬病毒的免疫防御能力。確定最佳配比與時(shí)間間隔：系統(tǒng)地研究LPSp與狂犬病毒抗原的不同配比組合，以及不同免疫接種時(shí)間間隔對(duì)免疫效果產(chǎn)生的影響。通過全面分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，篩選出能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生最強(qiáng)免疫反應(yīng)的LPSp與狂犬病毒抗原的最佳配比，以及最為適宜的免疫接種時(shí)間間隔。為狂犬病疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)和合理接種程序的制定提供科學(xué)、精準(zhǔn)的依據(jù)。揭示作用機(jī)制：從細(xì)胞和分子層面深入剖析LPSp增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫效果的內(nèi)在作用機(jī)制。探究LPSp對(duì)免疫細(xì)胞的激活途徑，以及對(duì)免疫相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。明晰LPSp如何影響機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)狂犬病毒抗原的識(shí)別、呈遞和應(yīng)答過程，為進(jìn)一步理解免疫佐劑的作用原理提供理論支持，也為新型狂犬病疫苗的研發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.3研究意義本研究深入探究LPSp對(duì)狂犬病毒抗原免疫效果的增強(qiáng)作用，具有重要的理論和實(shí)際意義，具體表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面：提高狂犬病疫苗免疫力：狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病的關(guān)鍵防線，然而目前其抗原性有限，常需多次接種，給受種者帶來諸多不便，還可能因接種程序不完整影響免疫效果。本研究若能證實(shí)LPSp對(duì)狂犬病毒抗原免疫效果的增強(qiáng)作用，有望顯著提升狂犬病疫苗的免疫力，使機(jī)體產(chǎn)生更高效、持久的免疫應(yīng)答。這不僅能提高疫苗對(duì)個(gè)體的保護(hù)效力，更能在群體層面有效降低狂犬病的傳播風(fēng)險(xiǎn)，為公共衛(wèi)生安全提供堅(jiān)實(shí)保障。減少疫苗接種次數(shù)：當(dāng)前狂犬病疫苗的多次接種程序繁瑣，增加了受種者的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本，也降低了接種依從性。通過研究LPSp與狂犬病毒抗原的最佳配比和免疫接種時(shí)間間隔，若能成功減少疫苗接種次數(shù)，將極大提高疫苗接種的便利性和可及性。這對(duì)于偏遠(yuǎn)地區(qū)、醫(yī)療資源匱乏地區(qū)的人群，以及那些難以按時(shí)完成復(fù)雜接種程序的個(gè)體來說，具有尤為重要的意義，能讓更多人及時(shí)獲得有效的免疫保護(hù)。降低狂犬病病例發(fā)生率：狂犬病的高致死率對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅，每年全球因狂犬病死亡的人數(shù)眾多。提高狂犬病疫苗的免疫效果和減少接種次數(shù)，能夠切實(shí)降低狂犬病病例的發(fā)生率。通過更有效的疫苗接種，減少狂犬病病毒的傳播和感染，從而降低狂犬病的發(fā)病率和死亡率，減輕社會(huì)和家庭因狂犬病帶來的沉重負(fù)擔(dān)，拯救更多生命，維護(hù)社會(huì)的穩(wěn)定和發(fā)展。為其他疫苗免疫增強(qiáng)提供理論基礎(chǔ)：LPSp作為一種潛在的免疫佐劑，其作用機(jī)制的研究不僅對(duì)狂犬病疫苗的優(yōu)化意義重大，還能為其他疫苗的免疫增強(qiáng)研究提供寶貴的理論借鑒。了解LPSp如何激活免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性以及增強(qiáng)免疫應(yīng)答，有助于開發(fā)新型、高效的免疫佐劑，推動(dòng)整個(gè)疫苗領(lǐng)域的發(fā)展。這可能為其他傳染病疫苗的研發(fā)和改進(jìn)提供新思路，提高疫苗的免疫效果和安全性，為人類預(yù)防和控制更多疾病提供有力支持。二、研究設(shè)計(jì)與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用6-8周齡、體重18-22g的純系Balb/c小鼠。Balb/c小鼠作為近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，基因純合度高達(dá)99%以上，遺傳背景高度一致，能有效減少個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性與可比性。在感染性疾病研究領(lǐng)域，因其對(duì)多種病原體具有易感性，常被用作理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為研究感染機(jī)制、疫苗效果評(píng)估等提供了良好的載體。本實(shí)驗(yàn)中選擇該品系小鼠，有助于準(zhǔn)確探究LPSp對(duì)狂犬病毒抗原免疫效果的影響。小鼠購自[供應(yīng)商名稱]，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心特定的無病原體環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度維持在22±2℃，相對(duì)濕度控制在50%±10%，遵循12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)周期，自由攝取無菌水和標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料。主要試劑：成團(tuán)泛菌脂多糖LPSp，純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)檢測(cè)，純度≥95%，由[制備單位]采用[具體制備方法]制備所得。該方法能有效去除雜質(zhì)，保證LPSp的高純度，從而確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性?？袢《镜鞍?，通過[提取來源及提取方法]從[具體來源]中提取并純化得到，其純度經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）等方法鑒定，純度≥90%，確保了蛋白的質(zhì)量和活性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的抗原來源。鋁佐劑，符合《中國藥典》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，由[生產(chǎn)廠家]生產(chǎn)，其質(zhì)量和安全性經(jīng)過嚴(yán)格檢測(cè)，常用于疫苗佐劑，為本實(shí)驗(yàn)提供了對(duì)比研究的基礎(chǔ)。ELISA檢測(cè)試劑盒，購自[試劑盒生產(chǎn)廠家]，包括用于檢測(cè)抗狂犬病毒IgG和IgM抗體滴度的相關(guān)試劑，如預(yù)包被狂犬病毒抗原的微孔板、酶標(biāo)記物、狂犬病毒IgG陽性對(duì)照、狂犬病毒IgG臨界對(duì)照、狂犬病毒IgG陰性對(duì)照、顯色液A、顯色液B、終止液、濃縮洗滌液（10倍）、樣品稀釋液、封板膜等。