高致病性動物病原微生物實驗生物安全柜氣流模式驗證細則一、驗證對象與適用范圍本細則適用于高致病性動物病原微生物實驗活動中所使用的Ⅱ級及Ⅲ級生物安全柜氣流模式驗證，其中Ⅱ級安全柜包含A1、A2、B1、B2四個亞型。驗證對象涵蓋柜內(nèi)垂直下降氣流、前窗操作口流入氣流、柜體結(jié)構(gòu)氣流屏障及HEPA過濾器完整性等關(guān)鍵防護環(huán)節(jié)。驗證工作需滿足GB41918-2022《生物安全柜》國家強制性標準要求，特別針對高致病性動物病原微生物（如非洲豬瘟病毒、禽流感病毒等）操作場景，確保氣流系統(tǒng)對人員、樣品和環(huán)境的三重防護效能。二、驗證環(huán)境與設(shè)備要求（一）環(huán)境條件控制驗證前需關(guān)閉實驗室通風柜、空調(diào)系統(tǒng)等可能產(chǎn)生氣流干擾的設(shè)備，保持實驗室內(nèi)溫度穩(wěn)定在18-25℃，相對濕度40%-60%，靜壓差符合BSL-3/4實驗室設(shè)計規(guī)范。生物安全柜應(yīng)在空載條件下連續(xù)運行30分鐘以上，確保氣流達到動態(tài)平衡狀態(tài)。工作臺面需鋪設(shè)無菌不銹鋼板，移除所有無關(guān)物品，避免氣流擾動。（二）儀器設(shè)備配置氣流檢測儀器：采用經(jīng)計量校準的熱球式風速儀（精度±0.01m/s），配備可伸縮探頭（長度≥50cm）；煙霧發(fā)生器選用甘油型或鈦四氯化物發(fā)煙裝置，煙霧顆粒直徑0.5-1.0μm，發(fā)煙量連續(xù)可調(diào)。過濾器檢測設(shè)備：氣溶膠光度計（量程0-100μg/L，精度±2%）、DOP/PAO氣溶膠發(fā)生器（輸出濃度10-20mg/m3），掃描探頭直徑≤10mm，掃描速率控制裝置。生物挑戰(zhàn)裝置：枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸浮液（濃度10?CFU/mL）、六孔撞擊式采樣器（流量28.3L/min）、恒溫培養(yǎng)箱（37℃±1℃）、生物安全柜專用密封式噴霧器（霧化粒徑3-5μm）。三、氣流模式驗證核心項目與方法（一）垂直下降氣流測試測試點位布置：按照“九宮格法”在工作臺面劃分9個測試點，每個點位距側(cè)壁≥15cm，探頭垂直向上置于臺面上方10cm處。對于1.8m寬安全柜，需增設(shè)至16個測試點，確保覆蓋整個操作區(qū)。風速測量流程：風速儀采樣時間設(shè)置為10秒/點，每個點位連續(xù)測量3次，計算算術(shù)平均值。Ⅱ級A2型安全柜下降氣流速度應(yīng)控制在0.25-0.50m/s，B2型需達到0.38-0.51m/s，且各點風速偏差≤±20%。煙霧可視化驗證：將發(fā)霧管沿工作臺面中心線置于前窗操作口頂端以上100mm高度，以5cm/s速度從柜內(nèi)一端勻速移至另一端。觀察煙霧應(yīng)呈層流狀垂直下降，無渦流、無停滯區(qū)域，在工作臺面形成均勻氣流屏障。當遇到柜內(nèi)固定支架等障礙物時，允許局部氣流擾動，但恢復(fù)穩(wěn)定距離不得超過障礙物高度的2倍。（二）前窗操作口流入氣流測試邊界氣流速度檢測：在操作口垂直方向劃分5個測量平面（距臺面0、5、10、15、20cm），每個平面取左、中、右3個點。Ⅰ級安全柜流入風速≥0.7m/s，Ⅱ級A2型≥0.5m/s，B1/B2型≥0.51m/s，且同一平面風速極差≤0.1m/s。邊緣氣流屏障測試：發(fā)霧管置于柜外35mm處，沿操作口上邊緣、左右側(cè)邊緣緩慢移動（速度≤2cm/s）。煙霧應(yīng)被穩(wěn)定吸入柜內(nèi)，形成連續(xù)的“氣幕”，不得出現(xiàn)外溢現(xiàn)象。在操作口corners位置（如前窗與左側(cè)壁交界處），允許煙霧有短暫回旋，但不得逸出柜外15cm范圍。動態(tài)操作模擬驗證：模擬操作人員手臂進出動作（頻率1次/3秒，持續(xù)1分鐘），同時在前窗外側(cè)5cm處設(shè)置粒子計數(shù)器（采樣流量1L/min）。操作期間柜外粒子濃度（≥0.5μm）應(yīng)≤10個/L，且無可見煙霧泄漏。（三）柜體結(jié)構(gòu)氣流完整性測試觀察窗氣流測試：將發(fā)霧管置于觀察屏內(nèi)側(cè)25mm處，高度為前窗操作口頂端以上150mm，水平移動發(fā)霧管。煙霧應(yīng)沿觀察屏垂直向下流動，在與下降氣流匯合處無逆流現(xiàn)象。對于傾斜式觀察窗，需特別檢測窗角區(qū)域，確保無氣流死角?；瑒哟懊荛]性測試：將前窗玻璃分別關(guān)閉至完全閉合、操作高度（200mm）、最大開啟位置三個狀態(tài)，發(fā)霧管沿玻璃與柜體接觸縫隙移動。