肝臟細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)操作流程詳解肝臟作為機(jī)體重要的代謝和解毒器官，其細(xì)胞組成復(fù)雜，包含肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、星狀細(xì)胞等多種類型。其中，肝細(xì)胞的分離與純化是開展肝臟生理功能研究、藥物代謝評(píng)估、疾病模型構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。本文將詳細(xì)闡述基于經(jīng)典兩步膠原酶灌注法的肝臟細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)操作流程，旨在為相關(guān)研究人員提供一套專業(yè)、嚴(yán)謹(jǐn)且具有實(shí)用價(jià)值的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前的充分準(zhǔn)備是確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行和獲得高質(zhì)量肝細(xì)胞的首要環(huán)節(jié)，涉及試劑配制、儀器調(diào)試及實(shí)驗(yàn)方案的細(xì)化。（一）試劑配制與材料準(zhǔn)備1.主要試劑：*無鈣鎂D-Hanks液（CMF-D-Hanks）：用于初始灌注，洗去血液并抑制細(xì)胞間連接。需提前配制，過濾除菌，4℃保存。使用前可預(yù)熱至37℃。*含EGTA的無鈣緩沖液：EGTA作為鈣離子螯合劑，能有效解離肝細(xì)胞間的橋粒連接，通常與CMF-D-Hanks按比例混合或單獨(dú)配制。*膠原酶溶液：這是肝細(xì)胞分離的關(guān)鍵試劑。常用膠原酶Ⅳ型或Ⅱ型，需用含鈣離子的緩沖液（如Hanks液或?qū)Ｓ酶渭?xì)胞洗滌液）溶解，濃度通常在0.05%-0.1%之間。配制后需過濾除菌，并置于37℃水浴中預(yù)熱。*肝細(xì)胞培養(yǎng)液：如Williams'E培養(yǎng)基或DMEM高糖培養(yǎng)基，添加胎牛血清（FBS，終濃度10%-20%）、青霉素-鏈霉素等抗生素，以及必要的谷氨酰胺等添加劑。同樣需預(yù)熱至37℃。*臺(tái)盼藍(lán)染液：用于檢測(cè)細(xì)胞活力，濃度通常為0.4%。*75%酒精、碘伏等消毒用品。2.主要器材與儀器：*手術(shù)器械：手術(shù)刀、手術(shù)剪（直剪、彎剪）、鑷子（直鑷、彎鑷、眼科鑷）、止血鉗、動(dòng)脈夾、縫合針線等，需高壓滅菌。*灌注裝置：恒流泵、灌注針（或靜脈留置針）、硅膠管。*離心管、培養(yǎng)皿、細(xì)胞篩（如70μm尼龍網(wǎng)）。*離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、CO?培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物準(zhǔn)備根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、品系及年齡體重。常用的有大鼠、小鼠，有時(shí)也會(huì)用到豚鼠或兔。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物需禁食一定時(shí)間（通常12-16小時(shí)），以減少肝臟糖原含量，便于后續(xù)操作和細(xì)胞活性維持，但可自由飲水。二、操作流程（一）動(dòng)物麻醉與固定1.麻醉：采用腹腔注射或吸入麻醉方式。腹腔注射常用戊巴比妥鈉（劑量需根據(jù)動(dòng)物種類和體重精確計(jì)算），待動(dòng)物角膜反射消失、四肢松弛后即可進(jìn)行手術(shù)。注意麻醉深度要適中，過深可能影響肝臟血流，過淺則動(dòng)物會(huì)掙扎。2.固定：將麻醉后的動(dòng)物仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，四肢用棉線或?qū)Ｓ霉潭▕A固定，腹部朝上。3.備皮與消毒：用脫毛劑或剃毛刀去除腹部毛發(fā)，然后依次用碘伏和75%酒精對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒，遵循“由內(nèi)向外、由上向下”的原則。（二）肝臟暴露與門靜脈插管1.腹部剖開：在腹部正中做一縱向切口，從劍突下至恥骨聯(lián)合上方，逐層剪開皮膚、皮下組織和腹肌，暴露腹腔內(nèi)臟器。操作時(shí)需小心，避免損傷腸道等腹腔器官。2.暴露門靜脈：輕柔地將胃腸等器官推向左側(cè)，充分暴露肝臟和門靜脈。門靜脈是肝臟灌注的關(guān)鍵血管，通常選擇肝門部的門靜脈主干或其分支（如腸系膜上靜脈）進(jìn)行插管。3.門靜脈插管：這是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中最具技巧性的步驟之一。用顯微鑷小心分離出門靜脈周圍的結(jié)締組織，在門靜脈近肝端用絲線打一松結(jié)（作為固定插管之用），遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾夾閉。用眼科剪在門靜脈壁上剪一小斜口，迅速將充滿無鈣緩沖液的灌注針（或連接硅膠管的靜脈留置針）插入血管，然后收緊并結(jié)扎固定絲線。插管成功的標(biāo)志是肝臟迅速充盈（無鈣緩沖液灌注時(shí)）。（三）肝臟灌注1.無鈣緩沖液灌注：?jiǎn)?dòng)恒流泵，以適當(dāng)流速（大鼠通常為8-15ml/min，小鼠為2-5ml/min）開始灌注無鈣緩沖液（37℃預(yù)熱）。