該試劑盒經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制和性能驗(yàn)證，具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)小鼠血清中的抗體滴度。其他材料：無菌注射器（1ml、0.25ml）、無菌離心管（1.5ml、5ml）、移液器及配套槍頭（10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl）、酶標(biāo)儀（[品牌及型號(hào)]，具備450nm波長(zhǎng)檢測(cè)功能，可精確測(cè)量吸光度值，為ELISA檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確讀取提供保障）、恒溫箱（[品牌及型號(hào)]，溫度控制精度為±0.5℃，用于ELISA實(shí)驗(yàn)中的孵育步驟，確保反應(yīng)在適宜的溫度條件下進(jìn)行）、離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)[X]rpm，具備不同轉(zhuǎn)頭可供選擇，滿足不同實(shí)驗(yàn)需求，用于小鼠血清的分離等操作）等。這些材料和設(shè)備均經(jīng)過嚴(yán)格的消毒和校準(zhǔn)，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和可靠性。2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將144只健康的6-8周齡Balb/c小鼠運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為6大組，每組24只小鼠。這6大組分別為：LPSp實(shí)驗(yàn)組：該組小鼠接種的是含有狂犬病毒蛋白與LPSp的混合制劑，旨在探究LPSp與狂犬病毒蛋白聯(lián)合作用時(shí)對(duì)免疫效果的影響，明確LPSp作為佐劑增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫應(yīng)答的能力?？袢《镜鞍讓?duì)照組：僅接種狂犬病毒蛋白，作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于對(duì)比單獨(dú)使用狂犬病毒抗原時(shí)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，為評(píng)估LPSp的佐劑效果提供參照。鋁佐劑疫苗對(duì)照組：接種含有鋁佐劑的狂犬病疫苗，鋁佐劑是目前常用的疫苗佐劑，該組用于對(duì)比LPSp與傳統(tǒng)鋁佐劑在增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫效果方面的差異。聯(lián)合佐劑組：接種含有鋁佐劑、LPSp和狂犬病毒蛋白的混合制劑，研究LPSp與鋁佐劑聯(lián)合使用時(shí)，是否對(duì)狂犬病毒抗原的免疫效果具有協(xié)同增強(qiáng)作用。LPSp佐劑對(duì)照組：僅接種LPSp，用于觀察LPSp單獨(dú)作用時(shí)對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響，排除LPSp自身可能產(chǎn)生的非特異性免疫刺激對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾?？瞻讓?duì)照組：注射等量的生理鹽水，作為空白對(duì)照，反映小鼠在未接受任何抗原或佐劑刺激時(shí)的自然免疫狀態(tài)，為其他實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果分析提供基礎(chǔ)參照。為了進(jìn)一步研究不同免疫次數(shù)對(duì)免疫效果的影響，每大組又細(xì)分為三個(gè)小組，每組8只小鼠，分別為單次免疫組、二次免疫組和四次免疫組。單次免疫組僅在實(shí)驗(yàn)開始的第0天進(jìn)行一次免疫接種；二次免疫組在第0天和第14天各免疫1次；四次免疫組則在第0天、第7天、第14天和第21天各免疫1次。通過設(shè)置不同免疫次數(shù)的小組，可以全面分析免疫次數(shù)與免疫效果之間的關(guān)系，確定最佳的免疫接種方案，為狂犬病疫苗的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。2.3免疫方法單次免疫組：在實(shí)驗(yàn)開始的第0天，對(duì)該組小鼠進(jìn)行一次免疫接種。具體操作如下，首先使用1ml無菌注射器抽取適量含有相應(yīng)成分（如LPSp實(shí)驗(yàn)組為狂犬病毒蛋白與LPSp的混合制劑，狂犬病毒蛋白對(duì)照組為狂犬病毒蛋白，鋁佐劑疫苗對(duì)照組為含鋁佐劑的狂犬病疫苗，聯(lián)合佐劑組為鋁佐劑、LPSp和狂犬病毒蛋白的混合制劑，LPSp佐劑對(duì)照組為L(zhǎng)PSp，空白對(duì)照組為生理鹽水）的溶液，然后更換為0.25ml無菌注射器，確保劑量準(zhǔn)確。將小鼠輕柔固定，使其背部皮膚充分暴露，用鑷子輕輕捏起小鼠背部皮膚，形成一個(gè)小皮褶。將注射器針頭以15-20度的角度刺入皮褶內(nèi)，確保針頭位于皮下，緩慢推注0.1ml免疫制劑。注射完畢后，輕輕拔出針頭，用棉球按壓注射部位片刻，防止溶液滲出。二次免疫組：分別在第0天和第14天對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種。第0天的免疫操作與單次免疫組在第0天的操作完全一致。在第14天進(jìn)行第二次免疫時(shí)，同樣先抽取適量免疫制劑，更換合適注射器，固定小鼠并暴露背部皮膚。捏起上次免疫部位附近（但需避開上次注射部位，以防止局部炎癥反應(yīng)過度或影響吸收）的皮膚形成皮褶，以相同的角度和方法刺入皮下，緩慢推注0.1ml免疫制劑。注射后同樣按壓注射部位，確保免疫過程順利進(jìn)行，減少小鼠應(yīng)激反應(yīng)。四次免疫組：在第0天、第7天、第14天和第21天各進(jìn)行一次免疫接種。每次免疫時(shí)，均嚴(yán)格按照上述單次免疫組的操作方法進(jìn)行。在多次免疫過程中，注意每次免疫的部位選擇，盡量在背部不同區(qū)域進(jìn)行注射，避免在同一部位反復(fù)注射，以減少局部組織損傷和炎癥反應(yīng)對(duì)免疫效果的影響。例如，第0天在小鼠背部左側(cè)偏上區(qū)域注射，第7天可在右側(cè)偏上區(qū)域，第14天在左側(cè)偏下區(qū)域，第21天在右側(cè)偏下區(qū)域等。每次注射前都要仔細(xì)檢查小鼠的健康狀況，確保小鼠符合免疫條件，如無發(fā)熱、感染等異常情況，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。2.4血清檢測(cè)方法在實(shí)驗(yàn)過程中，為了準(zhǔn)確評(píng)估小鼠在不同免疫方案下的免疫反應(yīng)，需要對(duì)小鼠血清中的抗狂犬病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)。具體的血清檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)和方法如下：采血時(shí)間點(diǎn)：?jiǎn)未蚊庖呓M、二次免疫組和四次免疫組的小鼠均在第7天、第14天、第21天、第30天、第45天、第60天進(jìn)行采血。這些時(shí)間點(diǎn)的選擇具有重要意義，第7天可以檢測(cè)到初次免疫后早期的免疫應(yīng)答情況，觀察機(jī)體是否開始產(chǎn)生抗體；第14天和第21天能進(jìn)一步了解免疫反應(yīng)的發(fā)展和增強(qiáng)情況；第30天、第45天和第60天則用于評(píng)估抗體的持續(xù)存在和變化趨勢(shì)，全面反映不同免疫次數(shù)和免疫方案對(duì)抗體產(chǎn)生和維持的影響。