在任何狀態(tài)下，均不得有煙霧從縫隙逸出，尤其注意滑動軌道與玻璃密封處。負壓隔離測試：Ⅲ級安全柜需進行手套接口氣密性測試，移除手套后在接口處測量風速≥0.7m/s；向柜內(nèi)充入1%示蹤氣體（如SF6），30分鐘內(nèi)濃度下降率應(yīng)≤0.1%/h，證明柜體整體氣密性符合要求。四、高效過濾器完整性驗證（一）HEPA過濾器掃描測試氣溶膠發(fā)生與采樣：在安全柜進風段注入DOP氣溶膠，上游濃度穩(wěn)定在10-20mg/m3。掃描探頭距過濾器表面25mm，以5cm/s速度做“S”形軌跡掃描，覆蓋過濾器整個表面及邊框密封處。泄漏判定標準：任何單點泄漏率＞0.01%即為不合格，邊框密封處泄漏率需≤0.005%。對于不可拆卸的排風過濾器，需采用整體效率測試法，下游濃度應(yīng)≤上游濃度的0.001%。過濾器壽命評估：通過預(yù)過濾器壓差監(jiān)測（初始壓差+50%為更換閾值）、風速衰減曲線（下降至初始值80%時需更換）、年度掃描數(shù)據(jù)趨勢分析，建立過濾器生命周期管理檔案。（二）氣流循環(huán)路徑驗證氣流比例測試：對于Ⅱ級A2型安全柜，采用風速法計算循環(huán)風量與排風風量比值，循環(huán)比例應(yīng)≥70%；B1型外排比例≥70%，B2型需達到100%全外排。測試時需關(guān)閉實驗室其他排風設(shè)備，避免系統(tǒng)壓力波動影響。污染物控制模擬：在工作臺面中央放置0.5mL熒光素鈉溶液（濃度1%），用熱風槍（溫度50℃）加熱產(chǎn)生氣溶膠。啟動安全柜后10分鐘，在排風口、操作口外側(cè)、實驗室回風口采集空氣樣品，熒光素鈉濃度應(yīng)依次遞減≥99.9%，證明污染物被有效控制在柜內(nèi)。五、生物防護性能驗證（一）人員保護挑戰(zhàn)試驗氣溶膠發(fā)生：在操作區(qū)左側(cè)放置噴霧器，以45°角向右側(cè)壁噴射枯草芽孢桿菌懸浮液，持續(xù)5分鐘（噴霧量5mL/min）。操作人員模擬常規(guī)移液操作，暴露于氣溶膠環(huán)境中。采樣與培養(yǎng)：在操作人員呼吸帶高度（距地面150cm）設(shè)置六孔撞擊式采樣器，采樣時間10分鐘。采樣結(jié)束后將培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)48小時，菌落數(shù)應(yīng)≤10CFU，且陰性對照組（未操作狀態(tài)）需≤1CFU。（二）樣品交叉污染測試模擬樣品布置：在工作臺面左、中、右位置放置3組培養(yǎng)皿（直徑90mm，含TSA培養(yǎng)基），間距360mm。左側(cè)皿作為污染源，接種1mL菌懸液；右側(cè)皿為目標樣品，暴露于氣流中。氣流傳播控制：啟動安全柜后，用無菌玻璃棒攪動左側(cè)菌液產(chǎn)生氣溶膠，持續(xù)2分鐘。培養(yǎng)后右側(cè)皿菌落數(shù)應(yīng)≤2CFU，證明垂直氣流有效阻斷交叉污染路徑。六、驗證結(jié)果判定與報告（一）合格標準綜合判定物理性能指標：所有風速測試點合格率100%，煙霧可視化無明顯渦流和泄漏；過濾器掃描無超標泄漏點；噪聲≤65dB（A計權(quán)），照度≥800lux（操作區(qū)中央）。生物防護指標：人員保護試驗菌落數(shù)≤10CFU，樣品保護試驗≤5CFU，交叉污染試驗≤2CFU，且三次平行試驗結(jié)果變異系數(shù)≤30%。文件記錄要求：驗證報告需包含設(shè)備校準證書、原始數(shù)據(jù)記錄表、煙霧測試視頻存檔（關(guān)鍵幀截圖）、過濾器掃描圖譜，所有數(shù)據(jù)需經(jīng)雙人復(fù)核并簽字確認。（二）驗證周期與維護建議定期驗證：新安裝安全柜需在啟用前完成全面驗證；日常使用中每半年進行風速與氣流模式測試，每年開展過濾器完整性與生物挑戰(zhàn)試驗；移動或重大維修后需重新驗證。預(yù)防性維護：每月清潔預(yù)過濾器（可水洗型），每季度檢查風機皮帶張力（偏差≤5mm），每年更換HEPA過濾器前進行生物滅活處理（如甲醛熏蒸或過氧化氫霧化）。建立驗證數(shù)據(jù)趨勢分析圖，提前識別氣流性能退化風險。七、高致病性動物病原微生物特殊要求針對非洲豬瘟病毒、口蹄疫病毒等氣溶膠傳播風險極高的病原體，需額外實施增強型驗證措施：動態(tài)壓力測試：模擬實驗室突發(fā)停電（安全柜斷電后30秒內(nèi)），測量柜內(nèi)負壓保持時間≥15分鐘，防止斷電瞬間氣溶膠外泄?；瘜W消毒兼容性驗證：使用10%次氯酸鈉溶液對柜內(nèi)表面進行噴霧消毒后，立即測試下降氣流速度變化率應(yīng)≤5%，證明消毒過程不影響氣流穩(wěn)定性。雙風機冗余測試：對于Ⅲ級安全柜