同時(shí)，在肝下下腔靜脈處剪一小口作為流出道，使灌注液能順利流出。灌注過程中密切觀察肝臟顏色變化，正常情況下肝臟會(huì)由暗紅色逐漸變?yōu)橥咙S色，質(zhì)地變軟。灌注時(shí)間通常為5-10分鐘，目的是洗去肝臟內(nèi)的血液，去除肝細(xì)胞間隙的鈣離子，為后續(xù)膠原酶消化做準(zhǔn)備。2.膠原酶溶液灌注：無鈣緩沖液灌注完成后，迅速切換至預(yù)熱的膠原酶溶液進(jìn)行灌注。灌注流速可略低于無鈣緩沖液。此時(shí)可見肝臟進(jìn)一步腫脹、變軟，表面出現(xiàn)顆粒感。灌注時(shí)間需根據(jù)膠原酶活性、肝臟大小及動(dòng)物種類進(jìn)行調(diào)整，一般為10-20分鐘。關(guān)鍵是觀察肝臟消化程度，當(dāng)輕輕擠壓肝臟時(shí)，肝小葉結(jié)構(gòu)易于分離，肝細(xì)胞可游離出來即可停止灌注。過度消化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，消化不足則細(xì)胞得率低。（四）肝細(xì)胞收集與純化1.肝臟剝離與消化終止：灌注結(jié)束后，迅速將肝臟完整取下，放入盛有預(yù)冷肝細(xì)胞培養(yǎng)液（或含血清的緩沖液）的培養(yǎng)皿中，輕輕撕去肝包膜及結(jié)締組織。用剪刀將肝臟剪成小塊，然后用吸管或鑷子輕輕吹散，使肝細(xì)胞充分釋放。加入適量冷的肝細(xì)胞培養(yǎng)液終止膠原酶的消化作用，并輕輕吹打混懸。2.細(xì)胞過濾：將細(xì)胞懸液通過70μm細(xì)胞篩過濾至離心管中，以去除未消化的組織塊和細(xì)胞團(tuán)。過濾時(shí)可適當(dāng)用培養(yǎng)液沖洗篩網(wǎng)。3.離心與洗滌：將過濾后的細(xì)胞懸液進(jìn)行低速離心（通常50×g-100×g，2-5分鐘）。離心后棄上清，沉淀用預(yù)冷的肝細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，輕輕吹打混勻，再次離心洗滌。一般洗滌2-3次，以徹底去除膠原酶和細(xì)胞碎片。最后一次離心后，棄上清，根據(jù)沉淀量加入適量肝細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。（五）細(xì)胞活力檢測(cè)與計(jì)數(shù)1.臺(tái)盼藍(lán)染色：取少量細(xì)胞懸液，與0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液等體積混合，室溫靜置1-2分鐘。2.計(jì)數(shù)與活力評(píng)估：將染色后的細(xì)胞懸液滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整而拒染臺(tái)盼藍(lán)，呈無色透明；死細(xì)胞則被染成藍(lán)色。計(jì)算細(xì)胞活力（活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）和細(xì)胞濃度。合格的肝細(xì)胞懸液活力應(yīng)在80%以上，方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（六）細(xì)胞接種（可選）根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將分離得到的肝細(xì)胞按照一定密度接種于預(yù)先用膠原或明膠包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后4-6小時(shí)左右，大部分肝細(xì)胞會(huì)貼壁。三、注意事項(xiàng)與經(jīng)驗(yàn)總結(jié)1.實(shí)驗(yàn)操作的連貫性與速度：肝臟灌注分離過程強(qiáng)調(diào)“快、準(zhǔn)、穩(wěn)”。從動(dòng)物麻醉、插管到灌注完成，應(yīng)盡可能縮短時(shí)間，以保證肝細(xì)胞活性。2.溫度控制：整個(gè)過程中，所有緩沖液、膠原酶溶液及培養(yǎng)液均需37℃預(yù)熱（除終止消化和洗滌用預(yù)冷溶液外），維持肝細(xì)胞在生理溫度下，減少冷損傷。3.灌注參數(shù)的優(yōu)化：灌注流速和壓力需適中，過高易造成血管破裂和細(xì)胞損傷，過低則灌注不均勻，影響消化效果。需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。4.膠原酶的選擇與濃度：不同批次的膠原酶活性差異較大，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度和灌注時(shí)間。5.無菌操作：雖然肝細(xì)胞短期培養(yǎng)對(duì)無菌要求相對(duì)較低（若僅用于急性實(shí)驗(yàn)），但為保證細(xì)胞活力和避免污染，應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范。6.動(dòng)物狀態(tài)：健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是獲得高質(zhì)量肝細(xì)胞的前提。避免使用患病、衰老或應(yīng)激狀態(tài)的動(dòng)物。7.細(xì)節(jié)決定成敗：門靜脈插管的技巧、灌注液流出道的通暢、膠原酶消化程度的判斷等細(xì)節(jié)，都直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。初學(xué)者需多加練習(xí)，積累經(jīng)驗(yàn)。四、結(jié)語肝臟細(xì)胞分離技術(shù)是肝臟生物學(xué)研