采血方法：采用小鼠眼內(nèi)眥靜脈采血法，這是一種常用且相對(duì)溫和的采血方式，對(duì)小鼠的損傷較小，能夠在多次采血過程中盡量減少對(duì)小鼠健康和免疫狀態(tài)的干擾。具體操作時(shí)，首先使用75%酒精棉球輕輕擦拭小鼠的眼部周圍，進(jìn)行消毒處理，以降低感染風(fēng)險(xiǎn)。然后，用左手輕輕固定小鼠，使其頭部稍微后仰，右手持毛細(xì)管（內(nèi)徑約0.5-1mm），將毛細(xì)管的尖端輕輕插入小鼠的眼內(nèi)眥靜脈。插入時(shí)要注意角度和力度，避免過度損傷眼部組織。由于眼內(nèi)眥靜脈壓力的作用，血液會(huì)自然流入毛細(xì)管中，當(dāng)采集到約0.2-0.3ml血液時(shí)，緩慢拔出毛細(xì)管。采血后，用棉球輕輕按壓小鼠的眼內(nèi)眥部位，進(jìn)行止血處理，確保小鼠的安全。血清分離：將采集到的血液立即轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管中，避免血液凝固和污染。將離心管放入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為3000-4000rpm，離心時(shí)間為10-15分鐘。在離心過程中，血液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞等細(xì)胞成分會(huì)沉淀到離心管底部，而血清則會(huì)分離到上層。離心結(jié)束后，用移液器小心吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，并做好標(biāo)記。將分離得到的血清置入-80℃冰箱中保存待測(cè)，-80℃的低溫環(huán)境能夠有效保持血清中抗體的活性和穩(wěn)定性，防止抗體降解和失活，確保后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。ELISA檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清中抗狂犬病毒IgG、IgM的滴度。首先，從冰箱中取出預(yù)包被狂犬病毒抗原的微孔板，將其放置在室溫下平衡20-30分鐘，使微孔板的溫度與室溫一致，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。取出濃縮洗滌液，用蒸餾水或去離子水按照1:10的比例進(jìn)行稀釋，充分混勻后備用。將已分離好的血清用樣品稀釋液進(jìn)行1:100稀釋，例如取10μl血清加入到1ml樣品稀釋液中，使用移液器反復(fù)吹打，確保血清與樣品稀釋液充分混勻。取所需量的預(yù)包被微孔板條，固定于板架上，用移液器向每個(gè)微孔中加入100μl稀釋好的樣品。同時(shí)，將狂犬病毒IgG陽性對(duì)照、狂犬病毒IgG陰性對(duì)照各加1孔，狂犬病毒IgG臨界對(duì)照加3孔，每孔加入100μl相應(yīng)對(duì)照液。另留一孔不加樣品，作為空白對(duì)照孔，用于調(diào)零和背景扣除。在記錄紙上詳細(xì)記錄各樣品和對(duì)照品的次序或位置，以便后續(xù)結(jié)果分析。加樣完成后，用封板膜覆蓋板條，將其置于37℃恒溫箱中孵育30分鐘，使樣品中的抗體與微孔板上的狂犬病毒抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，甩凈孔中液體，將微孔板倒扣在吸水紙上，輕輕拍打，盡量去除殘留液體。用稀釋好的洗滌液加滿每孔，停留1分鐘后，再次甩凈、拍干，如此反復(fù)洗板3次，以去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少非特異性干擾。除空白對(duì)照孔外，其余各孔垂直滴加酶標(biāo)記物50μl（約1滴），再次將微孔板置于37℃孵育30分鐘，使酶標(biāo)記物與結(jié)合在抗原上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合。按照洗板步驟，再次用洗滌液洗板3次，拍干后，向每孔（含空白孔）垂直滴加顯色液A、B各50μl（約1滴），輕輕振蕩混勻，然后將微孔板置于37℃避光顯色15分鐘。在顯色過程中，酶標(biāo)記物會(huì)催化顯色液發(fā)生反應(yīng)，使微孔中的溶液顏色發(fā)生變化，顏色的深淺與血清中抗體的含量成正比。15分鐘后，向每孔（含空白孔）立即加入終止液50μl（約1滴），混勻后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度（A值）。通過測(cè)定A值，可以定量分析血清中抗狂犬病毒IgG、IgM抗體的滴度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1各實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗狂犬病毒IgG抗體滴度結(jié)果3.1.1不同免疫次數(shù)IgG抗體滴度比較在本次實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)不同免疫次數(shù)下各實(shí)驗(yàn)組小鼠產(chǎn)生的抗狂犬病毒IgG抗體滴度進(jìn)行了詳細(xì)的檢測(cè)與分析。結(jié)果顯示，LPSp實(shí)驗(yàn)組一次免疫、二次免疫、四次免疫分別在第21天、第21天、第30天誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體滴度均顯著高于鋁佐劑疫苗對(duì)照組、狂犬病毒蛋白對(duì)照組以及空白對(duì)照組（P＜0.05）。這表明LPSp與狂犬病毒抗原聯(lián)合使用，能夠更有效地刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗狂犬病毒IgG抗體，顯著增強(qiáng)了免疫效果。進(jìn)一步觀察不同免疫次數(shù)下LPSp實(shí)驗(yàn)組IgG抗體滴度的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)一次免疫后，抗體滴度在第14天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。這可能是由于一次免疫刺激相對(duì)較弱，機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答在初期迅速上升，但隨著時(shí)間推移，抗體水平因代謝等因素逐漸降低。二次免疫后，抗體滴度在第21天達(dá)到高峰，較一次免疫的高峰時(shí)間有所延遲，且抗體滴度水平更高。這是因?yàn)槎蚊庖吣軌蛟俅渭せ蠲庖呦到y(tǒng)，引發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，使得抗體產(chǎn)生量增加，同時(shí)免疫記憶細(xì)胞也得到進(jìn)一步激活，維持了較高的抗體水平。四次免疫后，抗體滴度在第60天仍呈上升趨勢(shì)，顯示出持續(xù)增強(qiáng)的免疫效果。多次免疫的累積效應(yīng)不斷刺激免疫系統(tǒng)，促使更多的免疫細(xì)胞參與免疫應(yīng)答，持續(xù)產(chǎn)生抗體，從而使抗體滴度不斷上升。與之對(duì)比，鋁佐劑疫苗對(duì)照組四次免疫后，IgG抗體滴度在第45天達(dá)到高峰，隨后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。這說明鋁佐劑雖然也能增強(qiáng)免疫效果，但與LPSp相比，其免疫效果的持續(xù)性較差。鋁佐劑可能主要通過吸附抗原，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的停留時(shí)間來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，但隨著抗原的逐漸清除，免疫刺激減弱，抗體水平也隨之下降。而LPSp能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，可能通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而使免疫效果更持久。3.1.2聯(lián)合佐劑組與鋁佐劑疫苗對(duì)照組IgG抗體滴度比較聯(lián)合佐劑組與鋁佐劑疫苗對(duì)照組一次免疫后的IgG抗體滴度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這表明在初次免疫時(shí)，鋁佐劑與LPSp聯(lián)合使用，并沒有比單獨(dú)使用鋁佐劑產(chǎn)生更顯著的免疫增強(qiáng)效果?？赡苁且?yàn)槌醮蚊庖邥r(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)新抗原的識(shí)別和應(yīng)答需要一定時(shí)間來啟動(dòng)，此時(shí)佐劑的作用相對(duì)不明顯，兩種佐劑組合并未產(chǎn)生協(xié)同增效作用。然而，聯(lián)合佐劑組與鋁佐劑疫苗對(duì)照組二次免疫、四次免疫后的IgG抗體滴度比較，僅在第14天這個(gè)時(shí)間段差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在第14天，聯(lián)合佐劑組的IgG抗體滴度顯著高于鋁佐劑疫苗對(duì)照組，這可能是二次免疫后，LPSp和鋁佐劑在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了不同的刺激作用，使得聯(lián)合佐劑組的免疫反應(yīng)更為強(qiáng)烈。但隨著時(shí)間推移，其他時(shí)間點(diǎn)兩者的抗體滴度差異不顯著，說明在整體的二次免疫和四次免疫過程中，LPSp與鋁佐劑聯(lián)合使用并沒有持續(xù)表現(xiàn)出優(yōu)于單獨(dú)使用鋁佐劑的免疫增強(qiáng)效果，兩者在增強(qiáng)免疫應(yīng)答方面的作用較為相似。這提示我們，LPSp與鋁佐劑在聯(lián)合使用時(shí)，可能不存在明顯的協(xié)同促進(jìn)作用，其免疫增強(qiáng)效果并非簡(jiǎn)單的疊加。3.2免疫次數(shù)對(duì)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗狂犬病毒IgG抗體的影響3.2.1不同組相同時(shí)間不同免疫次數(shù)IgG抗體滴度比較在對(duì)不同免疫次數(shù)的深入研究中，我們進(jìn)一步比較了LPSp實(shí)驗(yàn)組、鋁佐劑疫苗組、狂犬病毒蛋白對(duì)照組在同一時(shí)間點(diǎn)不同免疫次數(shù)下抗狂犬病毒IgG抗體滴度的差異。結(jié)果清晰地顯示，在各大組內(nèi)，免疫四次的小鼠產(chǎn)生的IgG抗體滴度均顯著高于免疫二次的小鼠（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，隨著免疫次數(shù)的增加，小鼠機(jī)體能夠產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的IgG抗體。多次免疫可以持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，不斷激活記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞，促使?jié){細(xì)胞持續(xù)分泌抗體，使得抗體滴度得以顯著提高。同時(shí)，免疫二次的小鼠產(chǎn)生的IgG抗體滴度也顯著高于免疫一次的小鼠（P＜0.05）。初次免疫后，機(jī)體免疫系統(tǒng)初次接觸抗原，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，但此時(shí)產(chǎn)生的抗體水平相對(duì)較低。二次免疫時(shí)，記憶細(xì)胞迅速被激活，增殖分化為漿細(xì)胞，快速產(chǎn)生大量抗體，使得抗體滴度顯著上升。這進(jìn)一步證明了免疫次數(shù)的增加對(duì)增強(qiáng)免疫效果具有重要作用，多次免疫能夠逐步增強(qiáng)機(jī)體對(duì)狂犬病毒抗原的免疫記憶和免疫應(yīng)答能力。3.2.2LPSp實(shí)驗(yàn)組與鋁佐劑疫苗對(duì)照組不同免疫次數(shù)效果對(duì)比在對(duì)LPSp實(shí)驗(yàn)組和鋁佐劑疫苗對(duì)照組的比較分析中，我們發(fā)現(xiàn)LPSp實(shí)驗(yàn)組的兩次免疫在30天以前產(chǎn)生的抗狂犬病毒IgG抗體滴度較鋁佐劑疫苗對(duì)照組的四次免疫高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這表明在免疫早期階段，盡管LPSp實(shí)驗(yàn)組的免疫次數(shù)相對(duì)較少，但其憑借LPSp作為佐劑的獨(dú)特免疫增強(qiáng)作用，與鋁佐劑疫苗對(duì)照組多次免疫后的抗體滴度水平相當(dāng)。LPSp可能通過激活免疫系統(tǒng)的特定信號(hào)通路，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)抗原的攝取、加工和呈遞能力，從而在較少的免疫次數(shù)下也能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答。然而，四次免疫后，LPSp實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗狂犬病毒IgG的滴度在各個(gè)時(shí)間段均顯著高于五次免疫的鋁佐劑疫苗對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。并且，LPSp實(shí)驗(yàn)組在免疫后第60天抗體滴度仍呈上升趨勢(shì)，而五次免疫的鋁佐劑疫苗對(duì)照組在第45天IgG的滴度達(dá)到高峰，以后逐漸下降。這充分說明，隨著免疫次數(shù)的進(jìn)一步增加，LPSp作為佐劑的優(yōu)勢(shì)更加明顯，能夠持續(xù)有效地增強(qiáng)免疫效果，使抗體滴度不斷上升并維持在較高水平。相比之下，鋁佐劑疫苗對(duì)照組雖然經(jīng)過多次免疫，但免疫效果的持續(xù)性較差，抗體滴度在達(dá)到高峰后逐漸下降。這可能是因?yàn)殇X佐劑的作用機(jī)制相對(duì)單一，主要通過吸附抗原延長(zhǎng)其在體內(nèi)的停留時(shí)間來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，隨著抗原的逐漸清除，免疫刺激減弱，抗體水平也隨之降低。而LPSp可能通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，不僅能夠激活免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)免疫記憶，從而使免疫效果更持久。3.3小鼠血清抗狂犬病毒IgM抗體的檢測(cè)結(jié)果在對(duì)小鼠血清抗狂犬病毒IgM抗體的檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)LPSp實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)合佐劑疫苗組展現(xiàn)出了獨(dú)特的免疫反應(yīng)特征。具體而言，這兩組在每一次免疫后的第七天，IgM抗體滴度分別顯著高于未加LPSp佐劑的狂犬病毒蛋白對(duì)照組與鋁佐劑疫苗組對(duì)照組。這一結(jié)果充分表明，LPSp佐劑能夠在免疫后的早期階段，即第七天，有效促進(jìn)小鼠機(jī)體產(chǎn)生更高水平的抗狂犬病毒IgM抗體，顯著增強(qiáng)了早期的免疫應(yīng)答。IgM作為機(jī)體在初次免疫應(yīng)答中最早產(chǎn)生的抗體，其快速且大量的產(chǎn)生對(duì)于機(jī)體迅速識(shí)別和抵御狂犬病毒的入侵具有重要意義。LPSp可能通過激活免疫系統(tǒng)中的固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，促使這些細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而激活B細(xì)胞，使其快速分化為漿細(xì)胞，大量產(chǎn)生IgM抗體。然而，值得注意的是，第七天后IgM抗體滴度出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著免疫反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，機(jī)體的免疫應(yīng)答逐漸從以IgM為主的早期階段過渡到以IgG為主的階段。在這個(gè)過程中，B細(xì)胞在抗原的持續(xù)刺激下，發(fā)生類別轉(zhuǎn)換，開始大量產(chǎn)生IgG抗體，而IgM的合成和分泌相應(yīng)減少。但當(dāng)再次免疫時(shí)，LPSp實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)合佐劑疫苗組又出現(xiàn)IgM抗體滴度顯著高于未加LPSp佐劑組的情況。這是因?yàn)樵俅蚊庖吣軌蚣せ钣洃汢細(xì)胞，這些記憶B細(xì)胞在LPSp佐劑的協(xié)同作用下，迅速增殖分化為漿細(xì)胞，再次快速產(chǎn)生大量IgM抗體。LPSp可能通過增強(qiáng)記憶B細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別和應(yīng)答能力，或者通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，為記憶B細(xì)胞的活化和增殖提供更有利的條件，從而使得再次免疫時(shí)IgM抗體能夠快速產(chǎn)生并達(dá)到較高水平。四、LPSp增強(qiáng)免疫效果的作用機(jī)制探討4.1LPSp對(duì)免疫細(xì)胞的激活作用LPSp作為一種潛在的免疫佐劑，能夠通過多種途徑激活巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，提高狂犬病毒抗原的免疫效果。巨噬細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在免疫防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。LPSp可以與巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs），如Toll樣受體4（TLR4）/髓樣分化因子2（MD2）/CD14復(fù)合體特異性結(jié)合。這種結(jié)合能夠觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中MyD88依賴性信號(hào)通路是主要的激活途徑之一。在該通路中，LPSp與受體結(jié)合后，首先招募MyD88接頭蛋白，MyD88通過其死亡結(jié)構(gòu)域與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員相互作用，激活I(lǐng)RAK4和IRAK1?；罨腎RAK1進(jìn)一步磷酸化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），使其泛素化并激活下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β激活激酶1（TAK1）。TAK1通過磷酸化激活核因子-κB（NF-κB）誘導(dǎo)激酶（NIK），進(jìn)而激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物。IKK復(fù)合物磷酸化IκB蛋白，使其降解，釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)一系列促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些細(xì)胞因子不僅能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞自身的活性，如提高其吞噬能力和殺菌能力，還能招募和激活其他免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，進(jìn)一步放大免疫反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞（DCs）是功能最為強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，在連接固有免疫和適應(yīng)性免疫中起著橋梁作用。LPSp同樣能夠激活樹突狀細(xì)胞，促進(jìn)其成熟和功能增強(qiáng)。當(dāng)LPSp與樹突狀細(xì)胞表面的TLR4等受體結(jié)合后，通過激活相關(guān)信號(hào)通路，促使樹突狀細(xì)胞表達(dá)高水平的共刺激分子，如CD80、CD86和主要組織相容性復(fù)合體II類分子（MHC-II）。CD80和CD86是重要的共刺激分子，它們與T細(xì)胞表面的CD28分子相互作用，提供T細(xì)胞活化所需的第二信號(hào)，增強(qiáng)T細(xì)胞的激活和增殖。MHC-II分子則負(fù)責(zé)將抗原肽呈遞給T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別和應(yīng)答。同時(shí)，LPSp激活的樹突狀細(xì)胞還會(huì)分泌大量的細(xì)胞因子，如IL-12等。IL-12是一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)初始T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th1細(xì)胞分泌的干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，不僅可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷病原體的能力，還能促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a等抗體亞型，提高體液免疫的效果。綜上所述，LPSp通過激活巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)其抗原呈遞能力和分泌細(xì)胞因子的能力，從而在機(jī)體對(duì)狂犬病毒抗原的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，為提高狂犬病疫苗的免疫效果提供了有力的支持。4.2LPSp對(duì)免疫信號(hào)通路的影響LPSp作為一種具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，對(duì)Toll樣受體（TLRs）等相關(guān)免疫信號(hào)通路的激活在增強(qiáng)免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其具體的分子機(jī)制涉及多個(gè)層面。Toll樣受體4（TLR4）是LPSp發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要靶點(diǎn)之一。LPSp與TLR4的結(jié)合具有高度特異性，這種結(jié)合啟動(dòng)了復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。在MyD88依賴性信號(hào)通路中，LPSp與TLR4結(jié)合后，MyD88作為關(guān)鍵的接頭蛋白被迅速招募。MyD88通過其死亡結(jié)構(gòu)域與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員相互作用，依次激活I(lǐng)RAK4和IRAK1?；罨蟮腎RAK1進(jìn)一步磷酸化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），使其發(fā)生泛素化修飾。泛素化的TRAF6能夠激活下游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β激活激酶1（TAK1）。TAK1通過磷酸化激活核因子-κB（NF-κB）誘導(dǎo)激酶（NIK），進(jìn)而激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物。IKK復(fù)合物對(duì)IκB蛋白進(jìn)行磷酸化修飾，導(dǎo)致IκB蛋白降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其進(jìn)入細(xì)胞核后，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)一系列促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些促炎細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中具有多種重要功能，它們能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和分化，還能招募其他免疫細(xì)胞到炎癥部位，從而放大免疫反應(yīng)。除了MyD88依賴性信號(hào)通路，LPSp還可以激活TRIF依賴性信號(hào)通路。在TRIF依賴性信號(hào)通路中，LPSp與TLR4結(jié)合后，招募含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白TRIF。TRIF通過與TRAF3相互作用，激活TBK1和IKKε激酶。這些激酶能夠磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），使其發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，IRF3與特定的DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)I型干擾素（IFN-α和IFN-β）等基因的轉(zhuǎn)錄。I型干擾素在免疫反應(yīng)中具有重要的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，它們可以激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），增強(qiáng)其對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷能力，還能調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化和分化，促進(jìn)抗病毒免疫反應(yīng)的發(fā)生。LPSp對(duì)免疫信號(hào)通路的激活還涉及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。LPSp刺激免疫細(xì)胞后，能夠激活細(xì)胞內(nèi)的MAPK信號(hào)通路，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。這些激酶被激活后，通過磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等過程。例如，ERK的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，JNK和p38MAPK的激活則與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡密切相關(guān)。在LPSp激活的免疫細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性和功能。綜上所述，LPSp通過激活Toll樣受體等相關(guān)免疫信號(hào)通路，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子的分泌，從而在增強(qiáng)免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的分子機(jī)制作用。深入了解LPSp對(duì)免疫信號(hào)通路的影響，有助于進(jìn)一步揭示其增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫效果的內(nèi)在機(jī)制，為開發(fā)新型、高效的狂犬病疫苗提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和深入的數(shù)據(jù)分析，全面探究了LPSp作為免疫佐劑對(duì)狂犬病毒抗原免疫效果的影響，取得了一系列具有重要意義的研究成果。LPSp佐劑顯著增強(qiáng)免疫效果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰表明，LPSp佐劑具有顯著增強(qiáng)小鼠抗狂犬病毒免疫效果的作用。在不同免疫次數(shù)下，LPSp實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗狂犬病毒IgG抗體滴度均顯著高于鋁佐劑疫苗對(duì)照組、狂犬病毒蛋白對(duì)照組以及空白對(duì)照組。這充分證明了LPSp與狂犬病毒抗原聯(lián)合使用，能夠更有效地刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗狂犬病毒IgG抗體，顯著提升免疫效果。一次免疫、二次免疫和四次免疫的LPSp實(shí)驗(yàn)組分別在第21天、第21天和第30天誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體滴度達(dá)到較高水平，且四次免疫后在第60天仍呈上升趨勢(shì)。這表明LPSp不僅能快速激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還能使免疫效果持續(xù)增強(qiáng)，有效延長(zhǎng)抗體的維持時(shí)間。LPSp佐劑效果優(yōu)于鋁佐劑：LPSp佐劑在增強(qiáng)小鼠對(duì)狂犬病毒蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生抗狂犬病毒免疫效果方面，明顯優(yōu)于鋁佐劑。LPSp佐劑促進(jìn)小鼠產(chǎn)生的抗狂犬病毒IgM、IgG抗體濃度均顯著高于鋁佐劑，維持時(shí)間也顯著長(zhǎng)于鋁佐劑。LPSp佐劑狂犬病毒疫苗免疫二次的效果與鋁佐劑狂犬病毒疫苗免疫四次相當(dāng)，而LPSp佐劑狂犬病毒疫苗免疫四次的效果則顯著強(qiáng)于鋁佐劑狂犬病毒疫苗免疫五次的效果。這顯示出LPSp佐劑在提高免疫效果和減少接種次數(shù)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，為狂犬病疫苗的優(yōu)化提供了新的方向。LPSp與鋁佐劑無協(xié)同作用：聯(lián)合佐劑組與鋁佐劑疫苗對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，LPSp佐劑與鋁佐劑之間無協(xié)同促進(jìn)作用。一次免疫后，兩組的IgG抗體滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；二次免疫和四次免疫后，僅在第14天這個(gè)時(shí)間段差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明LPSp與鋁佐劑聯(lián)合使用時(shí)，并未產(chǎn)生優(yōu)于單獨(dú)使用鋁佐劑的免疫增強(qiáng)效果，兩者在增強(qiáng)免疫應(yīng)答方面的作用較為相似。5.2研究的局限性盡管本研究在探索LPSp增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫效果方面取得了顯著成果，但仍存在一定的局限性，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：動(dòng)物模型的局限性：本研究采用Balb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，小鼠具有繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、遺傳背景相對(duì)清晰等優(yōu)點(diǎn)，在免疫學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。然而，小鼠與人類在生理結(jié)構(gòu)、免疫系統(tǒng)組成和功能等方面存在一定差異。例如，小鼠的免疫系統(tǒng)相對(duì)較為敏感，對(duì)某些抗原的免疫應(yīng)答可能與人類不同。此外，小鼠的壽命較短，難以模擬人類長(zhǎng)期的免疫過程和疫苗的長(zhǎng)期效果。因此，本研究結(jié)果在向人類應(yīng)用轉(zhuǎn)化時(shí)可能存在一定的局限性，未來需要進(jìn)一步開展基于靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人體臨床試驗(yàn)的研究，以驗(yàn)證LPSp在人類中的免疫增強(qiáng)效果和安全性。研究指標(biāo)的局限性：本研究主要通過檢測(cè)小鼠血清中抗狂犬病毒IgG、IgM抗體滴度來評(píng)估免疫效果。抗體滴度是衡量體液免疫應(yīng)答的重要指標(biāo)之一，能夠直觀反映機(jī)體對(duì)狂犬病毒抗原的免疫反應(yīng)強(qiáng)度。然而，免疫應(yīng)答是一個(gè)復(fù)雜的過程，除了體液免疫外，細(xì)胞免疫在抵抗狂犬病毒感染中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）能夠識(shí)別并殺傷被狂犬病毒感染的細(xì)胞，輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）能夠分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。本研究未對(duì)細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行深入檢測(cè)，如Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌水平、CTL的活性等。這些細(xì)胞免疫指標(biāo)對(duì)于全面理解LPSp增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫效果的機(jī)制具有重要意義。因此，未來的研究應(yīng)增加細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，以更全面地評(píng)估LPSp的免疫增強(qiáng)作用。LPSp應(yīng)用安全性的局限性：LPSp作為一種潛在的免疫佐劑，雖然在本研究中顯示出良好的免疫增強(qiáng)效果，但在實(shí)際應(yīng)用中，其安全性問題不容忽視。LPSp來源于革蘭陰性非致病菌成團(tuán)泛菌的脂多糖，盡管其毒性相對(duì)較低，但仍可能引起機(jī)體的免疫反應(yīng)和不良反應(yīng)。例如，高劑量的LPSp可能導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng)，引發(fā)發(fā)熱、乏力、惡心等不適癥狀。此外，LPSp的純度和質(zhì)量控制也可能影響其安全性和有效性。本研究未對(duì)LPSp的安全性進(jìn)行全面系統(tǒng)的評(píng)估，如長(zhǎng)期毒性、生殖毒性、致突變性等。因此，在將LPSp應(yīng)用于狂犬病疫苗的臨床開發(fā)之前，需要進(jìn)行嚴(yán)格的安全性評(píng)價(jià)研究，確保其在人體中的安全性和耐受性。5.3未來研究方向展望基于本研究的成果與不足，未來在LPSp增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫效果的研究領(lǐng)域，可從以下幾個(gè)重要方向展開深入探索：優(yōu)化LPSp與疫苗配比：進(jìn)一步細(xì)致研究LPSp與狂犬病毒抗原的最佳配比，探索在不同免疫策略下，如不同免疫途徑（皮下、肌肉、皮內(nèi)等）和不同免疫劑量，LPSp與狂犬病毒抗原的最優(yōu)組合。通過全面系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，深入分析不同配比下免疫效果的差異，不僅關(guān)注抗體滴度的變化，還需綜合考慮免疫細(xì)胞的活化、細(xì)胞因子的分泌以及免疫記憶的形成等多個(gè)方面，以確定能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生最強(qiáng)烈、最持久免疫應(yīng)答的LPSp與疫苗的精確配比。這將為狂犬病疫苗的高效制備提供更精準(zhǔn)的配方依據(jù)，進(jìn)一步提升疫苗的免疫效果。探索聯(lián)合其他佐劑：盡管本研究表明LPSp與鋁佐劑無協(xié)同促進(jìn)作用，但LPSp與其他新型佐劑的聯(lián)合使用仍具有廣闊的研究空間。未來可積極探索LPSp與其他免疫佐劑，如免疫刺激復(fù)合物（ISCOM）、細(xì)胞因子IL-2、角鯊烯佐劑、胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸序列等聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的免疫增強(qiáng)效果。研究不同佐劑組合對(duì)免疫細(xì)胞的協(xié)同激活作用，以及對(duì)免疫信號(hào)通路的交互調(diào)節(jié)機(jī)制。通過篩選出具有協(xié)同效應(yīng)的佐劑組合，開發(fā)出更高效的復(fù)合佐劑，為狂犬病疫苗的創(chuàng)新研發(fā)提供新的思路和方法。開展臨床試驗(yàn)：本研究主要在小鼠模型上進(jìn)行，未來需將研究成果逐步向臨床試驗(yàn)轉(zhuǎn)化。開展基于靈長(zhǎng)類動(dòng)物的臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證LPSp增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫效果在更接近人類的動(dòng)物模型中的有效性和安全性。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)上，謹(jǐn)慎推進(jìn)人體臨床試驗(yàn)，嚴(yán)格遵循臨床試驗(yàn)的規(guī)范和倫理要求，全面評(píng)估LPSp佐劑狂犬病疫苗在人體中的免疫原性、安全性和耐受性。通過大規(guī)模、多中心的臨床試驗(yàn)，收集充分的數(shù)據(jù)，為L(zhǎng)PSp佐劑狂犬病疫苗的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)。拓展應(yīng)用范圍：除了狂犬病疫苗，LPSp作為免疫佐劑在其他疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用也值得深入研究。探討LPSp對(duì)其他病毒、細(xì)菌或寄生蟲疫苗抗原免疫效果的增強(qiáng)作用，如流感疫苗、乙肝疫苗、結(jié)核疫苗等。研究LPSp在不同疫苗體系中的作用機(jī)制和適用條件，拓展其在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，為解決更多傳染病的預(yù)防問題提供新的手段和策略。六、參考文獻(xiàn)[1]WorldHealthOrganization.(2017).Theimmunologicalbasisforimmunizationseries:module17:rabies.WorldHealthOrganization./iris/handle/10665/259511.License:CCBY-NC-SA3.0IGO.[2]王啟輝，冷靜，王健，鄭禹.LPSp作為乙型肝炎表面抗原佐劑的初步研究[J].廣西預(yù)防醫(yī)學(xué)，2004,(05):257-259.[3]申繼清.LPSp增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫效果的實(shí)驗(yàn)研究[D].廣西醫(yī)科大學(xué)，2007.[4]申繼清，王啟輝，葉潔梅，王健，冷靜.LPSp對(duì)不同免疫方案中狂犬病毒抗原免疫效果影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].山東醫(yī)藥，2011,51(43):31-33.DOI:10.3969/j.issn.1002-266X.2011.43.014.[5]NishizawaT,InagawaH,OshimaH,etal.Homeostasisasregulatedbyactivatedmacrophage.I.Lipopolysaccharide(LPS)fromwheatflour:isolation,purificationandsomebiologicalactivities[J].ChemPharmBull(Tokyo),1992,40(2):479-483.[6]JohnsonAG,GainesS,LandyM.StudiesontheOantigenofSalmonellatyphosa.V.Enhancementofantibodyresponsetoproteinantigensbythepurifiedlipopolysaccharide[J].JExpMed,1956,103(2):225-246.[7]JohnsonDA,KeeganDS,SowellCG,etal.3-O-DesacylmonophosphoryllipidAderivatives:synthesisandimmunostimulantactivities[J].JMedChem,1999,42(22):4640-4649.[8]MizunoD,SomaG.Oralorpercutaneousadministrationoflipopolysaccharideofsmallmolecularsizemaycurevariousintractablediseases:anewversionofColey'stoxin[J].MolBiother,1992,4(4):166-169.[9]OkutomiT,NishizawaT,InagawaH,etal.InhibitionofmorphinedependencebyalipopolysaccharidefromPantoeaagglomerans[J].EurCytokineNetw,1992,3(4):417-420.[10]SuzukiT,FunadaM,SuganoY,etal.EffectsofalipopolysaccharidefromPantoeaagglomeransonthecocaine-inducedplacepreference[J].LifeSci,1994,54(6):175-180.[11]KameiJ,IwamotoY,SuzukiT,etal.AntinociceptiveeffectoflipopolysaccharidefromPantoeaagglomeransonstreptozotocin-induceddiabeticmice[J].EurJPharmacol,1994,251(1):95-98.[12]GotoS,SakaiS,KeraJ,etal.Intradermaladministrationoflipopolysaccharideintreatmentofhumancancer[J].CancerImmunolImmunother,1996,42(4):255-261.[13]梁自乾，冷靜.LPSP霜?jiǎng)┰跓齻麆?chuàng)面的應(yīng)用[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000,(01):16-17.[14]黃志明，黃仁彬，陳家歡，陳美芳，楊斌，黎肇炎，王乃平。小麥非致病菌脂多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,(02):195-197.[2]王啟輝，冷靜，王健，鄭禹.LPSp作為乙型肝炎表面抗原佐劑的初步研究[J].廣西預(yù)防醫(yī)學(xué)，2004,(05):257-259.[3]申繼清.LPSp增強(qiáng)狂犬病毒抗原免疫效果的實(shí)驗(yàn)研究[D].廣西醫(yī)科大學(xué)，2007.[4]申繼清，王啟輝，葉潔梅，王健，冷靜.LPSp對(duì)不同免疫方案中狂犬病毒抗原免疫效果影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].山東醫(yī)藥，2011,51(43):31-33.DOI:10.3969/j.issn.1002-266X.2011.43.014.[5]NishizawaT,InagawaH,OshimaH,etal.Homeostasisasregulatedbyactivatedmacrophage.I.Lipopolysaccharide(LPS)fromwheatflour:isolation,purificationandsomebiologicalactivities[J].ChemPharmBull(Tokyo),1992,40(2):479-483.[6]JohnsonAG,GainesS,LandyM.StudiesontheOantigenofSalmonellatyphosa.V.Enhancementofantibodyresponsetoproteinantigensbythepurifiedlipopolysaccharide[J].JExpMed,1956,103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